CN110754573A - 一种桔梗皂苷d饲料添加剂及其应用、制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桔梗皂苷D饲料添加剂，桔梗皂苷D是从桔梗中分离出来的一种单体细胞,C57H92O28，相对分子质量为1224.58。桔梗皂苷D具有抗炎、阵痛、抗肿瘤、保肝及免疫调节等药理活性的作用。现有技术中对桔梗皂苷D在生产中应用和研究都很少，本发明把桔梗皂苷D具有的免疫作用运用到饲料添加剂中，研究桔梗皂苷D对小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响，为饲料的利用和开发提供依据。

Description

一种桔梗皂苷D饲料添加剂及其应用、制备方法
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体为一种桔梗皂苷D饲料添加剂及其应用、制备方法。
背景技术
桔梗皂苷D（PD）是桔梗的主要活性成分，又名白药、铃铛花、灯笼棵和人参等，已收录于《中国药典》我国最早的一部药书《神农本草经》中已记录其药用价值，属常用中草药，且药食同源，性平味苦，归肺、胃经，并列为下品。为了研究桔梗皂苷D的生物活性，近年来，国内外的众多专家学者做了诸多试验，证明 PD具有抗氧化、抗炎、抗癌、减肥和保肝等多种作用本文主要是概述目前的研究情况，为后续药物的提供依据。
野生桔梗资源较为丰盛且药用价值高，属多年生草木，为优质药材，多见于荒山草丛、灌木丛中。根部肥大，茎部直，叶子无柄，全株光滑。体内有白色乳
汁。花色多为紫蓝，少数为白。桔梗分布范围广泛，遍布在我国大部分地区，华北、东北产量较大，且华东地区产品质量最佳，尤以安徽淮北。但由于人们连年采挖野生桔梗，资源已殆尽，人工种植方法开始普及。一般在春末秋初进行采摘。
有研究测定不同时期的桔梗单株和群体生物量积累、干物质分配、根系产量和桔梗皂苷D 含量的动态变化，设计了 5 种不同种植密度，结果表明，适宜的种植密度对桔梗干物质积累与分配、根系产量、桔梗皂苷D含量和群体产量具有重要影响。
在中国乃至日韩等东亚国家，桔梗作为一种药食同源的传统中药，除了可被制成美味菜肴且含有多种氨基酸和人体必需微量元素，还有大量亚油酸等不饱和脂肪酸，营养丰富，降压减脂、抗炎止咳、抗动脉粥样硬化，属于很好的保健性食品。作为桔梗中发挥疗效的主要物质，PD 表现出良好的药理活性。桔梗味道苦涩辛辣，故能行气散寒，止咳平喘化痰，以桔梗为处方，我国己开发了信宁止咳糖浆、复方桔梗片等桔梗药剂，国外发明一种桔梗提取物保健饮料试验证明，PD 可用来作为桔梗质量评价的主要指标。有研究证明，PD通过抑制粘附蛋白的表达来预防肺炎支原体感染，而粘蛋白可作为评价药物祛痰止咳效果的指标之一。已在多种炎症模型研究中证实了 PD 的抗炎活性。PD 为降低香烟烟雾诱导的肺组织病变、炎性细胞浸润，可通过激活Nrf2信号抑制炎症反应，阻断 NF-κB 的活化从而治疗肺炎。同时，PD 显著增加Ig M抗体生成及刺激淋巴细胞增殖，并且显著提高细胞因子Th1和Th2 的产生，上调 Th1 m RNA 的表达及增加自然杀伤细胞和细胞毒性 T细胞，从而提高自身免疫系统的免疫力。
研究发现，PD通过破坏热休克蛋白(Hsp90)/细胞分裂周期蛋白37（Cdc37）复合物的结合，提供了肺癌治疗策略研究发现，PD对肿瘤生长有明显抑制作用，对免疫器官和体重无明显影响，PD 在体内至少可以通过改善免疫功能、诱导细胞凋亡和抑制血管生成而在体内抑制 H22肝癌细胞生长，并呈剂量依赖。也有报道研究PD对男性生殖系统常见的的前列腺癌的治疗。PD可显著影响细胞增殖，诱导细胞凋亡，引起细胞周期阻滞，对非恶性前列腺上皮细胞影响不明显，结果显示 PD在体内外均对前列腺癌有显著活性，这些研究为人类未来开发研究前列腺癌治疗剂提供了建设性意见。采用蛋白质组学方法研究PD治疗肝癌细胞后蛋白的变化，结果表明，PD对肝癌细胞的增殖具有浓度和时间依赖性抑制作用为PD抗癌活性的作用机制提供了新的线索。
桔梗皂苷D是常用传统中药桔梗的主要活性成分之一, 近年来国内外对其研究与日俱增。目前我国饲料业发展很快很大，但是不强比较单一、添加成分比较单一，需要积极的开发新的成分。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种桔梗皂苷D饲料添加剂及其应用、制备方法，桔梗皂苷D是从桔梗中分离出来的一种单体细胞,C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。桔梗皂苷D具有抗炎、阵痛、抗肿瘤、保肝及免疫调节等药理活性的作用。桔梗皂苷D在生产中应用和研究都很少，本研究把桔梗皂苷D具有的免疫作用运用到饲料添加剂中，研究桔梗皂苷D对小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响，可以为饲料的利用和开发提供依据。
