CN110776536A - 一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，包括有发酵液预处理、干菌粉浸泡提取、浓缩、萃取、结晶等步骤，得到了纯度大于90％的丁烯基多杀菌素。其中结晶过程将溶析结晶和低温结晶相结合，在保证重结晶收率的同时，实现了丁烯基多杀菌素产物中丁烯基多杀菌素A和丁烯基多杀菌素D含量的可控，前者是后者含量的5‑8倍。该工艺成本低、生产设备简单、产率高、产物组成可控，具有工业化应用前景。

Description

一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺

技术领域

本发明涉及从发酵液中提取抗生素的方法。更具体地，涉及一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺。

背景技术

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyns)又名pogonins，由是土壤放线菌须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)代谢产生的一类与多杀菌素结构类似、杀虫机制相同的大环内酯类杀虫剂。丁烯基多杀菌素具备多杀菌素独特的杀虫机制，同时对害虫具有较强的摄食毒性及快速触杀毒性。主要作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholinereceptor，nAchR)、γ-氨基丁酸受体(γ-amino-hutyric acid receptor，GABA)，通过刺激神经系统从而引起兴奋，导致非功能性的肌肉收缩，颤抖，衰竭和麻痹等，最终使得害虫死亡，丁烯基多杀菌素独特的杀虫机制使其对非靶标性益虫、哺乳动物、环境等不造成任何威胁，是一种安全可靠的新型生物杀虫剂，兼具化学农药的高效性及生物农药的安全性。此外，丁烯基多杀菌素比多杀菌素具有更多的衍生物，到目前为止，已检测到30多种丁烯基多杀菌素衍生物。丁烯基多杀菌素和多杀菌素两者均具有杀虫、杀螨、杀虱活性，但丁烯基多杀菌素比多杀菌素具有更宽的杀虫谱，它能有效的控制膜翅目、鳞翅目、缨翅目、双翅目、鞘翅目等害虫，对鳞翅目、缨翅目具有较强的选择性杀虫活性，对多杀菌素难控制的对农作物危害极大的烟青虫、苹果蠹蛾、马铃薯甲虫等丁烯基多杀菌素却能有效防治，丁烯基多杀菌素比多杀菌素具有更高的杀虫活力和更为广泛的杀虫谱，有望成为新一代多杀菌素类高效杀虫剂。

丁烯基多杀菌素难溶于水，但随着pH的减小，溶解度会增大，它易溶于醇类、酯类等多种极性、非极性有机溶剂。经有氧发酵后须糖多孢菌发酵液中主要含有丁烯基多杀菌素A(spinosyn α1)和D(spinosyn δ1)两种杀虫活性成分。丁烯基多杀菌素A的分子式为C₄₃H₆₇NO₁₀，分子量为757.99，熔点为110℃，蒸气压(25℃)：1.30×10^-14Pa，水中溶解度与pH值密切相关，在pH 5.0的溶解度为184ppm，在甲醇中的溶解度为150000ppm左右；丁烯基多杀菌素D的分子式为C₄₄H₆₉NO₁₀，分子量为771.99，熔点为160℃左右，蒸气压(25℃)：1.10×10^-14 Pa，水中溶解度与pH值密切相关，在pH 5.0的溶解度为17.5ppm左右，在甲醇中的溶解度为2100ppm左右。丁烯基多杀菌素的结构式如下所示，其中R＝H 时，是丁烯基多杀菌素A，R＝CH₃时，是丁烯基多杀菌素D。

丁烯基多杀菌素作为一种绿色安全高效生物农药，应用前景非常广阔。自然条件下丁烯基多杀菌素的降解途径主要分为光降解和微生物降解，最终转化成对环境无害的C、H、O和N等成分，由于其在环境中短暂性存在，只要合理使用就不会对地下水等造成危害，因此安全性较高。研究发现，丁烯基多杀菌素A和D对烟夜娥幼虫LC50活性相当，但丁烯基多杀菌素A对棉蚜虫、粉虱的 LC50较丁烯基多杀菌素D高5倍以上。若使用纯度更高或单独以丁烯基多杀菌素A作为有效成分，杀虫活性可能会更好。另外以丁烯基多杀菌素A为先导化合物，可以合成一系列的丁烯基多杀菌素衍生物，对发现杀虫活性更好的化合物，开发新一代生物农药具有重要意义。

