CN110801822A - 一种富集关附甲素a的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法 - Google Patents

一种富集关附甲素a的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药材中有效成分分析前处理领域，特别涉及一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法。该磁性固相萃取剂的制备方法包括：以关附甲素A为模板分子、NVP和AA为功能单体、MBA为交联剂、H2O2‑Vc为引发剂、KH570为偶联剂修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，采用表面分子印迹技术制备而得。本发明采用分子印记技术结合磺酸功能化法磁性固相萃取关附甲素A，双重作用提高磁性固相萃取效率，减少有机试剂消耗，绿色环保，分离快速，操作简便，回收率及灵敏度高，选择性好，可用于中药材等实际样品中(痕量)关附甲素A的富集、分离，便于后期的高效液相或其他分析方法的分析检测。

Description

一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法
技术领域
本发明涉及中药材中有效成分分析前处理领域，特别涉及一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法。
背景技术
黄花乌头[Aconitum Coreanum(Levl.)Rapaics]系毛茛科(Ranuculaceae)乌头属(Aconitum L.)植物，具有祛风除湿、温经止痛之功效。黄花乌头块根内含有的叔胺类二萜生物碱-关附甲素A(Guanfu base A,GFBA)，在镇痛、抗炎、抗心律不齐和强心作用等方面功能显著，被称为“特异性减慢心率药”，已开发成我国的原创一类新药，即盐酸关附甲素注射液。关附甲素A：分子式C24H31NO6；分子量429.5，分子结构如式1所示。
Figure BDA0002280900580000011
由于中药材黄花乌头成分复杂，所以在分析前一般均需要采用合适的前处理步骤，对目标待测物进行富集、分离，以降低基质干扰和提高分析的准确性和分析效率。为实现这一目标，目前已经发展多种前处理方法，如溶液萃取、蒸馏、色谱柱分离和超临界流体萃取法，以及经改良的添加了离子液体的两相萃取法对待分析样品进行前处理。然而这些方法大都存在问题，如步骤繁琐、易受到基质干扰、耗时较长等。
磁性固相萃取技术(Magnetic solid phase extraction，MSPE)是以磁性纳米粒子及其表面功能化的新型纳米材料作为吸附基质的一种固相萃取技术。与传统萃取技术相比，MSPE是将磁性吸附剂直接分散于样品溶液或悬浮液中与待测体系充分接触，并借助外加磁场实现目标物与样品基质的分离，然后选用合适的溶剂洗脱目标物，再进行后续的分析检测。它避免了大量有机溶剂的使用，从而减少了样品处理过程对环境和分析人员的伤害；更重要的一点，可有效避免溶剂残留对食品和中药材后续利用的影响；另外，磁性固相萃取技术无需消耗大量能源且避免了普通固相萃取技术繁琐的过柱操作、吸附柱容易堵塞和重复性差及回收困难等问题，因而具有很好的应用前景。
好的磁性固相萃取剂是MSPE技术的关键。磁性固相萃取剂通常由磁源和非磁性材料组成，磁源使吸附剂具有磁性，非磁材料则是为吸附目标物提供作用位点，具有较大比表面积、较好生物相容性、容易达到磁性分离的磁性纳米粒子。磁源研究较多的是磁性纳米材料，该材料的磁核主要是铁、镍、钴等金属及其氧化物。其中最常见的是磁铁-四氧化三铁(Fe3O4)。由于磁性Fe3O4纳米粒子具有超顺磁性，极易发生团聚，并且对目标物缺少选择性，故其吸附性能受到一定限制。因此通常对磁性Fe3O4或钴铁磁体等纳米材料并进行表面功能化修饰，或采用一定的包埋技术制得磁性纳米复合材料可有效避免上述问题发生。磁性纳米复合材料不仅能反复使用，而且能避免传统固相萃取小柱易堵塞等问题，使得MSPE具有简单快速、绿色安全、高效经济等优点。MSPE自1973年被发现以来，取得了良好的应用效果，是一种极具潜力的样品前处理技术。
