CN110753558A - 新化合物及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有将免疫应答与定义的治疗靶标连接的能力的新化合物，涉及所述化合物在治疗癌症和感染性疾病中的用途，涉及包含所述化合物的组合物、它们的制备方法以及在所述方法中使用的新中间体。

Description

新化合物及其治疗用途
发明领域
本发明涉及具有将免疫应答与定义的治疗靶标连接的能力的新化合物，涉及所述化合物在治疗癌症和感染性疾病中的用途，涉及包含所述化合物的组合物、它们的制备方法以及在所述方法中使用的新中间体。
发明背景
有必要寻找招募个体免疫系统来对抗疾病的新方法。人免疫系统不断检查身体以发现外来信号，从而识别潜在有害的病原体或突变的人细胞(可能成为癌生长的原因)并且将其作为消除的目标。存在天然抗体，可以招募它们到所述病原体或突变的人细胞以驱使免疫系统消除威胁。
癌症是一组涉及异常细胞生长的疾病，可能会侵袭或扩散到身体的其它部位。2012年，约有1,410万人罹患癌症。它导致大约820万人死亡，或占所有人类死亡的14.6％。男性最常见的癌症类型是肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和胃癌。在女性中，最常见的类型是乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和宫颈癌。众所周知，免疫应答在癌细胞的鉴定和消除中起着至关重要的作用。存在通过增强个体免疫力来帮助抗击癌症的药物。有必要能够更好地将免疫应答特异性靶向癌细胞，并且产生更大范围的患者自身的肿瘤相关抗原。将预先存在的天然抗体靶向患者自身的肿瘤可以满足这一需求。迫切需要确定治疗细菌、病毒和真菌感染的新方法。抗微生物药耐药性正成为全球健康的主要威胁。例如，据估计，美国每年有超过200万人感染对一类抗生素具有耐药性的细菌(Centers for Disease Control andPrevention,2013)。
WO 2005/079423中公开了治疗感染性疾病或癌症的新方法，其描述了包含两个结合部分的免疫接头。第一结合部分能够结合个体的免疫应答组分。第二结合部分能够结合任何化合物或异物，例如抗原、病原体、化学物质或内源性物质，例如在癌症中发现的改变的细胞。所述免疫接头的产生的作用在于使个体先前存在的免疫应答转向靶标，即癌细胞或特异性病原体。所述第一结合部分的实例包括被所述个体的免疫系统识别为外来的并且因此将触发免疫应答的化合物或活性剂。
第一结合部分的典型实例包括小分子半抗原二硝基苯基(DNP)、鼠李糖或β-1,6-葡聚糖。第一结合部分的另一个实例是能够与人血清抗体抗α-半乳糖基(即半乳糖基-α-1,3-半乳糖基-β-1,4-N-乙酰基葡糖胺；‘抗-Gal’)结合的碳水化合物分子。
由于免疫功能取决于多价，因此抗-Gal募集不仅取决于抗-Gal的浓度，还取决于抗体对靶标的亲和力。
所述第二结合部分的实例包括与特异性靶分子结合的抗体或其片段。所述第二结合部分的其它实例包括已建立的治疗性抗体或其功能片段。以此方式靶向的细胞或病原体可以被免疫系统识别为外来的并且标记为破坏。因此，天然抗体可以被动员到这些肿瘤细胞或病原体，并且利用免疫系统消除威胁。
WO 98/34957描述了使用标记有α-半乳糖基表位的抗体刺激免疫应答。该文献描述了其中免疫系统的刺激依赖于将α-半乳糖基表位掺入抗体恒定区内改造的糖基化位点的实施方案。据报道，在表达α-1,3-半乳糖基转移酶的细胞系中产生适当改造的抗体会导致α-半乳糖基表位的添加。在这种情况下，掺入的表位的数目取决于为糖基化改造的残基的数目。该方法的缺点在于可导入的α-半乳糖基残基的数目受到限制(受位点特异性氨基酸修饰的数目限制)。该方法的另一个缺点在于α-1,3-半乳糖基转移酶递送了碳水化合物衍生物群体，其对于抗-半乳糖基抗体募集可能不是最佳的，从而进一步限制了免疫募集表位的数目。因此，需要能够相对于抗体部分优化装载和呈递α-半乳糖基表位以最大化免疫应答的接头分子。
因此，非常需要含有间隔基的接头分子，该间隔基已被优化以控制第一结合部分(即能够结合人抗α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子)相对于第二结合部分(即抗体或抗原结合片段)的位置的数量和位置。此类接头分子被设计成以能够优化免疫募集的功效同时最小化潜在副作用的方式吸引天然抗体，并且由此在提供有效的抗癌疗法和针对传染源的疗法中具有很大的实用性。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了免疫缀合物，其包含通过接头与能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子连接的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述接头包含至少一个能够展示出一个或多个能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物表位的苯基环。
根据本发明的第二方面，提供了免疫缀合物，其为式(A)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002304261050000031
其中F为能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；Cy为苯基、联苯基或三联苯基；SA和SB表示为F和L的最佳距离而选择的间隔基；m表示选自1-5的整数；z表示选自1-30的整数；并且L为抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自-(CH2)a-或-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团，其中所述-CH2-基团的1-10个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-O-、-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自1-35的整数；
b表示选自0-5的整数；
c表示选自1-20的整数；
d表示选自1-20的整数；
S2表示间隔基，其选自-(CH2)e-或-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团，其中所述-CH2-基团的1-3个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-；
e表示选自1-15的整数；
f表示选自1-10的整数；
g表示选自1-20的整数；
h表示选自1-5的整数；
z表示选自1-30的整数；
X1表示抗体或抗原结合片段连接部分；
Y1和Y2独立地表示键、-O-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NHSO2-、-SO2NH-或-NHC(O)NH-基团；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1-5的整数；并且
Cy表示苯基、联苯基、三联苯基，其中当Cy表示联苯基或三联苯基时，所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，并且所述一个或多个[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
附图简述
图1：实施例1-4的还原SDS page分析。
图2：实施例5-8的还原SDS page分析。
图3：单体含量分析：实施例1-8的SEC。
图4：实施例1-8化合物的M86IgM数据。
图5：实施例1-4化合物的M86IgG数据。
图6：显示应用10nM的实施例5(图6A)、实施例6(图6B)、实施例7(图6C)和实施例8(图6D)与10nM西妥昔单抗比较的将抗-α半乳糖基IgM抗体俘获至细胞表面。
图7：募集hIVIG抗-α-半乳糖基IgG至A431细胞的实施例18-23化合物的剂量滴定。
图8：募集抗-半乳糖基M86IgM抗体至A431细胞的实施例9-24化合物的剂量滴定。
图9：实施例13-17、20、22、23和24化合物与20％人血清(HS)或热灭活人血清(HIHS)+25μg/mL M86IgM在A431细胞上的C3b沉积数据。
图10：实施例20和23化合物的吞噬作用数据。
图11：募集抗-半乳糖基M86IgM抗体至Raji细胞的实施例25和26化合物的剂量滴定。
图12：西妥昔单抗缀合物的还原SDS-PAGE凝胶分析(实施例9-17)。
图13：西妥昔单抗-Fab缀合物的还原SDS-PAGE凝胶分析(实施例18-24)。
图14：实施例20(图14A)、22(图14B)和23(图14C)的MS分析。
图15：利妥昔单抗和利妥昔单抗-Fab缀合物(实施例25(图15B)和26(图15C))的还原SDS-PAGE(图15A)和SEC分析。
图16：西妥昔单抗-Fab的SDS-PAGE(图16A)、MS(图16B)和SEC(图16C)分析。
图17：利妥昔单抗的SDS-PAGE(图17A)和SEC分析(图17B)和利妥昔单抗-Fab的SEC分析(图17C)。
发明详述
根据本发明的第一方面，提供了免疫缀合物，其包含通过接头与能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子连接的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述接头包含至少一个能够展示出一个或多个能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物表位的苯基环。
