CN110755401A - 一种姜黄素胡椒碱制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种姜黄素胡椒碱制剂、其制备方法及应用，属于制药技术领域。本发明的姜黄素胡椒碱制剂包括主药和辅料，主药为重量比为(9‑11):1的姜黄素和胡椒碱，辅料包括稀释剂、润滑剂和溶剂；所述主药和辅料的重量比为(1.5‑2.5):1。本发明的姜黄素胡椒碱制剂主药与辅料混合情况良好，主药分布均匀，无辅料结块、包裹主药情况，从而使主药能有效保证药物的稳定性，并有效发挥其药效，可应用于抗热损伤效应及热应激所致的雌性生殖炎性反应效应，能长期服用，安全性高。

Description

一种姜黄素胡椒碱制剂、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及一种姜黄素胡椒碱制剂、其制备方法及应用。

背景技术

姜黄素是一种天然植物化合物，是从姜黄、郁金、莪术、咖喱等中提取的一种黄色酚类化合物，是膳食姜黄的主要成分。姜黄在古代的中国和印度就已经被当做药材来使用，在现代应用最多的是作为咖喱的香料。姜黄素具有广泛的生物活性，包括抗氧化、神经保护、抗炎、抗衰老等(Du et al.2012)。姜黄素具有很高的安全性和有效性，作为一种病理条件下的健康治疗药物及健康状态下的保健营养剂，在药理学领域迅速受到重视。但姜黄素由于水溶性差、易光解、口服生物利用度低，临床应用及保健品应用受限。

胡椒碱是一种生物碱，从天然来源Piper longum和Piper nigrum中提取，也是一种安全性高的天然化合物，于1819年由汉斯·克里斯蒂安(Hans Christian)首次发现。因其具有良好的吸收和生物增强性能(Volak et al.2008)，可提高姜黄素等多种药物的生物利用度，能够有效提高姜黄素的溶解度，提高其生物利用度(PanahiY et al，2015)，也因此被称为生物利用率增强剂。低剂量胡椒碱联合姜黄素可提高血浆浓度和吸收程度，且无不良反应。

热应激是处于高温环境下导致机体产生的一系列非特异性生理应答反应的总和。当机体处于热暴露中时，组织细胞遭受缺血、缺氧、氧化损伤、炎症等多种有害刺激，热休克蛋白(heat shock protein,HSP)基因表达和合成迅速增加(张凡建等，2012)，进一步可能发展为中暑。目前，中暑导致的细胞损伤机制和组织病理变化过程尚不明确，缺少有效的临床早期诊断和治疗，以至于住院成本高且重症中暑患者死亡率高，故对于高热环境引起的一系列损伤应以预防为主。

姜黄素是一种天然植物化合物，主要提取于多年生草本植物姜黄；姜黄在古代的中国和印度就已经被当做药材来使用，在现代应用最多的是作为咖喱的香料。目前研究普遍认为姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗微生物等健康促进作用，对氧化应激和各种急慢性炎症反应均有一定的保护和治疗作用(T.Kawamori，1998)。同时研究发现，姜黄素可提高大鼠对高热环境的耐受率和生存率(李佳佳等，2015)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种药效好的姜黄素胡椒碱制剂。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：

一种姜黄素胡椒碱制剂，所述姜黄素胡椒碱制剂包括主药和辅料，所述主药为重量比为(9～11):1的姜黄素和胡椒碱，所述辅料包括稀释剂、润滑剂和溶剂；所述主药和辅料的重量比为(1.5～2.5):1。

作为优选，所述主药和辅料的重量比为2:1。

作为优选，所述姜黄素胡椒碱制剂为胶囊制剂。

作为优选，所述稀释剂包括重量比为(1.5～2.6):1的淀粉和糊精。

作为优选，所述稀释剂包括重量比为2:1的淀粉和糊精。

作为优选，所述淀粉包括玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。所述糊精为酶法制备的水溶性麦芽糊精，采用酶法工艺低程度控制水解转化、提纯、干燥制备而成。

作为优选，所述润滑剂为PEG4000，所述稀释剂和润滑剂的重量比为(1～2):1。

作为优选，所述溶剂为重量浓度为70～90％的乙醇溶剂,所述主药与溶剂的重量比为(3～5):1。

本发明制剂的主药以姜黄素为主，胡椒碱为辅，并优化二者的比例，使得胡椒碱能够有效提高姜黄素生物利用率。

辅料是药物的辅助成分，与产品的成型和稳定、质量标准、药动学特征等密切相关。辅料的选择首先是为了满足剂型的需要，同时也是为了药物在生产、储存及使用中保持稳定，使大生产后制剂质量始终保持稳定以保证用药安全。同时，选择辅料也需要满足制剂外观美观和便于工艺操作等要求。

