CN110791584A

CN110791584A - 检测山茶花腐病菌的引物对cm、检测试剂及其应用

Info

Publication number: CN110791584A
Application number: CN201911229575.XA
Authority: CN
Inventors: 段维军; 郭立新; 吕燕
Original assignee: Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science Technology
Current assignee: Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science Technology
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-12-04
Also published as: CN110791584B

Abstract

本发明公开了检测山茶花腐病菌的引物对CM、检测试剂试剂盒及利用其进行实时荧光PCR的检测方法和相关应用，具体属于生物技术领域。其中，该引物对CM是由引物CM‑F和引物CM‑R组成，CM‑F为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。CM‑R为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。本发明提供的引物对、探针及试剂盒能够更快速、准确地检测出山茶花腐病菌。

Description

检测山茶花腐病菌的引物对CM、检测试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测山茶花腐病菌的引物对CM、检测试剂试剂盒，及利用其进行实时荧光PCR的检测方法和相关应用。

背景技术

山茶花腐病菌，隶属于真菌门、子囊菌亚门、子囊菌纲、柔膜菌目、核盘菌科、叶杯菌属。山茶花腐病菌已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。目前，山茶花腐病菌主要分布于北美洲的美国，欧洲的德国、英国、葡萄牙、西班牙、法国、意大利、瑞士和德国，大洋州的新西兰以及亚洲的日本。山茶花腐病菌是专性寄生菌，仅侵染山茶属植物花朵而不侵染其他部位，受其侵染的花朵变褐色，花期缩短，提前脱落。由于山茶属植物为观花植物，主要观赏价值在于其花朵，因此该病害严重影响其经济价值。

山茶花腐病菌的形态特征：菌核薄片状、盘状或浅杯状。菌核直径约为1.86～12.3×1.37～8.20mm。未成熟时白色，成熟时呈深褐色或黑色。分生孢子梗瓶梗状，透明至褐色，在分生孢子梗顶端产生小型分生孢子。小型分生孢子圆形至卵圆形，单核，含一个油球，直径3.1～4.2μm。有些孢子可连接成短链。

山茶花腐病菌在山茶花器上的发病表征：山茶花腐病菌只侵染山茶属(Camelliaspp.)植物的花朵。病菌通常在早春阶段由子囊孢子侵染花瓣基部，形成棕色小斑点，斑点逐步扩展后向上蔓延至整个花瓣，花瓣边缘腐烂。严重时，花朵中部变黑，完全坏死，干腐，最终脱落。但花的结构保持良好，即使花朵整个枯萎，经手挤压后花瓣也不会脱落。在花被侵染的后期，将花倒置并移除萼片，可见围绕花瓣基部出现一个白色至灰白色毛毯状近似环状的不育菌丝，像寄主的组织。该环状菌丝体是该病害的一个典型特征。在感染2～4周后，菌核开始在花瓣基部即花萼处形成，最初由一层密集的灰白色菌丝覆盖。成熟时菌核呈黑色近盘状。

迄今为止，国内外检测山茶花腐病菌的方法局限于形态学检测方法，费时费力，获知检测结果需要15天以上的时间，且容易漏检，出现假阴性结果。并且，传统应用形态学检测方法的过程中，对相关的检测人员的专业素质要求较高。

故根据时代的需求，研发出一种跟现有技术构成强区别的山茶花腐病菌的检测方法，是海关检测人员亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供检测山茶花腐病菌的引物对CM、检测试剂试剂盒及其应用，能够针对山茶花腐病菌进行快速、准确地检测。

为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。

引物对CM，是由引物CM-F和引物CM-R组成，所述CM-F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。

所述CM-R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

本发明提供一种检测试剂，该试剂盒是由上述引物对CM和探针CM-P组成，所述CM-P的核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。

作为优选，所述探针CM-P的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。具体的，所述CM-P的5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

本发明还提供了上述引物对CM和/或上述检测试剂的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鉴定山茶花腐病菌；

