CN110799544A - 用于鉴别并治疗白血病中对于cta4拮抗剂的耐药性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴别并治疗白血病中对于CTA4拮抗剂的耐药性的组合物和方法。特别地，本发明涉及用于鉴别并治疗伊匹单抗耐药性白血病的组合物和方法。

Description

用于鉴别并治疗白血病中对于CTA4拮抗剂的耐药性的组合物 和方法

相关申请

基于35U.S.C.§119(e)，本申请主张2017年6月27日提交的美国临时申请62/525,401的优先权，该临时申请通过引用而整体并入本文。

技术领域

本发明涉及鉴别并治疗白血病中对于CTA4拮抗剂的耐药性的组合物和方法。更特别地，本发明涉及用于鉴别并治疗伊匹单抗(Ipilimumab)耐药性白血病的组合物和方法。

背景技术

细胞毒T淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)拮抗剂(例如，伊匹单抗(Ipilimumab))可诱导一些类型的瘤形成(例如，白血病)的持久肿瘤缓解。不幸的是，很多白血病患者对使用伊匹单抗进行的治疗不产生应答。据此，在本文所述的发明之前，亟需确定更有效的预测对于CTLA4封锁的应答和耐药性的方法。

发明内容

本发明提供用于鉴别基因表达模式的技术，其区分CTLA4拮抗剂在瘤形成(例如，白血病)中的临床结果。特别地，本文的技术提供基因表达模式/签名，其鉴别可能对使用CTLA4拮抗剂诸如伊匹单抗进行的治疗具备耐药性的白血病形式。在本文所述的发明之前，该领域技术人员不了解能精确于此对CTLA4拮抗剂的应答和耐药性的任何分子签名。

一方面，本发明提供一种确定使用细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)拮抗剂治疗患有白血病的受试者是否将导致所述受试者的临床受益的方法。该方法可包括下述步骤：从罹患白血病的受试者获得测试样本；测定该测试样本中至少一种白血病相关基因的表达水平；将该测试样本中该白血病相关基因的表达水平与参考样本中该白血病相关基因的表达水平比较；以及，通过该测试样本中该白血病相关基因的表达水平是否与该参考样本中该参考样本中该白血病相关基因的水平不同，确定给药CTLA4拮抗剂是否将抑制该受试者体内的白血病。

在一个阐释性的具体例中，测试样本可从白血病组织、肿瘤微环境或肿瘤浸润免疫细胞获得。

在一个阐释性的具体例中，受试者体内的临床受益可以是通过实体肿瘤的疗效评估标准(RECIST)界定的完全或部分应答；通过RECIST界定的病情稳定；或无论疾病级数或通过irRC标准界定的应答如何，仍长期存活。

在一个阐释性的具体例中，测试样本可从白血病获得，且白血病相关基因可以是CD47分子(CD47)基因。在这种情形下，如果测试样本中CD47基因的表达水平高于参考样本中CD47基因的水平，则使用CTLA4拮抗剂治疗患有白血病的受试者将不导致该受试者的临床受益。但是，如果测试样本中CD47基因的表达水平等于或低于参考样本中CD47基因的水平，则使用CTLA4拮抗剂治疗患有白血病的受试者将导致该受试者的临床受益。

在一个阐释性的具体例中，样本可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。样本可来自血浆样本、血液样本、骨髓样本、淋巴结、或白血病感染的任何部位。样本也可包括循环肿瘤细胞。

在一个阐释性的具体例中，该参考样本是从健康的正常组织、接受来自CTLA4拮抗剂的临床受益的白血病、或未接受来自CTLA4拮抗剂的临床受益的白血病获得的。

在一个阐释性的具体例中，可经由Affymetrix基因芯片杂交、下一代测序、核糖核酸测序(RNA-seq)、实时逆转录酶聚合酶链反应(实时RT-PCR)分析、免疫组化(IHC)、免疫荧光、或甲基化特异性PCR来检测该白血病相关基因的表达水平。

在一个阐释性的具体例中，可经由RNA-seq检测该白血病相关基因的表达水平，且该参考样本可以是从来自与该测试样本相同个体的健康正常组织或来自不同个体的一个或多个健康正常组织中获得的。

在一个阐释性的具体例中，可经由RT-PCR检测该白血病相关基因的表达水平，且该参考样本可以是从与该测试样本相同的个体获得的。

在一个阐释性的具体例中，受试者或患者可以是人类。

在一个阐释性的具体例中，该方法还可包括以化疗剂、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法或免疫疗法治疗所述受试者的步骤。该化疗剂可以是达卡巴嗪、替莫唑胺、nab-紫杉醇、紫杉醇、顺铂或卡铂、或其热议组合。

在一个阐释性的具体例中，该方法还可包含给药CD47基因的抑制剂从而治疗白血病的步骤。特别地，该抑制剂包含小分子抑制剂、RNA干扰(RNAi)、抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、适配体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、或其任意组合。在抗体或抗体片段的情形中，该抗体或片段可以部分地人源化、完全人源化、或是嵌合的。例如，该抗体或抗体片段可包括纳米抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链可变片段(ScFv)、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、Bis-scFv、微小抗体、Fab2、Fab3片段、或其任意组合。

在一个阐释性的具体例中，该方法也可包括向受试者给药抗CD47抗体从而治疗白血病的步骤。

在一个阐释性的具体例中，CTLA4拮抗剂可以是伊匹单抗。

一方面，本公开提供一种用于预测在应答CTLA4疗法中没有临床受益的组合物，所述组合物包含CD47分子(CD47)基因合成的互补脱氧核糖核酸(cDNA)。

在一个阐释性的具体例中，CD47基因可以被固定在固体支撑物上。

在一个阐释性的具体例中，CD47基因可以被链接到可检测的标记，例如荧光标记、发光标记、化学发光标记、放射性标记、SYBR、Green标记、或Cy3标记。

一方面，本公开提供一种治疗有此需要的受试者体内的癌症的方法，其可包括将治疗有效量的一种或多种CTLA4抑制剂给药至该受试者的步骤，其中该受试者可被鉴别为不具有对至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达。

在一个阐释性的具体例中，CTLA4拮抗剂可以是伊匹单抗。

在一个阐释性的具体例中，所述至少一种耐药性癌症相关基因是CD47分子(CD47)基因。

一方面，本公开提供一种治疗有此需要的受试者体内的癌症的方法，其可包括下列步骤：将该受试者鉴别为具有对至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达；以及将治疗有效量的一种或多种CTLA4抑制剂和一种或多种所述至少一种耐药性癌症相关基因的抑制剂共同给药至所述受试者，从而治疗所述癌症。

在一个阐释性的具体例中，CTLA4拮抗剂可以是伊匹单抗。

在一个阐释性的具体例中，所述至少一种耐药性癌症相关基因是CD47分子(CD47)基因。

在一个阐释性的具体例中，癌症可以是白血病。

在一个阐释性的具体例中，该一种或多种抑制剂可包含小分子抑制剂、RNA干扰(RNAi)、抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、适配体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、或其任意组合。在抗体或抗体片段的情形中，该抗体或片段可以部分地人源化、完全人源化、或是嵌合的。该抗体或抗体片段可包括纳米抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链可变片段(ScFv)、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、Bis-scFv、微小抗体、Fab2、Fab3片段、或其任意组合。

在一个阐释性的具体例中，该方法还可包括向受试者给药抗CD47抗体从而治疗白血病的步骤。

一方面，本公开提供一种试剂盒，包含用于对来自罹患癌症的受试者的生物学样本进行对至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达的分析的试剂。

在一个阐释性的具体例中，对该至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达包含对该至少一种耐药性癌症相关基因的过度表达。

在一个阐释性的具体例中，所述至少一种耐药性癌症相关基因是CD47分子(CD47)基因。

定义

除非明确指出或从语境中明显可见，否则本文中使用的术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如，处于均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所指出值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从语境中明确排除，否则本文中提供的所有数值均以术语“约”修饰。

短语“异常表达”用来指代偏离(即，增加或降低的表达水平)该基因的正常参考表达水平的表达水平。

本文中使用的术语“抗肿瘤剂”指的是，具有抑制人体内赘生物如白血病的发展或进展的功能特性的剂。对转移的抑制是抗肿瘤剂的常见性质。

“剂”意为任何小化合物、抗体、核酸分子、或肽、或其片段。

“改变”意为基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如通过该领域已知的方法如本文中揭示的那些方法所检测。如本文中所用，改变包括表达水平变化至少1％，如，表达水平变化至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，改变包括表达水平变化至少5％至10％，优选变化25％，更优选变化40％，且最优选表达水平变化50％或更高。

“缓解”意为减少、阻抑、衰减、缩减、迟滞或稳定化疾病的发展或进展。

如本文中所用，术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所希望的生物学活性即可。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”互换地使用。

“单离的抗体”是已经与其天然环境的成分单离及/或自该天然环境的成分回收的抗体。抗体天然环境的污染物组分是将会干扰该抗体的诊断性或治疗性用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。优选实施方式中，该抗体被纯化：(1)至超过95重量％的抗体，如通过Lowry方法所测，且最优选超过99重量％；(2)至足以通过使用旋杯式测序仪获得至少15个N端或内部氨基酸的残基的程度；或(3)至通过SDS-PAGE在还原或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色的同质性。单离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是由于该抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。但通常情况下，单离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。

抗体四链基本单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个该异四聚体基本单元与被称为J链的额外的肽一起组成，并因此含有10个抗原结合位点，而所分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个四链基本单元以及J链的多价组合体。在IgG的情形中，该四链单元通常为约150,000道尔顿。每一L链通过一价二硫键链接至H链，同时，两个H链依据该H链同种型而通过一个或多个二硫键彼此链接。每一H链和L链也具有规则间隔的链间二硫桥。每一H链在N端具有可变域(V_H)，对于α链和γ链，该V_H域后接着三个恒定域(C_H)，对于μ同种型和ε同种型，该V_H域后接着四个C_H域。每一L链在N端具有可变域(V_H)，接着是位于该V_H域另一端的恒定域(C_L)。V_L与V_H对准，且C_L与重链的第一个恒定域(C_H1)对准。据信，特定的氨基酸残基在轻链可变域与重链可变域之间形成界面。将V_H和V_L配对在一起形成单个抗原结合部位。对于不同类别抗体的结构和特性，见，例如，《基础和临床免疫学(第八版)》(Basic and Clinical Immunology,8th edition,DanielP.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994)第71页第6章。

基于其恒定域(C_L)的氨基酸序列，来自任何脊椎物种的L链均可分配至被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种截然不同的类型中的一种。依据其重链的恒定域(C_H)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别或同种型。存在五种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指代为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的重链。基于C_H序列和功能的相对较小的差异，该γ类和α类进一步分为多个子类，如，人类表达下述子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