本发明制剂的主药姜黄素和胡椒碱黏度大、物理稳定性较低、流动性差，因此作为制成制剂时填充工艺难度大，易导致装样不准确，装样差异明显等问题，从而影响药物临床疗效。本发明根据姜黄素、胡椒碱自身物理化学属性(如药物粉体流动性差、吸水性强、黏度等)及其配置比例，并考虑制备装样量，选用稀释剂、润滑剂和溶剂作为辅料，有助于药物制剂的成型及药物吸收。

本发明通过合理配伍主药和辅料的具体组分，并控制其比例，使得主药与辅料混合情况良好，主药分布均匀，无辅料结块、包裹主药情况，从而使主药能有效保证药物的稳定性，并有效发挥其药效。

本发明的稀释剂选用重量比为(1.5～2.6):1的淀粉和糊精，淀粉和糊精均为多糖类成分，为白色细腻粉末，物理性质稳定、吸湿性佳，本发明选用淀粉和糊精作为稀释剂，在增加胶囊制剂内容物重量和体积的同时，能够有效提高本发明主药姜黄素和胡椒碱的分散性能，避免其团聚，降低其胶囊制剂的填充难度。

本发明的胶囊内容物姜黄素和胡椒碱在混合后流动性会进一步降低，进而会影响胶囊制剂的装样准确性。本发明优选PEG4000是作为润滑剂，能够有效提高本发明胶囊制剂内容物的流动性，改善胶囊制剂内容物的粘度，从而改善本发明胶囊制剂的填充状态。

本发明选用重量浓度为70～90％的乙醇溶剂，能够有效溶解本发明的主药成分，增加主药稳定性，保障制药工艺合理稳定开展，并提高主药生物利用度，促进药效发挥。本发明中溶剂的添加量不能过多或过少，过多会影响制剂物理稳定性；过低则影响姜黄素的有效含量及药效发挥。

本发明的另一目的在于提供一种姜黄素胡椒碱胶囊制剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)筛选胶囊壳，存放备用；

(2)将所述的主药、稀释剂和润滑剂按比例混合均匀，然后加入溶剂，再次混匀，得填装料；

(3)将填装料填装于胶囊壳中，封装，即制得姜黄素胡椒碱胶囊制剂。

作为优选，步骤(1)中所述胶囊壳筛选后存放于密封、干燥于不受压的容器中，存放温度为20～30℃，相对湿度30～40％。

作为优选，步骤(1)中选用药典标准1号胶囊壳。

由于胶囊剂制剂过程对包装材料具有特殊依赖性，而本申请的主要药效活性成分姜黄素等具有较高的吸湿性及不稳定性，因此本发明将胶囊壳置于特定的保存环境中，以保证胶囊囊体不会发生溶胀、变形等问题，从而保证更好的完成胶囊制剂的制备。

本发明按照中国药典2015年版四部--药用辅料明中胶空心胶囊项目下检查项目完成对使用胶囊壳的质量检测，检测项目包括：

1)外观：色彩鲜艳、色度均匀、囊壳光洁，切口平整圆滑；

2)含水量：12～15％；

3)气味：无臭无味；

4)长度和厚度：全囊长度偏差在±0.3mm以内，囊壳厚度均匀；

5)脆碎度：有一定的强度和弹性，轻捏囊体和囊帽不变形；

6)溶化时限：于37℃水中振摇15min，全部溶散；

7)粘度：采用平氏粘度计检查本品运动黏度高于60mm²/s；

8)松紧度：反复取样10粒胶囊检识，未见漏粉。

制备过程中选用符合上述标准的胶囊壳。

作为优选，步骤(2)中，所述将主药、稀释剂和润滑剂按比例混合均匀的过程为，先将稀释剂、润滑剂混合均匀，得辅料Ⅰ，将胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀，然后加入姜黄素混合均匀。

作为优选，所述胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀时，辅料Ⅰ分三次加入。

作为优选，所述胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀时，辅料Ⅰ分三次加入，第一次加入辅料Ⅰ重量的14～20％，第二次加入辅料Ⅰ重量的36～45％，第三次加入余下的辅料Ⅰ。

作为优选，所述制备方法中，所有的固体物质在混合均匀后，均过筛(80目)三次。

作为优选，所述制备方法在20～30℃、35～65％湿度的条件下进行。

本发明在混料过程中，先将辅料中的稀释剂、润滑剂混合均匀，再加入胡椒碱和姜黄素，使得能够用辅料饱和筛及容器的表面能，防止主料损失。

本发明的第三目的在于提供姜黄素胡椒碱制剂在抗热损伤效应及热应激所致的雌性生殖炎性反应中的应用，采用所述的姜黄素胡椒碱制剂或所述的制备方法制得的姜黄素胡椒碱胶囊制剂，可用于抑制高温环境下的热损伤和热应激反应所导致的雌性生殖炎症反应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：。

本发明通过合理配伍主药和辅料的具体组分，并通过特定的制备方法，使得主药与辅料混合情况良好，主药分布均匀，无辅料结块、包裹主药情况，从而使主药能有效保证药物的稳定性，并有效发挥其药效。