为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：
一种桔梗皂苷D的应用，所述桔梗皂苷D应用于动物饲料添加剂；所述桔梗皂苷D提取物是从桔梗中分离出来,分子式为C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。
一种桔梗皂苷D的应用，所述桔梗皂苷D在制备提高动物巨噬细胞和脾淋巴细胞增殖的动物饲料添加剂中的应用。
一种桔梗皂苷D的应用，所述桔梗皂苷D提高饲料添加剂对动物的淋巴细胞增殖的应用。
一种桔梗皂苷D的应用，所述桔梗皂苷D提高饲料添加剂对动物的的淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6因子的应用。
一种桔梗皂苷D饲料添加剂，所述桔梗皂苷D饲料添加剂包括桔梗皂苷D提取物，所述桔梗皂苷D提取物是从桔梗中分离出来,分子式为C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。
一种桔梗皂苷D饲料添加剂的应用的制备方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，菌悬液制备；第二步，淋巴细胞的制备；第三步，巨噬细胞的制备；第四步，数据分析。
进一步的，第一步中，将金黄色葡萄球菌种接种于肉汤培养基上，斜面活化，恒温37℃培养18-24h，挑若干个单个菌落接种于新鲜肉汤培养基中，置３７℃恒温箱中培养18-24h，肉汤稀释浓度至106ＣＦＵ／ｍＬ，４℃保存。
进一步的，第二步中，将健康BALA／c 小鼠颈椎脱臼致死，无菌分离脾，置RPMI－1640培养液中，200 目细胞筛研磨，离心，收集细胞悬液，1500 r／min离心５min，弃上清，加入红细胞裂解液，RPMI－1640完全培养液终止反应，1500ｒ／min离心５min，弃上清，Ｈａｎｋｓ液洗涤３ 次，重悬细胞，37℃５％二氧化碳培养３ｈ，收集未贴壁悬浮细胞，1500／min 离心5min，弃上清，重悬细胞，调整细胞浓度至10万个／ｍＬ，待用。
进一步的，第三步中，健康BALA／c 小鼠颈椎脱臼致死，75％乙醇浸泡消毒３ ｍｉｎ；将皮肤剪开暴露腹膜，将４ｍＬRPMI－1640不完全培养液注入小鼠腹腔，轻揉小鼠腹部２～３ｍｉｎ，静止5-7min无菌抽取腹腔液，1000ｒ／min离心５min，弃上清，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤２次。RPMI－1640培养液悬浮细胞，Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色计活细胞超过95％，将细胞密度调整为500 万个／ｍＬ，制成腹腔巨噬细胞悬液。96孔细胞培养板每孔加入100μＬ细胞悬液，置５％ ＣＯ２中，３７ ℃培养２ ｈ，弃上清，RPMI－1640不完全培养液洗板１次，弃上清，每孔再加入100μＬ的RPMI－1640完全培养液，贴壁细胞即为纯化后的小鼠巨噬细胞。
进一步的，第四步，数据分析，采用SPSS16.统计软件进行单因素方差统计学分析，PD 能刺激淋巴细胞提高其增殖能力； PD能够诱导淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6因子。
本发明具有如下有益效果：桔梗皂苷D是从桔梗中分离出来的一种单体细胞,C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。桔梗皂苷D具有抗炎、阵痛、抗肿瘤、保肝及免疫调节等药理活性的作用。桔梗皂苷D在生产中应用和研究都很少，本研究把桔梗皂苷D具有的免疫作用运用到饲料添加剂中，研究桔梗皂苷D对小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响，可以为饲料的利用和开发提供依据。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1.1实验材料