术语“可变”指的是下述事实：不同抗体的V域的某些片段的序列大为不同。该V域介导抗原结合，并界定特定抗体对于其特定抗原的特异性。但是，可变性在该可变域的110个氨基酸跨度上并非均匀分布。反而该V区域由多个以被称为“高变区”的较短的极度可变区域分开的被称为构架区(FR)的相对不变的伸展段组成，该构架区为15至30个氨基酸，而每个高变区的长度为9至12个氨基酸。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，它们形成环圈连接，并在一些情形中形成该β-折叠结构的一部分。每一链中的高变区通过该FR而极为靠近地保持在一起,并与来自另一链的高变区保持在一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(见，《具有免疫学意义的蛋白质序列(第五版)》(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)))。恒定域不直接牵涉入抗体至抗原的结合中，但展现多种效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

当在本文中使用时，术语“高变区”指的是作为抗原结合的原因的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”(如，当根据Kabat计数系统计数时，V_L中大约在残基24至34(L1)、残基50至56(L2)和残基89至97(L3)左右，V_H中大约在残基31至35(H1)、残基50至65(H2)和残基95至102(H3)；《具有免疫学意义的蛋白质序列(第五版)》(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)))的氨基酸残基；及/或那些来自“高变环”(如，当根据Chothia计数系统计数时，V_L中的残基24至34(L1)、残基50至56(L2)和残基89至97(L3)，以及V_H中的残基26至32(H1)、残基52至56(H2)和残基95至101(H3)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))的残基；及/或那些来自“高变环”/CDR(如，当根据IMGT计数系统计数时，V_L中的残基27至38(L1)、残基56至65(L2)和残基105至120(L3)，以及V_H中的残基27至38(H1)、残基56至65(H2)和残基105至120(H3)；Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999)；Ruiz,M.e al.Nucl.AcidsRes.28:219-221(2000))的残基。视情况，该抗体在下述一个或多个点具有对称插入：当根据AHo；Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001)计数时，V_L中的28、36(L1)、63、74至75(L2)和123(L3)，以及V_H中的28、36(H1)、63、74至75(H2)和123(H3)。

如本文中所用，术语“单克隆抗体”指的是从基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以微量存在的可能天然出现的突变以外，包含该群体的个体抗体是相同的.单克隆抗体是高度特异性的，被引导至单个抗原位点。此外，与包括被引导至不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每一个单克隆抗体被引导至该抗原上的单一决定位。该单克隆抗体的优点除了它们的特异性之外，还在于它们可通过其它抗体无杂质地合成。修饰语“单克隆”被视为需要通过任何特定方法生产该抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过Kohler et al.,Nature,256:495(1975)中首次描述的杂种细胞方法制备，或可使用在细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法(见，例如，美国专利4,816,567)制造。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks etal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中单离。

单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中该重链及/或轻链的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定抗体类别或子类的相应序列相同或同源，同时，该链的剩余部分于源自另一物种或属于另一抗体类别或子类的相应序列相同或同源，一级此类抗体的片段，只要它们展现所希望的生物学活性即可(见，美国专利No.4,816,567；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。还提供源自人类抗体的可变域抗原结合序列。据此，本文中最感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人类抗原结合序列(如，CDR)且含有一个或多个源自非人类抗体的序列如FR或C区序列的抗体。此外，本文中最感兴趣的嵌合抗体是那些包含一个抗体类别或子类的人类可变域抗原结合序列以及源自另一抗体类别或子类的另一序列如FR或C区序列。本文中感兴趣的嵌合抗体也包括那些含有与本文中描述的那些相关或源自不同物种如非人灵长动物(如，旧大陆猴、猿等)的可变域抗原结合序列的嵌合抗体。嵌合抗体也包括灵长动物源化(primatized)抗体和人源化抗体。

而且，嵌合抗体可包含未见于接受者抗体中或供体抗体中的残基。做出这些修饰以进一步细化抗体效能。进一步的细节见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

“人源化抗体”通常认为是具有一个或多个被引入该抗体中的来自非人类来源的氨基酸残基的人类抗体。这些非人类氨基酸残基一般称为“输入”残基，它们典型取自“输入”可变域。传统上，遵循Winter及合作者的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过以输入高变区序列替换人类抗体的相应序列来实施人源化。据此，此类“人源化的”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中，实质上少于完整的人类可变域已经被替换为来自非人类物种的相应序列。

“人类抗体”是仅含有存在于由人类天然产生的抗体中的序列的抗体。但是，如本文中所用，人类抗体可包含未见于天人出现的人类抗体内的残基或修饰，包括本文所述的那些修饰和变体序列。典型地，做出这些修饰以增强抗体效能。

“完整的”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定域CH1、CH 2和CH 3的抗体。该恒定域可以是天然序列恒定域(如，人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选该完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双特异性抗体；线性抗体(见，美国专利5,641,870；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

短语抗体的“功能性片段或类似物”是具有与全长度抗体一样的定性生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物是可以一定方式结合至IgE免疫球蛋白的化合物，从而防止或实质上降低该分子具有结合至高亲和性受体Fc_εRI的能力的可能性。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的称为“Fab”片段的抗原结合片段，以及剩余的“Fc”片段，是反应易于结晶的能力的消化作用。Fab片段由整个L链连同H链的可变域(VH)、以及一条重链的第一恒定域(CH 1)组成。关于抗原位点，每一Fab片段都是单价的，即，每一Fab片段具有一个抗原结合位点。对抗体进行胃蛋白酶处理导致单个的大F(ab')2片段，该片段大致上对应于两个经二硫键链接的具有二价抗原结合活性的Fab片段，且该片段仍能交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，Fab’片段在CH1域的羧基端还具有包括来自该抗体铰接区的一个或多个半胱氨酸的少量残基。本文中，Fab'-SH指代其恒定域的半胱氨酸残基承载游离巯基的Fab’。F(ab')2抗体片段最初作为两个Fab’片段之间具有铰接半胱氨酸的成对Fab’片段而生产。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

“Fc”片段包含通过二硫键保持在一起的两个H链的羧基端部分。通过在该Fc区内的序列确定抗体的效应子功能，该Fc区也是由见于某种类型的细胞上的Fc受体(FcR)识别的部分。

“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一片段由紧密、非共价关联的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。这两种结构域的折叠产生6个高变环(从H链和L链各产生3个环)，这6个高变环贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并向抗体提供抗原结合特异性。但是，甚至单个可变域(或仅包含对于抗原为特异性的3个CDR的半Fv)也具有识别并结合抗体的能力，即使结合的亲和性低于整个结合位点。

“单链Fv”也简写为“SFv”或“scFv”，是包含连接为多肽单链的VH抗体域和VL抗体域。优选的，sFv多肽还包含位于VH域与VL域之间的多肽链接基，该链接基使得sFv能形成所希望的用于抗原结合的结构。对于sFv的回顾，见罗斯伯格(Rosenburg)和穆尔(Moore)编撰的《单克隆抗体病理学》第113卷(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994))中的Pluckthun；下文的Borrebaeck 1995。

术语“二体抗体”指的是通过下述制备的小抗体片段：构建在VH域与VL域之间具有短链接基(约5至10个残基)的sFv片段(见前述段落)，从而实现多个V域的链间而非链内的配对，得到二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性的二体抗体两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中，两个抗体的VH域和VL域存在于不同的多肽链上。二体抗体更完整地揭示于EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。

如本文中所用，“内化”抗体是在结合至哺乳动物细胞上的抗原(如，细胞表达多肽或受体)时被该细胞吸收(即，进入该细胞)的抗体。当然，内化抗体将包括抗体片段、人类或嵌合抗体、和抗体偶联物。对于某些治疗性应用，预期在体内进行内化。被内化的抗体分子数将足以或适合杀死细胞尤其是被感染的细胞或抑制该细胞的生长。依据该抗体或抗体偶联物的潜能，在一些情形中，将单一抗体分子摄取入该细胞内足以杀死该抗体所结合的靶点细胞。例如，某种毒素在杀伤方面的潜能高，使得该毒素偶联至该抗体而得的一个分子的内化足以杀死被感染的细胞。

如本文中所使用，如果抗体以可检测的水平与该抗原反应，优选其亲和常数K_a大于或等于约10⁴M^-1，或大于或等于约10⁵M^-1，或大于或等于约10⁶M^-1，或大于或等于约10⁷M^-1，或大于或等于约10⁸M^-1，则称该抗体为“免疫特异性的”、对于抗原为“特异性的”或“特异性地结合”抗原。抗体对其同源抗原的亲和性一般也表达为解离常数KD，在某些实施方式中，如果HuM2e抗体以小于或等于10^-4M、小于或等于10^-5M、小于或等于10^-6M、小于或等于10^-7M、或小于或等于10^-8M的K_D结合至M2e时，则HuM2e特异性地结合至M2e。可使用传统技术例如Scatchardet al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))中揭示的技术轻易地测定抗体的亲和性。

抗体与抗原、细胞或其组织的结合特性通常可使用免疫检测方法进行测定，该方法包括，例如，基于免疫荧光的测定如免疫组化(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS)。

具有指定抗体的“生物学特征”的抗体是具备该抗体区别于其它抗体的一种获得生物学特征的抗体。例如，某些实施方式中，具有指定抗体的生物学特征的抗体将结合与所指定抗体结合的相同表位，和/或具有如同所指定抗体一般的常见效应子功能。

术语“拮抗剂”抗体以最广泛的意义使用，且包括部分或完全地封锁、抑制或中和其特异性结合的表位、多肽或细胞的生物学活性。鉴别拮抗剂抗体的方法可包含：令被备选拮抗剂抗体特异性结合的多肽或细胞与该备选拮抗剂抗体接触，并测量正常情况下与该多肽或细胞相关的一种或多种生物学活性的可检测的改变。

抗体“效应子功能”是指那些可归因于抗体的Fc区(原生序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，并随着抗体同种型而改变。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；自体吞噬；细胞表面受体(如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。

“结合至”分子意为具有对于该分子的物理化学亲和性。

“对照”或“参考”意为比较的标准。一方面，如本文中所用，“与对照样本或受试者相比的改变”理解为具有与来自正常的、未处理的或对照样本相比的显著性差异的水平。对照样本包括，例如，培养物中、一种或多种实验室测试动物体内、或一位或多位人类受试者体内的细胞。选择和测试杜仲样本的方法处于该领域技术人员的能力之内。分析物可以是由该细胞或有机体特别地表达或产生的天然出现的物质(如，抗体、蛋白)或由受体构造产生的物质(如，β-半乳糖苷酶或荧光素酶)。依据用于检测的方法的不同，该改变的量和测量值可变。统计学显著性的确定处于该领域技术人员的能力之内，例如，构成阳性结果的与均值的标准偏差数字。

“检测”是指鉴别待检测的试剂(如，核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))的存在、不存在或量。

