CN110777092A - 基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂 - Google Patents

基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵食品生产技术领域，公开了一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂，固态发酵剂由菌酶母液、填充料、保护剂组成；菌酶母液由所述菌酶母液植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌及胰蛋白酶组成；植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌按菌泥体积比为100：(10～100)：(10～100)；酸性蛋白酶的添加量为0.5～3.5mL/100g鱼肉。本发明采用优良的固态复配发酵菌剂进行接种发酵，能够明显缩短发酵鱼肉的周期，避免杂菌的污染，提升了产品的安全性，降低生产成本，还可以改善产品的营养、品质和风味，有助于使传统发酵鱼制品实现工业化、标准化和规模化的生产。

Description

基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂
技术领域
本发明属于发酵食品生产技术领域，尤其涉及一种基于复合菌种结合酸性 蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂。
背景技术
目前，业内最接近的现有技术是如下：
我国拥有丰富的淡水鱼资源量，全国内陆水域鱼类800多种，纯淡水鱼类 760种，本世纪初以来淡水鱼产量逐年递增，2018年达3156.23万吨，占世界 淡水鱼总产量70％以上，其中大宗淡水鱼产量占我国淡水鱼产量的70％以上 (中国渔业统计年鉴，2019)。虽然淡水鱼养殖产业的迅速发展，但仍主要以鲜 销为主，淡水鱼加工比例不足淡水鱼产品总量的11％，其加工比例远低于世界 平均水平，且加工方式仅局限在传统的初级加工，精深加工产业发展不足，从 而加工业和养殖业之间的矛盾日益突出，甚至会影响淡水鱼产业的发展。
水产品加工方式可分为传统手工加工和现代自动化加工两大类，传统加工 主要指腌制、干制、熏制和天然发酵等。目前，我国有许多地方特色传统发酵 鱼制品，如湖南祁阳的鲊鱼，安徽的臭鳜鱼，苗族侗族的酸鱼，安庆、聂家和 绍兴等地的糟醉鱼，民间自制的咸鱼和腊鱼等也属于发酵鱼制品。这些发酵鱼 制品大多是利用自然界的微生物在适宜的温湿条件下发酵而成的，但这种传统 自然发酵方式的加工环境和发酵条件随机性强且因原料的不同，使得每种发酵 制品的风味差异大，产品品质难以控制，发酵周期较长，从而导致这类发酵鱼 制品缺乏统一的生产质量标准，难以实现工业化和规模化生产。
随着研究的深入，微生物接种技术慢慢应用到发酵食品的生产过程中。接 种发酵是指在特定发酵阶段选择性的接种目的优势菌株，通过在鱼体上接种微 生物发酵剂，不仅能够缩短发酵周期，在一定程度上避免杂菌的污染，提升产 品的安全性，提高设备利用率和生产效率，降低生产成本，还可以改善产品的 营养、品质和风味，有助于使传统发酵鱼制品实现工业化、标准化和规模化的 生产。Devi等(Devi K R et al.，2015)分析了印度传统非盐腌鱼产品Ngari在 发酵过程中菌落结构的变化情况，发现第3个月嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)大量增殖，第6个月破布子乳酸菌(Lactobacilluspobuzihii)大量增 殖，而3至6个月出现了肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)以及6至9 个月出现了印度杆菌(Bacillus indicus)，这些已确定的优势菌株可用来优化发 酵技术和缩短发酵时间，使Ngari实现工业化生产。Riebroy等(Riebroy S et， al.2008)对泰国鱼糜Som-fug的加工工艺进行了改进，将戊糖片球菌、植物乳 杆菌和乳酸片球菌分别接种至黄笛鲷上，发现与自然发酵鱼糜相比，接种了乳 酸片球菌的鱼糜发酵周期更短，并且具有较高的感官品质。卢晓莉(卢晓莉， 2007)从传统鱼鲊中筛选出植物乳杆菌和戊糖片球菌这两种优势菌株，作为复 合发酵剂接种鱼鲊，明显提高了产品的营养品质，并使产品具有更浓郁的发酵 风味。裘迪红等(裘迪红等，2015)用植物乳杆菌发酵草鱼，并对草鱼发酵过 程中的挥发性成分进行了分析，结果表明，发酵使土腥味的己醛、庚醛减少， 蘑菇香味的1-辛烯-3-醇增多，发酵后期还产生了有薄荷香味的丙酮和有奶油香 味的乙偶姻等增香成分。高沛(高沛，2017)对发酵成熟酸鱼的风味物质进行 主成分分析，发现Lp-120主要促进乙酸酯类风味物质的形成，Sx-135和Sc-31 主要促进乙酯类风味物质的形成。张潇等(张潇等，2016)用植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、戊糖片球 菌(Pediococcus pentosaceus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合发酵 草鱼制作鲊鱼，结果表明，接种发酵可使鲊鱼中的有害菌和生物胺得到抑制， 有利于保证鲊鱼产品的生物安全性。因此如果采用优良的发酵剂进行接种发酵， 可在一定程度避免上述自然发酵方式所产生的问题。
目前，用于发酵动物性食品的菌株种类主要是以乳酸菌、葡萄球菌和酵母 菌为主，发酵植物性食品主要是以乳酸菌、酵母菌和霉菌为主。乳酸菌在发酵 过程中能与发酵体系中其他微生物等互相作用，共同发酵产生醇、醛、酮、酸 等，生成发酵食品的特殊风味物质，同时它能够起到分解有机物，产生乳酸、 醋酸、丙酸等有机酸以及类似细菌素的细小蛋白质或肽类(抗菌肽)，具有抑制其 他有害细菌生长的作用。