(b2)制备用于鉴定山茶花腐病菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有山茶花腐病菌；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有山茶花腐病菌的试剂盒。

上述检测试剂中，CM-F、CM-R、CM-P均可独立包装。CM-F、CM-R、CM-P混合使用时，其摩尔比可为1:1:1。

本发明提供了一种试剂盒，包括上述引物对CM或上述检测试剂；所述试剂盒的功能为如下(c1)和(c2)：

(c1)鉴定山茶花腐病菌；

(c2)检测待测样本是否含有山茶花腐病菌。

本发明还提供了一种鉴定山茶花腐病菌的方法，该方法包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对CM或权利要求2或3所述的检测试剂进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测菌为或候选为山茶花腐病菌，如果不显示阳性扩增曲线、待测菌为或候选为非山茶花腐病菌。

其中，以上任一所述实时荧光PCR的反应体系中，所述CM-F浓度为0.5μmol/L，所述CM-R浓度为0.5μmol/L，所述CM-P浓度为0.5μmol/L。以上任一所述实时荧光PCR的反应体系可由

Universal PCR Master Mix、所述CM-F、所述CM-R、所述CM-P、模板和水组成。

同时，以上任一所述实时荧光PCR的反应条件可为：50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

以上任一所述特异扩增产物可含有71bp的DNA片段。

在本发明中，上述鉴定山茶花腐病菌的方法可应用在检测待测样本中是否含有山茶花腐病菌。

本发明还提供了一种检测待测样本是否含有山茶花腐病菌的方法，该方法包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否具有所述引物对CM的靶序列，如果具有所述靶序列，则待测样本含有山茶花腐病菌，如果不具有所述靶序列，则待测菌不含有或疑似不含有山茶花腐病菌。

其中，待测样本可为植物样品、真菌纯培养样品或菌核样品等。植物样本具体可为植物花器，更具体可为山茶花器。

所述靶序列可为如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列4所示的DNA分子；

(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

序列4：

TCTTGATGGCTCTGGTGTGTAAGTAATCCCGAAATTTCTTGTCACATTTTGAACGATTCTGACATGTTTTG

本发明中，所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加可为1-5个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

本发明通过设置上述实验条件进一步优化了实时荧光PCR的反应体系，获得了最优的引物浓度和探针浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)快速简单：只需少量样品DNA，用荧光PCR仪仅需1小时就可完成PCR步骤，得到检测结果，且避免了普通分子检测技术中的电泳等处理过程。

(2)特异性强：采用针对山茶花腐病菌的特异引物对进行目标基因片段的扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性。

(3)灵敏度高：由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，进一步提高灵敏度。

(4)交叉污染低：整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染。

(5)可以实现定量检测。

附图说明

图1为山茶花腐病菌特异性试验结果。

图2为检测山茶花腐病菌的成套试剂的标准曲线。横坐标为基因组DNA浓度，纵坐标为Ct值。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

Universal PCR Master Mix，ABI公司产品。

实施例1

1、检测山茶花腐病菌的检测试剂的制备

本实施例提供的检测山茶花腐病菌的检测试剂由名称为CM的引物对和名称为CM-P的探针组成。CM由名称分别为CM-F和CM-R的单链DNA组成，二者的摩尔比为1:1，CM能从杜鹃花枯萎病菌的基因组DNA中扩增得到序列表中序列4所示的DNA片段。各引物序列如下：