本发明的姜黄素胡椒碱复合制剂能够长期服用预防高温所带来的热损伤和热应激反应所导致的炎症反应，有效性和安全性高。

附图说明

图1为cur-H组大鼠子宫的组织结构形态学观察图。

图2为cur-M组大鼠子宫的组织结构形态学观察图。

图3为cur-L组大鼠子宫的组织结构形态学观察图。

图4为C组大鼠子宫的组织结构形态学观察图。

图5为Ber组大鼠子宫的组织结构形态学观察图。

图6为cur-H组大鼠卵巢的组织结构形态学观察图。

图7为cur-M组大鼠卵巢的组织结构形态学观察图。

图8为cur-L组大鼠卵巢的组织结构形态学观察图。

图9为C组大鼠卵巢的组织结构形态学观察图。

图10为Ber组大鼠卵巢的组织结构形态学观察图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

本实施例中的姜黄素胡椒碱胶囊制剂的制备方法如下：

(1)按照以下组分和配比配置制剂原料，主药为重量比为10:1姜黄素和胡椒碱，辅料包括稀释剂、润滑剂和溶剂，其中稀释剂为重量比为2:1的玉米淀粉和/或马铃薯淀粉和糊精，糊精为酶法制备的水溶性麦芽糊精，采用酶法工艺低程度控制水解转化、提纯、干燥制备而成，润滑剂为PEG4000，稀释剂和润滑剂的重量比为1.5:1，溶剂为重量浓度为75％的乙醇溶剂，主药与溶剂的重量比为4:1，主药和辅料重量比为2:1；

并选用药典标准1号胶囊壳，存放于密封、干燥于不受压的容器中备用，存放温度为25℃，相对湿度35％。

(2)先将稀释剂、润滑剂混合均匀，得辅料Ⅰ，将胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀，辅料Ⅰ分三次加入，第一次加入辅料Ⅰ重量的17％，第二次加入辅料Ⅰ重量的40％，第三次加入余下的辅料Ⅰ；然后加入姜黄素混合均匀；所有的固体物质在混合均匀后，均过筛(80目)三次；再加入溶剂，再次混匀，制得填装料。

(3)将填装料填装于胶囊壳中，封装，即制得姜黄素胡椒碱胶囊制剂。

除胶囊壳的存放外，整个制备过程在25℃、50％湿度的条件下进行。

实施例2

本实施例中的姜黄素胡椒碱胶囊制剂的制备方法如下：

(1)按照以下组分和配比配置制剂原料，主药为重量比为9:1姜黄素和胡椒碱，辅料包括稀释剂、润滑剂和溶剂，其中稀释剂为重量比为2.6:1的马铃薯淀粉和糊精，糊精为酶法制备的水溶性麦芽糊精，采用酶法工艺低程度控制水解转化、提纯、干燥制备而成，润滑剂为PEG4000，稀释剂和润滑剂的重量比为1:1，溶剂为重量浓度为70％的乙醇溶剂，主药与溶剂的重量比为3:1，主药和辅料重量比为1.5:1；

并选用药典标准1号胶囊壳，存放于密封、干燥于不受压的容器中备用，存放温度为20℃，相对湿度40％。

(2)先将稀释剂、润滑剂混合均匀，得辅料Ⅰ，将胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀，辅料Ⅰ分三次加入，第一次加入辅料Ⅰ重量的14％，第二次加入辅料Ⅰ重量的45％，第三次加入余下的辅料Ⅰ；然后加入姜黄素混合均匀；所有的固体物质在混合均匀后，均过筛(80目)三次；再加入溶剂，再次混匀，制得填装料；

(3)将填装料填装于胶囊壳中，封装，即制得姜黄素胡椒碱胶囊制剂。

除胶囊壳的存放外，整个制备过程在20℃、65％湿度的条件下进行。

实施例3

本实施例中的姜黄素胡椒碱胶囊制剂的制备方法如下：

(1)按照以下组分和配比配置制剂原料，主药为重量比为11:1姜黄素和胡椒碱，辅料包括稀释剂、润滑剂和溶剂，其中稀释剂为重量比为1.5:1的玉米淀粉和糊精，糊精为酶法制备的水溶性麦芽糊精，采用酶法工艺低程度控制水解转化、提纯、干燥制备而成，润滑剂为PEG4000，稀释剂和润滑剂的重量比为2:1，溶剂为重量浓度为90％的乙醇溶剂，主药与溶剂的重量比为5:1，主药和辅料重量比为2.5:1；

并选用药典标准1号胶囊壳，存放于密封、干燥于不受压的容器中备用，存放温度为30℃，相对湿度30％。

(2)先将稀释剂、润滑剂混合均匀，得辅料Ⅰ，将胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀，辅料Ⅰ分三次加入，第一次加入辅料Ⅰ重量的20％，第二次加入辅料Ⅰ重量的36％，第三次加入余下的辅料Ⅰ；然后加入姜黄素混合均匀；所有的固体物质在混合均匀后，均过筛(80目)三次；再加入溶剂，再次混匀，制得填装料；