分子印记聚合物(Molecular Imprinted Polymer，MIP)技术是指针对某一特定分子制备具有选择性识别能力的聚合物的技术，他是通过模板分子、功能单体和交联剂的作用产生有化学选择性的键合位点的一种技术。待测底物通过与模板分子聚合物在形状、大小和功能基团的定位方面吻合而被识别。MIP可与液相色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、固相萃取等分离分析技术联用。根据模板分子和功能单体形成复合物时作用力的性质，分子印记分为共价型和非共价型两种。共价型分子印记过程中，模板分子和单体通过可逆的共价作用形成复合物。分子和单体间的作用力较强，形成的复合物很稳定，但过程复杂，模板分子需要被单体衍生化，而且模板分子的抽提也较困难。非共价型分子印记方法中，聚合通过弱分子间作用力完成，如氢键、偶极、离子、金属螯、电荷转移、疏水、范德华力等。非共价型印记聚合技术具有较广泛的目标分子的范围，分子间作用力形式多样，模板分子易于除去等优点。通过离子的螯合及空间位阻效应，单体和模板分子可在极性溶剂中形成复合物。由于具有萃取时间短、有机溶剂使用量少和操作简便等优点，在中药材领域前处理应用具有潜在应用前景。
MIP技术具有预定性强、选择性高、重复利用性好等优点，特别适用于从生物样品、环境样品以及植物等复杂体系中分离特定目标分子。但MIPs在洗脱模板和吸附过程仍需离心和过滤等繁琐操作。MSPE保留了传统固相萃取简单、高效和有机溶剂耗量少的优点。在磁性固相萃取过程中，磁性吸附剂不是填充到吸附柱中，而是直接被添加至样品的溶液或悬浮液中，将目标化合物吸附到分散的磁性吸附剂表面，在外部磁场作用下就可使目标化合物与样品基质分离。磁分离技术避免了普通固相萃取技术中操作繁琐、吸附柱易堵塞、重复性差等问题，同时具备富集效率高、分离过程简便等优点，因而具有很好的应用前景。两种技术的结合成为纯化、富集和分析样品中的待测物质的有力手段。
目前，中药材中关附甲素A及其他活性成分的富集技术有磺化等功能化法磁性固相萃取或分子印记法磁性固相萃取等。然而，仅磺化功能化法磁性固相萃取只能起到一定的阳离子的选择性富集作用；而仅分子印记磁性固相萃取虽然只能提高分子识别作用。是前期如不能很好的富集，亦达不到很好的分离分析目的。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法。该磁性固相萃取剂对GFBA的吸附效率可达到97.2％，可达到很好的富集效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂，其制备方法包括如下步骤：
步骤1：以磺酸化石墨烯(GS)为基体，六水氯化铁及六水硝酸钴为磁性纳米颗粒铁钴磁体CoFe2O4的制备前体物质，采用一步溶剂热法制备得到CoFe2O4/GS；
步骤2：以关附甲素A为模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸为功能单体、N,N’－亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、H2O2-Vc为引发剂、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，采用表面分子印迹技术制备得到对关附甲素A特异性识别的磁性固相萃取剂，即铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物，记为CoFe2O4/GS/GFBA-MIP。
本发明公开了一种基于分子印迹结合磺酸功能化法增强磁性固相萃取黄花乌头中关附甲素A的富集技术，所述技术首先采用高压脉冲电场法对样品进行组织细胞破裂及水解，并将水解液冷冻再融化；然后制备不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)；其次，磁性固相萃取剂的表征；再次，不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)对黄花乌头中关附甲素A的吸附/解吸附研究；最后开展不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)对黄花乌头中关附甲素A的固相萃取应用及应用评价研究。
本发明在磁性固相萃取的基础上进行磺化，提高分子识别能力；同时进一步引进表面分子印记技术，进一步提高分子的选择性，并将其作为固相萃取的吸附剂进行黄花乌头中生物碱提取前处理，建立了分子印记技术结合磺酸功能化法磁性固相萃取关附甲素A的分析前处理新技术。相较于其他分析前处理方法，该方法分离快速、简便，回收率与灵敏度高，选择性好，特别适用于中药材等实际样品中痕量关附甲素A的富集。
作为优选，步骤1具体为：