但是目前国际上关于丁烯基多杀菌素的研究仍处在起步阶段，发酵液中丁烯基多杀菌素含量低，造成分离提取困难，且无法控制产物中丁烯基多杀菌素 A和丁烯基多杀菌素D的含量，其应用受到非常大的限制。

因此，需要提供一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，实现产物中丁烯基多杀菌素A和丁烯基多杀菌素D的含量可控。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，该工艺成本低、操作简便、产物纯度高、收率高，且实现了产物中丁烯基多杀菌素A和丁烯基多杀菌素D的含量可控。

本发明的另一个目的在于提供一种由上述提取丁烯基多杀菌素工艺提取得到的丁烯基多杀菌素。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，包括以下步骤：

(1)发酵结束后放罐前，加氢氧化钠调节发酵液pH至8.0-10.0，向发酵液中依次加入硅藻土和珍珠岩助滤剂，混合均匀，然后升温至90℃-95℃，保温搅拌1-3h，发酵液中形成大量的絮状悬浮物，得预处理后发酵液；利用板框压滤机或离心机过滤，然后烘干至含水量为5％-10％，得到干菌粉；

(2)将干菌粉投入浸提罐中，用低沸点极性有机溶剂在室温搅拌浸泡1-2 h，收集有机溶剂浸提液，重复浸提多次，合并浸提液；真空浓缩除去低沸点极性有机溶剂，得油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液；

(3)按照油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液重量和非水溶性有机溶剂体积的比为1:(5-6)g/mL，将两者混合均匀，得到丁烯基多杀菌素负载有机相液；水洗除杂，然后加入酸水进行反萃取，室温静置分层，收集酸水相；其中丁烯基多杀菌素负载有机相液与加入酸水体积比为1-5:1，酸水浓度为0.1-0.4mol/L；

(4)除去酸水相中的有机溶剂，调节酸水相pH为8.0-11.5，产生大量絮状沉淀，离心或过滤得到丁烯基多杀菌素粗结晶；

(5)向丁烯基多杀菌素粗结晶中加入结晶溶剂，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩后，得浓缩液；然后向浓缩液中滴加去离子水，以10-20℃/h的速度程序降温至5-10℃，搅拌养晶，离心，去离子水洗涤晶体 1-3次，真空烘干，得到丁烯基多杀菌素精粉。

在本发明提供的丁烯基多杀菌素提取工艺中，主要包括了发酵液预处理、干菌粉浸泡提取、浓缩、萃取、提取、结晶等步骤，特别是通过对结晶过程中结晶溶剂类型、含量、结晶温度、养晶时间的调整，实现了产物中丁烯基多杀菌素A和丁烯基多杀菌素D的含量的调控。

优选地，步骤(1)中，硅藻土的加入量为发酵液体积的比为(0.01-0.03):1 g/mL，珍珠岩助滤剂的加入量与发酵液体积的比为(0.02-0.05):1g/mL。更优选地，硅藻土的加入量与发酵液体积的比为0.02:1g/mL，珍珠岩助滤剂的加入量与发酵液体积的比为0.04:1g/mL。在升过程中，先加入硅藻土，搅拌均匀后加入珍珠岩。硅藻土作为丁烯基多杀菌素发酵液的吸附絮凝剂，其吸附杂蛋白等形成大颗粒胶状沉淀从而提升丁烯基多杀菌素发酵液滤速和澄清度，珍珠岩助滤剂为丁烯基多杀菌素发酵液过滤实现固液分离时起助滤作用。

优选地，步骤(2)中，所述低沸点极性有机溶剂为甲醇、石油醚或丙酮；优选为甲醇；优选地，低沸点极性有机溶剂的加入量与丁烯基多杀菌素干菌粉的重量比为(3-8):1mL/g，浸泡温度为20℃-30℃。