(3)将填装料填装于胶囊壳中，封装，即制得姜黄素胡椒碱胶囊制剂。

除胶囊壳的存放外，整个制备过程在30℃、35％湿度的条件下进行。

本发明实施例1～3中制得的胶囊制剂可用于抗热损伤效应和热应激所致的雌性生殖炎性反应效应。

对比例1

主药和辅料的重量比为1:1，其他与实施例1相同。

对比例2

主药和辅料的重量比为1.5:1，其他与实施例1相同。

对比例3

主药和辅料的重量比为2.5:1，其他与实施例1相同。

对比例4

主药和辅料的重量比为3:1，其他与实施例1相同。

对比例5

采用淀粉和乳糖作为稀释剂，其他与实施例1相同。

对比例6

采用糊精和乳糖作为稀释剂，其他与实施例1相同。

对比例7

淀粉和糊精的重量比为1:1，其他与实施例1相同。

对比例8

淀粉和糊精的重量比为1.5:1，其他与实施例1相同。

对比例9

淀粉和糊精的重量比为2.6:1，其他与实施例1相同。

对比例10

淀粉和糊精的重量比为3:1，其他与实施例1相同。

对比例11

采用PEG2000为润滑剂，其他与实施例1相同。

对比例12

采用60％乙醇作为溶剂，其他与实施例1相同。

对比例13

采用70％乙醇作为溶剂，其他与实施例1相同。

对比例14

采用90％乙醇作为溶剂，其他与实施例1相同。

对比例15

采用95％乙醇作为溶剂，其他与实施例1相同。

对比例16

将胶囊壳置于40℃、75％湿度的加速稳定性条件下存放30天，其他与对比例1胶囊的存放条件一致。

比较实施例、对比例1～4中主药和辅料混合制得填装料后，分别取样检测其各项性能，结果如表1所示。

表1：不同比例主药与辅料混合情况

实施例1

实施例2

实施例3

对比例1

对比例2

对比例3

对比例4

主药:辅料

2:1

1.5:1

2.5:1

1:1

1.5:1

2.5:1

3:1

主药分布情况

++

++

++

+

++

++

+

辅料包裹主药情况

-

-

-

-

-

-

++

粉末流动性

++

++

++

--

++

++

-

主药含量

97.7％

96.8％

97.1％

82.1％

96.5％

97.3％

75.0％

由表1可知，当主药和辅料的重量比为1:1时，辅料过多，容易掩盖主药及容易包裹主药，原料药物含量相对较低；当主药和辅料的重量比为在(1.5～2.5):1之间时，混合情况良好，主药分布均匀，无辅料结块、包裹主药情况，且主药含量最高；当主药和辅料的重量比为3:1时，辅料过少，混合粉末流动性差，导致主药和辅料的混合难以达到均匀，取样检测结果显示主药含量过低，说明主药和辅料混合不均匀。

比较实施例、对比例5～10主药和辅料混合后制得的混合料的分散度和流动性，结果如表2所示。

表2：不同稀释剂及比例对混合料的影响

实施例1

实施例2

实施例3

对比例5

对比例6

对比例7

对比例8

对比例9

对比例10

淀粉:糊精

2:1

2.6:1

1.5:1

1:1

1.5:1

2.6:1

3:1

分散度

++

++

++

+

+

+

++

++

+

流动性

-

-

-

-

-

-

-

-

-

由表2可知，当采用乳糖与淀粉或糊精配比作为稀释剂时，混合料的分散性效果较差，表明并非所有稀释剂都能用于本发明。且当淀粉和糊精重量比为(1.5～2.6):1时混合料的分散度明显大于淀粉和糊精重量比为其他比例，而无论淀粉和糊精的比例如何变化，均对混合料的流动性无影响。

比较实施例、对比例11中主药和辅料混合后制得的混合料的分散度，结果如表3所示。

表3：不同润滑剂对混合料的影响

	实施例1	实施例2	实施例3	对比例11
					润滑剂	PEG2000	PEG2000	PEG2000	PEG4000
粉末分散度	+++	+++	+++	++

由表3可知，采用PEG4000时混合料的分散度明显优于采用PEG2000的分散度，表明并非所有润滑剂都能用于本发明。

比较实施例、对比例12～15中主药和辅料混合后制得的混合料的分散度及主药的溶解性，结果如表4所示。

表4：不同溶剂对混合料的影响

实施例1

实施例2

实施例3

对比例12

对比例13

对比例14

对比例15

溶剂

75％乙醇

70％乙醇

90％乙醇

60％乙醇

70％乙醇

90％乙醇

95％乙醇

分散度

++

++

++

+

++

++

++

主药溶解性

++

++

++

+

++

++

++

由表4可知，当采用低于70％的乙醇作为溶剂时，混合料的分散度和主药的溶解性均较差，采用大于90％乙醇溶剂时混合料的分散度和主药的溶解性均较好，但制剂安全性较低，因此不采用。