然而，发酵鱼类制品风味的形成不仅只是依靠乳酸菌代谢产生，鱼体自身 还含有大量的内源酶会使蛋白质降解，释放出游离氨基酸，这就为微生物提供 了可利用的底物。然而内源酶的释放需要较长的时间，对风味的增加起到的作 用比较慢。因此，可以通过添加一些风味酶、脂肪酶等蛋白酶类与微生物发酵 协同作用，使其在发酵过程中释放出更多的游离氨基酸或游离脂肪酸，加快发 酵的进程，丰富鱼肉的滋味成分并使其营养特性、感官品质得到一定程度的提 高。另外，也可加入溶菌酶等抑菌酶类，提高发酵鱼肉制品的安全性。
此外，鱼肉腌制前若含水量较高会在发酵过程中出水过多，导致鱼肉鲜味 降低，因此，可以通过添加酵母抽提物来起到一个明显的增鲜作用。酵母抽提 物是以食品用酵母为主要原料，以酵母自身的酶或外加食品级酶的共同作用下， 酶解自溶(可再经分离提取)后得到的产品，并富含氨基酸、肽、多肽等酵母 细胞中的可溶性成分，具有良好的增鲜、增香作用。酵母抽提物主要分为高肽 类、高I+G类以及高葡聚糖类。关于酵母提取物用于改善发酵鱼制品风味，提高 鱼肉的鲜度研究报道还鲜有报道。
在众多发酵淡水鱼产品中，固态发酵是一种能提供优质蛋白质资源、深受 人们喜爱的发酵方法，在现代工业化生产中，固态发酵相对液态发酵具有设备 投资少、操作简便等优点，因此，微生物固态发酵剂逐渐成为热点，对各种固 态发酵剂的研究也相继增多。固态发酵剂是指经过真空冷冻干燥法、喷雾干燥 法或微波干燥法等方法制得呈干粉状或颗粒状的发酵剂。真空冷冻干燥作为目 前多数微生物干燥的主要方法，是指将菌液在较低的温度(一般为-10～-50℃) 下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最 终使物料脱水的干燥技术，其对菌体和菌体内的活性生物大分子保存较完备， 也适用于热敏性和对热敏感的微生物；喷雾干燥是直接将制备好的菌悬液经过 雾化装置喷雾成雾状，在干燥室内与高温空气直接接触进行传热传质，产品分 散性和溶解性较好，生产过程简单，设备相对成本较低，特别适用于工业化连 续生产；微波干燥法是通过微波加热原理使物料内部水分加热蒸发得到干燥效 果的，具有加热速度快的优点，低剂量的微波还具有较明显非热效应(亦称生 物效应)，能够改变微生物的细胞膜通透性、代谢情况以及繁殖时间，若采用较 低温度的微波条件不仅可以降低物料的水分含量，起到干燥作用，同时还可以 促进菌体的代谢和生长，且对食品的营养成分影响不大。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)发酵鱼制品大多是利用自然界的微生物在适宜的温湿条件下发酵而成 的，这种传统自然发酵方式的加工环境和发酵条件随机性强且因原料的不同， 使得每种发酵制品的风味差异大，产品品质难以控制，安全性难以保证，发酵 周期较长，从而导致这类发酵鱼制品缺乏统一的生产质量标准，难以实现工业 化和规模化生产。
(2)液态发酵是以液体为培养基，进行微生物的生产繁殖并将其菌液进行 接种，此法存在菌体生长量低，占用空间大，不易保存等缺点。
(3)在发酵过程中，鱼体自身含有大量的内源酶会使蛋白质降解，释放出 游离氨基酸，为微生物提供了可利用的底物。然而，由于快速发酵的周期时间 短，从而导致内源酶的释放需要较长的时间，对风味的增加起到的作用比较慢。
(4)发酵鱼肉制品通常会随着发酵过程中水分的产生以及其他环境因素的 影响，从而导致鱼肉鲜香味不足。
解决上述技术问题的难度：
(1)菌酶比例复配比例的优选；
(2)菌酶协同固态发酵剂干燥方式的优选。
(3)为了起到增鲜作用酵母抽提物类型的选择。
解决上述技术问题的意义：
(1)确定一个最优的菌酶比例使得微生物与酶能更好地结合，有利于在发 酵过程中增加其滋味成分并且使其营养特性得到一定程度地提高。
(2)确定菌酶协同固态发酵剂的干燥方式能够最大程度地保留住该固态发 酵剂的活性和效果，使得鲊鱼制品的品质得到更好地提升。
(3)由于酵母菌抽提物的种类较多，其根据种类的不同产品的特性也略有 不同，添加一种最适合的酵母抽提物对鲊鱼制品的整体鲜味地提升起到一个很 重要的作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于复合菌种结合酸性蛋白 酶的菌酶协同作用固态发酵剂。
本发明是这样实现的，一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用 固态发酵剂由菌酶母液、填充料(按菌酶母液质量的5～15％加入)、保护剂(按 菌酶母液质量的5～20％)组成；
所述菌酶母液由植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌及酸性蛋白酶组成；
所述植物乳杆菌XSB-001，已保藏于中国典型培养保藏中心CCTCC，保藏号 CCTCCM2012396；生物材料的分类命名：植物乳杆菌XSB-001Lactobacillus plantarum XSB-001，单位全称：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武 汉大学，保藏日期：2012年10月11日，保藏编号：CCTCC NO：M2012396。
所述乳酸片球菌，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，保藏号CICC10344；
所述戊糖片球菌，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，保藏号 CICC22227；
所述植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌菌体活菌数 106cfu/mL～109cfu/mL；所述植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌分别培养至11～15h、7～12h、5～16h后6000rpm进行冷冻离心浓缩后，植物乳杆菌：乳酸 片球菌：戊糖片球菌按菌泥菌泥体积比100：(10～100)：(10～100)计；
所述酸性蛋白酶的添加量为0.5～3.5mL/100g鱼肉，所述酸性蛋白酶含量 10000～20000U/mL；