进一步地，所述低沸点极性有机溶剂为甲醇，加入甲醇的体积与丁烯基多杀菌素干菌粉重量比为5:1g/mL。

优选地，步骤(3)中，非水溶性有机溶剂包括有甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一种；优选为乙酸乙酯。

优选地，步骤(3)中，酸水包括有草酸水溶液、酒石酸水溶液、柠檬酸水溶液、冰醋酸水溶液中的一种；优选地，所述酸水为酒石酸水溶液。

优选地，步骤(4)中采用真空浓缩方式除去酸水相中的有机溶剂，采用氢氧化钠溶液调节酸水相pH。

优选地，步骤(5)中结晶溶剂为甲醇、乙腈、丙酮中的一种或两种组合。

优选地，步骤(5)中，浓缩液体积为滤液体积的0.1-0.2倍。

优选地，步骤(5)中，加入去离子水的体积是浓缩液体积的0.05-0.1倍；优选地，所述去离子水的滴加速率为1-20mL/min；优选地，所述搅拌养晶时间为6-12h。

在本发明中，步骤(5)中采用了溶析结晶和低温结晶相结合的方式提高丁烯基多杀菌素粗结晶纯度，在保证了重结晶收率的同时提升了丁烯基多杀菌素的质量，得到的丁烯基多杀菌素精粉纯度在90％以上。同时，通过调控工艺参数，制备得到了以丁烯基多杀菌素A为主要成分产物，α表示产物中丁烯基多杀菌素A和丁烯基多杀菌素D的含量比值，本发明产物中α的取值为5-8。

本发明还提供了由上述提取方法得到的一种丁烯基多杀菌素，该丁烯基多杀菌素中丁烯基多杀菌素A的含量是丁烯基多杀菌素D的5-8倍。

本发明提供的丁烯基多杀菌素中丁烯基多杀菌素A的含量是丁烯基多杀菌素D的5-8倍，可用来制备针对棉蚜虫、粉虱等对丁烯基多杀菌素A敏感的害虫的杀虫剂，杀虫效果更好；高含量的丁烯基多杀菌素A也可作为先导化合物，用于合成一系列的丁烯基多杀菌素衍生物，在发现杀虫活性更好的化合物，开发新一代生物农药方面具有重要意义。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，包括有发酵液预处理、干菌粉浸泡提取、浓缩、萃取、结晶等步骤，得到了纯度大于90％的丁烯基多杀菌素。其中结晶过程将溶析结晶和低温结晶相结合，在保证重结晶收率的同时，实现了丁烯基多杀菌素产物中α值的可控，达到了 5-8。同时，本发明的提取工艺中，对调节pH后的发酵液采取了分阶段添加硅藻土和珍珠岩助滤剂的方法，大大提高了过滤效率，并降低了丁烯基多杀菌在滤液中的残留。将发酵液浓缩后浸提，节省了溶剂的用量和能耗，缩短了生产周期。该工艺成本低、生产设备简单、产率高、产物组成可控，具有工业化应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出实施1制得的丁烯基多杀菌素纯品的HPLC检测谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

以下描述的发酵液均为含丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌发酵液。α值表示丁烯基多杀菌素A和丁烯基多杀菌素D的含量之比。

实施例1

一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，具体步骤如下：

(1)发酵结束后放罐前，向100L发酵液中加入浓度为0.1-0.2g/mL的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH至8.5，然后升温，依次加入硅藻土和珍珠岩助滤剂，加入后硅藻土和珍珠岩的浓度分别为0.015g/mL和0.025g/mL，混合均匀，升温至90℃，保温搅拌1.5h，发酵液中形成大量的絮状悬浮物，得预处理后发酵液；预处理后发酵液利用板框压滤机或离心机过滤，完成固液分离所需时间为 1h，滤液中丁烯基多杀菌素含量为50μg/mL，收集滤饼；将收集得到的滤饼在 60-80℃烘干至含水量为7.2％，得到干菌粉。

(2)将烘干后的丁烯基多杀菌素菌丝体投入到浸提罐中，加入甲醇的体积与丁烯基多杀菌素菌丝体的重量比为4:1mL/g，浸泡温度为20℃-30℃，浸泡时间2h，然后离心或过滤实现固液分离，收集有机溶剂浸提液，重复浸提3 次。