在表1～表4中，各性能指标采用评价等级表示，其中，“--”表示较差，“-”表示差，“+”表示一般，“++”表示较好，“+++”表示良好。

实施例1～3和对比例16中存放的胶囊壳，每10天取样检测一次，发现实施例1中的胶囊壳未发生变化，而对比例16中的胶囊壳20天后发生囊体变形。主要原因为明胶溶胀及挤压变形。

采用实施例1中制得的制剂进行应用试验，具体试验方法及试验结果如下。

(一)试验方法

1)试验动物及试验环境

35只SPF级SD雌性大鼠，8周龄，体质量200±20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(SCXK(京)2016-0006)。大鼠自购入后于军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所实验动物房分笼饲养，清洁级环境适应性喂养3天，自由摄食和饮水,室温(22±0.5)℃，湿度40～60％。并按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

2)试验分组和灌胃方法

将35只SPF级SD雌性大鼠随机分为5组，每组7只，并且每组随机编号为1～7，5组分别为高剂量组(cur-H组)、中剂量组(cur-M组)、低剂量组(cur-L组)、空白对照组(C组)、阳性对照组(Ber组)，各组的喂药方法如下：

cur-H组：将制得的黄素胡椒碱胶囊制剂的填装料按照200mg/kg的比例溶于花生油中，配成混悬液搅拌摇匀，按照0.1mL/20g·d灌胃，每天上午9:00～10:00灌胃一次，持续28天；

cur-M组：将制得的黄素胡椒碱胶囊制剂的填装料按照100mg/kg的比例溶于花生油中，配成混悬液搅拌摇匀，按照0.1mL/20g·d灌胃，每天上午9:00～10:00灌胃一次，持续28天；

cur-L组：将制得的黄素胡椒碱胶囊制剂的填装料按照50mg/kg的比例溶于花生油中，配成混悬液搅拌摇匀，按照0.1mL/20g·d灌胃，每天上午9:00～10:00灌胃一次，持续28天；

C组：将花生油按照0.1mL/20g·d灌胃，每天上午9:00灌胃一次，持续28天。

Ber组：将小檗碱按照200mg/kg的比例溶于生理盐水，配成混悬液摇匀，按照0.1mL/20g·d灌胃，每天上午9:00灌胃一次，持续28天。小檗碱(berberine,Ber)亦称黄连素,是从中药黄连中提取的异喹啉类生物碱,有较强的抗炎抗菌作用(贾燕珺等，2013)。临床应用多为盐酸小檗碱，是经典的临床抗炎药物。

各组大鼠在灌胃的第1、7、14、21天灌胃前称量体重。

3)建立急性热应激模型

各组连续灌胃28天后，在第29天进入高温动物仓进行热暴露120min，不对大鼠进行麻醉，不限制笼内活动，可自由饮水摄食。高温动物仓设置温度为41±0.5℃，湿度为22±1％。在热暴露前和热暴露后分别对35只大鼠称量体重、测肛温并记录。

4)实验动物的样本取材

热暴露后，使用20％乌拉坦溶液按4ml/kg体重剂量分批麻醉各组大鼠。大鼠麻醉后仰卧位固定在手术台上剖开腹部，用抗凝管进行腹主动脉取血。随后分别取子宫、卵巢等器官，将子宫、卵巢周围的脂肪组织剥离，置于多聚甲醛溶液中。血样静置12小时后，3000转离心10分钟，取血清分装，冻存于液氮罐中待测。

5)试验检测方法

测量肛温步骤：将大鼠放入特制的束缚鼠笼，将兽用测温仪的通道探头上方5cm用酒精棉擦拭，涂抹上凡士林，将探头插入大鼠肛门5cm深，待数值稳定后读取，保留小数点后两位，记录后将肛温计归零，重复步骤测量下一只大鼠。

称量体重步骤：电子体重计归零，称量大鼠体重，待数值稳定后读取小数点后一位，记录后重复步骤称量下一只大鼠。

子宫、卵巢病理切片的制备：剖取子宫及卵巢组织，经4％多聚甲醛溶液固定，常规取材，脱水，包埋，制片，HE染色后，在光学显微镜下观察并描述，并拍摄对应主要描述中不同种类的病变部位。

血液样本的测定：血液样本的测定血样静置半天后，3000转离心10分钟，取血清。采用酶联免疫法(ELISA)分别测定大鼠的促肾上腺皮质激素(ACTH)、热休克蛋白70(HSP70)、皮质酮(Cort)、脂多糖(LPS)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素10(IL-10)、钙网蛋白(CRT)。具体步骤按照试剂盒说明书步骤进行。

统计学处理：实验数据以

表示,并采用单因素方差(one-way ANOVA)分析进行组间差异显著性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。统计学处理均在SPSSStatistics21.0统计软件上完成。用GraphPad Prism 7.0医学绘图软件对所得数据进行统计作图。