所述填充料分为喷雾干燥填充料(按质量比由2～6％的可溶性淀粉、2～6％的 脱脂奶粉组成)、真空冷冻干燥填充料(按质量比由5％～10％的预糊化淀粉、 2％～6％的脱脂奶粉组成)、微波干燥填充料(按质量比由0.5％～2％淀粉和0.5％～2％ 麦芽糊精组成)三者中的一种；
所述保护剂分别为喷雾干燥保护剂(按质量比由1～5％甘油、4～8％蔗糖、1～5％明胶组成)、真空冷冻干燥保护剂(按质量比由1～3％胶原小肽、4～8％海藻糖、 1～4％β-环糊精组成)、微波干燥保护剂(按质量比由0.5～2％蔗糖、0.1～1％甘油、 0.5～2％脱脂乳和0.5％～2％海藻酸钠组成)三者中的一种。
本发明的另一目的在于提供一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同 作用固态发酵剂的制备方法，所述基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作 用固态发酵剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌种的制备：植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS 琼脂培养基活化2次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养 基分别培养11～15h、7～12h、5～16h，使菌体活菌数均达到106～109cfu/mL；4℃ 6000rpm冷冻离心，菌体沉淀用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理 盐水，4℃冰箱保存，24h内备用；
步骤二，菌酶母液的制备：步骤一得到的活菌数达到106～109cfu/mL的植物 乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌在4℃6000rpm冷冻离心浓缩后，植物乳杆 菌：乳酸片球菌：戊糖片球菌按菌泥体积比为100：(10～100)：(10～100)计， 将菌泥混合，加入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为 0.5～3.5mL/100g鱼肉，记为菌酶母液；
步骤三，菌酶母液的干燥。干燥方式可采用以下三种方式中的一种。
(1)喷雾干燥：按质量比计向菌酶母液加1～5％甘油、4～8％蔗糖、1～5％明 胶作为抗热保护剂，另加2～6％的可溶性淀粉、2～6％的脱脂奶粉作为填充料。设 定其喷雾干燥条件为：进料温度10～20℃、出料温度60～80℃、流速为 120mL/h～180mL/h即得到固态复合发酵菌剂，该复合发酵剂的内控质量标准为 三个菌的活菌总数达到107cfu/mL，三个菌的活菌数分别达到106cfu/mL。采用聚 乙烯包装袋密封包装上述固态复合发酵菌剂，在4℃保存备用。
(2)真空冷冻干燥：按质量比向菌酶母液中添加保护剂1～3％胶原小肽、 4～8％海藻糖、1～4％β-环糊精作为保护剂，另加5％～10％的预糊化淀粉、2％～6％ 的脱脂奶粉作为填充料。先在-20℃冰箱预冻1～2h，随后放入真空冷冻干燥机。 冻干程序为：以-20～-45℃冻结菌酶母液，持续3～4h，随后以2℃/h程序升温到 室温20℃，真空度保持在100mbar以下。冻干之后进行简单地粉碎处理并装入 铝箔包装袋，在4℃保存备用。
(3)微波干燥：按质量比计加0.5～2％蔗糖、0.1～1％甘油、0.5～2％脱脂乳和0.5％～2％海藻酸钠作为保护剂，另加0.5％～2％淀粉和0.5％～2％麦芽糊精作为填充料。设定的微波条件是：采用脉冲微波或间歇微波，微波剂量为0.5～3kW/kg， 总处理时间为2～60min，其中微波时间占总处理时间的30～70％，使干燥结 束时发酵剂的温度至70℃以下，水分含量至20～15％或以下。
进一步，步骤一中菌种的制备前需进行菌种活化，具体包括：
(1)冷冻干燥管开管，用沾有70％酒精的棉花擦拭外管，在火焰上加热外 管的尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端，取出隔 热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管的棉塞；
(2)无菌吸管，吸取0.3-0.5mL指定的液体培养基，滴入管内，并震荡， 直到均匀悬浮；
(3)取0.1-0.2mL的菌体悬浮液于指定平板培养基上，做划线分离培养或 做稀释，用无菌L型玻璃棒均匀涂抹，检验菌种的纯度及活化情况；剩余菌体 全部移入指定液体培养基内，并依据指定温度培养；
本发明的另一目的在于提供一种利用所述基于复合菌种结合酸性蛋白酶的 菌酶协同作用固态发酵剂的发酵鲊鱼的发酵方法，所述发酵鲊鱼的发酵方法包 括：
步骤1，接种发酵，新鲜草鱼洗净，去头、去尾、去内脏，切成约1cm×2cm×2cm 的小块，洗净并沥水。鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称 取鱼肉100g、米粉15～60g、辣椒10％～30％、生姜2％～10％、食盐1％～5％，加水 30～50mL，接入固态发酵剂，按鱼体重量计加入1％～10％，装瓶、压实并密封； 置于15～35℃恒温培养箱，保温发酵24～72h；
步骤2，终止发酵，将发酵好的草鱼肉块取出，按质量比计加入0.5％～1.5％ 的安琪酵母抽提物FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或FIG12LS或FIG18LS 或FA01或FIG00或F55或F58进行混匀后放入真空包装袋，将其100℃蒸煮 20min～40min终止发酵，冷却至室温。
其中，自然发酵作为空白对照组。方法步骤包括：新鲜草鱼洗净，去头、 去尾、去内脏，切成约1cm×2cm×2cm的小块，洗净并沥水；鲜红辣椒洗净，去 籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称取鱼肉100g、米粉15～60g、辣椒10％～30％、 生姜2％～10％、食盐1％～5％，加水30～50mL，混合均匀装瓶、压实并密封；置于 15～35℃恒温培养箱，保温发酵24～72h后，将发酵好的草鱼肉块取出放入真空 包装袋，将其100℃蒸煮20min～40min终止发酵，冷却至室温。