在本发明第一方面的一个实施方案中，所述接头包括苯基、联苯基或三联苯基。在本发明第一方面的另一个实施方案中，所述接头包括联苯基。
根据本发明的第二方面，提供了免疫缀合物，其为式(A)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002304261050000061
其中F为能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；Cy为苯基、联苯基或三联苯基；SA和SB表示为F和L的最佳距离选择的间隔基；m表示选自1-5的整数；z表示选自1-30的整数；并且L为抗体或其抗原结合片段。
根据可以提及的本发明的第二方面，提供了免疫缀合物，其为式(A)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002304261050000062
其中F为能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；Cy为苯基、联苯基或三联苯基；SA和SB表示为F和L的最佳距离而选择的间隔基；m表示选自1-5的整数；z表示选自1-10的整数；并且L为抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002304261050000063
其中L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自-(CH2)a-或-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团，其中所述-CH2-基团的1-10个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-O-、-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自1-35的整数；
b表示选自0-5的整数；
c表示选自1-20的整数；
d表示选自1-20的整数；
S2表示间隔基，其选自-(CH2)e-或-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团，其中所述-CH2-基团的1-3个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-；
e表示选自1-15的整数；
f表示选自1-10的整数；
g表示选自1-20的整数；
h表示选自1-5的整数；
z表示选自1-30的整数；
X1表示抗体或抗原结合片段连接部分；
Y1和Y2独立地表示价键、-O-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NHSO2-、-SO2NH-或-NHC(O)NH-基团；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1-5的整数；并且
Cy表示苯基、联苯基、三联苯基，其中当Cy表示联苯基或三联苯基时，所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，并且所述一个或多个[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
根据可以提及的本发明的另一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自-(CH2)a-或-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团，其中所述-CH2-基团的1-10个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-O-、-S-、＝N(H)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自1-35的整数；
b表示选自0-5的整数；
c表示选自1-20的整数；
d表示选自1-20的整数；
S2表示间隔基，其选自-(CH2)e-或-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团，其中所述-CH2-基团的1-3个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-；
e表示选自1-15的整数；
f表示选自1-10的整数；
g表示选自1-20的整数；
h表示选自1-5的整数；
z表示选自1-10的整数；
X1表示抗体或抗原结合片段连接部分；
Y1和Y2独立地表示键、-O-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NHSO2-、-SO2NH-或-NHC(O)NH-基团；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1-5的整数；并且
Cy表示苯基、联苯基、三联苯基，其中当Cy表示联苯基或三联苯基时，所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，并且所述一个或多个[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
本发明包括新的免疫缀合物接头的描述和用途，所述新的免疫缀合物接头除与所选抗体或其片段上的单个或多个位点缀合外，还能够展示碳水化合物的一个或多个表位，从而使得天然抗体能够最佳地募集，同时保留靶标结合功效。本发明为本领域技术人员提供了微调每个所选抗体或其片段的最佳碳水化合物数目，以实现最佳的抗-Gal募集并且保留靶标功效。
单克隆抗体极大地改善了罹患癌症的患者的结果，但是某些患者群体显示出对这些疗法的内在耐药性，不过，可以观察到良好的结果，但这些结果可能是短暂的，并且获得的对mAb疗法的耐药性仍然是一个问题，并且抗体效能提高是期望的。肿瘤可以证明或展示出导致对抗体治疗的耐药性或对抗体治疗的应答降低的机制，例如通过增加受体表达或改变信号传导通路或降低免疫应答(Reslan,L.Mabs 2009,3,222)。例如，患者可以显示出由于影响EGFR信号传导的KRAS突变的表达而导致对西妥昔单抗的内在耐药性(Lievre,A,J.Clin.Oncol.2008,26,374)。另外，在患者最初对西妥昔单抗反应良好的情况下，大多数将最终获得耐药性(Bianco,R.Endocr.Relat.Cancer 2005,S159；Brand,TM.CancerBiol.Ther.2011,11,777)。
在用利妥昔单抗(抗-CD20单克隆抗体)治疗的非霍奇金淋巴瘤患者的情况下，观察到对治疗性抗体具有耐药性的另一个实力。在大约一半治疗幼稚患者
Figure BDA0002304261050000091
中观察到了对利妥昔单抗的耐药性。对利妥昔单抗疗法显示出初始响应的患者经常会产生耐药性。耐药性机制很复杂，并且克服抗药性的策略在患者中显示出有限的成功(Best Pract.Res.Clin.Haematol.2011,203-216)，因此仍然迫切需要改善治疗性抗体的活性以增加和延长患者的响应。
已经采取了许多方法来改善治疗性抗体的功效，包括抗体药物缀合物(ADC)，抗体毒素缀合物(免疫毒素)和具有增强的效应器机制的改造的抗体，例如抗体依赖性细胞毒性增加(ADCC)。尽管做出了这些努力，但几乎没有疗法在临床上取得成功，并且副作用(例如毒性)仍然是关键问题(Beck,A.Nat.Rev.Drug.Discov.2017)，因此，需要新的策略来修饰mAb以增强功效，从而改善患者结果。
α-Gal表位(Galα1,3Galα1,4GlcNAc-R)是一种独特的碳水化合物，其天然产生于糖脂和糖蛋白上，以便在分支的寡糖上展示出多个表位(J.Immunology(2007),178(7),4676-87)。α-Gal表位例如由转移酶α1-,3-GT合成，该酶是众所周知的在多个糖基化位点催化Galα-1,3-Gal的合成的酶(WO 98/34957)。尽管这种方法是有效的，但是合成依赖于现有的或改造的糖基化位点，并且每个缀合位点仅允许一个α-Gal单元。
因此，迫切需要一种适合的模块化方法以便单呈递或多呈递α-Gal三糖单元来最佳地利用天然免疫系统。
本发明化合物包含接头分子，其相对于结合部分L(即抗体或其片段)的位置已被优化以控制和显示F基团(即能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子)的数目和位置。例如，刚性环状基团具有为一个或多个F基团相对于L的最佳定位提供骨架的优点。应当理解，F基团相对于L的确切数目和方向将取决于L基团的性质。此外，包含单个苯基环、联苯基环或三联苯基环的环状基团的存在提供了提供多个F基团(即能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子)的显著优势，以增强来自宿主产生的免疫应答。多个结合基团的化学呈递是本领域先前已知的，然而，与采用单个6元环系统(即苯基)、通过键连接的两个6元环系统(联苯基)或通过2个键连接的3元环系统(三联苯基)的本发明相反，使用一个或多个氨基酸基团(例如参见WO 2014/178878)或支链接头基团(例如参见US 2014/0112975)已经实现了这一目的。这种区别的技术效果是，与现有技术中已知的接头相比，本发明化合物可以更容易地制备，这有利地避免了手性中心的存在并且不易被蛋白酶降解。本发明化合物的合成也没有使用树脂，因此提供了适合于大规模制药生产的规模的优点。因此，本发明化合物不仅在治疗上有效，而且提供了以下优点：增强了来自宿主的免疫应答，并且以规模可伸缩性的高收率容易并且高效地合成。另外，本发明的接头不是不稳定的，因此，典型地不包含本领域在先已知的许多化合物所要求的“可裂解的接头”组分(例如参见US 8,828,956)。此外，本发明的接头使本领域技术人员能够在合成方面容易并且有效地选择特定的左手和右手基团组合，以使得每个抗体或其片段缀合位点具有最佳数目的F基团。