CM-F(正向引物，序列表的序列1)：

序列1：5'-TCTTGATGGCTCTGGTGTGTAAG-3'。

CM-R(反向引物，序列表的序列2)：

序列2：5'-CAAAACATGTCAGAATCGTTCAAAA-3'。

探针CM-P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB：

探针CM-P(序列表的序列3)：

序列3：5’-FAM-AATCCCGAAATTTC-MGB-3’。

检测山茶花腐病菌的成套试剂中的两条引物和探针均可独立包装，CM-F、CM-R和CM-P的摩尔比可为1:1:1。

实施例2

测试实施例1中制备得到的检测试剂的特异性

待测样本：山茶花腐病菌Ciborinia camelliae(菌株编号为CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM81、CM82、CM83、CM84、CM85、CM96～CM143、CM188、CM189、CM-JX6、CM-JX7、CM-JX8、CM-JX9、CM-JX10、CM-HN6、CM-HN7、CM-HN8、CM-HN9、CM-HN10)、杜鹃花枯萎病菌Ovuliniaazalea(OV70)、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、麦角菌Claviceps purpurea(SC1、SC2、SC3)、美澳型核果褐腐病菌Monilinia fructicola MF、桃褐腐核盘菌Monilinia laxa ML、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、刺盘孢属(Colletotrichum sp.)、叶点霉属(Phyllosticta sp.)、间座壳属(Diaporthe sp.)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria sp.)茎点霉属(Phoma sp.)。上述各菌株均为本实验分离鉴定，且可通过市场上购买得到，均不涉及到新的菌种。

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、以步骤1获得的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR。

反应体系(10μL)：5μL

Universal PCR Master Mix，0.5μL CM-F(10μmol/L)，0.5μL CM-R(10μmol/L)，0.5μL CM-P(10μmol/L)，1μL基因组DNA，用灭菌双蒸水补至10μL。该反应体系中，CM-F浓度为0.5μmol/L，CM-R浓度为0.5μmol/L，CM-P浓度为0.5μmol/L。用等体积水代替基因组DNA，作为空白对照。

反应条件：50℃2min、95℃10min；95℃15s、60℃1min，共40个循环。

结果(图1)表明，只有以山茶花腐病菌(菌株编号为CM96～CM143、CM188、CM189、CM-JX6、CM-JX7、CM-JX8、CM-JX9、CM-JX10、CM-HN6、CM-HN7、CM-HN8、CM-HN9、CM-HN10)作为待测样本时显示阳性扩增曲线，其他各个菌株作为待测样本时均不显示阳性扩增曲线。表明实施例1的检测山茶花腐病菌的检测试剂具有较强的特异性。

实施例3

测试实施例1中制备得到的检测试剂的灵敏度

1、提取山茶花腐病菌CM143菌株的基因组DNA，将基因组DNA进行梯度稀释后作为模板。

2、以步骤1获得的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR。

反应体系(10μL)：5μL Universal PCR Master Mix，0.5μL CM-F(10μmol/L)，0.5μL CM-R(10μmol/L)，0.5μL CM-P(10μmol/L)，1μL基因组DNA，用灭菌双蒸水补至10μL。该反应体系中，CM-F浓度为0.5μmol/L，CM-R浓度为0.5μmol/L，CM-P浓度为0.5μmol/L。用等体积水代替基因组DNA，作为空白对照。

共有反应体系1-8个反应体系体系，反应体系1中，基因组DNA含量为55ng。

反应体系2中，基因组DNA含量为5.5ng。

反应体系3中，基因组DNA含量为550pg。

反应体系4中，基因组DNA含量为55pg。

反应体系5中，基因组DNA含量为5.5pg。

反应体系6中，基因组DNA含量为550fg。

反应体系7中，基因组DNA含量为55fg。

反应体系8中，基因组DNA含量为5.5fg。

结果显示，反应体系1-5均显示阳性扩增曲线，反应体系6、7、8以及空白对照中均无阳性扩增曲线，表明，实施例1的检测山茶花腐病菌的成套试剂的最低检测限为5.5pg模板DNA/10μL体系。

根据基因组DNA含量和Ct值制作标准曲线如图2所示，标准曲线为y＝-3.318862x+28.875307，R²,0.9963372，x为基因组DNA含量(ng/L)，y为Ct值。结果显示，反应体系6、7和8所对应的点Ct值大于35。