进一步，步骤1、步骤2中的发酵温度25～35℃。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述基于复合菌种结合酸性蛋白酶的 菌酶协同作用固态发酵剂的发酵臭鳜鱼的发酵方法，所述发酵臭鳜鱼的发酵方 法包括以下步骤：
步骤1，接种发酵，新鲜鳜鱼去头、去尾、去内脏，洗净并沥水；鲜红辣椒 洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎。称取鱼肉100g、辣椒10％～30％、生 姜2％～10％，食盐1％～5％，加水30～50mL，接入固态发酵剂，按鱼体重量计加入 1％～10％，装瓶、压实并密封；置于10～25℃恒温培养箱，保温发酵2d～10d；
步骤2，终止发酵，将发酵好的鳜鱼肉取出，按质量比计加入0.5％～1.5％的 酵母抽提物FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或FIG12LS或FIG18LS或FA01 或FIG00或F55或F58进行混匀后放入真空包装袋中，将其100℃蒸煮20～40min 终止发酵，冷却至室温。
其中，自然发酵作为空白对照组。方法步骤包括：新鲜鳜鱼去头、去尾、 去内脏，洗净并沥水；鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎。称 取鱼肉100g、辣椒10％～30％、生姜2％～10％，食盐1％～5％，加水30～50mL，混 合均匀装瓶、压实并密封；置于10～25℃恒温培养箱，保温发酵2～10d后取出 鱼肉，放入真空包装袋中，将其100℃蒸煮20～40min终止发酵，冷却至室温。
进一步，步骤1、步骤2中发酵温度10～25℃。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明采用优良的固态复配发酵菌剂进行接种发酵，能够明显缩短发酵鱼 肉的周期，在一定程度上避免杂菌的污染，提升产品的安全性，降低生产成本， 还可以改善产品的营养、品质和风味，有助于使传统发酵鱼制品实现工业化、 标准化和规模化的生产。
本发明将发酵菌液制成固态发酵剂，在产品上产上具有设备投资少、操作 简便等优点，利于工业化生产。
本发明采用菌酶结合协同发酵的方法对鱼肉进行快速发酵，酸性蛋白酶在 酶的活性部位中含有一个或更多的羧基，能够将蛋白质水解成更多的分子小肽， 因能提高氨基酸含量，提高食品风味、改良品质。
本发明按质量比计加入一定量的酵母抽提物，酵母抽提物(YE)主要成分 为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素和微量元素，其中谷氨酸含量达到 8％左右，呈味核苷酸(IMP，GMP)最高达到20％以上，YE是将MSG和IMP、 GMP三种鲜味物质居于一身的鲜味物质，具有很好的增鲜特性。关于酵母提取 物用于改善发酵鱼制品风味，提高鱼肉的鲜度研究报道还鲜有报道。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用 固态发酵剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的总酸含量和pH值示意图。
图3是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的挥发性盐基氮含量和硫代巴比 妥酸含量示意图。
图4是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的可溶性蛋白含量示意图。
图5是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的可溶性固形物含量示意图。
图6是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的电子鼻传感器相应雷达图。
图7是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的滋味特征雷达图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
发酵鱼制品大多是利用自然界的微生物在适宜的温湿条件下发酵而成的， 这种传统自然发酵方式的加工环境和发酵条件随机性强且因原料的不同，使得 每种发酵制品的风味差异大，产品品质难以控制，安全性难以保证，发酵周期 较长，从而导致这类发酵鱼制品缺乏统一的生产质量标准，难以实现工业化和 规模化生产。液态发酵是以液体为培养基，进行微生物的生产繁殖并将其菌液 进行接种，此法存在菌体生长量低，占用空间大，不易保存等缺点。在发酵过 程中，鱼体自身含有大量的内源酶会使蛋白质降解，释放出游离氨基酸，为微 生物提供了可利用的底物。然而，由于快速发酵的周期时间短，从而导致内源酶的释放需要较长的时间，对风味的增加起到的作用比较慢。发酵鱼肉制品通 常会随着发酵过程中水分的产生以及其他环境因素的影响，从而导致鱼肉鲜香 味不足。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一种基于复合菌种结合酸性 蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协 同作用固态发酵剂的制备方法包括以下步骤：
S101：菌种的制备：植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS琼 脂培养基活化2次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养基 分别培养11～15h、7～12h、5～16h，使菌体活菌数均达到106～109cfu/mL；4℃ 6000rpm冷冻离心，菌体沉淀用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理 盐水，4℃冰箱保存，24h内备用。
