CN110791463A - 一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺。一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，包括如下步骤：第一步：准备材料和试剂；第二步：配制培养基；第三步：处理样品；第四步：乳酸菌的分离；第五步：乳酸菌的筛选。通过所述的一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺得到的S26、S42、S53三株乳酸菌的特点是：经过12h的生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；对13种抗生素均有敏感性，可以作为肉品发酵的备选菌株，可用来发酵肉制品，比如羊肉。

Description

一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺。
背景技术
发酵肉制品是以各类畜禽肉为原料，采用微生物发酵技术，将原料肉经特定的微生物作用，产酸使pH值下降，并经过低温失水使产品的Aw降低，从而增加产品的保藏性能的一大类肉制品。侗族是中国少数民族之一，其制作的发酵酸肉营养丰富，风味独特，保存期长，是经过乳酸细菌、葡萄球菌、酵母菌、微球菌等多个微生物菌群自然发酵而成的发酵肉制品。在其发酵过程中，乳酸菌起到了至关重要的作用，一方面它能将原料中的碳化合物分解为乳酸，导致产品的pH值下降，有效抑制病原菌及有害菌的生长；另一方面它还赋予了产品特有的风味和坚实的质地。此外，乳酸的产生还会加速亚硝酸盐向一氧化氮肌红蛋白的转化，减少产品中亚硝酸盐的残留量，同时促进了良好色泽的形成，因此其常常被筛选出来用作肉品发酵剂。
虽然我国是肉制品生产大国，但加工能力却远比不上西方国家。近年来，发酵肉制品因其感官性质独特、营养丰富、利于消化吸收、货架期长等众多的优点，越来越受广大人民的欢迎。但由于其生产周期长，工业化生产的规模受到限制，价格昂贵，不能满足日益增长的市场需求。因此，筛选用于发酵肉制品的乳酸菌株，对于缩短发酵肉制品生产周期，实现商业化具有重要意义。
为此，设计一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，以期为新型健康发酵肉制品，比如发酵羊肉的研究和开发提供优质菌种资源。
发明内容
本发明为克服以上不足，提供一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，包括如下步骤：
第一步：准备材料和试剂
侗族地区传统发酵酸肉，以下简称侗族酸肉；
第二步：配制培养基：
参考现有技术配制MRS固体培养基、产粘性培养基、耐盐性试验培养基、耐硝性试验培养基、产H2S培养基、葡萄糖产气培养基、氨基酸脱羧酶培养基、硝酸盐还原培养基、产氨培养基、乳酸纸层析试剂、石蕊牛乳培养基、V-P反应培养基；
第三步：处理样品
在无菌条件下取侗族酸肉25g，切碎，加入到225mL的无菌生理盐水中，振荡均匀备用；取1.0mL加至到9.0mL无菌生理盐水中进行梯度稀释；
第四步：乳酸菌的分离
选取合适的稀释度，涂布于含3％CaCO3的MRS固体培养基上，凝固后置于37℃培养；挑取产生碳酸钙溶解圈的单菌落反复划线，直至获得纯的菌株；对纯菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶活性测定，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌。
第五步：乳酸菌的筛选
在发酵肉制品的生产中，乳酸菌应符合以下筛选标准：能够耐受6％的NaCl和150mg/kgNaNO2、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；
依据筛选标准，按照以下方法进行筛选：产黏性试验、耐盐性试验、耐硝性试验、产H2S试验、发酵葡萄糖产气试验、氨基酸脱羧酶试验、硝酸盐还原能力试验、产氨试验、乳酸的纸层析分析、石蕊牛乳试验、V-P试验、产酸性试验、抑菌试验、蛋白酶活性检测和脂肪酶活性检测。
一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，筛选出三株菌S26、S42和S53，S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌，可用来发酵肉制品，比如羊肉；
S26、S42、S53三株乳酸菌的特点是：在12h生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；S26、S42、S53三株乳酸菌对13种抗生素均有敏感性，可以作为肉品发酵的备选菌株；所述13种抗生素包括头孢噻肟(CEF)、头孢氨苄(CEP)、氨卡西林(AMP)、卡那霉素(KAN)、庆大霉素(GEN)、新霉素(NEO)、链霉素(STR)、四环素(TET)、红霉素(ERY)、万古霉素(VAN)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(EVO)、阿莫西林(AMO)。
本发明的有益效果是：
本发明所述的一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，从侗族酸肉中提出了三株适宜发酵肉类的乳酸菌S26、S42和S53；S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌；