“可检测的标记”意为一种组合物，当链接(如，直接或间接地接合)至感兴趣的分子时，该组合物使得后者可经由例如光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。直接标记可通过将该标记链接至该分子的键或相互作用而出现；而间接标记可通过使用被直接或间接地标记的链接基或桥接部分而出现。桥接部分可放大可检测的信号。例如，有用的标记可包括放射性同位素、磁性微珠、金属微珠、胶体离子、荧光标记的化合物、高电子密度试剂、酶(例如，一般用于酶联免疫吸收试验(ELISA))、生物素、地高辛或半抗原。当将荧光标记的分子暴露于适宜波长的光时，随后可由于荧光而检测该分子的存在。最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、对苯二甲醛和荧光胺。也可使用发射荧光的金属如152Eu或其它镧系金属可检测地标记该分子。这些金属可使用金属螯合基团如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)附接至分子。也可通过将该分子偶联至化学发光化合物而可检测地标记该分子。随后，通过检测在化学反应过程中浮现的发光的存在来检测经化学发光标签的分子的存在。尤其有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、发色吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

“检测步骤”可使用多种已知方法中的任一种来检测核酸(如，甲基化的DNA)或多肽的存在。可使用探针的检测方法的类型包括西方墨点法、南方墨点法、点杂交或槽印迹、以及北方墨点法。

如本文中所用，“诊断”指的是将病理或症状归类，确定丙烯的严重性(如，阶段或分期)，监控病理学进展，预测病理结局，和/或确定修复的前景。

术语“有效量”和“治疗有效量”的配方或配方组分意为，足以提供所希望的效果的单独或组合使用的配方或组分的量。举例而言，“有效量”意为相对于未治疗患者缓解疾病如白血病症状所需的单独或组合使用的化合物的量。用来实践本发明的用于治疗性处理疾病的活性化合物的有效量可变，取决于给药模式以及受试者的年龄、体重和一般健康情况。基本上，主治医生或兽医将决定适宜的量和给药方案。这一量被称为“有效”量。

术语“表达谱”被广泛使用，包括基因组表达谱。表达谱可通过任何用于确定核酸序列水平的便利的手段生成，例如，microRNA、标记的microRNA、扩增的microRNA、互补/合成DNA(cDNA)等的定量杂交，定量聚合酶链反应(PCR)和用于定量的ELISA；并允许对两个样本见的差异性基因表达进行分析。试验了受试者或患者肿瘤样本。通过如该领域中已知的任何便利方法采集样本。根据一些实施方式，术语“表达谱”意为测量核酸序列在所测量样本的中的相对丰度。

“片段”意为多肽或核酸分子的一部分。这一部分优选地含有参考核酸分子或多肽总长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。例如，该片段包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000核苷酸或氨基酸。但是，本发明也包含多肽片段和核酸片段，只要它们分别展现全长度多肽和核酸的所希望的生物学活性即可。采用几乎任何长度的核酸片段。例如，本发明的多种实作中包括例示性的总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对长度(包括所有中间长度)的多核苷酸链段。同样，采用几乎任何长度的多肽片段。例如，本发明的多种实作中包括例示性的总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个氨基酸长度(包括所有中间长度)的多肽链段。

“杂交”意为互补核酸碱基之间的氢键键合，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)和反向胡斯坦氢键键合。举例而言，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核酸碱基。

“杂交”意为在互补多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)或其部分在多种严格条件下配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

术语“单离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指的是材料没有不同程度的在其天然状态下发现的正常伴生组分。“单离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于“单离”的分隔程度。

“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质最够不含其它材料，使得任何杂质均不在材料上影响该蛋白质的生物学性质或不造成其它负面后果。换言之，如果本发明的核酸或肽基本上在通过重组DNA技术生产时不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当化学合成时不含化学前体或其它化学品，则该核酸或肽是纯化的。典型使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高校液相色谱来测定纯度和均质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中给出实质上的一条谱带。对于可进行修饰如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可给出可分开纯化不同的单离的蛋白。

同样，“基本上纯的”意为已经与其天然伴随组分分离的核苷酸或多肽。典型地，以重量计，当核苷酸和多肽的至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％不含其天然关联的蛋白质和天然出现的有机分子时，则该核苷酸和多肽是基本上纯的。

“单离的核酸”意为核酸不含在该核酸所源自的有机体的天然出现的基因组中位于该核酸侧翼的基因。该术语覆盖，举例而言：(a)一种DNA，其作为天然出现的基因组DNA的一部分但侧翼没有在其天然来源的有机体基因组中位于该分子侧翼的两个核酸序列；(b)一种核酸，其被以使得所得分子与天然出现的载体或基因组DNA不同的方式并入载体或原核细胞或真核细胞的基因组DNA内；(c)一种独立分子，如合成cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)生产的片段、或限制酶断片；以及(d)一种重组核苷酸序列，其是杂合基因即编码融合蛋白的基因的一部分。根据本发明的单离的核酸分子进一步包括通过合成生产的分子，以及已经在化学上改变和/或具有经修饰的骨架的任何核酸。例如，单离的核酸是纯化的cDNA或RNA多核苷酸。单离的核酸分子也包括信使核糖核酸(mRNA)分子。

“单离的多肽”意为已经与其天然伴随组分分离的本发明的多肽。典型地，以重量计，当多肽的至少60％不含其天然关联的蛋白质和天然出现的有机分子时，则该多肽是单离的。优选该制剂含有至少75重量％、更优选至少90重量％、最优选99重量％的本发明的多肽。可通过例如从天然来源提取、编码多肽的重组核酸的表达、或化学合成蛋白质来获得本发明的单离的多肽。可通过任何适宜的方法例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。

术语“固定化”或“附接”指的是探针(如，核酸或蛋白质)和固体支撑物，其中该探针与固体支撑物之间的结合在结合、洗涤、分析和移除的条件下足够稳定。该结合可以是共价的或非共价的。共价键可在该探针与该固体支撑物之间直接形成，或可通过交联剂或通过将具体反应性基团包合在该固体支撑物上或该探针上或两种分子上而形成。非共价结合可以是静电相互作用、亲水作用和疏水作用中的一种或多种。非共价结合中包括分子至支撑物的非共价附接和生物素化的探针至该分子的非共价结合。固定化也可牵涉共价相互作用和非共价相互作用的组合。

“标记物”意为任意蛋白质或多核苷酸，其在表达水平或活性上有与疾病或病变如白血病相关的改变。

“调整”意为改变(增加或降低)。通过该领域已知的标准方法如本文中揭示的那些来检测此类改变。

术语“正常量”指的是复合物在已知未诊断患有白血病的个体体内的正常量。可使用诸如参考限、检测限、或风险界定阈值的技术测量测试样本中该分子的量并与“正常对照水平”比较，以界定截留点和不正常的数值(如，对于白血病)。“正常对照水平”意为典型见于已知未苦于白血病的受试者体内的一种或多种蛋白质(或核酸)的水平或组合蛋白指数(若组合核酸指数)。基于分子是否单独使用或在与其它蛋白质组合的配方中使用，此类正常对照水平和截留点可变并组成索引。作为另一种选择，该正常对照水平可以是来自先前测试的在临床相关时间范围内未转换为白血病的受试者的蛋白谱的数据库。另一方面，正常对照水平可以是相对于看家基因的水平。

所测定的水平可以与对照水平或截留水平或阈值水平相同，或可以相对于对照水平或截留水平或阈值水平增加或降低。一些方面，该对照受试者是相同物种、性别、民族、年龄组、吸烟状态、体重指数(BMI)、当前治疗方案状态、医疗史、或其组合的匹配对照，但与被诊断的受试者的不同之处为对照受试者未苦于所探究的疾病或未处于该疾病的风险下。

相对于对照水平，所测定的水平可以是增加的水平。如本文中所用，关于水平(如，表达水平、生物学活性水平等)的术语“增加的”指的是高于对照水平的任意％增加。该增加的水平可以是，相对于对照水平，至少或约1％增加、至少或约5％增加、至少或约10％增加、至少或约15％增加、至少或约20％增加、至少或约25％增加、至少或约30％增加、至少或约35％增加、至少或约40％增加、至少或约45％增加、至少或约50％增加、至少或约55％增加、至少或约60％增加、至少或约65％增加、至少或约70％增加、至少或约75％增加、至少或约80％增加、至少或约85％增加、至少或约90％增加、或至少或约95％增加。

相对于对照水平，所测定的水平可以是减少的水平。如本文中所用，关于水平(如，表达水平、生物学活性水平等)的术语“减少的”指的是高于对照水平的任意％减少。该减少的水平可以是，相对于对照水平，至少或约1％减少、至少或约5％减少、至少或约10％减少、至少或约15％减少、至少或约20％减少、至少或约25％减少、至少或约30％减少、至少或约35％减少、至少或约40％减少、至少或约45％减少、至少或约50％减少、至少或约55％减少、至少或约60％减少、至少或约65％减少、至少或约70％减少、至少或约75％减少、至少或约80％减少、至少或约85％减少、至少或约90％减少、或至少或约95％减少。

可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％一致，但典型将展现统计学一致性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致性。具有与内源性序列“基本一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。

举例而言，严格的盐浓度一般为少于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选少于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选少于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格度杂交可在有机溶剂如甲酰胺不存在下获得，而高严格度杂交可在至少约35％甲酰胺且更优选至少约50％甲酰胺的存在下活儿。严格的温度条件一般将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，且最优选至少约42℃的温度。可变的附加因素，如杂交时间、洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及包含或不饱和载体DNA，是该领域技术人员所周知的。通过按需要组合这些多种条件来实施各种水平的严格度。在优选的实施方式中，杂交将出现在30℃的750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中。在更优选的实施方式中，杂交将出现在37℃的500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中。在最优选的实施方式中，杂交将出现在42℃的250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中。对这些条件的有用改变对于该领域技术人员是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也将改变。可通过盐浓度和温度来界定洗涤严格度条件。如上，可通过降低盐浓度或增加温度来增加洗涤严格度。举例而言，洗涤步骤的严格的盐浓度优选为少于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选少于约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，且甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将出现在25℃的30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将出现在42℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将出现在68℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。对这些条件的额外改变对于该领域技术人员是显而易见的。杂交技术是该领域技术人员所周知的，且揭示在例如Bentonand Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques,1987,Academic Press,New York)；以及Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中。

“瘤形成”意为以过度增殖或细胞凋亡减少为特征的疾病或病症。本发明可应用的例示性的瘤形成包括，但不限于，胰腺癌、白血病(如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性原始粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金症、非霍奇金症)、华氏巨球蛋白血症、重链病、以及实体瘤如肉瘤和癌(如，纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、伊文斯肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。

如本文中所用，一方面，“下一代测序”(NGS)，也称为高通量测序，是用来描述大量不同测序方法的笼统术语，该测序方法包括但不限于，

测序、Roche454sequencing^TM、Ion torrent^TM、质子/个人化操作基因组测序仪(Proton/personalgenome machine(PGM))测序、以及SOLiD测序。这些近期的方法令DNA和RNA的测序比先前使用的Sanger测序更快且更便宜。见，LeBlanc et al.,2015Cancers,7:1925-1958，通过引用并入本文；以及Goodwin et al.,2016Nature Reviews Genetics,17:333-351，通过引用并入本文。