S102：菌酶母液的制备：步骤S101得到的活菌数达到106～109cfu/mL的植 物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌在4℃6000rpm离心后，植物乳杆菌：乳 酸片球菌：戊糖片球菌按菌泥体积比为100：(10～100)：(10～100)计，将菌 泥混合，加入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为 0.5～3.5mL/100g鱼肉，记为菌酶母液。
S103：菌酶母液的干燥。
下面结合具体实施例对本发明的方案进一步进行描述。
实施例1：
一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂制备发酵鲊 鱼的方法，包括以下步骤：
S1、原料的准备：新鲜草鱼洗净，去头、去尾、去内脏，切成约1cm×2cm×2cm 的小块，洗净并沥水。
S2、发酵：鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称取鱼肉 100g、米粉30％、辣椒20％、生姜8％、食盐3％，加水40mL，接入固态发酵 剂，按鱼体重量计加入10％，装瓶、压实并密封；置于30℃恒温培养箱，保温 发酵48h。
S3、终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出，按质量比计加入1％的安琪酵 母抽提物KU012进行混匀后放入真空包装袋中，将其100℃蒸煮40min终止发 酵，冷却至室温。
所述固态发酵剂由菌酶母液按质量比100份计、填充料12％及保护剂15％ 组成。
所述固态发酵剂的制备步骤如下：
(1)植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活化2 次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养基分别培养15h、 12h、16h，使菌体活菌数均达到109cfu/mL；4℃6000rpm冷冻离心，菌体沉淀 用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理盐水，4℃冰箱保存，24h内备 用。
(2)将(1)中得到的活菌数达到109cfu/mL的植物乳杆菌按体积比100份 计、乳酸片球菌50份、戊糖片球菌50份在4℃6000rpm离心将菌泥混合后，加 入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为1.5mL/100g鱼肉， 此记为菌酶母液。
(3)将菌酶母液进行干燥，干燥方式为真空冷冻干燥。
真空冷冻干燥：按质量比向菌酶母液中添加保护剂2％胶原小肽、2％海藻 糖、2％β-环糊精作为保护剂，另加7％的预糊化淀粉、6％的脱脂奶粉作为填充 料。先在-20℃冰箱预冻2h，随后放入真空冷冻干燥机。冻干程序为：以-45℃ 冻结菌酶母液，持续3h，随后以2℃/h程序升温到室温20℃，真空度保持在 100mbar以下。冻干之后进行简单地粉碎处理并装入铝箔包装袋，在4℃保存备 用。
实施例2：
一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂制备发酵鲊 鱼的方法，包括以下步骤：
S1、原料的准备：新鲜草鱼洗净，去头、去尾、去内脏，切成约1cm×2cm×2cm 的小块，洗净并沥水。
S2、发酵：鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称取鱼肉 100g、米粉60％、辣椒30％、生姜10％、食盐3％，加水45mL，接入固态发 酵剂，按鱼体重量计加入5％，装瓶、压实并密封；置于20℃恒温培养箱，保 温发酵72h。
S3、终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出，按质量比计加入1.0％的安琪 酵母抽提物KK02进行混匀后放入真空包装袋中，将其100℃蒸煮30min终止发 酵，冷却至室温。
所述固态发酵剂由菌酶母液按质量比100份计、填充料11％及保护剂11％ 组成。
所述固态发酵剂的制备步骤如下：
(1)植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活化2 次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养基分别培养13h、 10h、14h，使菌体活菌数均达到108cfu/mL；4℃6000rpm冷冻离心，菌体沉淀 用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理盐水，4℃冰箱保存，24h内备 用。
(2)将(1)中得到的活菌数达到108cfu/mL的植物乳杆菌按体积比100份 计、乳酸片球菌30份、戊糖片球菌70份在4℃6000rpm离心将菌泥混合后，加 入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为0.5mL/100g鱼肉， 此记为菌酶母液。
(3)将菌酶母液进行干燥，干燥方式为微波干燥法。
微波干燥：按质量比计加1.5％蔗糖、0.8％甘油、1.5％脱脂乳和1.5％海藻 酸钠作为保护剂，另加2％淀粉和2％麦芽糊精。设定的微波条件是：采用脉冲 微波或间歇微波，微波剂量为1kW/kg，总处理时间为50min，其中微波时间 占总处理时间的70％，使干燥结束时发酵剂的温度至70℃以下，水分含量至 20％或以下。
实施例3：
一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂发酵臭鳜鱼 的方法，包括以下步骤：
S1、原料的准备：新鲜鳜鱼去头、去尾、去内脏，洗净并沥水。
S2、发酵：鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎。称取鱼肉 100g、辣椒25％、生姜9％，食盐1.5％，混合均匀装瓶、压实并密封；置于18℃ 恒温培养箱，保温发酵4d。
