CN110760448A - 一株促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，经形态学和分子生物学鉴定为鬼伞属真菌(Coprinus sp.)，命名c‑6‑2，菌株的ITS基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏号为GDMCC No.60036；所述的促进带叶兜兰植株生长的菌株在促进带叶兜兰植株生长中的应用。采用本发明提供的菌株促进带叶兜兰育苗的效率和进程，操作简单、成本低廉，对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。

Description

一株促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用。
背景技术
兜兰属(Paphiopedilum)植物，花形奇特，花色艳丽，是人们最喜爱的兰科植物之一，人们常称兜兰为“拖鞋兰”、“仙履兰”。近十几年来，由于猖獗走私以及生境破坏等原因，野生兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，不少种类已经到了灭绝的边缘。
为了缓解对野生植株的采集压力，保护濒危物种，以及满足人们对兜兰属植物的需求，国内外学者对兜兰植物的人工繁殖进行了大量地研究。目前，部分兜兰种类的无菌播种和组织培养技术已获成功，但无菌苗栽培后生长缓慢、成活率低，制约着兜兰的人工繁育。在自然条件下，菌根真菌可以帮助植物度过脆弱的幼苗期长成植株，提高植株提高养分的吸收效率和逆境抵抗力。但因为兜兰属植物菌根真菌分离培养困难，尚缺乏具有较为显著的促生菌株。因此，筛选和培养具有促进兜兰植株生长的菌株对兜兰栽培和种群恢复具有重要意义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，从而能有效的促进带叶兜兰植株生长。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，经形态学和分子生物学鉴定为鬼伞属真菌(Coprinus sp.)，命名c-6-2，菌株的ITS基因序列表如SEQ ID NO.1所示，于2016年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No.60036。
其中，所述促进带叶兜兰植株生长的菌株在促进带叶兜兰植株生长中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明菌株c-6-2与带叶兜兰植株共培养可以促进幼苗生长发育，长出能进行光合作用的叶片，将幼苗移栽至基质培育，幼苗均能存活且生长良好。
(2)采用本发明提供的菌株促进带叶兜兰育苗的效率和进程，操作简单、成本低廉，对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。
附图说明
图1为本发明促进带叶兜兰植株生长的菌株在PDA固态培养基上的菌落形态(背面)。
图2为本发明促进带叶兜兰植株生长的菌株在PDA固态培养基上的菌落形态(正面)。
图3为本发明促进带叶兜兰植株生长的菌株的菌丝形态。
图4为采用本发明促进带叶兜兰植株生长的菌株制备的菌剂对植株生长对比图；图中CK为未使用本发明的菌剂的植株；c-6-2是使用本发明的鬼伞属(Coprinus sp.)c-6-2制备的固体菌剂。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
菌根真菌的分离鉴定和培养：
(1)分离及纯化培养基
分离菌根真菌培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，马铃薯200g、琼脂6g、葡萄糖15g，补水至1000ml，PH自然。依照常规生物学试验方法，配置分离培养基，121℃高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至45℃左右，加入链霉素(100ug/ml)和青霉素(100ug/ml)，摇匀后制备平板。
(2)菌根真菌分离及纯化方法
菌根真菌分离按照常规组织分离法：取带叶兜兰新鲜营养根，选取在莱卡显微镜下观察选择具有菌丝团的根段，在流水下冲洗干净，用75％酒精漂洗分别处理8min，无菌水冲洗1-2次，再用10％NaClO消毒8min，无菌水冲洗7-8次。将上述处理过的根切成1-2mm的小段，然后将处理好的材料置于PDA平板上，24℃恒温培养3-5d，可见从皮层细胞内长出的菌丝长入培养基内。利用菌丝尖端挑取法对菌株进行分离和纯化，再接到试管中保存。
(3)菌根真菌的形态学鉴定
观察菌株的菌落特征，包括菌落形状、大小、色泽、生长速度及菌丝、孢子梗及孢子形态等。观察发现在PDA培养基上，菌落成淡黄色，早期菌丝紧贴培养基生长，部分侵入培养基内；后期有绒毛状白色气生菌丝，并形成微小颗粒状菌丝团，如图1、图2所示；菌丝生长极快约2d左右即可长满培养皿；菌丝无隔，未见孢子产生，如图3所示。
分子鉴定方法：
菌丝收集：将菌株接种至PDA液体培养基摇菌7-10天(200rpm，25℃)，滤纸过滤收集菌丝，用于基因组提取，总DNA提取使用CTAB法。
ITS区段的PCR扩增：rDNA ITS区段的扩增采用通用引物ITS1(5＇TCCGTAGGTGAACCTGCGG3＇)如SEQ ID NO.2所示，ITS4(5＇TCCTCCGCTTATTGATATGC3＇)如SEQID NO.3所示。PCR反应体系的组成为10×Buffer 5ul，10mmol/L NTP(Mg+)1ul，10u mol/L引物各1ul，模板DNA 1ul(终浓度在80ng/L左右)，Taq酶1U(0.25ul)，用无菌纯水定容至50ul。PCR反应采用BIARAD Engine型PCR仪，循环参数为：预变性95℃，4min，变性95℃，40s，退火56℃，40s，延伸72℃，45s；补平72℃，8min，共进行35个循环。