S26、S42、S53三株乳酸菌的特点是：经过12h的生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；对13种抗生素均有敏感性，可以作为肉品发酵的备选菌株，可用来发酵肉制品，比如羊肉。
附图说明
图1为乳酸菌主要发酵特性阳性菌数表；
图2为菌株S26、S42、S53的形态学特征；
图3为菌株S26、S42、S53生理生化鉴定结果；
图4为菌株S26、S42、S53的生长曲线及pH值变化曲线；
图5为乳酸菌对13种抗生素的敏感性检测结果表；
图6为菌株S26、S42和S53株菌拮抗效果比较。
具体实施方式
以下将结合本发明的实施例进行详细叙述。
一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，包括如下步骤：
第一步：准备材料
侗族地区传统发酵酸肉，以下简称侗族酸肉，购买于京东网站；
第二步：配制培养基：
参考现有技术配制MRS固体培养基、产粘性培养基、耐盐性试验培养基、耐硝性试验培养基、产H2S培养基、葡萄糖产气培养基、氨基酸脱羧酶培养基、硝酸盐还原培养基、产氨培养基、乳酸纸层析试剂、石蕊牛乳培养基、V-P反应培养基；
第三步：处理样品
在无菌条件下取侗族酸肉25g，切碎，加入到225mL的无菌生理盐水中，振荡均匀备用；取1.0mL加至到9.0mL无菌生理盐水中进行梯度稀释；
第四步：乳酸菌的分离
选取合适的稀释度，涂布于含3％CaCO3的MRS固体培养基上，凝固后置于37℃培养；挑取产生碳酸钙溶解圈的单菌落反复划线，直至获得纯的菌株；对纯菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶活性测定，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌。
第五步：乳酸菌的筛选
在发酵肉制品的生产中，乳酸菌应符合以下筛选标准：能够耐受6％的NaCl和150mg/kgNaNO2、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
依据筛选标准，按照以下方法进行筛选：产黏性试验、耐盐性试验、耐硝性试验、产H2S试验、发酵葡萄糖产气试验、氨基酸脱羧酶试验、硝酸盐还原能力试验、产氨试验、乳酸的纸层析分析、石蕊牛乳试验、V-P试验、产酸性试验、抑菌试验、蛋白酶活性检测和脂肪酶活性检测。
一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，筛选出具有明显溶钙圈的菌落进行反复纯化，在经革兰染色以及过氧化氢酶活性测定后，共获得G+、过氧化氢酶试验阴性的疑似乳酸菌共54株，分别命名为S1～S54；
对54株菌株的分析检测结果：
乳酸菌共54株具有的特点，所有乳酸菌菌株都能耐受2％Nacl和50mg/kg的亚硝酸盐；
52个乳酸菌菌株能耐受4％Nacl；
50个乳酸菌菌株能耐受6％Nacl；
51个乳酸菌菌株能耐受100mg/kg的亚硝酸盐；
49个乳酸菌菌株能耐受150mg/kg的亚硝酸盐；
所有乳酸菌菌株发酵葡萄糖不产气，不生成H2S，产酸；
53个乳酸菌菌株不产粘液；
40个乳酸菌菌株V-P反应阳性；
28个乳酸菌菌株不会发生氨基酸脱羧反应；
28个乳酸菌菌株可抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长；
48个乳酸菌菌株能使牛奶酸凝。
三株菌鉴定及结果：
54株中的S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌，对三株菌进行如下鉴定：
A、乳酸菌的鉴定：
(1)形态特征鉴定
将纯化好的菌株利用平板划线的方法接种于MRS培养基平板上，在37℃条件下恒温培养，观察并记录菌株的菌落形态。对菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下油镜观察并记录待测菌株的菌体形态特征，分离得到符合发酵条件的三株乳酸菌，琼脂培养基上的菌落形态、革兰氏染色后显微镜下的菌体形态描述，如图2所示，如证明文件所示。
(2)生化鉴定
按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》等文献上的试验方法将筛选所得的菌株接入生化鉴定管，18～72h后观察记录现象。初步鉴定S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌，结果如图3所示。
(3)16SrDNA分子鉴定
DNA的提取：分别用细菌基因组DNA提取试剂盒对分离纯化的细菌进行提取，提取步骤按试剂盒说明书进行；PCR扩增及测序：PCR反应体系(50uL)：10×ExTaqbuffer5.0uL，2.5mmol/LdNTPMix4.0uL，10pPrimer12.0uL，10pPrimer22.0uL，5uExTaq0.5uL，Template2.0uL，ddH2O36.5uL；反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s(24次循环)；PCR扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，20min，恒压对PCR产物进行电泳，并在凝胶成像系统下观察，并照相分析；将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化和测序；序列分析：测序结果在NCBI利用Blast做相似性比对分析；另外，用ContigExpress软件对序列进行拼接及人工校正，生成Fasta格式文件，利用Mega7软件按照Neighbor-Joining法聚类构建系统发育树。