在肿瘤学领域也已知单克隆抗体片段，例如Fab、Fab’、Fab’2、Fab2、Fab3、F(ab)2、Fv、scFv、双体、三抗体、四抗体、纳米抗体。已经报道了相比全长mAb的许多优点；包括由于其更小的尺寸，更容易生产(它们可以在大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达而导致的便利性和更有效的按比例扩大生产)所导致的增加的肿瘤渗透性以及降低的免疫原性。但是，与全长mAb相比，片段例如scFvs或Fab片段的功效可能会降低。例如，Fab片段上缺乏Fc结构域消除了ADCC驱动的功效的潜能，这通常是抗肿瘤应答的组分(Nelson,A.L.mAbs 2009,2,77)。
因此，抗体片段的益处通常被与其相关的功能丧失所抵消。应用本发明的含苯基的接头以提供新的构建体，其中将最佳数目的α-Gal部分缀合到抗体片段上，这提供了增强抗体片段的抗肿瘤作用的新方法。
对于mAb及其片段，受控的位点特异性缀合在本领域中是众所周知的，例如，通过掺入额外的半胱氨酸残基。这种方法提供了几个优点，特别是通过使得mAb或片段衍生化而不会破坏靶标结合表位，并且通过控制加载即实现固定化学计量(Shen,B.Q.Nat.Biotechnol.2012,30,184)。位点特异性缀合的一个限制在于缀合部分的低负载可能导致限制功效。使得每个缀合位点能够呈递多个α-Gal部分的本发明的含苯基的接头的应用，即使缀合位点的数量低也能够提供实现高α-Gal/抗体比例(高载量)的方法。
连接基定义
在一个实施方案中，S1表示间隔基，其选自：
-(CH2)a-，其中所述-CH2-基团的1-5个(例如2、3或5个)可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮(例如-(CH2)2-NHCO-环己基-CH2-3-吡咯烷-2,5-二酮-、-(CH2)2-NHCO-环己基-CH2-3-吡咯烷-2,5-二酮-S-(CH2)3-C(＝NH)-或-(CH2)2-NHCO-(CH2)3-CO-)；或
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述-CH2-基团的1-5个(例如2个)可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-NHC(O)-或吡咯烷-2,5-二酮(例如-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-3-吡咯烷-2,5-二酮-)。
在另一个实施方案中，S1表示间隔基，其选自：
-(CH2)a-，其中所述-CH2-基团的1-10个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-O-、-S-、＝N(H)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮(例如-(CH2)2-NHCO-环己基-CH2-吡咯烷-2,5-二酮-或-(CH2)2-NHCO-环己基-CH2-吡咯烷-2,5-二酮-S-(CH2)3-C(＝NH)-)。
可以理解，选择a、b、c、d、e、f、g和h以维持基团F与L之间的适合的接头长度。F与L之间适合的接头长度的实例在约
Figure BDA0002304261050000121
-约
Figure BDA0002304261050000122
或更长的长度，约
Figure BDA0002304261050000123
-约
Figure BDA0002304261050000124
约-约
Figure BDA0002304261050000126
约
Figure BDA0002304261050000127
-约
Figure BDA0002304261050000128
约
Figure BDA0002304261050000129
-约
Figure BDA00023042610500001210
约
Figure BDA00023042610500001211
-约约
Figure BDA00023042610500001213
-约
Figure BDA00023042610500001214
约
Figure BDA00023042610500001215
-约
Figure BDA00023042610500001216
因此，在一个实施方案中，a、b、c、d、e、f、g和h表示不大于45的总整数，例如5-45，例如7-42，例如不大于30，例如5-30，例如7-29。
在一个实施方案中，a表示选自1-30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自2-30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自2、4、6、9、11、18或30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自6-30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自6、11、18或30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自5-15的整数。在另一个实施方案中，a表示选自6-11的整数。在另一个实施方案中，a表示选自6、7或11的整数。在另一个实施方案中，a表示选自6的整数。在一个可选择的实施方案中，a表示选自7的整数。在一个可选择的实施方案中，a表示选自11的整数。
在一个实施方案中，b表示选自0-3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自0或3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自1-3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自2或3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自3的整数。
在一个实施方案中，c表示选自1-15的整数。在另一个实施方案中，c表示选自1-12的整数。在另一个实施方案中，c表示选自4-12的整数。在另一个实施方案中，c表示选自4或12的整数。在另一个实施方案中，c表示选自4的整数。
在一个实施方案中，d表示选自1-15的整数。在另一个实施方案中，d表示选自2-13的整数。在另一个实施方案中，d表示选自2、5或13的整数。在另一个实施方案中，d表示选自13的整数。在一个可选择的实施方案中，d表示选自3的整数。
在一个实施方案中，Y1表示键、-C(O)NH-或-O-。在另一个实施方案中，Y1表示-C(O)NH-。
在一个实施方案中，S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被1或2个选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-的基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-、-(CH2)3-、-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-、-(CH2)3-NH-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1-3个任选被1-3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)。
在另一个实施方案中，S2表示间隔基，其选自-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-、-(CH2)3-、-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-或-(CH2)3-NH-CH2-)或-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-或-(CH2)4-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-)。
在另一个实施方案中，S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被1或2个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1-3个任选被1-3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)。
在另一个实施方案中，S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被1或2个选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-的基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1-3个任选被1-3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-。