(二)结果与分析

1)行为学观察

热应激期间：进入热舱前，各组大鼠体毛呈干燥状态。进入热舱后，大鼠表现出异常兴奋、局促不安、笼内四处窜动。热应激40分钟后，体毛全部呈湿润状态。多数大鼠趴在笼子底部不动，或埋头于其他动物身下；仅少数大鼠仍有活动，且动作迟缓。大鼠进食饮水均减少。Ber组5号大鼠测量肛温，核心体温高达42.98℃，发生热休克，已丧失行动能力，仅剩呼吸，数分钟后死亡。

2)体重变化

a.不同药物灌胃处理对大鼠体重增长的影响如表1所示。

表1灌胃期间大鼠体重增量

注：与第一周体重比较，*P<0.05。

表1所示为各时点大鼠体重与第一周初时体重相比的增量，可以看出C组大鼠体重增长量的略低于其他组，但无统计学差异(P＞0.05)。

b.急性热应激对大鼠体重的影响

表2急性热应激前后大鼠体重变化

如表2所示，急性热应激后，大鼠体重有明显下降，但各组体重减少量与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。

3)急性热应激对大鼠肛温的影响

表3急性热应激前后雌性大鼠肛温的变化情况

注：与对照比，*P＜0.05；**P＜0.01

由表3可见，急性热应激前，各组大鼠肛温均无统计学差异。急性热应激后，大鼠肛温均有上升；cur-H组(P＜0.01)与cur-M组(P＜0.05)肛温显著低于C组肛温。

4)各组大鼠HPA轴功能影响的比较

表4急性热应激后各组大鼠HPA功能情况

注：与对照比，*P＜0.05；**P＜0.01

如表4可见，各组血清ACTH均无差异(P＞0.05)；各姜黄素胡椒碱制剂处理组血清CORT浓度则显著均低于C组(P＜0.05，P＜0.01)，且姜黄素胡椒碱处理的低、中、高组(cur-L组、cur-M组cur-H组)血清CORT浓度存在较为明显的剂量效应关系。

5)各组大鼠子宫和卵巢组织结构形态学观察

a.各组大鼠子宫的组织结构形态学观察

图1～5为各组大鼠子宫的组织结构形态学观察图。由图1和图5可见，cur-H组与Ber组的大鼠子宫粘膜层上皮结构完整，上皮细胞形态结构正常、排列紧密；固有层可见少量淋巴细胞浸润，子宫腺数量丰富。由图2和图4可见，cur-M组和C组子宫粘膜层多见上皮细胞点状坏死，核碎裂或溶解；固有层可见少量淋巴细胞浸润，子宫腺上皮细胞多见胞质空泡化，少量细胞坏死，核碎裂或溶解。由图3可见，cur-L组子宫粘膜层可见大量上皮细胞胞质疏松淡染或空泡化；固有层可见水肿，并伴有少量淋巴细胞浸润，子宫腺上皮细胞多见胞质空泡化。

b.各组大鼠卵巢的组织结构形态学观察

图6～10为各组大鼠卵巢的组织结构形态学观察图。由图6和图7可见，cur-H组与cur-M组卵巢组织中各级卵泡形态结构正常；退化的黄体中可见少量细胞胞质空泡化。由图8、图9和图10可见，cur-L组、Ber组和C组卵巢组织中各级卵泡形态结构正常；局部退化的黄体中可见不同程度的细胞胞质空泡化、点状的细胞凋亡和核碎裂；组织中可见较多血管淤血扩张，血管腔内可见大量红细胞。

6)各组大鼠血清炎症因子与血清热休克蛋白水平的比较

表5急性热应激后各种大鼠热应激蛋白HSP70、CRT的水平

注：与C组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与Ber组比，#P＜0.05，##P＜0.01。

表6急性热应激后各组大鼠内毒素LPS及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10

水平

注：与C组比，*P＜0.05；**P＜0.01；与Ber组比，#P＜0.05。

如表5结果显示，各姜黄素胡椒碱制剂处理组和Ber组血清HSP70浓度均明显低于C组(P＜0.05或P＜0.01)；各姜黄素胡椒碱制剂处理组与Ber组无显著差异。高、中、低浓度的姜黄素胡椒碱制剂组CRT的表达均低于C组(P＜0.05)；而Ber组与C组相比无差异(P＞0.05)。

由表6结果显示，各姜黄素胡椒碱制剂处理组血清LPS浓度均明显低于C组(P＜0.05或P＜0.01)，Ber组与C组相比无差异；cur-H组大鼠血清TNF-α显著低于C组(P＜0.05)；cur-M组和cur-L组相比于C组略有降低的趋势；血清IL-10与血清IL-1β各组之间均无差异(P＞0.05)。