S3、终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出，按质量比计加入1％的安琪酵 母抽提物FA28进行混匀后放入真空包装袋中，将其100℃蒸煮30min终止发酵， 冷却至室温。
所述固态发酵剂由菌酶母液按质量比100份计、填充料7％及保护剂13％ 组成。
所述固态发酵剂的制备步骤如下：
(1)植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活化2 次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养基分别培养15h、 12h、16h，使菌体活菌数均达到109cfu/mL；4℃6000rpm冷冻离心，菌体沉淀 用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理盐水，4℃冰箱保存，24h内备 用。
(2)将(1)中得到的活菌数达到109cfu/mL的植物乳杆菌按体积比100份 计、乳酸片球菌80份、戊糖片球菌80份在4℃6000rpm离心将菌泥混合后，加 入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为2.5mL/100g鱼肉， 此记为菌酶母液。
(3)将菌酶母液进行干燥，干燥方式为喷雾干燥法。
喷雾干燥：按质量比计向菌酶母液加5％甘油、8％蔗糖、5％明胶作为抗热保 护剂，另加6％的可溶性淀粉、6％的脱脂奶粉作为填充料。设定其喷雾干燥条件 为：进料温度10℃、出料温度60℃、流速为160mL/h即得到固态复合发酵菌 剂，该复合发酵剂的内控质量标准为三个菌的活菌总数达到107cfu/mL，三个菌 的活菌数分别达到106cfu/mL。采用聚乙烯包装袋密封包装上述固态复合发酵菌 剂，在4℃保存备用。
实施例4：
一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂发酵臭鳜鱼 的方法，包括以下步骤：
S1、原料的准备：新鲜鳜鱼去头、去尾、去内脏，洗净并沥水。
S2、发酵：鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎。称取鱼肉 100g、辣椒10％、生姜5％，食盐2％，混合均匀装瓶、压实并密封；置于10℃ 恒温培养箱，保温发酵8d。
S3、终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出，按质量比计加入1.5％的安琪 酵母抽提物FIG18LS进行混匀后放入真空包装袋中，将其100℃蒸煮35min终 止发酵，冷却至室温。
所述固态发酵剂由菌酶母液按质量比100份计、填充料15％及保护剂20％ 组成。
所述固态发酵剂的制备步骤如下：
(1)植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活化2 次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养基分别培养13h、 10h、14h，使菌体活菌数均达到108cfu/mL；4℃6000rpm冷冻离心，菌体沉淀 用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理盐水，4℃冰箱保存，24h内备 用；
(2)将(1)中得到的活菌数达到108cfu/mL的植物乳杆菌按体积比100份 计、乳酸片球菌30份、戊糖片球菌30份在4℃6000rpm离心将菌泥混合后，加 入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为1.5mL/100g鱼肉， 此记为菌酶母液。
(3)将菌酶母液进行干燥，干燥方式优选微波干燥。
微波干燥：按质量比计加2％蔗糖、1％甘油、2％脱脂乳和2％海藻酸钠作为 保护剂，另加2％淀粉和2％麦芽糊精。设定的微波条件是：采用脉冲微波或间 歇微波，微波剂量3kW/kg，总处理时间为60min，其中微波时间占总处理时间 的70％，使干燥结束时发酵剂的温度至70℃以下，水分含量至20％或以下。
对比例1：
一种基于自然发酵的发酵鲊鱼的方法，包括以下步骤：
S1、原料的准备：新鲜草鱼洗净，去头、去尾、去内脏，切成约1cm×2cm×2cm 的小块，洗净并沥水。
S2、发酵：鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称取鱼肉 100g、米粉45％、辣椒20％、生姜8％、食盐2％，加水45mL，装瓶、压实并密 封；置于25℃恒温培养箱，保温发酵60h。
S3、终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出放入真空包装袋中，将其100℃ 蒸煮30min终止发酵，冷却至室温。
对比例2：
一种基于自然发酵的发酵臭鳜鱼的方法，包括以下步骤：
S1、原料的准备：新鲜鳜鱼去头、去尾、去内脏，洗净并沥水。
S2、发酵：鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎。称取鱼肉 100g、辣椒15％、生姜5％，食盐1％，混合均匀装瓶、压实并密封；置于10℃ 恒温培养箱，保温发酵2d。
S3、终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出放入真空包装袋汇总，将其100℃ 蒸煮30min终止发酵，冷却至室温。
下面结合结果与分析对本发明作进一步描述。
一、pH值和总酸含量的测定
发酵鱼肉制品的总酸含量和pH值如图2所示，总酸和pH值不同主要是由 于发酵过程中氨基酸、有机酸和胺类化合物的产生不同，总酸的增加可能是由 于发酵过程中产生的有机酸造成的。
与对比例1和对比例2相比，实施例1、实施例2和实施例3、实施例4的 总酸含量都有不同程度的升高，说明添加菌株对其鱼肉进行发酵能在一定程度 上增加总酸含量。实施例1和实施例2的总酸含量相比对比例1分别提高7.82 g/kg、9.55g/kg，实施例3和实施例4相比对比例2分别提高0.99g/kg、1.90g/kg。 pH值上实施例1、实施例2和实施例3、实施例4均比对比例1和对比例2低， 通常认为pH值低于4.5，就可以抑制腐败菌的生长，保证产品的安全性，实施 例1pH值为4.04，实施例2的pH值为4.07，均低于4.5，有利于产品的安全性。