在另一个实施方案中，S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个、例如1个任选被1或2个、例如1个选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-的基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-)。
在另一个实施方案中，S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1个任选被-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的2个任选被-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)。
在一个实施方案中，e表示选自1-10的整数。在另一个实施方案中，e表示选自3-10的整数。在另一个实施方案中，e表示选自3、5、9或10的整数。在另一个实施方案中，e表示选自5-9的整数。在另一个实施方案中，e表示选自5或9的整数。在另一个实施方案中，e表示选自4-10的整数。在另一个实施方案中，e表示选自4、5或10的整数。在另一个实施方案中，e表示选自5的整数。
在一个实施方案中，f表示选自1-8的整数。在另一个实施方案中，f表示选自2-8的整数。在另一个实施方案中，f表示选自2-6的整数。在另一个实施方案中，f表示选自4-8的整数。在另一个实施方案中，f表示选自的整数4或8。在另一个实施方案中，f表示选自4的整数。
在一个实施方案中，g表示选自1-15的整数。在另一个实施方案中，g表示选自4-12的整数。在另一个实施方案中，g表示选自4或12的整数。在另一个实施方案中，g表示选自1-5的整数。在另一个实施方案中，g表示选自1-4的整数。在另一个实施方案中，g表示选自的4整数。
在一个实施方案中，h表示选自1-4的整数。在另一个实施方案中，h表示选自4的整数。
在一个实施方案中，Y2表示键、-O-或-NHC(O)-。在另一个实施方案中，Y2表示键或-O-。在另一个实施方案中，Y2表示-O-。
在一个实施方案中，m表示选自1-4的整数。在另一个实施方案中，m表示选自1-3的整数。在另一个实施方案中，m表示选自1或3的整数。在另一个实施方案中，m表示选自2或3的整数。在另一个实施方案中，m表示选自1或2的整数。在另一个实施方案中，m表示选自1的整数。在另一个实施方案中，m表示选自2的整数。在另一个实施方案中，m表示选自3的整数。在另一个实施方案中，m表示选自4的整数。
在另一个实施方案中，z表示选自1-25的整数。在另一个实施方案中，z表示选自1-20的整数。在另一个实施方案中，z表示选自2-20(例如2、4.9、5、7、8、10、11、14、15、17或20)的整数。在另一个实施方案中，z表示选自1-8的整数。在另一个实施方案中，z表示选自1-5的整数。在另一个实施方案中，z表示选自2-5的整数。在另一个实施方案中，z表示选自2或5的整数。在另一个实施方案中，z表示选自2的整数。在另一个实施方案中，z表示选自5的整数。
在一个实施方案中，Cy表示苯基或联苯基。在另一个实施方案中，Cy表示联苯基或三联苯基。在另一个实施方案中，Cy表示苯基或三联苯基。在另一个实施方案中，Cy表示联苯基。
根据本发明的另一方面，提供了式(I)a化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002304261050000151
其中L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自：
-(CH2)a-，其中所述-CH2-基团的2、3或5个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；或
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述-CH2-基团的2个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-NHC(O)-或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自6、7或11的整数；
b表示选自3的整数；
c表示选自4的整数；
d表示选自3的整数；
S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1个任选被-NHC(O)-基团取代；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的2个任选被-NHC(O)-基团取代；
e表示选自5的整数；
f表示选自4的整数；
g表示选自4的整数；
h表示选自4的整数；
z表示选自2-20的整数；
X1表示-S-或-N(H)-；
Y1表示-C(O)NH-；
Y2表示-O-；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1或3的整数；并且
Cy表示联苯基，其中所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，并且一个或多个所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
根据可以提及的本发明的另一方面，提供了式(I)a化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002304261050000171
其中L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自-(CH2)a-基团，其中所述-CH2-基团的1-5个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-O-、-S-、＝N(H)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自6或11的整数；
S2表示间隔基，其选自-(CH2)e-基团，其中所述-CH2-基团的1-3个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-；
e表示选自5的整数；
z表示选自2-5的整数；
X1表示-S-或-N(H)-；
Y1表示-C(O)NH-；
Y2表示-O-；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1或3的整数；并且
Cy表示联苯基，其中所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，并且一个或多个所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包括实施例1-26化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其为实施例1-26化合物的游离碱。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包括实施例1-8化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其为实施例1-8化合物的游离碱。
αGal
本文中提及的术语“能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子”包括能够与所述人的免疫应答组分(即抗α-半乳糖基抗体)结合并且从而引发人免疫应答的糖(即碳水化合物)部分。在一个实施方案中，所述抗-α-半乳糖基抗体为抗-α-半乳糖基IgG抗体或抗-α-半乳糖基IgM抗体。此类碳水化合物分子的实例包括α-半乳糖基化合物及其修饰的衍生物。适当的碳水化合物分子的其它实例包括US 2012/0003251中列出的α-gal表位，其适合用于选择性靶向和杀死肿瘤细胞，该表位引入本文作为参考。在一个实施方案中，F选自半乳糖基-α-1,3-半乳糖基-β-1,4-N-乙酰基葡糖胺、α1-3半乳二糖、α1-3-β1-4-半乳三糖或Galili五糖(galilipentasaccharide)。
在一个特别的实施方案中，F具有如下式之一中所示的结构：
Figure BDA0002304261050000181
其中S2是指连接至S2基团的点。
在一个特别的实施方案中，F具有如下式中所示的结构：
其中S2是指连接至S2基团的点。
抗体及其抗原结合片段
本文提及的术语“抗体”是指结合已知抗原、特别是免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分的分子或分子的活性片段，即包含免疫特异性地结合抗原的结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白可以是任意类型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的IgG，或IgA1和IgA2中的IgA)。