对提取菌株的总DNA进行PCR扩增，如证明文件所示，扩增出3条特异的、大小约为1500bp的条带。获得的特异性片段纯化后进行测序，将测序结果用BLAST进行序列同源性比对，根据比对结果显示，S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌。
B、菌株产酸能力和生长曲线的测定
将新鲜培养的适龄待测菌株接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，用不接菌的MRS液体培养基作为空白对照，每隔2h用721型分光光度计于600nm波长下测定各菌株的菌液的OD值，并用酸度计测定pH值。其OD值大小表示菌株的生长情况，pH值可反应出菌株的产酸能力。
分别绘制三株菌的生长曲线及pH值变化曲线，如图4所示，a、b、c分别为香肠乳杆菌S26、植物乳杆菌S42、乳酸片球菌S53的生长曲线及pH值变化曲线。
C、菌株安全性分析
(1)抗生素敏感性试验
采用药敏纸片琼脂扩散(直径6.0mm)法检测从酸肉中分离到的三株乳酸菌对头孢噻肟(CEF)、头孢氨苄(CEP)、氨卡西林(AMP)、卡那霉素(KAN)、庆大霉素(GEN)、新霉素(NEO)、链霉素(STR)、四环素(TET)、红霉素(ERY)、万古霉素(VAN)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(EVO)、阿莫西林(AMO)的敏感性。使用涡旋混匀器混匀实验菌液，各取100uL菌液涂布于MRS固体培养基上，待菌液被培养基完全吸收后，将药敏纸片放于培养基上，静置15min后，倒置放于37℃培养箱中培养20h，测量并记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小。
结果判定参照《CLSI抗菌药物敏感性试验标准》，被测菌株对抗生素的敏感性检测结果如证明文件所示，香肠乳杆菌S26对这几类抗生素均表现出敏感性；植物乳杆菌S42对糖肽类抗生素中的万古霉素表现为耐药，对其他类抗生素均有敏感性；乳酸片球菌S53对氨基糖苷类中的卡那霉素和喹诺酮类中的环丙沙星表现为耐药，对其他抗生素均有敏感性。
(2)质粒提取
通过琼脂糖凝胶电泳对S26、S42和S53做质粒检测，同时以含有质粒的菌株(pET-22b)作对照，结果如证明文件所示，对照菌株所在泳道出现荧光条带，而被测菌株所在泳道均未出现荧光条带，可以认定3株菌不含有质粒。
(3)溶血试验在血平板培养基上涂布100uL实验菌液，待菌液被培养基完全吸收后，倒置放于37℃培养箱中培养20h，观察是否出现溶血现象。如证明文件所示，S26、S42和S53均无溶血现象产生。
D、菌株的拮抗试验用接种环挑取S26菌株，在MRS固体培养基上划一直线接菌；37℃条件下培养48h，待形成菌落后，沿菌落边缘(不接触)用接种环从垂直方向接S42，37℃条件下培养24h，观察S26对于S42的抑制效果。同理，检测S26对S53的抑制效果。
如图6所示，S26、S42和S53之间均无拮抗性，可以用来复配发酵。
三株菌的鉴定结果：
在12h生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；同时对这三株菌进行了安全性方面的评估，发现乳酸菌对13种抗生素均有敏感性，安全性好，可以作为肉品发酵的备选菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：准备材料和试剂
侗族地区传统发酵酸肉，以下简称侗族酸肉；
第二步：配制培养基：
参考现有技术配制MRS固体培养基、产粘性培养基、耐盐性试验培养基、耐硝性试验培养基、产H2S培养基、葡萄糖产气培养基、氨基酸脱羧酶培养基、硝酸盐还原培养基、产氨培养基、乳酸纸层析试剂、石蕊牛乳培养基、V-P反应培养基；
第三步：处理样品
在无菌条件下取侗族酸肉25g，切碎，加入到225mL的无菌生理盐水中，振荡均匀备用；取1.0mL加至到9.0mL无菌生理盐水中进行梯度稀释；
第四步：乳酸菌的分离
选取合适的稀释度，涂布于含3％CaCO3的MRS固体培养基上，凝固后置于37℃培养；挑取产生碳酸钙溶解圈的单菌落反复划线，直至获得纯的菌株；对纯菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶活性测定，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌；
第五步：乳酸菌的筛选
在发酵肉制品的生产中，乳酸菌应符合以下筛选标准：能够耐受6％的NaCl和150mg/kgNaNO2、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；
依据筛选标准，按照以下方法进行筛选：产黏性试验、耐盐性试验、耐硝性试验、产H2S试验、发酵葡萄糖产气试验、氨基酸脱羧酶试验、硝酸盐还原能力试验、产氨试验、乳酸的纸层析分析、石蕊牛乳试验、V-P试验、产酸性试验、抑菌试验、蛋白酶活性检测和脂肪酶活性检测。
2.一种乳酸菌，其特征在于，所述一种乳酸菌用于发酵肉制品。
3.根据权利要求2所述的一种乳酸菌，其特征在于，通过权利要求1所述的一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺提取。
4.根据权利要求3所述的一种乳酸菌，其特征在于，所述的一种乳酸菌具体为香肠乳杆菌或植物乳杆菌或乳酸片球菌。
5.根据权利要求4所述的一种乳酸菌，其特征在于，所述肉制品为羊肉。
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