(3)将浸提液在60℃-80℃下真空浓缩，除去甲醇，得到丁烯基多杀菌素浓缩液。

(4)按油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液重量和乙酸乙酯的体积比为1:5g/mL 混合，升温至50℃搅拌溶解1-2h，得到丁烯基多杀菌素负载有机相液。

(5)丁烯基多杀菌素负载有机相液水洗除杂2-3次，然后按负载有机相与酸水体积比为2:1，向有机相中加入0.2mol/L酸水进行反萃取，搅拌30min后静置分层，收集酸水相，有机相回收重复利用。

(6)利用真空浓缩法除去酸水中的有机溶剂，用氢氧化钠溶液调节pH至 8.0-11.5，得絮状沉淀，离心或过滤得到丁烯基多杀菌素粗结晶。

(7)将丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：结晶溶剂体积为0.05:1g/mL加入甲醇，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/6，得浓缩液；以1-20mL/min的速率缓慢滴加浓缩液 1/10体积的去离子水，从60℃以10-20℃/h的速度程序降温至5℃-10℃，搅拌养晶8h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到丁烯基多杀菌素精粉，纯度为90.6％，α值(A/D)为5.8，总收率为82.7％。

实施例1制备得到的产物的HPLC检测谱图如图所示，可见精分中主要成分为丁烯基多杀菌素A和D，其中丁烯基多杀菌素A的峰面积为D的5-6倍。

其中丁烯基多杀菌素A的出峰时间为8.08min，D的出峰时间为9.35min；丁烯基多杀菌素A的峰面积为D峰面积的5.4倍，该工艺得到的产品丁烯基多杀菌素纯度达到90％以上。

实施例2

一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，具体步骤如下：

(1)发酵结束后放罐前，向100L发酵液中加入浓度为0.1-0.2g/mL的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH至9.5，然后升温，依次加入硅藻土和珍珠岩助滤剂，加入后硅藻土和珍珠岩的浓度分别为0.025g/mL和0.035g/mL，混合均匀，升温至95℃，保温搅拌2.5h，发酵液中形成大量的絮状悬浮物，得预处理后发酵液；预处理后发酵液利用板框压滤机或离心机过滤，完成固液分离所需时间为40min，滤液中丁烯基多杀菌素含量为30μg/mL，收集滤饼；将收集得到的滤饼在60-80℃烘干至含水量为7.6％，得到干菌粉。

(2)将烘干后的丁烯基多杀菌素菌丝体投入到浸提罐中，加入甲醇的体积与丁烯基多杀菌素菌丝体的重量比为4:1mL/g，浸泡温度为20℃-30℃，浸泡时间2h，然后离心或过滤实现固液分离，收集有机溶剂浸提液，重复浸提3 次。

(3)将浸提浓液在60℃-80℃下真空浓缩，除去甲醇，得到丁烯基多杀菌素油膏。

(4)按油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液重量和乙酸乙酯的体积比为1:5g/mL 混合，升温至50℃搅拌溶解1-2h，得到丁烯基多杀菌素负载有机相液。

(5)丁烯基多杀菌素负载有机相液水洗除杂2-3次，然后按负载有机相与酸水体积比为4:1，向有机相中加入0.4mol/L酸水进行反萃取，搅拌30min后静置分层，收集酸水相，有机相回收重复利用。

(6)利用真空浓缩法除去酸水中的有机溶剂，用氢氧化钠溶液调节pH为 8.0-11.5，得絮状沉淀，离心或过滤得到丁烯基多杀菌素粗结晶。

(7)将丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入乙腈，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以1-20mL/min的速率缓慢滴加浓缩液 1/10体积的去离子水，从60℃以10-20℃/h的速度程序降温至5℃-10℃，搅拌养晶8h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到丁烯基多杀菌素精粉，纯度为91.2％，α值(A/D)为6.1，总收率为83.3％。