在本发明的范围内，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、人抗体和人源化抗体及其活性片段。与已知抗原结合的分子的活性片段的实例包括Fab、F(ab’)2、scFv和Fv片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物以及任何上述抗体和片段的表位结合片段。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指在实验室中从单个克隆大量生产并且仅识别一种抗原的抗体。单克隆抗体通常通过将正常短寿命的、产生抗体的B细胞与快速生长的细胞(例如癌细胞)(有时称为“无限增殖”细胞)融合来制备。所得的杂交细胞或杂交瘤迅速繁殖，从而生成产生大量抗体的克隆。为了本发明的目的，“单克隆抗体”也应理解为包含由尚未达到完全单克隆性的母克隆产生的抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指包含来自小鼠的可变区，即结合区和衍生自不同来源或物种的恒定区的至少一部分的单克隆抗体，其通常通过重组DNA技术制备。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是示例性实施方案。这样的小鼠/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包含编码小鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段。本公开内容涵盖的其它形式的“嵌合抗体”是其中类别或亚类已经与原始抗体的类别或亚类相比被修饰或改变的那些形式。此类“嵌合”抗体也称为“类别转换抗体”。产生嵌合抗体的方法涉及目前本领域中众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利5,202,238和美国专利5,204,244。
如本文所用，术语“人源化抗体”或“抗体的人源化形式”是指其中框架或“互补决定区”(CDR)已被修饰以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一些示例性的实施方案中，将VH和VL的CDR移植到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等人,Nature 332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.等人,Nature 314(1985)268-270。重链和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列。例如，在Lefranc,M.-P.,CurrentProtocols in Immunology(2000)-Appendix 1P
A.1P.1-A.1P.37中列出了人重链和轻链可变框架区，并且可以通过IMGT,theinternational ImMunoGeneTics information
Figure BDA0002304261050000201
(http://imgt.cines.fr)或通过http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk得到。任选地，框架区可以通过进一步的突变来修饰。示例性的CDR相当于代表识别上述针对嵌合抗体的抗原的序列的那些CDR。在一些实施方案中，这种人源化形式与人恒定区嵌合。如本文所用，术语“人源化抗体”还包含在恒定区中修饰以产生根据本公开的性质的抗体，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别切换”，即Fc部分的改变或突变(例如，从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是众所周知的(van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述动物在免疫接种时能够在不存在内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的所有组成成分或选择人抗体。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列导致抗原攻击时产生人抗体(参见，例如，Jakobovits,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等人,Nature 362(1993)255-258；Brueggemann,M.D.等人,YearImmunol.7(1993)33-40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole,A.等人和Boerner,P.等人的技术也可利用于生产人单克隆抗体(Cole,
A.等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Liss,A.R.(1985)p.77；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已经提到的，根据本公开，本文所用的术语“人抗体”还包含在恒定区中修饰，以产生本公开的性质的抗体，例如关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别切换”，即Fc部分的改变或突变(例如，从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
如本文所用，“单链抗体”是指单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人,1988,Science242:423-426,Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883或双特异性单链Fv(WO 03/11161)。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合两个(或多个)不同抗原的抗体。
如本文所用，术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如可能是其可变结构域，或至少是其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体描述于例如Huston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-88中。抗体片段可以通过许多本领域已知的技术衍生自本发明的抗体。例如，可以用酶例如胃蛋白酶切割纯化的单克隆抗体，并且进行HPLC凝胶过滤。然后可以收集适当的含有Fab片段的级分，并且通过膜过滤等浓缩。对于分离抗体活性片段的通用技术的进一步描述，参见例如Khaw,B.A.等人，J.Nucl.Med.23:1011-1019(1982)；Rousseaux等人，MethodsEnzymology,121:663-69,Academic Press,1986。
如本文所用，术语“特异性”和“特异性地”可互换使用，以表示其它生物分子不显著结合特异性结合感兴趣的生物分子的抗体。在一些实施方案中，与除包含肽内的表位的肽以外的生物分子的结合水平导致通过ELISA或亲和力测定的方式可忽略的(例如，无法确定的)结合亲和力。
所谓“可忽略的结合”是指比包含肽内表位的肽的结合少至少约85％，特别是至少约90％，更特别是至少约95％，甚至更特别是至少约98％，但特别是至少约99％并且至多100％的结合。
如本文所用，术语“表位”是指靶分子(例如，抗原，例如蛋白质)上与抗原结合分子(例如，抗体或抗体片段)结合的位点。表位可以由靶分子的连续或相邻的不连续残基(例如氨基酸残基)形成。由连续残基(例如氨基酸残基)形成的表位通常也称为线性表位。表位通常包括至少5个并且至多约12个残基，大部分在6至10个残基(例如氨基酸残基)之间。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体的高变区。当在本文中使用时，术语“高变区”，“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的序列高变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区；VH(H1、H2、H3)中的三个和VL(L1、L2、L3)中的三个。许多高变区描述正在使用中，并且在本文中涵盖。Kabat互补决定区基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。术语“CDR”之前的字母“HC”和“LC”分别是指重链和轻链的CDR。
如本文所用，术语“同源性”和“同一性”可互换使用。序列之间的序列同源性或同一性的计算如下进行。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比(％)，为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中导入空位，目的在于最佳比对，并且可以忽略用于比较目的的非同源序列)。在优选的实施方案中，为了比较目的比对参比序列的长度为参比序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，并且甚至更优选至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸酸或核酸“同源性”)。考虑到空位数和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数，这需要引入以实现两个序列的最佳比对。
序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在优选的实施方案中，使用Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)的算法，其已合并到GCG软件包中的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获取)，使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，。在又一个优选的实施方案中，采用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获取)中的GAP程序，应用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。一组特别优选的参数(如果从业者不确定应使用哪些参数来确定分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制内，则应使用该参数)是BLOSUM 62得分矩阵，其具有空位罚分12，空位延伸罚分4和移码空位罚分5。