(三)讨论

1)体重变化

灌胃期间各组大鼠体重均稳定增长，仅C组体重增量略低于其他组，各组间均无统计学差异，说明大鼠的成长状况良好。表明长期姜黄素胡椒碱制剂预处理对雌性大鼠的体重无影响。急性热应激前后雌性大鼠体重变化明显，可能是由于热应激期间饮水进食减少，出汗、呼吸频率加快、尿失禁等使大鼠体液流失。各组之间体重减少并无统计学差异，说明姜黄素胡椒碱制剂并不会影响热应激中大鼠体液的流失。

2)对大鼠肛温的影响

急性热应激前各组大鼠肛温没有统计学差异，说明长期摄入姜黄素胡椒碱制剂不会影响适宜环境温度下的正常核心体温。急性热应激后，各组大鼠肛温均显著性升高,各姜黄素胡椒碱制剂处理组大鼠平均肛温均低于C组，其中cur-H组(P＜0.01)和cur-M组(P＜0.05)具有统计学差异；姜黄素可能通过某些调节机制，使机体在热环境中核心体温略低于其他个体，起到一定的保护作用，cur-H组大鼠核心体温最低，但该组大鼠核心体温依旧达到了39.28±0.36℃，并不足以避免机体产生热应激。

3)对HPA轴的影响

当机体暴露于热环境中时，大脑皮层感受到热刺激，激活机体下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic-pituitary-adrenal cortical axis，HPA轴)、下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT轴)、下丘脑-垂体-性腺轴(HPO轴)以及下丘脑和垂体其它激素的改变，以稳定机体内环境，其中以HPA轴最为重要(Natalie E,et al2015)。应激启动HPA轴，导致皮质醇分泌增加，以增强机体对不利环境的抵抗力；有研究表明，热应激导致糖皮质激素的过量分泌，而过量的糖皮质激素能导致免疫抑制、海马神经元损伤和机体代谢紊乱等负面效(刘法东等，2014)。

促肾上腺皮质激素(adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH)由脑垂体前叶分泌，促使肾上腺皮质分泌皮质醇(cortisol，CORT)，CORT是应激激素糖皮质激素的主要成分，在应激状态下能发挥一定的保护作用，但过量的CORT则会导致应激损伤(Beléen C，et al,2012)。

本发明试验结果显示，急性热应激后各组大鼠血清ACTH浓度并无差异，而各姜黄素胡椒碱制剂处理组大鼠血清中的CORT明显低于C组，提示姜黄素并不会影响ACTH的分泌，而是直接调控糖皮质激素的分泌，降低了血清中糖皮质激素水平，减缓应激损伤。长期小檗碱预处理同样不能抑制ACTH的分泌，可减少血清中皮质酮CORT的含量，但抑制能力明显低于各姜黄素胡椒碱制剂处理组。

4)对子宫和卵巢的影响

通过切片组织观察，可以看到cur-H组与Ber组子宫组织结构更加完好，其余组都出现了不同程度的空泡化、坏死和核溶解等，组织细胞损伤较严重，高剂量的姜黄素和小檗碱都表现出了对子宫的抑炎保护作用。cur-H组与cur-M组卵巢组织相比其他组的结构更加完好，仅有退化的黄体中有少量空泡化情况出现，其余组则出现了较严重的细胞坏死、凋亡和空泡化，甚至出现较多的血管淤血扩张，高剂量和中剂量的姜黄素都表现出了对于急性热应激中大鼠卵巢的保护作用。高剂量的姜黄素预处理对于急性热应激雌性大鼠的生殖系统具有一定的保护作用。

5)对热休克蛋白与炎症反应的影响

血清HSP70属于细胞外HSP70，与组织细胞中HSP70的保护作用完全相反，属于炎症因子，是细胞受到强烈应激导致细胞死亡破坏而释放到细胞外的“危险信号”，能激活免疫细胞上的细胞表面受体(Luciana M，et al.2015)，如TLR2和TLR4，从而导致NF-κB活化，导致促炎因子TNF-α、IL1-β和IL-6的产生(Qu J，et al.2017)。CRT其氨基酸序列与HSP70等经典热休克蛋白没有同源性，但其免疫学活性与热休克蛋白非常相近(Graner MW，etal.2003)，也归入热休克蛋白家族来研究，因此一般认为HSP70和CRT均属于热休克蛋白家族成员。有研究显示，CRT能够从坏死和凋亡的细胞中释放入血，引起炎症反应(Basu S，etal.2003)。因此在热应激环境中，HSP70和CRT的血清浓度与热应激强度正相关。本研究显示，各姜黄素胡椒碱制剂处理组均可降低大鼠血清中HSP70和CRT浓度，对热应激大鼠起到一定保护作用；而Ber组则仅能降低血清中HSP70的浓度，对CRT则无显著影响。