如本文中所用，如“获得一剂”中的“获得”包括合成、购买或以其它方法取得该剂。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“或”理解为包含的。除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“一(a)”、“一(an)”和“该”理解为单数或复数。

短语“药学可接受的载剂”是该领域中公认的，且包括适用于将本发明的化合物给药至哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或媒介物。载剂包括牵涉入将所测试的剂从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一器官或身体的一部分的液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化材料。就与配方中其它成分可相容且不对患者造成伤害而言，每种载剂应是“可接受的”。可用作药学可接受的载剂的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓蜡；油类，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其它用于药物配方中的非毒性可相容物质。

“蛋白质”或“多肽”或“肽”意为任何超过2个天然或非天然氨基酸的链，无论其是否具有翻译后修饰(如，糖基化或磷酸化)，其构建天然出现或非天然出现的多肽或肽的全部或一部分，如本文中所述。

“引物组”意为一组可用于例如PCR的寡核苷酸。引物组将由至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600或更多个引物组成。

术语“预防”(动词和名词)是指将剂或组合物给药至处于发展出、易患、或倾向于具有特定负面症状、病症或疾病风险下的临床上无症状的个体，且因此涉及防止症候和/或其根本肇因的出现。

术语“进展”、“分期”和“侵略性的确认”在本文中定义为对瘤形成如白血病及其演变的严重程度以及修复前景的预测，如从该疾病的一般病程所预计的。一旦侵略性(如，Gleason得分)得以确认，就选择适宜的治疗方法。

本文中，范围可表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当此范围被表达时，另一方面包括从该一个特定值和/或到该另一个特定值。同样，当数值通过前缀“约”表达为大约数时，应理解为该特定数值形成另一方面。还应理解，每一范围的端点均明显与另一端点相关，且独立于该另一端点。也应理解，本文中揭示了大量值，而每一值除了其自身值外，在本文中也揭示为“约”该特定值。也应理解，贯穿本申请，数据提供为不同的格式，且这一数据代表端点和起始点以及该数据点的任意组合的范围。例如，如果揭示了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则理解为大于、大于或等于、小于、小于或等于、以及等于10和15的值以及10与15之间的值也视为被揭示。也应理解，还揭示两个特定单位之间的每一单位。例如，如果10和15被揭示，则11、12、13和14页被揭示。

本文中提供的范围理解为该范围内所有值的略写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的组的任意数字、数字组合或子范围以及前述整数之间的所有中间的十分位小数如，举例而言，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于“子范围”，尤其预期从该范围的任一端延伸的“嵌套子范围”。例如，例示性范围1至50的嵌套子范围可包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，以及在另一方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。

“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变。

“参考序列”是用作序列比对或基因表达比对基础的界定序列。参考序列可以是特定序列的一部分或整体；例如，全长度cDNA或基因序列的连段、或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常为只杀约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，且甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度将通常为至少约40个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，且甚至更优选约100个核苷酸或约300个或约500个核苷酸或与之接近或之间的任何整数。

如本文中所用，术语“样本”是指以用于体外评估目的获得的生物学样本。用于本文所述方法的例示性的组织样本包括来自白血病肿瘤或周围微环境(即，间质)的组织样本。关于本文中揭示的方法，样本或患者样本优选可包含任何体液或组织。一些实施方式中，体液包括但不限于，从受试者获得的血液、血浆、血清、淋巴、乳汁、唾液、黏液、精液、阴道分泌物、细胞提取物、炎症性积液、脑脊液、粪便、玻璃体液或尿液。在一些方面，样本是血液样本、血浆样本、血清样本和尿液样本的至少两种的复合组。在例示性的方面，样本包含需要或其成分(如，血浆、血清、经由白细胞去除法获得的部分)。优选的样本是全血、血清、血浆或尿液。样本也可以是组织或体液的经部分纯化的成分。

参考样本可以是“正常”样本，其来自未罹患疾病或病症的供体的体液，或来自罹患疾病或病症的受试者的正常组织。参考样本也可以来自未经治疗的供体或未经活性剂处理的细胞培养物(如，未经处理或仅给药媒介物)。参考样本也可以是在令细胞或受试者与待测试的剂或治疗性干预接触之前的“零时间点”取得，或在前瞻研究开始时取得。

“固体支撑物”描述条带、聚合物、微珠或纳米粒子。条带可以是涂覆有核酸探针(或蛋白质)的多孔或无孔固体支撑物条带，其包含将核酸探针链接至载体以制备偶联物并将该偶联物固定在多孔固体支撑物上。周知的支撑物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长石和磁铁矿。对于本发明的目的，载体的特性可以是在一定程度上可溶或不可溶。支撑物材料可以具有几乎任何可能的结构配置，只要偶联分子能结合至结合剂(如，抗体或核酸分子)即可。因此，该支撑物配置可以是球形如微珠、或筒状如测试管的内表面、或棒的外表面。作为另一种选择，表面可以是平坦的，如片、测试带等。例如，支撑物包括聚苯乙烯微珠。该领域技术人员将知悉多种其它适用于结合抗体或抗原的载剂，或将能使用常规实验而确定该载剂。在其它方面，固体支撑物包含聚合物，其中，剂化学键合、固定、分散或关联至该聚合物。聚合物支撑物可以是聚合物网，且可制备为微珠形式(如，通过悬浮聚合)。被引入聚合物支撑物中的活性位点的位置取决于聚合物支撑物的类型。例如，在膨胀型凝胶微珠聚合物支撑物中，活性位点均匀地分布在整个微珠上，而在大孔微珠聚合物支撑物中，活性位点主要位于大孔的内表面上。固体支撑物如装置，仅含有结合剂或含有结合剂以及用于至少1、2、3或4个其它分子的另一结合剂。

“特异性结合”意为化合物或抗体识别并结合本发明的多肽，但基本上不识别并结合天然地包括本发明多肽的样本如生物学样本中的其它分子。

“特异性结合剂”描述了对于靶标分子的亲和性超过10倍于、优选超过100倍于、且最优选超过1000倍于另一分子的剂。如该领域技术人员将知晓的，术语“特异性”用来指示样本中存在的其它生物分子并不显著结合至对于靶标分子为特异性的结合剂。优选的，与除靶标分子之外的生物分子的结合水平导致结合亲和性为与靶标分子亲和性的至多仅10％或更低，仅5％或更低，仅2％或更低，或仅1％或更低。优选的特异性结合剂将满足亲和性和特异性两者的上述最低标准。例如，对于其特异性靶标分子，抗体具有低至毫摩尔(10^-6)、纳摩尔(10^-7至10^-9)的结合亲和性范围，而高亲和性抗体的这一范围是低至纳摩尔(10^-9)或皮摩尔(10^-12)。

“基本相同”意为多肽或核酸分子展现与参考氨基酸序列(例如，任何一种本文所述的氨基酸序列)或核酸序列(例如，任何一种本文所述的核酸序列)的至少50％一致性。优选的，此序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致。

通常使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心的遗传学计算机公司(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。该软件通过设定多种替换、删除、及/或其它修饰的同源性程度来匹配一致或相似的序列。保守替换典型包括下述各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在例示性的测定一致性程度的途径中，可使用BLAST程序，其中介于e^-3与e^-100之间的可能性得分指示密切相关的序列。

如本文中所用，术语“受试者”包括被证实苦于所示病症的动物王国所有成员。在一些方面，受试者是哺乳动物，而在一些方面，受试者是人。该方法也应用于陪伴性动物如狗和猫，以及家畜如牛、马、绵羊、山羊、猪和其它驯养动物和野生动物。

“苦于或疑似苦于”特定疾病、病症或症状的受试者具有足够数量的风险因子或呈现出足够数量的疾病、病症或症状的剂型或症状或其组合，使得有能力的个体诊断或怀疑该受试者苦于疾病、病症或症状。鉴别苦于或疑似苦于癌症(如白血病)相关病症的受试者的方法处于该领域技术人员的能力之内。苦于和疑似苦于特定疾病、病症或症状的受试者不一定是两个不同的组。

如本文中所用，“被怀疑为”或“被证实为”或“被诊断为”特定疾病或病症或“处于发展特定疾病或病症的风险之下”是指，基于遗传学、环境、健康和/或其它风险因子，个体比一般人群更可能发展出疾病或病症。发展出疾病的可能性的增加可以是约10％、20％、50％、100％、150％、200％或更高的增加。

如本文中所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指将剂或配方给药至患有负面症状、病症或疾病的由临床症状的个体，以实现症候严重性和/或频率的降低、消除症候和/或其基础肇因、和/或促进对损伤的改善或补救。应知晓，尽管未排除，但治疗病症或症状并不需要完全消除与该病症或症状相关的病症、症状或症候。

如本文中所用，一方面，“肿瘤微环境”(TME)是肿瘤存在的细胞环境，包括周围的血管、免疫细胞、纤维原细胞、骨髓源炎症细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ECM)。肿瘤与周围微环境是紧密相关的且时常相互作用。肿瘤可通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受而影响微环境，同时该微环境内的免疫细胞可影响癌细胞的生长和进化，如在免疫编辑中。

在一些情况下，本发明的组合物口服给药或全身给药。其它给药途径包括直肠给药、外用给药、眼内给药、口含给药、阴道给药、脑池内给药、脑室内给药、气管内给药、鼻腔给药、透皮给药、移植物内/上给药、或肠道外途径给药。术语“肠道外”包括皮下、鞘内、静脉内、肌肉内、腹膜内、或输注。静脉内和肌肉内途径并不特别适用于长期治疗和预防。但它们在紧急情况下是优选。包含本发明组合物的组合物可加至生理学流体如血液中。对于预防性治疗，口服给药可能是优选，这是因为对于患者以及给药方案来说具有便利性。肠道外形式(皮下或静脉内)对于更急性的病情或由于胃肠道不耐受、肠梗阻不能忍受经肠给药的患者或其它病危患者来说可能是优选。对于肺血管疾病(如，肺动脉高血压)，吸入疗法是最适宜的。

药物组合物可组装在制剂和或药物系统中，用于制止快速分化细胞如癌细胞的细胞循环。根据本发明这一方面的试剂盒或药物系统包含载剂单元如盒、箱、管，其内部严格限制有一个或多个容器单元如小瓶、管、安瓿、瓶、注射器或袋。本发明的试剂盒或药物系统也可包含相关的该试剂盒使用说明书。

本文中提供的任何组合物或方法可与本文中提供的一种或多种任何其它组合物和方法组合。

在适用或并未明确否认的情况下，预期本文所述的任一具体例能与任何其它一个或多个具体例组合，即便这些具体例在本发明的不同方面下描述。

这些和其它具体例为下述具体实施方式所公开和/或涵盖。

附图说明

下述具体实施方式以示例途径给出，而非试图将本发明唯一地限制为所述具体具体例，联合附图可最佳地理解该具体实施方式，在附图中：

图1A和图1B显示在使用单剂量的伊匹单抗治疗之前(图1A)和之后(图1B)，与白血病皮肤表现相关的皮肤损害的摄影图片。图1C和图1D显示治疗之前(图1C)和之后(图1D)，皮肤损害的组织学染色组织切片。