二、挥发性盐基氮(TVB-N)含量和硫代巴比妥酸值(TBA)的测定
发酵鱼肉制品的挥发性盐基氮含量和硫代巴比妥酸含量如图3所示。
挥发性盐基氮是指某些蛋白质及含氮物质被微生物分泌的蛋白酶降解或脱 氨反应形成，其可以反映产品的腐败程度，欧盟规定鱼肉中的挥发性盐基氮含 量不得高于35mg/100g。实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的挥发性盐 基氮含量均低于这个指标，而对比例2的挥发性盐基氮含量已高过欧盟的标准。 硫代巴比妥酸值可以代表鱼肉制品中脂肪的氧化情况，若TBA值过高氧化过度 则会产生不好的风味且不利于产品的安全性，如轻微氧化有时还可促进风味的 形成，可以看出实施例1、实施例2和实施例3、实施例4的TBA值均低于对比 例1和对比例2，说明接种菌株进行发酵能显著抑制其他腐败微生物的生长以及 微生物的内源酶作用使得发酵鲊鱼制品中的抗氧化肽增多，使脂肪氧化受到抑 制。
从图3中可以看出实例1、实例2的挥发性盐基氮和硫代巴比妥酸含量均低 于对比例1，其挥发性盐基氮分别降低12.12mg/100g、10.2mg/100g，硫代巴比 妥酸含量分别降低0.24mg/kg、0.20mg/kg；实例3、实例4的挥发性盐基氮和 硫代巴比妥酸含量也均低于对比例2，其挥发性盐基氮分别降低18.2mg/100g、 11.86mg/100g，硫代巴比妥酸含量分别降低0.52mg/kg、0.33mg/mg。
综上，说明菌酶液接入发酵的鱼肉制品的安全品质优于自然发酵的鱼肉制 品。
三、可溶性蛋白质和可溶性固形物的测定
发酵鱼肉制品的可溶性蛋白含量和可溶性固形物含量如图4、图5所示。
从图4、图5中可以看出，实施例1、实施例2和实施例3、实施例4的可 溶性蛋白含量和可溶性固形物含量均高于对比例1和对比例2。实施例1、实施 例2相比对比例1可溶性蛋白含量分别提高0.93mg/g、1.61mg/g，其可溶性固 形物含量分别提高0.90％、2.15％；实施例3、实施例4相比对比例2可溶性蛋 白含量分别提高2.00mg/g、2.34mg/g，其可溶性固形物含量分别提高1.18％、 4.07％。可以说明酸性蛋白酶的加入可促进蛋白质的水解，加快鱼肉制品的发酵 进程并且有利于更多的滋味物质在短时间生成。
四、电子鼻的测定
发酵鱼肉制品的电子鼻测定结果如图6所示。
从图中可以看出，发酵鱼肉制品之间的风味都较为相似，且实例1、实例2 和实例3、实例4的风味强度强于比例1和比例2，尤其是实例1和实例4的风 味最佳。说明添加菌酶液进行发酵的鱼肉不仅可以实现风味的保真且能大大提 高产品的风味品质。
五、电子舌的测定
发酵鱼肉制品的电子舌测定结果如图7所示，其中图中的AHS代表酸味， CTS表示代表咸味，NMS代表鲜味，ANS代表甜味，SCS代表苦味。鲜味主要来 源于氨基酸和核苷酸的分解代谢，酸味主要来源于酒石酸、苹果酸、乳酸、醋 酸、柠檬酸和琥珀酸等，酸度对鱼肉口感风味和成熟度有良好的改善作用，咸 味主要来源于一些无机盐离子，苦味在低浓度下表现为为丰富性，如咖啡和啤 酒的苦味感。这些滋味特征的变化可能源于氨基酸、糖类和核苷酸等代谢。
从图中可以看出，实施例1、实施例2和实施例3、实施例4相比对比例1 和对比例2在滋味上均有较大的改善。实施例1、实施例2在酸味、咸味、咸味 和甜味相比对比例1均有不同程度地提高，而在苦味方面有较大地改善，总体 提高了发酵鲊鱼鱼肉的滋味品质，其中实例2的滋味品质最优。实例3、实例4 在酸味、咸味、咸味和甜味相比对比例2都有显著提高，也显著改善了产品的 苦味，提升了发酵臭鳜鱼的滋味品质，尤其是实例4。
由此可以说明酸性蛋白酶的加入能大大的提升发酵鱼肉制品的风味，其能 够将蛋白质水解成更多的分子小肽，因能提高氨基酸含量，提高食品风味、改 良品质。
综上，加入菌酶液发酵的鱼肉制品其滋味品质由于自然发酵的鱼肉制品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂，其特征在于，所述基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂由菌酶母液、填充料、保护剂组成；按质量计，填充料为菌酶母液质量的5～15％、保护剂为菌酶母液质量的5～20％；
所述菌酶母液由植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌及酸性蛋白酶组成；
所述植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌菌体活菌数106～109cfu/mL；所述植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌分别培养至11～15h、7～12h、5～16h后6000rpm进行冷冻离心浓缩，按按菌泥体积比植物乳杆菌：乳酸片球菌：戊糖片球菌为100：(10～100)：(10～100)；
所述酸性蛋白酶的添加量为0.5～3.5mL/100g鱼肉，所述酸性蛋白酶含量10000～20000U/mL；
所述填充料分为喷雾干燥填充料、真空冷冻干燥填充料、微波干燥填充料中的一种；
所述喷雾干燥填充料，按质量比由2～6％的可溶性淀粉、2～6％的脱脂奶粉组成；真空冷冻干燥填充料按质量比由5％～10％的预糊化淀粉、2％～6％的脱脂奶粉组成；微波干燥填充料按质量比由0.5％～2％淀粉和0.5％～2％麦芽糊精组成；
所述保护剂分别为喷雾干燥保护剂、真空冷冻干燥保护剂、微波干燥保护剂中的一种；
所述喷雾干燥保护剂按质量比由1～5％甘油、4～8％蔗糖、1～5％明胶组成；真空冷冻干燥保护剂按质量比由1～3％胶原小肽、4～8％海藻糖、1～4％β-环糊精组成；微波干燥保护剂按质量比由0.5～2％蔗糖、0.1～1％甘油、0.5～2％脱脂乳和0.5％～2％海藻酸钠组成。