可选择的是，可以使用Meyers等人(1989)CABIOS 4:11-17)的算法确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比，其已并入了ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120权重残差表，以及空位长度罚分12和空位罚分4。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸、组氨酸)。
在一个实施方案中，抗体为多克隆抗体。在一个实施方案中，抗体为人源化抗体、人抗体、鼠抗体或嵌合抗体。
在一个实施方案中，其抗原结合片段是抗原结合片段(Fab)或单链可变片段(scFv)。在另一个实施方案中，所述片段选自Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2和scFv。
应当理解，X1可以表示任何适合的抗体或抗原结合片段连接部分，并且所述基团的选择将取决于被选为抗体内连接点的氨基酸残基。
在一个实施方案中，X1表示-S-或-N(H)-。在该实施方案中，L缀合至如下一至三个结构之一的式(I)化合物：
Figure BDA0002304261050000241
其中S1和z如本文所定义，并且Ab表示抗体或其抗原结合片段，其被反应性硫羟基或赖氨酸基团终止。这类反应性硫羟基或半胱氨酸基团可以位于抗体或其抗原结合片段上，或它们通过位点特异性修饰被导入肽链，以通过改造的氨基酸残基递送另外的缀合点(Nat.Biotechnol.2008,925；Nat.Biotechnol.2012,184)。可选择的是，可以将位点特异性氨基酸并入期望的肽链以便能够实现用于位点特异性缀合的正交化学反应(OPRD(2016),20,852-866)。具有正交反应性的氨基酸的实例包括对-乙酰基苯丙氨酸(pAcPhe,J.Mol.Biol.2011,595)、对-叠氮基甲基-l-苯丙氨酸(pAMF,Bioconjug.Chem 2014,351)、N6-((2-叠氮基乙氧基)羰基)-L-赖氨酸(Bioconjug.Chem.2015,2249)。
应当理解，本发明的抗体或抗原结合片段将被装配为结合至治疗靶标，所述治疗靶标是癌细胞或特异性病原体。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段被装配为结合癌细胞。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关的抗原在肿瘤细胞上的细胞表面表达与在健康细胞上的表达不同。
在优选的实施方案中，抗体或抗原结合片段结合癌细胞或病原体上的靶标。优选的靶标包括：EGFR、HER2、HER3、CD22、EpCAM、PSMA、PSCA、FLT-3、CD30、CD20、CD33、CD23、CD2、CD37、CD25、CD73、CD47、LGR-5、CD80、CD86、CD70、CD74、CD40、CD19、CD79b、CA-125、c-met、CXCR4、DR5、PD-1、PD1L、LeY、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MIP-1A、MIP-1B、KIT、TRAIL受体(R1和R2)、CXCR4、CEACAM、IgF-1R、碳酸酐酶IX、PDGFRa、CD137、CD276、间皮素、VEGFR、P-钙黏着糖蛋白、CD56、细菌Psl、细菌脂多糖、细菌LPS的半乳糖体-III表位、细菌PcrV、RSV F蛋白。
抗-EGFR抗体
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段为表皮生长因子受体(EGFR)结合表位。众所周知，EGFR在几种人癌症类型中过表达。在某些癌细胞上的高表达使EGFR成为新疗法的吸引人的靶标。在一个实施方案中，EGFR结合抗体或抗原结合片段是与选自以下的任何EGFR亚家族结合的表位：EGFR(ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2)，Her 3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。适合的EGFR结合抗体的实例包括但不限于西妥昔单抗、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)和帕木单抗(Panitumumab)。
在另一个实施方案中，EGFR抗体是西妥昔单抗，其为杂种小鼠/人嵌合抗体，包含重链和轻链序列，如(a)Li等人(2005)Cancer Cell 7,301-11；(b)Dubois等人(2008)Anal.Chem.80,1737-45；和(c)www.imgt.org；www.drugbank.ca上取得的IMGT数据库或WO2016/196682中所公开的。
在另一个实施方案中，西妥昔单抗抗体或其抗原结合片段识别并且特异性结合EGFR，并且具有重链和轻链可变结构域，其与SEQ ID NOS：1和2具有至少80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，EGFR结合抗体的片段可以选择作为L的实例。典型的实例包括但不限于西妥昔单抗Fab(Li,S.等人(2005)Cancer Cell 7,301-311)；西妥昔单抗scFv(US 7,060,808)；帕木单抗Fab(Sickmier E.A.等人(2016)PLoSOne 11,9,e0163366)；帕木单抗scFv(US 6,235,883)和D2C7scFv(US 2013/0022598；Clin Cancer Res 2013,19(17),4717-4727)。
抗-CD20抗体
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段为CD20结合表位。众所周知，除去表达CD20的细胞(例如B细胞)在治疗血液系统癌症例如白血病和淋巴瘤方面具有治疗益处。适合的CD20结合抗体的实例包括但不限于利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)和奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)。
Figure BDA0002304261050000281
在另一个实施方案中，CD20抗体为利妥昔单抗，其为杂种小鼠/人嵌合抗体，包含重链和轻链序列，如(a)US 5,736,137、(b)Wang,B.等人(2013)Analyst 138,3058-3065和(c)www.imgt.org；www.drugbank.ca取得的IMGT数据库中所公开的。
在另一个实施方案中，利妥昔单抗抗体或其抗原结合片段识别并且特异性地结合CD20，并且具有与SEQ ID NOS：3和4具有至少80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链和轻链可变结构域。
在另一个实施方案中，CD20结合抗体的片段可以选择作为L的实例，典型实例包括但不限于利妥昔单抗Fab(Du,J.等人(2007)，J.Biological Chem.282,15073-15080)。
在另一个实施方案中，CD20抗体或其片段选自利妥昔单抗或利妥昔单抗Fab。
病原体特异性抗体靶标
在可选择的实施方案中，抗体或抗原结合片段被装配为结合特定的病原体。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段被装配为结合金黄色葡萄球菌(S.aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)细菌。适合的抗体的实例包括但不限于WO 2015/196011、WO 2012/170807和WO 2014/074528中报道的那些。
缀合物
本文公开的任何抗体或其片段可以与包含一个或多个α-Gal的本文所述的环状间隔基接头缀合。本发明涉及在保持抗体或其片段的功效的同时，选择每个接头每个缀合位点的最佳数目的α-Gal单元的能力。缀合的类型可以由本领域技术人员选择，以基于接头的末端官能度和抗体或其片段的表面反应性或选择的反应性位点实现分离的材料的最高收率和纯度。在一些实施方案中，通过向马来酰亚胺部分中添加硫羟基来促进缀合。可选地，可以通过氨基与活化的酯例如NHS酯之间的酰胺键形成来促进缀合。
当缀合物包含导致多个缀合反应的几个反应性位点时，应当理解，上述范围可以指每个抗体或其片段的接头分子的实际或平均数目。
如本文所用，术语‘LAR’(接头：抗体比)是指已成功缀合至抗体或其片段的接头分子的实际数目或平均数目。LAR等价于本文定义为“z”的整数的值。确定接头载量的多种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，通过Mal-vc-PAB-MMAE作为接头的替代有效负载的反应来确定LAR，并且使用HIC进行分析。
缀合物特性