将GS分散于乙二醇水溶液中，超声处理，得到GS悬浮液；
取六水氯化铁、六水硝酸钴溶解于水，转入GS悬浮液中进行反应；
再加入水合肼，在140～160℃下反应8～12h，得到CoFe2O4/GS。
优选地，步骤1具体为：
将0.1～0.2g GS分散于50～70mL 70vt％～80vt％乙二醇水溶液中，超声0.5～1.5h，得到GS悬浮液；
取0.2～0.4g六水氯化铁、0.1～0.3g六水硝酸钴溶解于40～50mL水，转入GS悬浮液中反应4～6h；
再加入4～5mL水合肼，搅拌25～35min，在140～160℃下反应8～12h，冷却，清洗，过滤，干燥，得到CoFe2O4/GS。
作为优选，步骤2具体为：
KH570与CoFe2O4/GS反应，得到KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒；
在N,N’－亚甲基双丙烯酰胺、H2O2-Vc存在的条件下，关附甲素A、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒反应得到铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物。
在具体实施例中，步骤2具体为：
首先将20.00g乳化剂OP-10，25mL正丁醇和60mL环己烷混合均匀，加到装有磁子、球形冷凝管和N2导管的三口烧瓶中。然后将0.3g CoFe2O4/GS加入到上述三口烧瓶中，滴加3mL浓氨水，20℃反应1h。反应结束后，在该体系中加入1.26mLKH570，50℃反应5h。同时，将18mL，18mmolL-1的GFBA乙醇溶液、0.56gAA和0.35gNVP加入到50mL烧杯中，室温下搅拌5h后加入到上述经KH570改性后的体系中，搅拌10min后，再加入5.8mmoL MBA,0.08mmolH2O2和0.20mmolVc,35℃反应28h得到KH570改性的磁性纳米印记复合物(CoFe2O4/GS/GFBA-MIPs)。产物利用外加磁场进行分离，先用甲醇-乙酸(甲醇与乙酸体积比为9：1)洗脱液清洗3次后，再放入盛有甲醇、乙酸洗脱液的索氏抽提器中洗脱模板分子，直到洗脱液的吸光度小于0.005。将产物在40℃真空干燥24h，得到的样品标记为CoFe2O4/GS/GFBA-MIP。
作为优选，GS的制备方法为：以GO为前体物质，经过硼氢化钠预还原，再经过对氨基苯磺酸冰浴磺化和联氨还原，得到GS。
本发明还提供了该磁性固相萃取剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：以磺酸化石墨烯(GS)为基体，六水氯化铁及六水硝酸钴为磁性纳米颗粒铁钴磁体CoFe2O4的制备前体物质，采用一步溶剂热法制备得到CoFe2O4/GS；
步骤2：以关附甲素A为模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸为功能单体、N,N’－亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、H2O2-Vc为引发剂、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，采用表面分子印迹技术制备得到对关附甲素A特异性识别的磁性固相萃取剂，即铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物，记为CoFe2O4/GS/GFBA-MIP。
本发明还提供了一种提取富集关附甲素A的方法，包括如下步骤：
将待测黄花乌头与乙醇水溶液混合，除氧密封，在电场强度10～30kv·cm-1、料液比1：(5～15)、脉冲时间30～90S条件下进行高压脉冲电场水解，冷却，将水解液挥干，加水复溶，放置-20～-60℃条件下冷冻2～4h，然后常温溶化，过滤，得到含有关附甲素A的样品；
将磁性固相萃取剂与含有关附甲素A的样品混合，吸附后回收，解吸附，得到关附甲素A。
作为优选，吸附的次数为4～8次，每次吸附的时间为100～150min。
优选地，吸附的次数为6次，每次吸附的时间为120min。
作为优选，解吸附采用的洗脱剂为NaH2PO4溶液、甲醇水溶液、乙腈水溶液、氨水丙酮溶液中的一种。
优选地，解吸附采用的洗脱剂为氨水丙酮溶液。