2.一种如权利要求1所述的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的制备方法，其特征在于，所述基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌种的制备：植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活化2次，30℃培养分别培养至48h；接种至200m L MRS液体培养基分别培养11～15h、7～12h、5～16h，使菌体活菌数均达到106～109cfu/mL；4℃6000rpm冷冻离心，菌体沉淀用无菌生理盐水清洗两次，重新悬浮于无菌生理盐水，4℃冰箱保存，24h内备用；
步骤二，菌酶母液的制备：步骤一得到的活菌数达到106～109cfu/mL的植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌在4℃6000rpm冷冻离心浓缩后，植物乳杆菌：乳酸片球菌：戊糖片球菌按菌泥体积比为100：(10～100)：(10～100)计，将菌泥混合后，将菌泥混合，加入10000～20000U/mL酸性蛋白酶液体；酸性蛋白酶的添加量为0.5～3.5mL/100g鱼肉，记为菌酶母液；
步骤三，菌酶母液的干燥。
3.如权利要求2所述的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤一中菌种制备前需进行菌种活化，具体包括：
(1)冷冻干燥管开管，用沾有70％酒精的棉花擦拭外管，在火焰上加热外管的尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端，取出隔热纤维纸和内管，取出内管的棉塞；
(2)无菌吸管，吸取0.3-0.5mL指定的液体培养基，滴入管内，并震荡，直到均匀悬浮；
(3)取0.1-0.2mL的菌体悬浮液于指定平板培养基上，做划线分离培养或做稀释，用无菌L型玻璃棒均匀涂抹，检验菌种的纯度及活化情况；剩余菌体全部移入指定液体培养基内，并依据指定温度培养。
4.如权利要求2所述的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤三中，干燥方式采用如下三种方式中的一种：
(1)喷雾干燥：按质量比计向菌酶母液加1～5％甘油、4～8％蔗糖、1～5％明胶作为抗热保护剂，另加2～6％的可溶性淀粉、2～6％的脱脂奶粉作为填充料；设定其喷雾干燥条件为：进料温度10～20℃、出料温度60～80℃、流速为120mL/h～180mL/h即得到固态复合发酵菌剂，该复合发酵剂的内控质量标准为三中菌株的活菌总数达到107cfu/mL，三个菌的活菌数分别达到106cfu/mL，采用聚乙烯包装袋密封包装上述固态复合发酵菌剂，在4℃保存备用；
(2)真空冷冻干燥：按质量比向菌酶母液中添加保护剂1～3％胶原小肽、4～8％海藻糖、1～4％β-环糊精作为保护剂，另加5％～10％的预糊化淀粉、2％～6％的脱脂奶粉作为填充料，先在-20℃冰箱预冻1～2h，随后放入真空冷冻干燥机，冻干程序为：以-20～-45℃冻结菌酶母液，持续3～4h，随后以2℃/h程序升温到室温20℃，真空度保持在100mbar以下，冻干后进行粉碎处理并装入铝箔包装袋，在4℃保存备用；
(3)微波干燥：按质量比计加0.5～2％蔗糖、0.1～1％甘油、0.5～2％脱脂乳和0.5％～2％海藻酸钠作为保护剂，另加0.5％～2％淀粉和0.5％～2％麦芽糊精，设定的微波条件是：采用脉冲微波或间歇微波，微波剂量为0.5～3kW/kg，总处理时间为2～60min，其中微波时间占总处理时间的30～70％，使干燥结束时发酵剂的温度低于70℃，水分含量小于15～20％。
5.一种利用权利要求1所述的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的发酵鲊鱼的发酵方法，其特征在于，所述发酵鲊鱼的发酵方法包括：
步骤1，接种发酵：新鲜草鱼洗净，去头、去尾、去内脏，切成约1cm×2cm×2cm的小块，洗净并沥水；鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称取鱼肉100g、米粉15～60g、辣椒10％～30％、生姜2％～10％、食盐1％～5％，加水30～50mL，接入固态发酵剂，按鱼体重量计加入1％～10％，装瓶、压实并密封；置于15～35℃恒温培养箱，保温发酵24～72h；
步骤2，终止发酵：将发酵好的草鱼肉块取出，按质量比计加入0.5％～1.5％的安琪酵母抽提物FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或FIG12LS或FIG18LS或FA01或FIG00或F55或F58进行混匀后放入真空包装袋，将100℃蒸煮20min～40min终止发酵，冷却至室温。
6.如权利要求5所述的发酵臭鳜鱼发酵方法，其特征在于，步骤1、步骤2中的发酵温度为25～35℃。
7.一种利用权利要求1所述的基于复合菌种结合酸性蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的发酵臭鳜鱼的发酵方法，其特征在于，所述发酵臭鳜鱼的发酵方法包括以下步骤：
步骤1，接种发酵：新鲜鳜鱼去头、去尾、去内脏，洗净并沥水；鲜红辣椒洗净，去籽后剁碎；生姜洗净去皮，切碎；称取鱼肉100g、辣椒10％～30％、生姜2％～10％，食盐1％～5％，加水30～50mL，接入固态发酵剂，按鱼体重量计加入1％～10％，装瓶、压实并密封；置于10～25℃恒温培养箱，保温发酵2d～10d；
步骤2，终止发酵：将发酵好的鳜鱼肉取出，按质量比计加入0.5％～1.5％的酵母抽提物FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或FIG12LS或FIG18LS或FA01或FIG00或F55或F58进行混匀后放入真空包装袋中，将100℃蒸煮20～40min终止发酵，冷却至室温。
8.如权利要求7所述的发酵臭鳜鱼的发酵方法，其特征在于，步骤I、步骤II中的发酵温度10～25℃。
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