CN110760501A

CN110760501A - 一种乙酰胆碱脂酶的共交联固定化方法

Info

Publication number: CN110760501A
Application number: CN201910417654.7A
Authority: CN
Inventors: 吴嘉沁; 张瑞丰; 李艳; 肖通虎; 龙能兵
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110760501B

Abstract

本发明是关于一种乙酰胆碱酯酶的共交联固定化方法。使用油溶性的异氰脲酸三丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的乙酰胆碱酯酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化乙酰胆碱酯酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在79mg酶/g载体时具有最高的比活性，达到游离酶的91％。

Description

一种乙酰胆碱脂酶的共交联固定化方法

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种乙酰胆碱脂酶的共交联固定化方法，该新型固定化乙酰胆碱酯酶可专门用于农药残留检测。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.1.7)是一类糖蛋白(等电点为5.0)，属于丝氨酸水解酶类，是神经中枢的关键酶。乙酰胆碱酯酶主要存在于人类、昆虫以及脊椎动物中，分布于神经组织以及红细胞、血小板、血清等非神经组织中，在神经传导过程中起着重要的作用。正常基体在兴奋时，神经末梢释放出乙酰胆碱，传导刺激，然后被乙酰胆碱酯酶分解而失去作用。乙酰胆碱酯酶对调节人体的各方面的平衡起着多大的作用，酶的破坏甚至会危及人体的健康。

氨基甲酸酯类杀虫剂杀虫活性高，在工农业中被广泛应用，由此带来的农药残留问题已成为影响人类健康与环境安全的重大隐患。有机磷农药和氨基甲酸酯类农药杀灭害虫的机理是利用该农药抑制生物体中乙酰胆碱酯酶的活性，使酶活性减弱或失去催化水解乙酰胆碱的功能，从而将害虫致死。利用这一特性可将乙酰胆碱酯酶固定后制成酶传感器用于检测水体，土壤和果蔬中的农药残留。因此，乙酰胆碱酯酶在环保、医学、农业、军事等各个领域得到广泛的应用。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的乙酰胆碱脂酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的乙酰胆碱脂酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的乙酰胆碱脂酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于乙酰胆碱酯酶的固定，利用乙酰胆碱酯酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种乙酰胆碱酯酶的固定化方法，这种方法是基于乙酰胆碱酯酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂异氰脲酸三丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为乙酰胆碱酯酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过乙酰胆碱酯酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使乙酰胆碱酯酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的乙酰胆碱酯酶；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.5的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将乙酰胆碱酯酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶25mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g异氰脲酸三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的固定化乙酰胆碱酯酶的产物。

非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，乙酰胆碱酯酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，降低了酶的交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化乙酰胆碱酯酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使乙酰胆碱酯酶以极高的效率被固定化；4)采用多官能度的交联剂能使固定化产物形成支化结构，阻止酶的聚集，提高酶的催化性能。

具体实施方式

酶的固定化

1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.5的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将乙酰胆碱酯酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶25mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

5)在搅拌下将1.2g异氰脲酸三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的固定化乙酰胆碱酯酶的产物。

固定化酶的负载量测定：

由于共交联法固定乙酰胆碱酯酶后，反应残留液中测不到乙酰胆碱酯酶的活性，说明经过交联后乙酰胆碱酯酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

酶活力测定：

(1)游离酶酶活测定：在1cm比色皿中依次加入3mL PBS(0.02mol/L，pH＝7.5)，20μL酶液(1U/mL)，100μL DTNB显色剂(20mmol/L)混匀。25℃保温15min后加20μL ATCh底物溶液(0.1mol/L)，混匀后将体系置于酶标仪中，在412nm处比色。测定并记录连续的3min内，毎隔半分钟的读数。根据每分钟内吸光度A₄₁₂nm的变化值来计算酶的活力。设三次重复，两个对照组(对照1：以10μL PBS缓冲溶液代替酶液；对照2：以20μL PBS缓冲溶液代替底物溶液)。酶活力U定义为每毫升酶溶液每分钟水解底物的微摩尔数，其计算公式为：

其中：V为反应总体积(mL)；A为反应吸光度的变化率(min^-1)；v是酶液体积(mL)；ε为吸光系数(L/mmol·mm)；d为测量的光径长度(mm)。

(2)固定化酶酶活测定：精确称取一定量的固定化酶，以不加底物的反应体系吸光度值作为初始值，按照溶液酶的活性测定步骤，在比色皿中将其与PBS和DTNB混匀，25℃保温15min后加入底物ATCh溶液，混合均匀后将比色皿置于酶标仪中，记录反应液在3min内每30s的A₄₁₂nm值。固定化酶活力用每克载体毎分钟水解底物的微摩尔数表征：

其中：m为固定化酶的干重(g)；A为反应吸光度的变化率(min^-1)；v是酶液体积ε为吸光系数(L/mmol·mm)；d为测量的光径长度(mm)。

相对活性：

将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

实验结果：

实验一共得到7个不同负载量的固定化乙酰胆碱酯酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为79mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的91％，这个结果说明乙酰胆碱酯酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量小于79mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而增大，这主要是因为，酶的含量较低时，聚合物结构比较紧密，酶的催化活性不容易发挥出来，随着酶含量增加，聚合物的结构变的松散，酶与底物的接触机会增大，其相对活性也随之提高。当负载量大于79mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联反应都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外支化程度高的交联剂还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又会变小。

我们以负载量为79mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.0条件下经过28天的储存，游离酶溶液只残留45％的活性，固定化酶能残留80％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。

附图说明

图1交联剂的化学结构。

图2固定化的乙酰胆碱酯酶催化活性与其负载量的依赖关系。

图3固定化与游离的乙酰胆碱酯酶储存稳定性比较。

Claims

1.一种乙酰胆碱酯共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相是作为交联剂的异氰脲酸三丙烯酸酯，其结构如下：

水相中的反应物为乙酰胆碱酯酶及结构如下的分子复合物：

所述的乙酰胆碱酯酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：

1)将数均分子量为454的双酚A环氧树脂、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.5的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

3)将乙酰胆碱酯酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围，将不同浓度的乙酰胆碱酯酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶25mL的比例混合；

4)在搅拌下将1.2g异氰脲酸三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的乙酰胆碱酯酶固定化产物。