（1）供试材料：
巴比赛（BALB／ｃ）小鼠，雌性，体质量１８～２２ｇ，锦州医科大学试验动物中心；饲养环境温度为（２０±２）℃，湿度为（５０％±１０％），自由摄食和饮水，试验前适应性饲养１周。桔梗皂苷Ｄ（生产批号：ＭＵＳＴ－１１０８２２１１），成都曼斯特生物科技有限公司。豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）和ＭＴＴ 培养液（Ｓｉｇｍａ 公司，美国）；胎牛血清（四季青生物工程有限公司，中国）；小鼠ＩＦＮ－γ 和ＩＬ－６ 检测试剂盒（武汉博士德公司，中国）及金黄色葡葡球菌ＡＢ９１０９３（中国微生物研究院）。
（2）实验仪器以及设备：
C02培养箱、倒置显微镜、低速离心机、酶标仪、PCR仪、超净工作台、天平等。
1.2实验方法
菌悬液制备
将金黄色葡萄球菌种接种于肉汤培养基上，斜面活化，恒温37℃培养18-24h，挑若干个单个菌落接种于新鲜肉汤培养基中，置３７℃恒温箱中培养18-24h，肉汤（或灭菌氯化钠注射液）稀释浓度至106ＣＦＵ／ｍＬ，４℃保存。
淋巴细胞的制备
将健康BALA／c 小鼠颈椎脱臼致死，无菌分离脾，置RPMI－1640培养液中，200 目细胞筛研磨，离心，收集细胞悬液，1500 r／min离心５min，弃上清，加入红细胞裂解液，RPMI－1640完全培养液终止反应，1500ｒ／min离心５min，弃上清，Ｈａｎｋｓ液洗涤３ 次，重悬细胞，37℃５％二氧化碳（ＣＯ２）培养３ｈ，收集未贴壁悬浮细胞，1500／min 离心5min，弃上清，重悬细胞，调整细胞浓度至10万个／ｍＬ，待用。
巨噬细胞的制备
健康BALA／c 小鼠颈椎脱臼致死，75％乙醇浸泡消毒３ ｍｉｎ；将皮肤剪开暴露腹膜，将４ｍＬRPMI－1640不完全培养液注入小鼠腹腔，轻揉小鼠腹部２～３ｍｉｎ，静止5-7min无菌抽取腹腔液，1000ｒ／min离心５min，弃上清，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤２次。RPMI－1640培养液悬浮细胞，Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色计活细胞超过95％，将细胞密度调整为500 万个／ｍＬ，制成腹腔巨噬细胞悬液。96孔细胞培养板每孔加入100μＬ 细胞悬液，置５％ ＣＯ２中，３７℃培养２ ｈ，弃上清，RPMI－1640不完全培养液洗板１次，弃上清，每孔再加入100μＬ的RPMI－1640完全培养液，贴壁细胞即为纯化后的小鼠巨噬细胞。
1.3数据分析
采用SPSS16.统计软件进行单因素方差统计学分析，数据以平均数±标准差表示，相同字母表示无显著性差异，不同字母代表差异显著。
2结果
2.1桔梗皂苷Ｄ对淋巴细胞增殖的影响
表1表明，PD 组淋巴细胞刺激指数均极显著高于空白对照组，表明 PD 能刺激淋巴细胞提高其增殖能力。阳性对照组与空白对照相比，具有显著性差异，说明阳性对照组能刺激淋巴细胞提高其增殖能力。阳性对照组的淋巴细胞刺激指数要显著高于实验组20μg/mLPD、80μg/mLPD的指数值。PD 为 40μg/m L 浓组淋巴细胞SI 均极显著，为2.95，显著高于其他实验组。PD 在低浓度时随着浓度的升高刺激指数随之升高，当达到一定浓度，刺激指数随浓度升高而降低。
表1 PD单药组对淋巴细胞增殖的影响
分组 淋巴细胞刺激指数（SI）
空白对照 1±0<sup>d</sup>
阳性对照 2.9±0.34<sup>a</sup>
20μg/mLPD 2.11±0.05<sup>bc</sup>
40μg/mLPD 2.95±0.12<sup>a</sup>
80μg/mLPD 2.3±0.6<sup>b</sup>
2.2桔梗皂苷D 对淋巴细胞分泌细胞因子的影响
表2表明，PD组淋巴细胞因子IFN－γ和IL-6显著高于空白对照组，表明 PD能够诱导淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6因子。阳性对照（LEV）组淋巴细胞因子要高于20μg/mLPD、80μg/mLPD和空白对照组实验组，表明LEV实验组诱导淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6因子。PD 为40μg/m L实验组的细胞分泌细胞因子的分泌量为125pg/mL，要显著高于其他实验组，说明PD ,在40μg/m L 浓度组对诱导淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6效果优于其他浓度组。淋巴细胞IFN-γ 和 IL-6 的分泌量在 PD低浓度时随PD浓度升高而升高，当 PD浓度达到一定量时，随着PD浓度升高而降低，呈现双向调节作用。