在本文所述的多个实施方案中的任何一个中，抗体或其片段将能够保持其与靶标的结合功效，同时能够最佳地募集抗-Gal。在一个实施方案中，西妥昔单抗保留其结合EGFR的能力，同时被缀合至平均至多五个，例如至多二十个，特别是至多三十个接头分子。
在一些实施方案中，本发明的缀合物可以显示以下性质的一种或多种：
a)接头与抗体或其片段的缀合与未缀合的对应物相比可能不会显著改变与靶标的结合功效；
b)包含α-Gal的接头的缀合可以实现高水平的LAR，而由于寡糖的亲水性而不会伴随高水平的聚集；
c)添加包含α-Gal的接头可以使抗体或其片段更稳定；
d)取决于所选择的接头和/或缀合方法，优选重链或轻链缀合；
e)包含高数量的α-Gal单元的一个选定接头的缀合可能表现出优于具有相同α-Gal负载的几个缀合位点的最佳性能；
f)接头与抗体或其片段的缀合可以导致增强的药代动力学特性。
盐及其衍生物
对式(I)化合物及其亚组的提及还包括其离子形式、盐、溶剂化物、异构体(包括几何和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、同位素和保护形式，例如，如下所述；优选其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂化物；并且更优选其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂化物，甚至更优选其盐或互变异构体或溶剂化物。在下文中，本发明任何方面中所定义的化合物及其离子形式、盐、溶剂化物、异构体(包括几何和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、同位素和保护形式(化学过程中的中间体化合物除外)均被称为“本发明化合物”。
式(I)化合物可以以盐的形式存在，例如酸加成盐，或在某些情况下为有机和无机碱的盐，例如羧酸盐、磺酸盐和磷酸盐。所有此类盐均在本发明的范围内，并且对式(I)化合物的提及包括化合物的盐形式。在一个实施方案中，式(I)化合物作为磷酸盐存在。
本发明的盐可以通过常规化学方法由含有碱性部分的母体化合物合成，所述方法例如描述于Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑),Camille G.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,精装,388页,2002年8月。通常，此类盐可以通过将这些化合物的碱形式与适当的碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；通常应用非水介质，例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。
酸加成盐(单盐或二盐)可以用多种酸形成，包括无机和有机酸。酸加成盐的实例包括与选自下列的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(例如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸以及酰化的氨基酸和阳离子交换树脂。
一组特别的盐包括由下列酸形成的盐：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸(甲磺酸酯)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡糖醛酸和乳糖酸。一种特别的盐是盐酸盐。另一种特别的盐是硫酸氢盐，也称为半硫酸盐。
仅作为实例，盐还包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵盐等。
当式(I)化合物含有胺官能团时，这些可以形成季铵盐，例如根据技术人员公知的方法通过与烷基化剂反应形成。此类季铵化合物在式(I)的范围内。
取决于形成盐的酸的pKa，本发明化合物可以以单盐或二盐存在。
本发明化合物的盐形式通常为药学上可接受的盐，并且药学上可接受的盐的实例讨论于Berge等人,1977,“Phamistry Acceptable Salts”,J.Pharm.Sci.,第66卷,第1-19页。然而，非药学上可接受的盐也可以制备为中间体形式，然后可以将其转化为药学上可接受的盐。可用于例如本发明化合物的纯化或分离的此类非药学上可接受的盐形式也构成本发明的一部分。
有机化学领域的技术人员应当理解，许多有机化合物可以与溶剂形成复合物，它们在该溶剂中反应或从其中沉淀或结晶。这些复合物被称为“溶剂化物”。例如，与水的复合物被称为“水合物”。本发明化合物的药学上可接受的溶剂化物也包括在本发明的范围内。
含有胺官能团的式(I)化合物也可以形成N-氧化物。本文提及的含有胺官能团的式(I)化合物还包括N-氧化物。
当化合物含有数个胺官能团时，一个或多于一个氮原子可以被氧化形成N-氧化物。N-氧化物的特别的实例为叔胺或含氮杂环的氮原子的N-氧化物。
可以通过用氧化剂例如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理相应的胺来形成N-氧化物，参见例如Advanced Organic Chemistry,Jerry March,第4版，WileyInterscience，pages。更特别地，N-氧化物可以通过L.W.Deady(Syn.Comm.1977,7,509-514)的方法制备，其中胺化合物与间氯过氧苯甲酸(mCPBA)反应，例如在惰性溶剂例如二氯甲烷中反应。
本领域技术人员应当理解，可以在最后的脱保护阶段之前制备的式(I)化合物的某些保护的衍生物可能本身不具有药理学活性，但是在某些情况下可以通过口服或非肠道施用，然后在体内代谢形成具有药理活性的本发明化合物。因此，此类衍生物可以被描述为“前药”。本发明化合物的所有此类前药都包括在本发明的范围内。适用于本发明化合物的前药官能团的实例描述于Drugs of Today,第19卷,第9期,1983,第499-538页以及Topicsin Chemistry,第31章,第306-316页和“Design of Prodrugs”,H.Bundgaard,Elsevier,1985,第1章(其公开内容引入本文作为参考)。本领域技术人员还应当进一步理解，当本发明化合物中存在此类官能团时，本领域技术人员已知为“前体部分”的某些部分(例如如H.Bundgaard在“Design of Prodrugs”中所述(其中公开内容引入本文作为参考))可以置于适当官能团上。
本发明化合物和多种盐的范围内还包括其多晶型物。
式(I)化合物可以以许多不同的几何异构和互变异构形式存在，并且提及的式(I)化合物包括所有这些形式。为免生歧义，当化合物可以以多种几何异构或互变异构形式之一存在并且只有一种被具体描述或示出时，也包含式(I)的所有其它形式。
本发明包括本发明化合物即式(I)化合物的所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子数但原子质量或质量数不同于通常在自然界发现的原子质量或质量数的原子所代替。
适合于包含在本发明化合物中的同位素的实例包括下列元素的同位素：氢，例如2H(D)和3H(T)；碳，例如11C、13C和14C；氟，例如18F；氮，例如13N和15N；氧，例如15O、17O和18O。
式(I)的某些同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素的那些化合物，可用于药物和/或底物组织分布研究。式(I)化合物还可以具有有价值的诊断性质，因为它们可以用于检测或鉴定标记化合物与其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间的复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用被标记物标记的化合物，所述标记物例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶)等。鉴于其容易掺入和具有现成的检测手段，放射性同位素氚即3H(T)和碳-14即14C对此目的特别有用。
用较重的同位素例如氘(即2H(D))取代可以提供由更好的代谢稳定性所带来的某些治疗优势，例如增加体内半衰期或降低剂量需求，因此在某些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素例如11C、18F、15O和13N的取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查靶点占用情况。
同位素标记的式(I)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术制备，或者通过与所附实施例和制备方法中所述类似的方法使用适当的同位素标记试剂代替以前使用的未标记试剂制备。
式(I)化合物的制备方法
在该部分内容中，如在本申请的所有其它部分中，除非上下文另有说明，提及式(I)时还包括如本文所定义的所有其它亚组及其实例。
涉及本文所述的本发明化合物可以如下面的方法和方案中所示例的逐步合成顺序制备。合成涉及多个中心构建体的制备，其然后使得能够选择分支和连接两个结合部分的接头的长度。式(I)化合物可以根据本领域技术人员公知的合成方法制备。例如，本领域技术人员应当理解，保护基团的化学步骤和选择可以以任何顺序操作以使得合成成功。
在一些实施方案中，式(A)化合物可以包含含有一个或多个接头组分的接头(SB)。示例性的接头组分包括但不限于6-马来酰亚氨基己酰基(MC)，马来酰亚氨基丙酰基(MP)，缬氨酸-瓜氨酸(vc)丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)，N-4-(2-吡啶基硫代)戊酸琥珀酰亚胺酯(SPP)和1-甲酸4-(n-马来酰亚氨基甲基)环己烷酯(SMCC)。