作为优选，NaH2PO4溶液的浓度为2～5mol·L-1，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(3～4)：1，乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为(3～4)：1，氨水丙酮溶液为15％～20％氨水和丙酮的混合溶液，氨水与丙酮的体积比为(3～5)：2。
优选地，NaH2PO4溶液的浓度为3mol·L-1，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为4：1，乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为4：1，氨水丙酮溶液为20％氨水和丙酮的混合溶液，氨水与丙酮的体积比为3：2。
本发明提供了一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法。该磁性固相萃取剂的制备方法包括：以GS为基体，六水氯化铁及六水硝酸钴为改性剂，采用一步溶剂热法制备得到CoFe2O4/GS；以关附甲素A为模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸为功能单体、N,N’－亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、H2O2-Vc为引发剂、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，采用表面分子印迹技术制备得到对关附甲素A特异性识别的磁性固相萃取剂。本发明的积极效果在于：
本发明采用高压脉冲电场法提取关附甲素A具有操作简单，样品提取快速完全，试剂用量少，快速节能，环境污染小等优点。另外，分析前处理过程添加冷冻及复溶环节，能通过“冰吐”作用，纯化目标物及减少后期对分离柱的污染；
本发明采用分子印记结合磺酸功能化法磁性固相萃取，双重作用提高磁性固相萃取效率，减少有机试剂消耗，绿色环保，分离快速，操作简便，回收率与灵敏度高，选择性好，可用于样品中痕量关附甲素A的富集、分离，便于后期的高效液相或其他分析方法的分析检测；
本发明方法集分离、富集于一体，CoFe2O4复合大比表面积石墨烯，可提高富集效率；磺酸功能化，可有阳离子交换剂的作用，可有效吸附诸如关附甲素A等叔胺类生物碱等阳离子；另一方面，分子印迹法可实现对目标分子的识别性，大大提高对关附甲素A的选择性，结合大比表面积石墨烯、磺酸功能化和分子印迹法多重富集和分离作用，富集和分离效率较普通的提高2倍，而且有机溶剂用量少；省去了固相萃取方法中必须的氮吹浓缩操作，可大幅度提高样品前处理的工作效率和降低成本。
附图说明
图1示磁性固相萃取剂的制备流程图；
图2示不同磁性固相萃取剂的萃取效率；
图3示不同洗脱剂的洗脱效率；
图4示不同磁性固相萃取剂对GFBA的识别和选择性。
具体实施方式
本发明公开了一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
石墨烯(Graphene,G)指由以苯环结构(即六角形蜂巢结构)周期性紧密堆积的碳原子构成的碳材料，石墨烯具有质量轻、高化学稳定性和高比表面积等优点，而被选择为载体材料应用于分离、富集领域。
分子印记聚合物(Molecular Imprinted Polymer，MIP)技术是指针对某一特定分子制备具有选择性识别能力的聚合物的技术，他是通过模板分子、功能单体和交联剂的作用产生有化学选择性的键合位点的一种技术。待测底物通过与模板分子聚合物在形状、大小和功能基团的定位方面吻合而被识别。
磁性固相萃取技术(Magnetic solid phase extraction，MSPE)是以磁性纳米粒子及其表面功能化的新型纳米材料作为吸附基质的一种固相萃取技术。
黄花乌头[Aconitum Coreanum(Levl.)Rapaics]系毛茛科(Ranuculaceae)乌头属(AconitumL.)植物，具有祛风除湿、温经止痛之功效。黄花乌头块根内含有的叔胺类二萜生物碱-关附甲素A(Guanfu base A,GFBA)，在镇痛、抗炎、抗心律不齐和强心作用等方面功能显著，被称为“特异性减慢心率药”，已开发成我国的原创一类新药，即盐酸关附甲素注射液。
缩写及化学式含义如下：
GO：氧化石墨烯；
G：石墨烯；
GS：磺酸化石墨烯；
GFBA：关附甲素A；
CoFe2O4：钴铁氧体；
KH570：硅烷偶联剂；
MIP：分子印记聚合物；
NVP：N-乙烯基吡咯烷酮；
AA：丙烯酸；
MSPE：磁性固相萃取技术；
CoFe2O4/G：钴铁氧体/石墨烯复合物；