图2说明了癌症免疫循环的示意图，这是描述在有效的抗癌免疫应答生成过程中出现的迭代步骤的理论建构。

图3显示柱状图，其说明在有应答肿瘤和无应答肿瘤两者中在伊匹单抗治疗后对免疫细胞转运做出应答的基因的表达的增加，如通过治疗前后表达水平的差异所指示。左轴和右轴均显示基因表达的单位：每百万读数中的转录物数目(TPM)，这是用来从RNA测序数据测量基因表达单位的标准(Li B,et al.Bioinformatics 26:4 2010)。右轴为CXCL9和CXCL10基因表达的按比例缩放；而左轴描述CCL3、CCL4、CCR5和CX3L1。左侧两个治疗前/治疗后标记对应于单一患者(具有生物复制样本/穿刺样本；黑色)，且绿色标记对应于第二位具有完全应答的患者。测试以下基因的表达水平：C-X-C基序趋化因子配体9(CXCL9；显示为黑色)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10；显示为橙色)、C-C基序趋化因子配体3(CCL3；显示为褐红色)、C-C基序趋化因子配体4(CCL4；显示为紫色)、C-C基序趋化因子受体5(CCR5；显示为蓝色)和C-X3-C基序趋化因子配体1(CX3CL1；显示为绿色)。如柱状图中可见，复发患者体内的伊匹单抗治疗前的肿瘤具有非常高的趋化因子“发炎(inflamed)”基线，其在伊匹单抗治疗后的复发肿瘤中得以下调。

图4为柱状图，其显示在伊匹单抗治疗后，有应答肿瘤和无应答肿瘤两者中可对通过血管内皮细胞进行的免疫细胞转运产生应答的基因的增加。左轴和右轴均显示基因表达的单位：每百万读数中的转录物数目(TPM)，这是用来从RNA测序数据测量基因表达单位的标准(Li B,et al.Bioinformatics 26:4 2010)。右轴为ICAM1和VCAM1基因表达的按比例缩放。左侧两个治疗前/治疗后标记对应于单一患者(具有生物复制样本/穿刺样本；黑色)，且绿色标记对应于第二位具有完全应答的患者。测试以下基因的表达水平：细胞间黏附分子1(ICAM1；显示为黑色)和血管细胞黏附分子1(VCAM1；显示为灰色)。如柱状图中可见，复发患者体内的伊匹单抗治疗前的肿瘤具有非常高的趋化因子“发炎”基线，其在伊匹单抗治疗后的复发肿瘤中得以下调。

图5为六张柱状图，其显示分别对应于T细胞、B细胞和巨噬细胞的特异性免疫子群体的基因表达模式。使用伊匹单抗治疗后，T细胞中的CD8A表达增加，B细胞和浆细胞中的CD20和CD138表达分别增加，且巨噬细胞中的MRC1和CD163以及趋化素表达增加。但是，在无应答患者体内，CD8+表达的增加(蓝色柱)仅见于使用伊匹单抗治疗后的T细胞中。在复发的情况下，所有细胞类型(即，T细胞、B细胞和巨噬细胞)均下调(红色柱)。

图6为分别显示在有应答患者、复发患者和无应答患者体内的巨噬细胞免疫逃逸的图。分析CD47表达以评估巨噬细胞防御能力。如图所示，三种耐药性肿瘤(“复发(Rel)”、“治疗前(Pre)”和“来自无应答患者的治疗后”)是CD7表达水平最高的，且它们也是巨噬细胞基因表达最低的。

图7为两张显示评估通过T细胞识别白血病的数据的图。如左图所示，有应答患者与表达T细胞受体基因如CD3E、CD3D、CD3G和CD247的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达。同样，有应答患者与表达信号传导基因如LCK、ITK和ZAP70的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达(右图)。复发类别与T细胞受体基因和信号传导基因两者的下调相关联。

图8为两张显示评估通过T细胞活化的数据的图。如左图所示，有应答患者与表达共抑制受体基因如CTLA4、LAG3、TIGIT、HAVCR2和PD1的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达。同样，有应答患者与表达共刺激受体基因如ICOS、CD28和CD27的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达(右图)。

图9为显示评估T细胞是否被活化且为溶细胞性的数据的图。有应答患者与表达CD8A和穿孔素(PRF1)的T细胞相关联，表明他们的肿瘤正在被溶细胞性的且具有杀死能力的CD8 T细胞浸润。在伊匹单抗治疗后的无应答患者体内，尽管CD8 T细胞到达肿瘤，但这些T细胞不是溶细胞性的，如通过PRF1基因表达缺乏所证实。

图10说明了在有应答患者体内进行伊匹单抗治疗之前7天(左图)和12天(右图)的免疫组化染色。染色数据显示，在伊匹单抗治疗后，CD8 T细胞进入肿瘤内(例如，PRF1染色)，并且接触并杀死多个肿瘤细胞。

具体实施方式

本发明至少部分地基于对基因表达模式的鉴别，其区分CTLA4拮抗剂在瘤形成(例如，白血病)中的临床结果。特别地，本文的技术提供基因表达模式/签名，其鉴别可能对使用CTLA4拮抗剂诸如伊匹单抗进行的治疗具备耐药性的白血病形式。在本文所述的发明之前，该领域技术人员不了解能精确于此对CTLA4拮抗剂的应答和耐药性的任何分子签名。

伊匹单抗是FDA批准的以CTLA4通路为靶向的抗体。伊匹单抗在白血病治疗中显示整体存活受益，且可在一些患者体内诱导持久的缓解。但是，很多白血病患者对伊匹单抗治疗不产生应答，因为它们具有对CTLA4拮抗剂的耐药性。在本文所述的本发明之前，没有预测临床结局的方法。因为伊匹单抗携带显著的抗免疫毒性，预测其将受益或将无受益在临床上具有关键的重要性。伊匹单抗落在被批准的更新、更低毒性免疫疗法的临床用途之外；但仅使用这一剂时可获得长期生存数据。因此，本文中呈递的结果允许将CTLA4封锁疗法与适宜的患者精确配对，并确定某些患者是否可以从联合疗法(例如，伊匹单抗和CD47抗体)中受益。

白血病

当身体内的细胞开始不受控制的生长时，癌症开始。几乎身体的任何部位内的细胞均可变为癌，且可随后扩散至身体的另一区域(例如，转移)。白血病是指一组通常始于骨髓的癌症。白血病往往导致大量的未完全发育的不正常白细胞(例如，原始细胞或白血病细胞)。白血病的症状可包括出血和淤伤、疲倦、发热、以及增加的感染风险，且往往是由于正常血液细胞的缺乏。典型通过血液测试或骨髓穿刺进行诊断。不同类型的白血病可具有不同肇因，但可牵涉遗传性和环境性两种风险因素。

存在四种类型的白血病：1)急性淋巴细胞白血病(ALL)、2)急性粒细胞白血病(AML)、3)慢性淋巴细胞白血病(CLL)和4)慢性粒细胞白血病(CML)。白血病和淋巴瘤都属于广义上的影响血液、骨髓和淋巴系统的肿瘤，作为造血和淋巴组织的肿瘤为人所知。具体类型的白血病可包括但不限于下列：

急性淋巴细胞白血病(ALL)是婴幼儿中最常见的白血病类型，但也影响成年人尤其是65岁(含)以上者。标准治疗包括化疗和放疗，且存活率随年龄而不同：儿童为85％，成年人为50％。亚型包括前体B细胞急性淋巴细胞白血病、前体T细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特白血病(Burkitt's leukemia)和急性混合型白血病。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)最常影响超过55岁的成年人。它极少影响儿童。三分之二的被影响人群为男性。五年存活率为75％。它是不可治愈的，但存在多种有效治疗。B细胞幼淋巴细胞白血病是CLL的一种亚型，是更具攻击性的疾病。

急性骨髓性白血病(AML)在成年人中的出现概率大于儿童，且男性中的出现概率大于女性。它通常使用化疗治疗。五年生存期为40％，但急性早幼粒细胞白血病(APL)除外，它的存活率超过90％。AML的亚型包括急性早幼粒细胞白血病、急性髓细胞性白血病和急性原巨核细胞白血病。

慢性骨髓性白血病(CML)主要出现在成年人中，但非常少量的儿童也可能发展出CML。CML往往使用伊马替尼(imatinib)(格列卫，在美国为Gleevec，欧洲为Glivec)或其它药物治疗，五年存活率为90％。慢性粒单核细胞白血病是CML的亚型。

毛细胞白血病(HCL)有时也视为慢性淋巴细胞白血病的子集。超过80％的被影响人群为成年男性，且迄今为止，尚未有儿童病例被报导。HCL是不可治愈的，但易于治疗。十年存活率为96％至100％。

T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)非常罕见，是极具攻击性的成年人白血病。尽管总体上比较罕见，但它是最常见的成熟T细胞白血病类型，其它白血病几乎全部牵涉B细胞。它难以治疗，且平均存活期短(例如，几个月)。

大颗粒淋巴细胞白血病可能牵涉T细胞或NK细胞。这一形式的白血病罕见且不是特别有攻击性。

成年人T细胞白血病由人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)造成，该病毒类似于HIV。HTLV感染CD4+T细胞并在该细胞内复制，但它并不摧毁该T细胞。反之，HTLV将所感染的T细胞“不灭”，赋予其不正常增殖的能力。I型和II型人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV-I/II)在世界某些区域内流行。

大多数形式的白血病使用药物典型与多药物化疗方案联合治疗。一些也使用放疗进行治疗。一些情况下，骨髓移植是有效的。

CTLA-4封锁

CTLA4或CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152(分化簇152)，是一种蛋白受体，其用作免疫检查点并下调免疫应答。CTLA4被组成性地表达在T调节细胞(Treg)中，但仅在激活后的常规T细胞中得以上调。当CTLA4结合至抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86时，CTLA4用作“关闭”开关。最近的报导建议，封锁CTLA4(使用CTLA的拮抗性抗体，如伊匹单抗)导致了治疗性受益。CTLA4封锁抑制了免疫系统对于肿瘤的耐受性，并提供可用于癌症患者的有用的免疫治疗策略。见，例如，Grosso J.and Jure-Kunkel M.2013,CancerImmun.,13:5，通过引用并入本文。

伊匹单抗是一种CTLA-4特异性的全人单克隆抗体，改善转移性黑素瘤患者的整体生存(Ji et al.,2012Cancer Immunol Immunother,61:1019-1031，通过引用并入本文)。事实上，导向对抗CTLA4的单克隆抗体如伊匹单抗，通过抑制检查点活性而令患有转移性黑素瘤的患者获得相当大的临床受益；但在本文所述的发明之前，对这些疗法的应答的临床预测没有完全表征(Van Allen,et al.,2015Science,350(6257):207-211，通过引用并入本文)。也见，Snyder et al.,2014The New England Journal of Medicine,373(20):1984，通过引用并入本文。