热环境下，内毒素的释出会大量增加。内毒素LPS是与机体生殖疾病密切相关的体内指标(Herath et al,2007)。LPS通过影响下丘脑-垂体-子宫/卵巢轴的生殖分泌功能，子宫技能以及卵巢规律性对雌性机体的繁殖性造成危害(赵善江等，2016)。本发明中，姜黄素胡椒碱制剂能大幅降低急性热应激所致的LPS的升高，从而降低LPS对雌性大鼠所致的生殖健康危害；Ber组小檗碱也同样具有此效果。内毒素可刺激机体产生促炎症细胞因子，可能引起全身炎症，而姜黄素胡椒碱制剂预处理能降低循环血液中LPS的浓度。故姜黄素可能是通过抑制HSP70、CRT从组织释放入血和抑制内毒素释放入血来抑制炎症反应，且具有一定的剂量依赖性。

致炎细胞因子TNF-α、IL1-β参与机体炎症反应、参与免疫调节，其血清浓度与热损伤程度相关，有研究表明，中暑动物血液中TNF-α、IL1-β等致炎因子的含量显著增高(Roberts GT，et al,2008)。本发明的试验结果显示姜黄素胡椒碱制剂处理组大鼠血清中TNF-α均有降低趋势，cur-H组显著低于对照组(P＜0.05)，而IL1-β各组间则无差异(P＞0.05)。

IL-10是机体重要的抗炎细胞因子，在机体受到刺激后合成较晚，能抑制促炎症因子的产生，可减轻过度的炎症反应对机体造成的损害(郑丰杰等，2017)。在人T细胞和实验性结肠炎动物等研究中显示，姜黄素能增加IL-10的产生(Fahey AJ，et al，2007)。本发明试验结果显示各组大鼠血清IL-10并无统计学差异，与前述研究不符，有可能是由于在急性热应激后，其产生较晚还未显示而致。

综上所述，采用本发明的姜黄素胡椒碱复合制剂长期服用进行预防，不影响机体的体重变化，对急性热应激后大鼠的体重亦无显著影响；长期摄入也不影响适宜环境下大鼠核心体温，亦不通过调控核心体温来减缓热损伤。因此，作为预防措施，本发明的姜黄素胡椒碱制剂安全性高。

本发明的姜黄素胡椒碱制剂长期摄入可保持急性热应激大鼠子宫和卵巢结构形态完整性，降低血清皮质酮浓度，保护HPA轴功能，降低应激损伤因子HSP70、CRT等释放，并抑制内毒素LPS及下游致炎因子TNF-α的释出，有助于大鼠低于急性热应激损伤，较之临床药物小檗碱更具保护性。因此，作为预防措施，本发明的姜黄素胡椒碱制剂有效性强。

与本发明的姜黄素胡椒碱制剂相比，小檗碱的长期摄入不影响正常大鼠体重，但导致其胃肠道反应较大，造成卵巢及子宫水肿；同时，小檗碱不能降低CRT；因此，小檗碱作为临床有效抗炎药物并不适宜于长期摄入以达到预防高温损伤的目的。

本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种姜黄素胡椒碱制剂，其特征在于，所述姜黄素胡椒碱制剂包括主药和辅料，所述主药为重量比为(9～11):1的姜黄素和胡椒碱，所述辅料包括稀释剂、润滑剂和溶剂；所述主药和辅料的重量比为(1.5～2.5):1。

2.根据权利要求1所述的姜黄素胡椒碱制剂，其特征在于，所述稀释剂包括重量比为(1.5～2.6):1的淀粉和糊精。

3.根据权利要求1所述的姜黄素胡椒碱制剂，其特征在于，所述润滑剂为PEG4000，所述稀释剂和润滑剂的重量比为(1～2):1。

4.根据权利要求1所述的姜黄素胡椒碱制剂，其特征在于，所述溶剂为重量浓度为70～90％的乙醇溶剂，所述主药与溶剂的重量比为(3～5):1。

5.一种姜黄素胡椒碱胶囊制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)筛选胶囊壳，存放备用；

(2)将如权利要求1～4任一权利要求所述的主药、稀释剂和润滑剂按比例混合均匀，然后加入溶剂，再次混匀，得填装料；

(3)将填装料填装于胶囊壳中，封装，即制得姜黄素胡椒碱胶囊制剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶囊壳筛选后存放于密封、干燥于不受压的容器中，存放温度为20～30℃，相对湿度30～40％。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述将主药、稀释剂和润滑剂按比例混合均匀的过程为，先将稀释剂、润滑剂混合均匀，得辅料Ⅰ，将胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀，然后加入姜黄素混合均匀。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述胡椒碱和辅料Ⅰ混合均匀时，辅料Ⅰ分三次加入。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法在20～30℃、35～65％湿度的条件下进行。

10.姜黄素胡椒碱制剂在抗热损伤效应及热应激所致的雌性生殖炎性反应中的应用，其特征在于，采用权利要求1～4任一权利要求所述的姜黄素胡椒碱制剂或权利要求5～9任一权利要求所述的制备方法制得的姜黄素胡椒碱胶囊制剂。

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