实施例3

一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，具体步骤如下：

(1)发酵结束后放罐前，向100L发酵液中加入浓度为0.2-0.3g/mL的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH至9.0，然后升温，依次加入硅藻土和珍珠岩助滤剂，加入后硅藻土和珍珠岩的浓度分别为0.02g/mL和0.04g/mL，混合均匀，升温至95℃，保温搅拌3h，发酵液中形成大量的絮状悬浮物，得预处理后发酵液；预处理后发酵液利用板框压滤机或离心机过滤，完成固液分离所需时间为30 min，滤液中丁烯基多杀菌素含量为20μg/mL，收集滤饼；将收集得到的滤饼在60℃-80℃烘干至含水量为6.8％，得到干菌粉，收率为98.0％。

(2)将烘干后的丁烯基多杀菌素菌丝体投入到浸提罐中，加入甲醇体积与丁烯基多杀菌素菌丝体重量比为5:1mL/g，浸泡温度为20℃-30℃，浸泡时间2h，然后离心或过滤实现固液分离，收集有机溶剂浸提液，重复浸提3次。

(3)将浸提浓液在60℃-80℃下真空浓缩，除去甲醇，得到丁烯基多杀菌素油膏。

(4)按油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液重量和乙酸乙酯的体积比为1:6g/mL 混合，升温至50℃搅拌溶解1-2h，得到丁烯基多杀菌素负载有机相液。

(5)丁烯基多杀菌素负载有机相液水洗除杂2-3次，然后按负载有机相与酸水体积比为3:1，向有机相中加入0.4mol/L酸水进行反萃取，搅拌30min后静置分层，收集酸水相，有机相回收重复利用。

(6)利用真空浓缩法除去酸水中的有机溶剂，用氢氧化钠溶液调节pH为 8.0-11.5，得絮状沉淀，离心或过滤得到多杀菌素粗结晶。

(7)将丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入等体积的甲醇和乙腈混合液，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以1-20mL/min 的速率缓慢滴加浓缩液1/10体积的去离子水，从60℃以10-20℃/h的速度程序降温至5℃-10℃，搅拌养晶8h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到丁烯基多杀菌素精粉，纯度为92.2％，α值(A/D)为7.3，总收率为85.1％。

对比例1

将通过实施例3步骤(6)得到的丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入乙酸丁酯，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以1-20 mL/min的速率滴加浓缩液1/10体积的去离子水，搅拌浓缩液，从60℃以 10-20℃/h的速度降温至5℃-10℃，搅拌养晶8h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到多杀菌素精粉，纯度为88.4％，α值(A/D)为4.7，总收率为70.5％。

可见，将结晶溶剂由甲醇、乙腈及其混合物改变为乙酸丁酯，所得多杀菌素精粉的纯度下降，α值降低，总收率下降。

对比例2

将通过实施例3步骤(6)得到的丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入甲醇溶液，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以25 mL/min的速率滴加浓缩液1/10体积的去离子水，搅拌浓缩液，从60℃以 10-20℃/h的速度降温至5℃-10℃，搅拌养晶8h后，离心，真空烘干，得到多杀菌素精粉，纯度为83.2％，α值(A/D)为4.3，总收率为78.1％。

可见，改变向浓缩液中滴加去离子水的速率，所得多杀菌素精粉的纯度下降，α值降低，总收率下降。

对比例3

将通过实施例3步骤(6)得到的丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入甲醇，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以1-20 mL/min的速率滴加浓缩液1/10体积的去离子水，搅拌浓缩液，从60℃以5-8℃ /h的速度程序降温至5-10℃，搅拌养晶8h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到多杀菌素精粉，纯度为83.4％，α值(A/D)为4.0，总收率为77.9％。

可见，将浓缩液的降温速度由10-20℃/h改变为5-8℃/h，所得多杀菌素精粉的纯度下降，α值降低，总收率下降。

对比例4

将通过实施例3步骤(6)得到的丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入甲醇，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以1-20 mL/min的速率滴加浓缩液1/10体积的去离子水，搅拌浓缩液，从60℃自然降温至室温25℃左右，搅拌养晶8h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3 次，真空烘干，得到多杀菌素精粉，纯度为82.2％，α值(A/D)为4.4，总收率为73.5％。