CoFe2O4/GS：磺酸化钴铁氧体/石墨烯复合物；
CoFe2O4/GS/GFBA-MIP：铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物；
CoFe2O4/G/GFBA-MIP：铁钴磁体/石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物；
MBA：N,N’－亚甲基双丙烯酰胺；
FeCl3·6H2O：六水氯化铁；
Co(NO3)2·6H2O：六水硝酸钴；
Fe3O4：四氧化三铁。
以下实施例中主要研究为：
首先采用高压脉冲电场法对样品进行组织细胞破裂及提取，并将水解液冷冻再融化；
然后制备不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)；
其次，不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)对黄花乌头中关附甲素A的吸附/解吸研究；
最后开展不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)对黄花乌头中关附甲素A的固相萃取应用及应用评价研究。
本发明提供的富集关附甲素A的磁性固相萃取剂及其制备和富集方法中所用原料、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本发明实施例提供了一种增强的磁性固相萃取黄花乌头中关附甲素A的富集分离技术，主要包括以下步骤：
1.采用高压脉冲电场法对样品进行组织细胞破裂及提取，并将水解液冷冻再融化
取待测黄花乌头1.5g于水解管中，加入5mL乙醇溶液(浓度为80％)，除氧密封好，设置电场强度20kv·cm-1，料液比1:10和脉冲时间60S进行高压脉冲法水解，待冷却至室温后将水解液挥干，加30mL水复溶，放置零下50度冷冻3小时，然后取出常温溶化，随后过滤。
2.磁性固相萃取剂的制备(CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)
(1)GO制备：以购买的石墨粉为基体，参照Hummers法制备氧化石墨烯(GO)并加以改良，GO的制备过程主要包括低温插层阶段、中温氧化阶段和高温水解阶段。
(2)GS制备：以上述步骤制备的GO为前体物质，经过硼氢化钠预还原，去除一部分含氧基团；对氨基苯磺酸冰浴磺化和联氨还原，去除剩余的含氧物质基团，得到磺酸化石墨烯GS。
(3)CoFe2O4/G及CoFe2O4的制备：CoFe2O4/G制备采用一步溶剂热法。以GO为基体，经过硼氢化钠预还原，乙二醇及超纯水为溶剂，六水氯化铁及六水硝酸钴为反应试剂，在150℃下反应10h利用共沉淀的方法合成，溶液中的Fe3+和Co2+会与G表面的羧基(-COOH)形成配合物，并在氨水(pH＝10)条件下形成磁性的CoFe2O4沉积并牢固负载于G的表面。可通过计算原料合成CoFe2O4和G占比不同的CoFe2O4/G，清洗过滤干燥得到产物。CoFe2O4的制备采用六水氯化铁及六水硝酸钴为反应试剂，在150℃下反应10h，清洗过滤干燥得到产物。
(4)CoFe2O4/GS：CoFe2O4/GS采用一步溶剂热法制备。将0.12g GS分散于45mL乙二醇及15mL超纯水中，超声1h；称取0.33g六水氯化铁、0.18g六水硝酸钴分散在42mL超纯水中溶解，转入GS悬浮液中离子交换5h；再加入4.2mL水合肼，搅拌30min，在150℃下反应10h，冷却至室温，清洗过滤干燥得到产物。
(5)CoFe2O4/GS/GFBA-MIP(钴铁磁体/磺酸化石墨烯-关附甲素A磁性分子印迹聚合物)：以关附甲素A(Guanfubase A,GFBA)为模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和丙烯酸(AA)为功能单体、N,N’－亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂、H2O2-Vc为引发剂、KH570(硅烷偶联剂)修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，借助表面分子印迹技术制备了能够对GFBA进行特异性识别的关附甲素A磁性分子印迹聚合物，具体流程图如图1所示。具体步骤如下：