实施例4

接种样品检测

1、将山茶花腐病菌CM143菌株接种至PDA培养基平板上，20℃培养箱静置培养15天左右。

2、完成步骤1后，用无菌水洗脱培养基上小型分生孢子，用4层无菌纱布过滤，用血球板计数器计量小型分生孢子浓度。

3、将步骤2得到的小型分生孢子液喷撒至山茶植株上，放置于自然条件下生长，观察花器发病情况，取发病花器以及其产生的菌核、叶片分别提取总DNA。

4、以步骤3获得的总DNA为模板，进行实时荧光PCR。

反应体系(10μL)：5μL

结果表明，接种山茶花腐病菌CM143菌株的花器出现了相应的发病表征，实时荧光PCR也均显示阳性扩增曲线。

对比例1

其他检测试剂的检测结果

利用其他检测试剂检测山茶花腐病菌，所用检测试剂为检测试剂1和检测试剂2，检测试剂1由名称为CM1的引物对和名称为CM-P1的探针组成，CM1由名称分别为CM-F1和CM-R1的单链DNA组成；检测试剂2由名称为CM2的引物对和名称为CM-P2的探针组成，CM2由名称分别为CM-F2和CM-R2的单链DNA组成。

CM-F1(正向引物)：5'-TGCCTGTTCGAGCGTCATT-3'；

CM-R1(反向引物)：5'-TTGCTGACATGGACTCAATACCA-3'；

探针CM-P1 5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB：探针CM-P1：5’-FAM-CAACCCTCAAGCACAGC-MGB-3’。

CM-F2(正向引物)：5'-CCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTT-3'；

CM-R2(反向引物)：5'-CGAGCATACAAGGCCGAAA-3'；

探针CM-P2 5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB：探针CM-P2：5’-FAM-TTGCTTTGGCGAGCTG-MGB-3’。利用上述两套检测试剂分别对实施例2的待测样本进行检测，结果发现：检测试剂1对美澳型核果褐腐病菌Monilinia fructicola MF有扩增，检测试剂2对灰葡萄孢菌Botrytis cinerea有扩增，表明，检测试剂1和检测试剂2的特异性不好。

序列表

<110> 宁波检验检疫科学技术研究院

<120> 检测山茶花腐病菌的引物对CM、检测试剂及其应用

<141> 2019-12-04

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> （1）

<400> 2

tcttgatggc tctggtgtgt aag 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> （2）

<400> 2

caaaacatgt cagaatcgtt caaaa 25

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> （3）

<400> 3

aatcccgaaa tttc 14

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> （4）

<400> 4

tcttgatggc tctggtgtgt aagtaatccc gaaatttctt gtcacatttt gaacgattct 60

gacatgtttt g 71

Claims

1.引物对CM，其特征在于由引物CM-F和引物CM-R组成，所述CM-F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述CM-R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

2.一种检测试剂，其特征在于由权利要求1中所述的引物对CM和探针CM-P组成，所述CM-P的核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3；

3.根据权利要求2所述检测试剂，其特征在于所述探针CM-P的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。

4.权利要求1所述引物对CM和/或权利要求2或3所述检测试剂的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鉴定山茶花腐病菌；

(b2)制备用于鉴定山茶花腐病菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有山茶花腐病菌；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有山茶花腐病菌的试剂盒。

5.一种试剂盒，包括权利要求1所述的引物对CM或权利要求2或权利要求3所述的检测试剂；所述试剂盒的功能为如下(c1)和(c2)：

(c1)鉴定山茶花腐病菌；

(c2)检测待测样本是否含有山茶花腐病菌。

6.一种鉴定山茶花腐病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对CM和/或权利要求2或3所述的检测试剂进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测菌为或候选为山茶花腐病菌，如果不显示阳性扩增曲线、待测菌为或候选为非山茶花腐病菌。

7.如权利要求6所述的方法在检测待测样本中是否含有山茶花腐病菌的应用。

8.一种检测待测样本是否含有山茶花腐病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否具有所述引物对CM的靶序列，如果具有所述靶序列，则待测样本含有山茶花腐病菌，如果不具有所述靶序列、待测菌不含有山茶花腐病菌。