表2 PD对淋巴细胞因子IFN－γ和IL-6分泌的影响
分组 IFN－γ(pg/mL） IL-6(pg/mL）
空白对照 880±65<sup>C</sup> 87.9±0.65<sup>C</sup>
阳性对照 1583±29<sup>a</sup> 127±29<sup>a</sup>
20μg/mLPD 1415±38<sup>b</sup> 111.5±38<sup>b</sup>
40μg/mLPD 1550±89<sup>a</sup> 125±0.89<sup>a</sup>
80μg/mLPD 1417±28<sup>b</sup> 114±0.8<sup>b</sup>
2.3桔梗皂苷Ｄ对巨噬细胞吞噬功能的影响
表3可知，PD组巨噬细胞的OD值均极显著于空白对照组，表明PD能够提高巨噬细胞的吞噬功能。阳性对照组巨噬细胞的OD值极显著高于空白对照组表明阳性对照（LEV） 能提高巨噬细胞的吞噬功能。阳性对照（LEV）组巨噬细胞OD值要高于20μg/mLPD、80μg/mLPD，与40μg/mLPD差异不显著。PD 为 40μg/m L 浓度组巨噬细胞的OD值极显著高于其他浓度组，表明PD为40μg/m L浓度组对提高巨噬细胞的吞噬效果优于其他浓度组，巨噬细胞的吞噬能力在PD低浓度时，随着PD浓度升高而升高，PD浓度达到一定量时，随着PD 浓度升高而降低，呈现双向调节作用。
表3桔梗皂苷 D对巨噬细胞吞噬功能的影响
分组 巨噬细胞OD值
空白对照 0.14±0.2<sup>c</sup>
阳性对照 0.239±0.4<sup>a</sup>
20μg/mLPD 0.18±0.05<sup>b</sup>
40μg/mLPD 0.25±0.02<sup>a</sup>
80μg/mLPD 0.186±0.06<sup>b</sup>
3结论
（1）机体免疫应答的一个重要阶段就是淋巴细胞的增殖，增殖能力的强弱反映淋巴细胞功能的强弱，通过淋巴细胞的增殖，能够间接的对机体的免疫功能作出判断，本论文研究结果显示，桔梗皂苷Ｄ 在一定的质量浓度范围内，能够促进淋巴细胞的增殖。随着桔梗皂苷Ｄ 质量浓度增加淋巴细胞增殖率也增加，当桔梗皂苷Ｄ 质量浓度达到一定时，随着桔梗皂苷Ｄ 质量浓度增加淋巴细胞增殖率反而下降。提示桔梗皂苷Ｄ促进淋巴细胞增殖，呈双重调节作用。
（2）研究表明，桔梗皂苷Ｄ 在一定的质量浓度范围内，能够促进淋巴细胞IFN－γ和IL-6的分泌，淋巴细胞IFN-γ 和 IL-6 的分泌量在 PD低浓度时随PD浓度升高而升高，当 PD浓度达到一定量时，随着PD浓度升高而降低，呈现双向调节作用。
（3）桔梗具有免疫调节功能，桔梗水提取物（ＣＫ）可促进巨噬细胞增殖、分化、吞噬和细胞毒性，另外还可促进一氧化氮（ＮＯ）及细胞因子的分泌，因此，它是调节巨噬细胞功能有效的促进。研究表明，桔梗皂苷Ｄ 在一定的质量浓度范围内，能够提高巨噬细胞的吞噬功能。随着桔梗皂苷Ｄ 质量浓度增加巨噬细胞的吞噬功能也增加，当桔梗皂苷Ｄ 质量浓度达到一定时，随着桔梗皂苷Ｄ质量浓度增加巨噬细胞的吞噬功能反而下降。说明桔梗皂苷Ｄ 促进巨噬细胞的吞噬功能呈双重调节作用。这在一定程度上可反应巨噬细胞吞噬细菌等异物的能力，因此提示桔梗皂苷Ｄ 可能对未活化的巨噬细胞的吞噬功能有上调作用，可增强对于外来病原体的固有免疫反应能力。
因此，本发明公开了一种桔梗皂苷D的应用，所述桔梗皂苷D应用于动物饲料添加剂；所述桔梗皂苷D提取物是从桔梗中分离出来,分子式为C57H92O28，相对分子质量为1224.58。
进一步的，所述桔梗皂苷D在制备提高动物巨噬细胞和脾淋巴细胞增殖的动物饲料添加剂中的应用。
进一步的，所述桔梗皂苷D提高饲料添加剂对动物的淋巴细胞增殖的应用。
进一步的，所述桔梗皂苷D提高饲料添加剂对动物的的淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6因子的应用。