产物送至北京奥科生物技术有限责任公司进行测序(使用仪器为ABI3730XL)，所得序列结果使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性，得到序列在NCBI上BLAST。
测序结果如SEQ ID NO.1所示，将测序结果在GenBank进行在线比对，测得该菌株与鬼伞属(Coprinus sp.)的相似性较高，序列相似性为百分之97％，确定分离到的菌株为鬼伞属真菌(Coprinus sp.)，将其命名为鬼伞属(Coprinus sp.)菌株c-6-2。
实施例2
菌剂的制备及应用
(1)液体菌剂制备及应用
采用PDA液体培养基(马铃薯200g、葡萄糖15g，补水至1000mL)121℃高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至室温。接种鬼伞属(Coprinus sp.)菌株c-6-2后在摇床以160-220rpm摇菌20d左右，稀释菌液200-300倍，即得液体菌剂。对近期移栽的组培苗进行蘸根或灌根，约60d灌根1次。组培苗出瓶要求为根长在2cm以上，3片以上叶片的植株才可移栽。
(2)固体菌剂制备及应用
将栽培基质(约2m2大小的松树皮：珍珠岩＝4:1质量比)浸泡到完全水饱和后在121℃高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至室温。接种鬼伞属(Coprinus sp.)菌株c-6-2制备的菌剂后在30℃放置25d左右，直至观察到树皮有乳白色后为止，得到的即为固体菌剂，将固体菌剂分装后移栽组培苗。
对施用菌剂(c-6-2)和未施用菌剂(CK)的移栽苗在移栽后约180d，随机各选择30株进行叶片数、最长叶、根数、最长根和鲜重进行测量，结果如图4(固体菌剂)、表1所示。
表1本发明的鬼伞属(Coprinus sp.)c-6-2制备的菌剂对带叶兜兰植株生物量的影响
Figure BDA0002266360960000051
注：数据后不同小写字母表示0.05水平上差异显著；不同大写字母表示0.01水平上的差异显著。
如表1可知，施用本发明的鬼伞属(Coprinus sp.)c-6-2制备的菌剂的植株叶片比不施用菌剂的多长出1片叶子，根长长2cm以上，鲜重明显增加1倍以上。
综上所述，本发明的鬼伞属(Coprinus sp.)c-6-2制备的菌剂可以显著增加植株的叶片生长，促进根的伸长，增加植株生物量的积累。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 一株促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用
<130> 中誉威圣
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 675
<212> DNA
<213> 鬼伞属(Coprinus sp.)
<400> 1
gttcgctcga tactatggcg ttggttgtag ctggctcctc ggagcaatgt gcacgcccgc 60
catttttatc tttccacctg tgcaccgact gtaggtctgg atacctctcg cctccgggcg 120
gatgcgaggg ttgctcgtaa gggcttccct tgaacttcca ggctctacgt ctttttacac 180
accccaatag tatgatgcag aatgtagtca atgggcttct cagcctataa aacactatac 240
aactttcagc aacggatctc ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 300
agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgctcct 360
tggtattccg aggagcatgc ctgtttgagt gtcattaaat tctcaacctc accagttttc 420
tgaactgact gaggcttgga tgtgggggtt tgtgcaggct gcctcaccgg cggtctgctc 480
ccctgaaatg cattagcgag gttcatgctg gacctccgtc tattggtgtg ataattatct 540
acgccgtgga cgaggataca gactcgcttc taaccgtccg cgaggacaat accttgacaa 600
tttgacctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag catatcaata agccggagga 660
aatggggtgg atagg 675
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (2)

1.一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，其特征在于：经形态学和分子生物学鉴定为鬼伞属真菌(Coprinus sp.)，命名c-6-2，菌株的ITS基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏号为GDMCC No.60036。
2.一种如权利要求1所述的促进带叶兜兰植株生长的菌株在促进带叶兜兰植株生长中的应用。
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