首先将20.00g乳化剂OP-10，25mL正丁醇和60mL环己烷混合均匀，加到装有磁子、球形冷凝管和N2导管的三口烧瓶中。然后将0.3g CoFe2O4/GS加入到上述三口烧瓶中，滴加3mL浓氨水，20℃反应1h。反应结束后，在该体系中加入1.26mLKH570，50℃反应5h。同时，将18mL，18mmolL-1的GFBA乙醇溶液、0.56gAA和0.35gNVP加入到50mL烧杯中，室温下搅拌5h后加入到上述经KH570改性后的体系中，搅拌10min后，再加入5.8mmoL MBA,0.08mmol H2O2和0.20mmol Vc,35℃反应28h得到KH570改性的磁性纳米印记湿复合物(CoFe2O4/GS/GFBA-MMIPs)。产物利用外加磁场进行分离，先用甲醇-乙酸(甲醇与乙酸体积比为9：1)洗脱液清洗3次后，再放入盛有甲醇、乙酸洗脱液的索氏抽提器中洗脱模板分子，直到洗脱液的吸光度小于0.005。将产物在40℃真空干燥24h，得到的样品标记为CoFe2O4/GS/GFBA-MIP。
3.不同的磁性固相萃取剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS和CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)对黄花乌头中关附甲素A的吸附/解吸研究
(1)吸附实验
取一系列质量(0.01～0.05g)的CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS,CoFe2O4/GS/GFBA-MIP置于100mL分液漏斗中，加入1.50g黄花乌头的30mL提取液(采用实施例1所述方法)(液相色谱-质谱法测的含量为2mg·g-1)，用液相色谱法测定不同固相萃取剂对GFBA的吸附量，计算不同固相萃取剂对GFBA的吸附量及吸附率(回收率)，结果如图2、表1所示。
表1吸附剂对GFBA的吸附量及吸附率
吸附剂 CoFe<sub>2</sub>O<sub>4</sub> CoFe<sub>2</sub>O<sub>4</sub>/G CoFe<sub>2</sub>O<sub>4</sub>/GS CoFe<sub>2</sub>O<sub>4</sub>/GS/GFBA-MIP
吸附量 1.386mg 1.575mg 1.914mg 1.994mg
回收率(％) 46.2 52.5 63.8 97.2
(2)脱附实验
用0.03g吸附剂(CoFe2O4,CoFe2O4/G,CoFe2O4/GS,CoFe2O4/GS/GFBA-MIP)对20mL质量浓度为5mg/L的GFBA溶液进行第一次吸附(120min)，吸附后用磁铁回收，并用超纯水清洗，用NaH2PO4(3mol·L-1)、甲醇/水(8：2,V:V)、乙腈/水(8：2,V:V)、氨水丙酮溶液(20％氨水：丙酮＝3：2,V:V)等解吸附。解吸附后用超纯水清洗，并放入真空干燥箱内干燥8h，进行下一次吸附实验。重复以上步骤6次后，计算解吸附率，结果如图3、表2所示。整个过程的固液分离均用磁铁分离。
表2不同洗脱剂对GFBA的解吸附率
洗脱剂 NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 甲醇/水 乙腈/水 NH<sub>3</sub>·H<sub>2</sub>O-丙酮
解吸附率(％) 83.2 61.1 42.8 95.5
结果表明CoFe2O4/GS/GFBA-MIP的吸附效率最佳，NH3·H2O的解吸附效果最好。分别达到97.2和95.5。且CoFe2O4/GS/GFBA-MIP的吸附率(97.2％)可达到CoFe2O4的(46.2％)2倍多。图4显示不同的吸附剂对GFBA的识别和选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种富集关附甲素A的磁性固相萃取剂，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
步骤1：以磺酸化石墨烯GS为基体，六水氯化铁及六水硝酸钴为磁性纳米颗粒铁钴磁体CoFe2O4的制备前体物质，采用一步溶剂热法制备得到铁钴磁体/磺酸化石墨烯CoFe2O4/GS；
步骤2：以关附甲素A为模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸为功能单体、N,N’－亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、H2O2-Vc为引发剂、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，采用表面分子印迹技术制备得到对关附甲素A特异性识别的磁性固相萃取剂，即铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物，记为CoFe2O4/GS/GFBA-MIP。