因此，本发明公开了一种桔梗皂苷D饲料添加剂，所述桔梗皂苷D饲料添加剂包括桔梗皂苷D提取物，所述桔梗皂苷D提取物是从桔梗中分离出来,分子式为C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种桔梗皂苷D的应用，其特征在于：所述桔梗皂苷D应用于动物饲料添加剂；所述桔梗皂苷D提取物是从桔梗中分离出来,分子式为C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。
2.如权利要求1所述的一种桔梗皂苷D的应用，其特征在于：所述桔梗皂苷D在制备提高动物巨噬细胞和脾淋巴细胞增殖的动物饲料添加剂中的应用。
3.如权利要求1所述的一种桔梗皂苷D的应用，其特征在于：所述桔梗皂苷D提高饲料添加剂对动物的淋巴细胞增殖的应用。
4.如权利要求1所述的一种桔梗皂苷D的应用，其特征在于：所述桔梗皂苷D提高饲料添加剂对动物的的淋巴细胞分泌IFN－γ和IL-6因子的应用。
5.一种桔梗皂苷D饲料添加剂，所述桔梗皂苷D饲料添加剂包括桔梗皂苷D提取物，所述桔梗皂苷D提取物是从桔梗中分离出来,分子式为C57H92O28，相对分子质量为1 224.58。
6.一种桔梗皂苷D饲料添加剂的应用的制备方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，菌悬液制备；第二步，淋巴细胞的制备；第三步，巨噬细胞的制备；第四步，数据分析。
7.如权利要求6述的制备方法，其特征在于：桔梗皂苷D饲料添加剂应用提高小鼠的淋巴细胞增殖。
8.如权利要求7所述的的制备方法，其特征在于：第一步中，将金黄色葡萄球菌种接种于肉汤培养基上，斜面活化，恒温37℃培养18-24h，挑若干个单个菌落接种于新鲜肉汤培养基中，置３７℃恒温箱中培养18-24h，肉汤稀释浓度至106ＣＦＵ／ｍＬ，４℃保存。
9.如权利要求7所述的的制备方法，其特征在于：第二步中，将健康BALA／c 小鼠颈椎脱臼致死，无菌分离脾，置RPMI－1640培养液中，200 目细胞筛研磨，离心，收集细胞悬液，1500 r／min离心５min，弃上清，加入红细胞裂解液，RPMI－1640完全培养液终止反应，1500ｒ／min离心５min，弃上清，Ｈａｎｋｓ液洗涤３ 次，重悬细胞，37℃５％二氧化碳培养３ｈ，收集未贴壁悬浮细胞，1500／min 离心5min，弃上清，重悬细胞，调整细胞浓度至10万个／ｍＬ，待用。
10.如权利要求7所述的的制备方法，其特征在于：第三步中，健康BALA／c 小鼠颈椎脱臼致死，75％乙醇浸泡消毒３ ｍｉｎ；将皮肤剪开暴露腹膜，将４ｍＬRPMI－1640不完全培养液注入小鼠腹腔，轻揉小鼠腹部２～３ｍｉｎ，静止5-7min无菌抽取腹腔液，1000ｒ／min离心５min，弃上清，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤２次；
RPMI－1640培养液悬浮细胞，Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色计活细胞超过95％，将细胞密度调整为500 万个／ｍＬ，制成腹腔巨噬细胞悬液；
96孔细胞培养板每孔加入100μＬ 细胞悬液，置５％ ＣＯ２中，３７ ℃培养２ ｈ，弃上清，RPMI－1640不完全培养液洗板1次，弃上清，每孔再加入100μＬ的RPMI－1640完全培养液，贴壁细胞即为纯化后的小鼠巨噬细胞。
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WO2010085091A2 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 B & C Biopharm Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis c, comprising the roots extract of platycodon grandiflorum or platycodon grandiflorum saponin components
CN104758339A (zh) * 2015-05-05 2015-07-08 吉林农业大学 桔梗皂苷元在制备药物和保健品中的新用途

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冯慧慧等: "桔梗皂苷D对小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响", 《饲料研究》 *

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