世界卫生组织(WHO)的标准

用于评估抗癌剂对于肿瘤收缩的有效性的WHO标准，由国际抗癌联盟和世界卫生组织在1970年代提出，是第一项用于肿瘤应答评估规范的普遍认可的具体标准。这些标准在1981年首次公布(Miller et al.,1981Clin Cancer Res.,47(1):207-14，通过引用并入本文)。WHO标准规定，>50％的肿瘤收缩为部分应答，而>25％的肿瘤增长为进行性疾病。

实体肿瘤疗效评价标准(RECIST)

RECIST是一套已公布的规则，其界定治疗过程中癌症患者体内肿瘤的改善(“应答”)、维持原状(“稳定化”)或恶化(“发展”)(Eisenhauer et al.,2009European Journalof Cancer,45:228-247，通过引用并入本文)。仅应将具有在基线可测量的疾病的患者包括在协议中，其中客观肿瘤应答是主要疗效指标。

用于评估靶点病灶的应答标准如下：

·完全应答(CR)：靶点病灶全部消失。

·部分应答(PR)：靶点病灶的最长直径(LD)之和减少至少30％，取基线总和LD为参考。

·病情稳定(SD)：既没有定性为PR的足够收缩，也没有定性为PD的足够增长，取从治疗开始以来的最小总和LD为参考。

·疾病发展(PD)：靶点病灶的LD之和增加至少20％，取自治疗开始以来记录的最小总和LD为参考或出现一个或多个新病灶。

用于评估非靶点病灶的应答标准如下：

·完全应答(CR)：非靶点病灶全部消失和肿瘤标记物水平的正常化。

·不完全应答/病情稳定(SD)：一个或多个非靶点病灶顽固存在或/和肿瘤标记物水平维持在高于正常的限制上。

·疾病发展(PD)：一个或多个新病灶的出现和/或现有非靶点病灶的明确发展。

用于评估最佳整体应答的应答标准如下：最佳整体应答是从治疗开始直至疾病发展/复发为止所记录的最佳应答(取自治疗开始以来记录的PD最小测量值为参考)。通常，患者的最佳应答评价将取决于测量和确认标准的达成。

·整体健康状况恶化但没有客观的疾病发展证据而需要终止治疗的患者应归类为具有“症状性恶化”。甚至在治疗终止之后，仍做出每一种尝试以记录客观发展。

·在一些情况下，可能难以区分残留疾病和正常组织。当完全应答的评估取决于这一决定时，有人推荐采用被考核的残留病灶(细针抽吸或生物活检)来证实完全应答状态。

免疫相关应答的标准

免疫相关应答标准(irRC)是一套已公布的规则，其界定治疗过程中癌症患者体内肿瘤的改善(“应答”)、维持原状(“稳定化”)或恶化(“发展”)，其中被评估的化合物是免疫肿瘤学药物。免疫相关应答标准在2009年首次公布(Wolchok et al.,2009Clin CancerRes,15(23):7412，通过引用并入本文)，它的出现缘于下述观察：在使用WHO或RECIST标准测量时，免疫肿瘤学药物在临床试验中失败，因为这些标准不能对多位患者在开始治疗与免疫系统明显起作用以降低肿瘤负载之间的时间差负责。在irRC研发中的关键驱动是下述观察：在对多种源自免疫系统的癌症疗法如细胞因子和单克隆抗体的研究中，所寻找的完全应答、部分应答以及病情稳定仅在肿瘤负载增加后出现，而肿瘤负载增加在传统的RECIST标准中被称为“病情发展”。RECIST没有考虑到给药与所观察的抗肿瘤T细胞应答之间的延迟，使得“成功的”药物即最终延长生命的药物在临床试验中反而失败。

irRC基于WHO标准，但对肿瘤负载的测量和对免疫相关应答的评价已经如下文所详述而做出修改。

对肿瘤负载的测量

在irRC中，通过将“指标”病灶与新病灶合并而测量肿瘤负载。通常，使用有限数量的基线“指标”病灶(换言之，最大的可鉴别的病灶)和在被视为“病情发展”的后续时间点鉴别的新病灶来测量肿瘤负载。相比之下，irRC中，新病灶是肿瘤负载的改变。irRC保留最初在WHO标准下不计入的病灶的二维测量值。

免疫相关应答的评价

在irRC中，免疫相关完全应答(irCR)是已测量的或未测量的病灶全部消失且没有新病灶；免疫相关部分应答(irPR)是肿瘤负载与基线相比降低50％，如irRC所界定；以及，免疫相关病情发展(irPD)是肿瘤负载与所记录的最低水平相比增加25％。其它所有情况均视为免疫相关病情稳定(irSD)。即使肿瘤负载一直在升高，免疫系统似乎在第一次给药后的几个月内“生效(kick in)”并在多位患者体内导致肿瘤负载的最终下降。关于这一明显的延迟，赋予25％阈值。

基因表达谱

通常，基因表达谱的方法可分为两大类：基于多核苷酸的杂交分析的方法，以及基于多核苷酸测序的方法。该领域中已知的用于将样本中mRNA表达定量的方法包括北方印迹法和原位杂交、RNAse保护分析、RNA-seq、以及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。作为另一种选择，采用是被特异性双螺旋的抗体，该双螺旋包括DNA双螺旋、RNA双螺旋、以及DNA-RNA杂交双螺旋或DNA-蛋白质说螺旋。基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达系列分析(SAGE)和通过大规模平行签名测序(MPSS)进行的基因分析。例如，使用RT-PCR来比较经过或未经过治疗的不同样本群体的正常组织和肿瘤组织内的mRNA水平，以表征基因表达模式、区分密切相关的mRNA、和/或分析RNA结构。

一些情况下，通过RT-PCR进行的基因表达谱的第一步是将RNA模板逆转录为cDNA，之后在PCR反应中扩增。例如，使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer,Calif.,USA)，遵循制造商的使用说明书，逆转录所提取的RNA。随后，该cDNA在使用例如TaqMan RTM(LifeTechnologies,Inc.,Grand Island,N.Y.)分析的后续PCR扩增和定量分析中用作模板。

微阵列

也可使用微阵列技术鉴别或证实差异性基因表达。在这些方法中，将待检测的多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)置于微阵列芯片基板上的板内或阵列内。随后，使用来自待检测的细胞或组织的特异性DNA探针杂交被置于阵列内的序列。正如RT-PCR方法，mRNA的来源通常为从人类肿瘤或肿瘤细胞以及相对应的正常组织或细胞系中单离的总RNA。因此，从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系单离RNA。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，则从冷冻的或存档的组织样本中提取mRNA。

在微阵列技术中，将PCR扩增的cDNA克隆体插入物以致密阵列方式应用到基板。被固定在微阵列芯片上的微阵列化的基因，适用于在严格条件下的杂交。

一些情况下，通过将从待检测的组织(如，白血病组织)提取的RNA逆转录来合并荧光核苷酸，从而生成荧光标记的cDNA探针。被施加到芯片上的标记的cDNA探针特异性地杂交至该阵列中的DNA的基因组。洗涤去除非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜扫描或通过另一检测方法如电荷耦合装置(CCD)相机来扫描芯片。通过对每一阵列化的元件的杂交的定量，评价相对应的mRNA丰度。

在一些配置中，使用双色荧光。通过使用双色荧光，从两个来源的RNA生成的单独标记的cDNA探针成对地杂交至阵列。因此，同步测定来自两个来源的对应于每一特异性基因的转录本的相对丰度。多种配置中，缩小规模的杂交可提供对大量基因表达谱的方便且快速的评估。多种配置中，此类方法可具有检测稀有转录本所需的灵敏度，该转录本以每细胞少于1000、少于100或少于10个拷贝的水平被表达。多种配置中，此类方法可检测表达水平的至少约2倍差异(Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2):106-149(1996))。多种配置中，通过可商购的设备遵循制造商的建议来实施微阵列分析，如，使用AffymetrixGenChip技术或Incyte微阵列技术。

RNA-seq

RNA测序(RNA-seq)也称为全转录组散弹枪测序(WTSS)，采用下一代测序(NGS)来显示在给定时刻生物学样本内RNA的存在和数量。

使用RNA-Seq来分析持续变化的细胞转录组。见，例如，Wang et al.,2009Nat RevGenet,10(1):57-63，通过引用并入本文。具体地，RNA-Seq促进着眼于另一基因剪切的转录本、转录后修饰、基因融合、突变/SNP和基因表达中的改变的能力。处理mRNA转录本之外，RNA-Seq可着眼于RNA的不同群体，以包括总RNA、小RNa如miRNA、tRNA和核糖体谱。也可使用RNA-seq来测定外显子/内含子边界，并精确地核实或修改所注释的5'和3’基因边界。

在RNA-seq之前，使用基于杂交的微阵列进行基因表达研究。使用微阵列的问题包括交叉杂交构件、对低表达和高表达基因的定量极差、以及需要知道待检测的序列。因为这些技术问题，转录组接管了基于测序的方法。这些从被表达的序列标签库的Sanger测序进展到基于化学标签的方法(如，基因表达的系列分析)，并组中进展为目前的技术——cDNA的NGS(尤其是RNA-Seq)。

“C-X-C基序趋化因子配体9(CXCL9)核酸分子”意为编码CXCL9多肽的多核苷酸。一种例示性CXCL9核酸分子以NCBI保藏号NM_002416.2提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQ ID NO:1)：

“CXCL9多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_002407.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:2)：

“C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)核酸分子”意为编码CXCL10多肽的多核苷酸。一种例示性CXCL10核酸分子以NCBI保藏号NM_001565.3提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQ ID NO:3)：

“CXCL10多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_001556.2的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:4)：

“C-C基序趋化因子配体3(CCL3)核酸分子”意为编码CCL3多肽的多核苷酸。一种例示性CCL3核酸分子以NCBI保藏号NM_002983.2提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQID NO:5)：

“CCL3多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_002974.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:6)：

“C-C基序趋化因子配体4(CCL4)核酸分子”意为编码CCL4多肽的多核苷酸。一种例示性CCL4核酸分子以NCBI保藏号NM_002984.3提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQID NO:7)：

“CCL4多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_002975.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:8)：

“C-C基序趋化因子受体5(CCR5)核酸分子”意为编码CCR5多肽的多核苷酸。一种例示性CCR5核酸分子以NCBI保藏号NM_000579.3提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQID NO:9)：

“CCR5多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_000570.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:10)：

“C-X3-C基序趋化因子配体1(CX3CL1)核酸分子”意为编码CX3CL1多肽的多核苷酸。一种例示性CX3CL1核酸分子以NCBI保藏号NM_002996.4提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQ ID NO:11)：

“CX3CL1多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_002987.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:12)：

“细胞间黏附分子1(ICAM1)核酸分子”意为编码ICAM1多肽的多核苷酸。一种例示性ICAM1核酸分子以NCBI保藏号NM_000201.2提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQ IDNO:13)：