2.根据权利要求1所述的磁性固相萃取剂，其特征在于，步骤1具体为：
将GS分散于乙二醇水溶液中，超声处理，得到GS悬浮液；
取六水氯化铁、六水硝酸钴溶解于水，转入GS悬浮液中进行反应；
再加入水合肼，在140～160℃下反应8～12h，得到CoFe2O4/GS。
3.根据权利要求2所述的磁性固相萃取剂，其特征在于，步骤1具体为：
将0.1～0.2g GS分散于50～70mL 70vt％～80vt％乙二醇水溶液中，超声0.5～1.5h，得到GS悬浮液；
取0.2～0.4g六水氯化铁、0.1～0.3g六水硝酸钴溶解于40～50mL水，转入GS悬浮液中反应4～6h；
再加入4～5mL水合肼，搅拌25～35min，在140～160℃下反应8～12h，冷却，清洗，过滤，干燥，得到CoFe2O4/GS。
4.根据权利要求1所述的磁性固相萃取剂，其特征在于，步骤2具体为：
KH570与CoFe2O4/GS反应，得到KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒；
在N,N’－亚甲基双丙烯酰胺、H2O2-Vc存在的条件下，关附甲素A、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒反应得到铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物。
5.根据权利要求1所述的磁性固相萃取剂，其特征在于，所述GS的制备方法为：以GO为前体物质，经过硼氢化钠预还原，再经过对氨基苯磺酸冰浴磺化和联氨还原，得到GS。
6.权利要求1至5中任一项所述磁性固相萃取剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：以磺酸化石墨烯(GS)为基体，六水氯化铁及六水硝酸钴为磁性纳米颗粒铁钴磁体CoFe2O4的制备前体物质，采用一步溶剂热法制备得到CoFe2O4/GS；
步骤2：以关附甲素A为模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸为功能单体、N,N’－亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、H2O2-Vc为引发剂、KH570修饰的CoFe2O4/GS纳米颗粒为磁性载体，采用表面分子印迹技术制备得到对关附甲素A特异性识别的磁性固相萃取剂，即铁钴磁体/磺酸化石墨烯/关附甲素A分子印记聚合物，记为CoFe2O4/GS/GFBA-MIP。
7.一种富集关附甲素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待测黄花乌头与10％～90％乙醇水溶液混合，除氧密封，在电场强度10～30kv·cm-1、料液比1：(5～15)、脉冲时间30～90S条件下进行高压脉冲电场水解，冷却，将水解液挥干，加水复溶，放置-20～-60℃条件下冷冻2～4h，然后常温溶化，过滤，得到含有关附甲素A的样品；
将权利要求1至5中任一项所述磁性固相萃取剂与含有关附甲素A的样品混合，吸附后回收，解吸附，得到关附甲素A。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述吸附的次数为4～8次，每次吸附的时间为100～150min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述解吸附采用的洗脱剂为NaH2PO4溶液、甲醇水溶液、乙腈水溶液、氨水丙酮溶液中的一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述NaH2PO4溶液的浓度为2～5mol L-1，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(3～4)：1，乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为(3～4)：1，氨水丙酮溶液为15％～20％氨水和丙酮的混合溶液，氨水与丙酮的体积比为(3～5)：2。
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