可见，将浓缩液的降温速率由10-20℃/h改变为自然降温，且降低后的温度由5℃-10℃改变为25℃室温，所得多杀菌素精粉的纯度下降，α值降低，总收率下降。

对比例5

将通过实施例3步骤(6)得到的丁烯基多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积为0.05:1g/mL加入甲醇溶液，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至初始体积的1/9，得浓缩液；以 1-20mL/min的速率滴加浓缩液1/10体积的去离子水，搅拌浓缩液，从60℃以 10-20℃/h的速度降温至室温5℃-10℃，搅拌养晶14h后，离心，少量去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到多杀菌素精粉，纯度为81.6％，α值(A/D) 为4.4，总收率为75.6％。

可见，改变搅拌养晶时间，所得多杀菌素精粉的纯度下降，α值降低，总收率下降。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵结束后放罐前，加氢氧化钠调节发酵液pH至8.0-10.0，向发酵液中依次加入硅藻土和珍珠岩助滤剂，混合均匀，然后升温至90℃-95℃，保温搅拌1-3h，发酵液中形成大量的絮状悬浮物，得预处理后发酵液；利用板框压滤机或离心机过滤，然后烘干至含水量为5％-10％，得到干菌粉；

(2)将干菌粉投入浸提罐中，用低沸点极性有机溶剂在室温下搅拌浸泡1-2h，收集有机溶剂浸提液，重复浸提多次，合并浸提液；真空浓缩除去低沸点极性有机溶剂，得油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液；

(3)按照油膏状丁烯基多杀菌素浓缩液重量和非水溶性有机溶剂体积的比为1:(5-6)g/mL，将两者混合均匀，得到丁烯基多杀菌素负载有机相液；水洗除杂，然后加入酸水进行反萃取，室温静置分层，收集酸水相；其中丁烯基多杀菌素负载有机相液与加入酸水体积比为(1-5):1，酸水浓度为0.1-0.4mol/L；

(4)除去酸水相中的有机溶剂，调节酸水相pH为8.0-11.5，产生大量絮状沉淀，离心或过滤得到丁烯基多杀菌素粗结晶；

(5)向丁烯基多杀菌素粗结晶中加入结晶溶剂，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩后，得浓缩液；然后向浓缩液中滴加去离子水，以10-20℃/h的速度程序降温至5℃-10℃，搅拌养晶，离心，去离子水洗涤晶体1-3次，真空烘干，得到丁烯基多杀菌素精粉。

2.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(1)中，硅藻土的加入量与发酵液体积的比为(0.01-0.03):1g/mL，珍珠岩助滤剂的加入量与发酵液体积的比为(0.02-0.05):1g/mL。

3.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述低沸点极性有机溶剂为甲醇、石油醚或丙酮；优选地，低沸点极性有机溶剂的加入体积与丁烯基多杀菌素干菌粉的重量比为(3-8):1mL/g，浸泡温度为20-30℃。

4.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(3)中，非水溶性有机溶剂包括有甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一种。

5.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(3)中，酸水包括有草酸水溶液、酒石酸水溶液、柠檬酸水溶液、冰醋酸水溶液中的一种；优选地，所述酸水为酒石酸水溶液。

6.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(4)中采用真空浓缩方式除去酸水相中的有机溶剂，采用氢氧化钠溶液调节酸水相pH。

7.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(5)中结晶溶剂为甲醇、乙腈中的一种或两种组合；优选地，步骤(5)中丁烯基多杀菌素粗结晶的质量与加入结晶溶剂体积的比值为(0.01-0.05):1g/mL。

8.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(5)中，浓缩液体积为滤液体积的0.1-0.2倍。

9.根据权利要求1所述的提取丁烯基多杀菌素的工艺，其特征在于，步骤(5)中，加入去离子水的体积是浓缩液体积的0.05-0.1倍；优选地，所述去离子水的滴加速率为1-20mL/min；优选地，所述搅拌养晶时间为6-12h。

10.如权利要求1-9任一所述从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺中提取得到的丁烯基多杀菌素，其特征在于，所述丁烯基多杀菌素中丁烯基多杀菌素A的含量是丁烯基多杀菌素D的5-8倍。

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