“ICAM1多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_000192.2的氨基酸一致性为至少约85％，且具有ICAM1活性，再现于下(SEQ ID NO:14)：

“血管细胞黏附分子1(VCAM1)核酸分子”意为编码VCAM1多肽的多核苷酸。一种例示性VCAM1核酸分子以NCBI保藏号NM_001078.3提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQID NO:15)：

“血管细胞黏附分子1(VCAM1)”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_001069.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有趋化因子活性，再现于下(SEQ ID NO:16)：

“CD47分子(CD47)核酸分子”意为编码CD47多肽的多核苷酸。一种例示性CD47核酸分子以NCBI保藏号NM_001777.3提供，通过引用并入本文，并再现于下(SEQ ID NO:17)：

“CD47多肽”意为一种多肽或其片段，其与通过引用并入本文的NCBI保藏号NP_001768.1的氨基酸一致性为至少约85％，且具有结合活性，再现于下(SEQ ID NO:18)：

药物疗法

多余治疗性用途，本文所述的组合物或剂可全身给药，例如，配制在药学可接受的缓冲剂如生理盐水中。优选的给药途径包括，例如，在患者体内提供连续、持续水平的药物的皮下注射、静脉注射、腹膜注射、肌肉注射或皮内注射。对人类患者或其它动物的治疗将使用位于生理学可接受的载体的治疗有效量的本文鉴别的治疗剂来完成。适当的载体及其配方揭示在E.W.Martin所著的《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences)中。待给药的治疗剂的量依据给药方式、患者的年龄和体重、以及瘤形成例如白血病的临床症状而改变。通常，该量将是在治疗其它与瘤形成相关的疾病中所使用的其它剂的用量范围内，但在一些情况下，因为化合物的特异性增加，将会需要较低的用量。例如，将治疗性化合物以对于瘤形成细胞为细胞毒的剂量给药。

药物组合物的配方

用于治疗瘤形成如白血病的化合物或化合物组合的给药，可通过任何导致与其它组分组合的治疗剂的浓度在减轻、降低或稳定化瘤形成中有效的适当手段进行。该化合物可以任何适宜的量包含在任何适当的载体物质中，且通常以该组合物总重量的1重量％至95重量％的量存在。该组合物可提供为适用于肠胃外(如，皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内)给药途径的剂型。可根据传统药学实践来配制药物组合物(见，如，A.R.Gennaro编撰的《雷明顿：药物科学与实践(第二十版)》(The Science and Practice of Pharmacy(20thed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000)以及J.Swarbrick和J.C.Boylan编撰的《药物技术百科全书》(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York))。

由于熟练技师知道与动物模型比较而修正人类用剂量是该领域的常识，可通过从小鼠体内使用的化合物的量外推而确定最初的人类用剂量。在某些具体例中，设想剂量可从约1μg化合物/Kg体重至约5000mg化合物/Kg体重；或从约5mg/Kg体重至约4000mg/Kg体重；或从约10mg/Kg体重至约3000mg/Kg体重；或从约50mg/Kg体重至约2000mg/Kg体重；或从约100mg/Kg体重至约1000mg/Kg体重；或从约150mg/Kg体重至约500mg/Kg体重变化。其它情况下，这一剂量可以是约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/Kg体重。在其它方面，预计剂量可在约5mg化合物/Kg体重至约20mg化合物/Kg体重的范围内。其它实施方式中，该剂量可以是约8、10、12、14、16或18mg/Kg体重。当然，这一剂量可上调或下调，如在此类治疗建议中常规进行的，取决于临床试验的结果和特定患者的需要。

根据本发明的药物组合物可配制为几乎在给药时立即释放活性化合物，或在给药后的任何预定时间或时间段释放该活性化合物。后者类型的组合物通常称为控释制剂，其包括(i)创建在相当长的一段时间内基本上恒定的体内药物浓度的制剂；(ii)在预定的滞后时间后创建在相当长的一段时间内基本上恒定的体内药物浓度的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定、有效的活性物质血浆水平且令与活性物质血浆水平起伏(锯齿状波动模式)相关的不希望的副作用最小化，在预定的时间段内持续作用的制剂；(iv)通过例如与胸腺相邻或接触的控释组合的空间设置来局部化作用的制剂；(v)允许便利地给药而使得给药剂量为例如每周一次或每两周一次的制剂；以及(vi)通过使用载体或化学衍生物将治疗剂递送至特定细胞类型(如，赘生性细胞)而以赘生物为靶点的制剂。对于一些应用，控释制剂避免了对于在一天内频繁给药以令血浆水平持续在治疗水平上的需要。

为了获得其中待测化合物的释放速率比代谢速率更为重要的受控释放，可采取任意策略，。一个实例中，通过适宜地选择多个制剂参数和成份，包括多种类型的控释组合物和包衣，获得受控的释放。因此，将治疗剂与适宜的赋形剂一起配制为药物组合物，当给药时，该药物组合物以受控的方式释放治疗剂。实例包括单一或多单元片剂或胶囊剂组合物、油溶液、悬浮体、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。

肠胃外组合物

药物组合物可通过注射、输注或移植(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)以的剂型、配方给药，或经由含有传统的、无毒的药学可接受的载体和佐剂的适当递送装置或移植物给药。此类组合物的配方和制备是制药配方领域技术人员所熟知的。配方可见于前文所述的《雷明顿：药物科学与实践》。

用于肠胃外使用的组合物可提供为单位剂型(如，在单剂安瓿中)，或提供在含有若干剂的小瓶中，且其中可加入适当的防腐剂(见下文)。该组合物可以是溶液、悬浮体、乳液、输注装置、或用于移植的递送装置的形式，或者其可作为待在使用前以适当的水或另一适当的媒介物重建的干粉存在。除了减小或减轻水生物的活性剂之外，组合物还可包括适当的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。可将活性治疗剂并入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等之内用于受控释放。此外，组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张度调节剂、和/或分散剂。

如上文所述，根据本发明的药物组合物可为适用于无菌注射的形式。为了制备此组合物，将适当的活性抗赘生治疗剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。在可接受的媒介物和溶剂中，可采用水、通过加入适宜量的盐酸、氢氧化钠或适当缓冲剂调节至适当pH的水、1,3-丁二醇、林格溶液、等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。水性配方也可傲寒一种或多种防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在该化合物之一仅略溶或微溶于水的情况下，可加入溶解增强剂或增溶剂，或溶剂可包括10重量％至60重量％的丙二醇。

控释肠胃外组合物

控释肠胃外组合物可以是水性悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮体、或乳液的形式。作为另一种选择，可将活性药物并入生物相容的载体、脂质体、纳米颗粒、移植物或输注装置中。

用于制备微球和/或微胶囊的材料是，例如，生物可降解/生物可腐蚀的聚合物，如聚泌乳激素、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟基乙基-L-谷氨酸盐)和聚乳酸。当配制控释肠胃外制剂时可使用的生物相容的材料是碳水化合物(如，葡聚糖)、蛋白质(如，白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于移植物中的材料可以是生物不可降解的(如，聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(如，聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、或聚原酸酯或其组合)。

试剂盒或药物系统

本发明组合物可组装在用于减轻赘生物(如，白血病)的试剂盒或药物系统中。根据本发明这一方面的试剂盒或药物系统包含载剂单元如盒、箱、管等，其内部严格限制有一个或多个容器单元如小瓶、管、安瓿、或瓶。本发明的试剂盒或药物系统也可包含使用本发明的剂的相关使用说明书。

除非明确指定，否则本发明的实践采用传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术处于该领域技术人员的知识范围内。此类技术在文献中完整地诠释，如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis,(Gait,1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture,(Freshney,1987)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)《实验免疫学手册》(Handbook ofExperimental Immunology,(Weir,1996)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells,(Miller and Calos,1987)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology,(Ausubel,1987)；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(CurrentProtocols in Immunology,(Coligan,1991))。这些技术可用来生产本发明的多核苷酸和多肽，且因此可在作成并实践本发明中考虑这些技术。尤其可用于特定实施方式的技术将在下文中讨论。

现在将详细参考本发明的例示性具体例。尽管将联合所述例示性具体例描述本发明，但应理解，并非试图将本发明限制为那些具体例。与之相反，旨在覆盖如可为所附权利要求书既定的本发明精神和范畴所包括的替代物、修饰物和等效物。

[实施例]

通过下述实施例进一步阐释本发明，下述实施例不应视为限制。本申请通篇所应用的所有参考文献的内容、GenBank保藏号和基因编号、以及公布的专利和专利申请通过引用并入本文。该领域技术人员应知悉，本发明可在变更所述结构、材料、组合物和方法的情况下实践，且此类变更视为处于本发明范畴内。

实施例1：同种异体移植后的CTLA4封锁

CTLA4抑制可再次唤醒休眠的移植物抗白血病(GVL)效应，其毒性低于供者淋巴细胞输注(DLI)。为了评估CTLA4封锁在同种移植移植后是否安全和/或有效，对28位患有复发血癌的患者，在同种异体造血干细胞移植后使用3mg/kg(n＝6)或10mg/kg(n＝22)的伊匹单抗治疗。在低剂量下没有观察到应答；但59％的高剂量患者的肿瘤减少(包括持久的完全缓解)，如图1所示，该图显示使用单剂量的伊匹单抗治疗前(上左图)和治疗后(上右图)的白血病皮肤表现相关的皮肤损害、以及治疗前(下左图)和治疗后(下右图)的皮肤损伤的组织学染色组织切片的摄影图片。

图2说明了癌症免疫循环的示意图，这是描述在有效的抗癌免疫应答生成过程中出现的迭代步骤的理论建构。

为了鉴别与预测对伊匹单抗的应答相关的免疫相关基因，对来自四位患者的11个肿瘤活检组织进行RNA测序。两位患者对于伊匹单抗具有完全应答，这两位患者中的一位具有两个肿瘤部位，使得总计包括来自有应答患者的3个部位的伊匹单抗治疗前/后的6个肿瘤样本。一位患者具有短暂应答，之后复发，因此存在来自这位患者的三个样本。四位患者中的一位对于伊匹单抗完全没有应答，存在来自这位患者的两个样本(治疗前/后)。如下文进一步详述，这些研究使得推断白血病微环境(LME)中的免疫亚群体和活化状态称为可能。

实施例2：伊匹单抗在免疫细胞转运中扮演的角色

如图3所示，在有应答肿瘤和无应答肿瘤两者中在伊匹单抗治疗后对免疫细胞转运做出应答的基因的表达有所增加，如通过治疗前后表达水平的差异所指示。测试以下基因的表达水平：C-X-C基序趋化因子配体9(CXCL9；显示为黑色)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10；显示为橙色)、C-C基序趋化因子配体3(CCL3；显示为褐红色)、C-C基序趋化因子配体4(CCL4；显示为紫色)、C-C基序趋化因子受体5(CCR5；显示为蓝色)和C-X3-C基序趋化因子配体1(CX3CL1；显示为绿色)。如柱状图中可见，复发患者体内的伊匹单抗治疗前的肿瘤具有非常高的趋化因子“发炎”基线，其在伊匹单抗治疗后的复发肿瘤中得以下调。

实施例3：白血病床浸润的分析

如图4所示，在伊匹单抗治疗后，有应答肿瘤和无应答肿瘤两者中可对通过血管内皮细胞进行的免疫细胞转运产生应答的基因有所增加。测试以下基因的表达水平：细胞间黏附分子1(ICAM1；显示为黑色)和血管细胞黏附分子1(VCAM1；显示为灰色)。如自图4可见，复发患者体内的伊匹单抗治疗前的肿瘤具有非常高的趋化因子“发炎”基线，其在伊匹单抗治疗后的复发肿瘤中得以下调。

图5评估了分别对应于T细胞、B细胞和巨噬细胞的特异性免疫细胞亚群体。使用伊匹单抗治疗后，T细胞中的CD8A表达增加，B细胞和浆细胞中的CD20和CD138表达分别增加，且巨噬细胞中的MRC1和CD163以及趋化素表达增加。但是，在无应答患者体内，CD8+表达的增加(蓝色柱)仅见于使用伊匹单抗治疗后的T细胞中。在复发的情况下，所有细胞类型(即，T细胞、B细胞和巨噬细胞)均下调(红色柱)。

实施例4：巨噬细胞免疫逃逸的分析

通过分析CD47表达，分别评估了有应答患者、复发患者和无应答患者体内的巨噬细胞免疫逃逸，以评估巨噬细胞防御能力(图6)。如图所示，三种耐药性肿瘤(“复发(Rel)”、“治疗前(Pre)”和“来自无应答患者的治疗后”)是CD7表达水平最高的，且它们也是巨噬细胞基因表达最低的。注意，无应答患者体内的CD47表达最高，表明CD47是鉴别对于使用CTLA拮抗剂例如伊匹单抗治疗具有耐药性的患者的有用生物标记物。

实施例5：T细胞识别白血病

如图7所述，经由对T细胞受体基因和T细胞信号传导基因的表达分析来评估T细胞对白血病的识别。如左图所示，有应答患者与表达T细胞受体基因如CD3E、CD3D、CD3G和CD247的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达。同样，有应答患者与表达信号传导基因如LCK、ITK和ZAP70的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达(右图)。复发类别与T细胞受体基因和信号传导基因两者的下调相关联。

实施例6：原位T细胞的活化

图8显示评估T细胞活化的数据。如左图所示，有应答患者与表达共抑制受体基因如CTLA4、LAG3、TIGIT、HAVCR2和PD1的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达。同样，有应答患者与表达共刺激受体基因如ICOS、CD28和CD27的T细胞相关联，而这些基因在复发患者或无应答患者体内不表达(右图)。

此外，图9显示评估T细胞是否被活化且为溶细胞性的数据。有应答患者与表达CD8A和穿孔素(PRF1)的T细胞相关联，表明他们的肿瘤正在被溶细胞性的且具有杀死能力的CD8 T细胞浸润。在伊匹单抗治疗后的无应答患者体内，尽管CD8 T细胞到达肿瘤，但这些T细胞不是溶细胞性的，如通过PRF1基因表达缺乏所证实。

通过免疫组化评估原位细胞毒性应答。图10说明了在有应答患者体内进行伊匹单抗治疗之前7天(左图)和12天(右图)的免疫组化染色。染色数据显示，在伊匹单抗治疗后，CD8 T细胞进入肿瘤内(例如，CD8A染色)，并且接触并杀死多个肿瘤细胞(例如，PRF1染色)。

总之，观察到了三种模式的免疫学应答。首先，显示完全应答的群体与活化的CTL、B细胞和巨噬细胞的差异化浸润相关，并且也显示了免疫抑制分子(例如，CD47)的下调。其次，显示对于CTLA4拮抗剂(例如，伊匹单抗)的耐药性的群体与CD8的标志性上调相关，除了缺乏巨噬细胞/浆细胞浸润和CD47增加之外，没有TCR信号传导、活化或溶胞活性。第三，显示短暂应答/复发的群体与下调的基线免疫“致敏”状态相关，如通过转运细胞因子(例如，CXCL9、CXCL10、CCR3、CCR4、CCL5、CX3CL1)减少、活化的内皮细胞(例如，VCAM1、ICAM1)减少、免疫亚群(例如，CD8A、CD138、MRC1、CD163、趋化素)减少、TCR信号传导(例如，CD3E、CD3D、CD3G,CD247；例如，LCK、ITK、ZAP70)减少、共抑制/共刺激分子(例如，CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、PD1；例如，ICOS、CD28、CD27)减少、以及细胞溶解(例如，PRF1、GZMA)减少所证实的。根据本文的技术，治疗前的免疫学状态可推断在同种异体移植后进行的免疫疗法干预的临床结果。

通过引用并入

本文引用或参考的所有文献和本文所引用文献中引入或参考的所有文献，与本文所提及的任何产品的任何制造商使用说明书、说明、产品说明和产品数据册或通过引用并入本文的任何文献一起，通过引用并入本文，且可用来实践本发明。

等效物

应理解，本文所述的详细实施例和具体例仅作为示例而给出用于阐释性的目的，而非视为限制本发明。建议该领域技术人员对其做出的各种修饰和改变，且这些修饰和改变包括在本申请的精神和范围内且视为处于所附权利要求书的范畴内。从所附权利要求书可清晰地了解与本发明的系统、方法和过程相关的额外的优势特征和功能。此外，该领域技术人员应认识到，或能使用不超过常规的实验获知，本文所述发明的具体具体例的多种等效物。此类等效物为所附权利要求书所涵盖。

Claims (39)

1.一种确定使用细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)拮抗剂治疗患有白血病的受试者是否将导致所述受试者的临床受益的方法，所述方法包含：

从患有白血病的受试者获得测试样本；

测定所述测试样本中至少一种白血病相关基因的表达水平；

将所述测试样本中所述白血病相关基因的所述表达水平与参考样本中所述白血病相关基因的表达水平比较；以及

确定如果所述测试样本中所述白血病相关基因的所述表达水平相对于所述参考样本中所述白血病相关基因的所述水平表达上有差异，所述CTLA4拮抗剂是否将抑制所述受试者的白血病。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样本从白血病组织、肿瘤微环境或肿瘤浸润免疫细胞获得。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者体内的临床受益包含通过实体肿瘤的疗效评估标准(RECIST)界定的完全或部分应答；通过RECIST界定的病情稳定；或无论疾病级数或通过irRC标准界定的应答为何仍长期存活。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样本从所述白血病获得，其中所述白血病相关基因包含CD47分子(CD47)基因；以及

确定如果所述测试样本中所述CD47基因的表达水平高于所述参考样本中所述CD47基因的水平，使用所述CTLA4拮抗剂治疗患有白血病的所述受试者将在所述受试者体内导致临床受益。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样本从所述白血病获得，其中所述白血病相关基因包含CD47分子(CD47)基因；以及

确定如果所述测试样本中所述CD47基因的表达水平等于或低于所述参考样本中所述CD47基因的水平，使用所述CTLA4拮抗剂治疗患有白血病的所述受试者将不在所述受试者体内导致临床受益。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包含血浆样本、血液样本、骨髓样本、淋巴结、或白血病感染的任何部位。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包含循环肿瘤细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考样本是从健康的正常组织、接受来自CTLA4拮抗剂的临床受益的白血病、或未接受来自CTLA4拮抗剂的临床受益的白血病获得的。

10.根据权利要求1所述的方法，其中经由Affymetrix基因芯片杂交、下一代测序、核糖核酸测序(RNA-seq)、实时逆转录酶聚合酶链反应(实时RT-PCR)分析、免疫组化(IHC)、免疫荧光、或甲基化特异性PCR来检测所述白血病相关基因的表达水平。

11.根据权利要求1所述的方法，其中经由RNA-seq检测所述白血病相关基因的所述表达水平，且所述参考样本是从来自与所述测试样本相同个体的健康正常组织或来自不同个体的一个或多个健康正常组织获得。

12.根据权利要求1所述的方法，其中经由RT-PCR检测所述白血病相关基因的所述表达水平，且所述参考样本是从与所述测试样本相同的个体获得。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类。

14.根据权利要求1所述的方法，还包括以化疗剂、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法或免疫疗法治疗所述受试者。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述化疗剂包含达卡巴嗪、替莫唑胺、nab-紫杉醇、紫杉醇、顺铂或卡铂。

16.根据权利要求4所述的方法，还包含给药所述CD47基因的抑制剂，从而治疗所述白血病。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抑制剂包含小分子抑制剂、RNA干扰(RNAi)、抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、适配体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、或其任意组合。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是部分人源化的、完全人源化的、或嵌合的。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包含纳米抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链可变片段(ScFv)、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、Bis-scFv、微小抗体、Fab2、Fab3片段、或其任意组合。

20.根据权利要求1所述的方法，还包含向所述受试者给药抗CD47抗体，从而治疗所述白血病。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述CTLA4拮抗剂是伊匹单抗。

22.一种用于预测在应答CTLA4疗法没有临床受益的组合物，所述组合物包含CD47分子(CD47)基因合成的互补脱氧核糖核酸(cDNA)。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述CD47基因被固定在固体支撑物上。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述CD47基因被链接到可检测的标记。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述可检测的标记包含荧光标记、发光标记、化学发光标记、放射性标记、SYBR、Green标记、或Cy3标记。

26.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包含：

向所述实施者给药治疗有效量的一种或多种CTLA4抑制剂，其中所述受试者被鉴别为不具有对至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述CTLA4拮抗剂是伊匹单抗。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少一种耐药性癌症相关基因是CD47分子(CD47)基因。

29.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包含：

将所述受试者鉴别为具有对至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达；以及

将治疗有效量的一种或多种CTLA4抑制剂和一种或多种所述至少一种耐药性癌症相关基因的抑制剂共同给药至所述受试者，从而治疗所述癌症。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述CTLA4拮抗剂是伊匹单抗。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种耐药性癌症相关基因是CD47分子(CD47)基因。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症是白血病。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述一种或多种抑制剂包含小分子抑制剂、RNA干扰(RNAi)、抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、适配体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、或其任意组合。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是部分人源化的、完全人源化的、或嵌合的。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包含纳米抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链可变片段(ScFv)、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、Bis-scFv、微小抗体、Fab2、Fab3片段、或其任意组合。

36.根据权利要求29所述的方法，还包含向所述受试者给药抗CD47抗体，从而治疗所述白血病。

37.一种试剂盒，包含用于对来自罹患癌症的受试者的生物学样本进行对至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达的分析的试剂。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中对所述至少一种耐药性癌症相关基因的异常表达包含对所述至少一种耐药性癌症相关基因的过度表达。

39.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述至少一种耐药性癌症相关基因是CD47分子(CD47)基因。

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