在一些实施方案中，式(A)化合物可以包含能够与抗体上的游离硫羟基反应以形成共价键的接头(SB)。本发明化合物明确地考虑但不限于用接头试剂制备的抗体缀合物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB。除可与抗体上的硫羟基反应的吡咯烷-2,5-二酮(马来酰亚胺)外的其它官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯、活化酯、磺酰氯和酰氯。
在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上的亲电基团反应的官能团。示例性的亲电基团包括但不限于醛、酮和羰基。另外，接头的反应性官能团的杂原子可以与抗体上的亲电基团反应。典型的实例包括但不限于肼、肟、氨基、酰肼、氨硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
在一些实施方案中，式(A)化合物可以包含能够与抗体上的游离胺反应以形成共价键的接头(SB)。本发明化合物明确地考虑但不限于使用羧酸活化剂例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-琥珀酰亚氨基-1,1,3,3-四甲基脲
Figure BDA0002304261050000341
四氟硼酸盐(TSTU)和苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基磷
Figure BDA0002304261050000342
六氟磷酸盐(PyBOP)制备的抗体缀合物。
根据本发明的另一方面，提供了制备如上所定义的式(I)化合物的方法，该方法包括：
(a)制备式(IA)化合物，其中X1表示-S-，通过使式(III)化合物，其中抗体或抗原结合片段包含至少一个反应性硫羟基，与式(II)化合物反应来进行，其中S1被马来酰亚胺终止：
Figure BDA0002304261050000351
其中F、S2、Y2、m、z、Cy、Y1和S1如上文所定义；或
(b)制备式(IC)化合物，其中X1表示-NH2，并且S1包含-S-CH2-CH2-CH2-C(＝NH)-，通过使式(IIIA)化合物，其中抗体或抗原结合片段包含至少一个反应性硫羟基，与式(II)化合物反应来进行，其中S1被马来酰亚胺终止：
Figure BDA0002304261050000352
其中F、S2、Y2、m、z、Cy、Y1、S1和L如上文所定义；或
(c)制备式(IB)化合物，其中X1表示-NH2，通过使式(IIB)化合物，其中S1被N-羟基琥珀酰亚胺基团终止，与式(IIIB)化合物反应来进行，其中抗体或抗原结合片段包含至少一个反应性氨基：
Figure BDA0002304261050000353
其中F、S2、Y2、m、z、Cy、Y1、S1和L如上文所定义；和/或
(d)使式(I)化合物或其被保护的衍生物相互转化为另一种式(I)化合物或其被保护的衍生物。
方法(a)和(b)通常包括硫羟基-马来酰亚胺反应；反应性硫羟基与α,β-不饱和酮例如马来酰亚胺的Michael加成反应。
优选的条件包括将接头-马来酰亚胺中间体与包含反应性硫羟基的抗体或其片段在如本文所述的适合缓冲液中在室温温育。典型的接头:抗体比(LAR)取决于存在于抗体或其片段上的游离硫羟基的数量，但通常范围为2-8。
方法(c)通常包括在活化酯存在下的酰胺键形成反应。典型的条件包括在室温在适合的缓冲液中将接头-NHS酯与含有反应性氨基的抗体或其片段一起温育。典型的接头:抗体比(LAR)取决于存在于抗体或其片段上的游离氨基的数量，但通常范围为2-20。
方法(d)通常包括本领域技术人员已知的相互转化方法。例如，在式(I)化合物中，第一个取代基可以根据本领域技术人员已知的方法转化成第二个备选取代基。本领域技术人员已知用于将前体化合物转化为式(I)化合物的多种众所周知的官能团相互转化，描述于Jerry March的Advanced Organic Chemistry,第4版,John Wiley&Sons,1992。例如采用有机锡试剂(Stille反应)、格氏试剂的可能的金属催化的官能化反应和与氮亲核试剂的反应描述于‘Palladium Reagents and Catalysts’[Jiro Tsuji,Wiley,ISBN 0-470-85032-9]和Handbook of OrganoPalladium Chemistry for Organic Synthesis[第1卷，由Ei-ichi Negishi编辑，Wiley，ISBN 0-471-31506-0]。
如果适当的话，可以在先前方法(a)、(b)和(c)中描述的反应之前或之后进行一种或多种本领域技术人员已知的反应，并且它们以适当的顺序进行以实现对上文所定义的必不可少的取代以得到其它式(I)化合物。可以在文献中发现其条件的此类反应的非限制性实例包括：
反应官能团的保护反应，
反应官能团的脱保护反应，
卤化反应，
脱卤化反应，
去烷基化反应，
胺、苯胺、醇和酚的烷基化和芳基化反应，
羟基上的Mitsunobu反应，
适当基团上的环加成反应，
硝基、酯、氰基、醛的还原反应，
过渡金属催化的偶联反应，
酰化反应，
磺酰基的磺酰化反应/引入反应，
酯基的皂化反应/水解反应，
酯基的酰氨化反应(amidification)或酯基转移反应，
羧基的酯化反应或酰氨化反应，
卤素交换反应，
用胺、硫醇或醇的亲核取代反应，
还原胺化反应，
羰基和羟胺基团上的肟形成反应，
S-氧化反应，
N-氧化反应，
成盐反应。
式(III)化合物可以包含至少一个可利用于反应的反应性硫羟基。反应性硫羟基的生成可以通过用TCEP还原抗体或抗原结合片段来实现。
优选的条件包括1.1当量TCEP:Ab、4.2当量TCEP:Ab或8当量TCEP:Ab。
可选择的是，反应性硫羟基的生成可以通过抗体或抗原结合片段上的至少一个赖氨酸残基与硫羟基化试剂例如Traut试剂(2-亚氨基硫代环戊烷)反应来实现。
优选的条件包括低LAR的12.2当量的2-亚氨基硫代环戊烷:Ab和高LAR的30.5当量2-亚氨基硫代环戊烷:Ab。
可以根据方案1中所述的方法由式(V)和(VI)化合物，然后与4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)或二(N-琥珀酰亚氨基)戊二酸酯(DSG)反应制备式(II)和(IIB)化合物：
方案1
其中PG为保护基，例如单甲氧基三苯甲基；S1被马来酰亚胺或NHS终止，Y1为CONH，并且S2、Y2、m、Cy和F如上文所定义。
式(II)化合物可以由式(IV)化合物制备，即末端氨基相互转化为反应性马来酰亚胺基团。优选的条件包括末端氨基与4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸马来酰亚胺酯(SMCC)在DMSO中在室温反应。可选择的是，通过末端氨基相互转化为反应性NHS基团，式(IIB)化合物可以由式(IV)化合物制备。优选的条件包括与交联剂二-(N-琥珀酰亚氨基)戊二酸酯在适合的无水有机溶剂例如DMF和DMSO或其组合中反应。
根据方法步骤(iii)和(iv)以及酰胺键形成步骤，然后是适合的脱保护步骤，式(IV)化合物可以由式(V)和(VI)化合物制备。典型的酰胺键形成步骤包含用包含磷酸酯的试剂、基于三嗪的试剂或包含碳二亚胺的试剂，在有机碱存在下，在有机溶剂中活化羧酸。优选的条件包括HATU((1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶
Figure BDA0002304261050000382
3-氧化物六氟磷酸盐)与三乙胺或二异丙基乙基胺在DMF或DMF和DMSO的混合物中。如果PG包含单甲氧基三苯甲基，则脱保护反应用酸介导。优选的条件包括在室温的0.2M HCl水溶液。
可选择的是，可以根据方案1A中所述的方法由式(VA)化合物，然后与4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)反应制备式(II)化合物。
Figure BDA0002304261050000391
方案1A
其中PG为保护基，例如单甲氧基三苯甲基；S1用马来酰亚胺终止，Y1为CONH，并且S2、Y2、m、Cy和F如上文所定义。
式(II)化合物可以根据如上述方案1中所述的步骤(iii)和(iv)由式(VA)和(VI)化合物制备。末端氨基相互转化为反应性马来酰亚胺基团如上述对方案1中步骤(ii)所述采用SMCC实现。
式(V)和(VA)化合物(其中S2用-NHCO-CH2-终止)可以根据方案2中所述的方法由式(VIII)、(IX)和(IXA)化合物制备。
Figure BDA0002304261050000401
方案2
其中m、Cy、S1、S2和F如上文所定义，PG1为包含叔丁基、甲基、乙基或苄基的保护基，并且PG2为包含的甲基、乙基或叔丁基的正交保护基。
式(V)、(IXA)和(VA)化合物可以根据方法步骤(iii)和(iv)、酰胺键形成步骤、随后是适合的脱保护反应由式(IX)化合物制备。如果PG包含苄基，则脱保护反应通过催化氢化介导。优选的条件包括在MeOH/EtOH或水或其任何组合中的10％Pd/C、在氢气气氛中(15-70psi)。可选择的是，脱保护通过相转移反应介导。优选的条件包括TEA和水在室温16小时。
如果PG包含甲基、乙基或叔丁基，则采用根据保护基的要求酸或碱介导的脱保护反应。如果需要酸介导的脱保护条件，则优选的条件包括TFA、在二
Figure BDA0002304261050000402
烷中的4M HCl或在水中的37％HCl，其中如果必要，使用DCM或水的共溶剂。如果需要碱介导的条件，则优选的条件包括在水性介质例如含水的甲醇或THF中的氢氧化钠或氢氧化锂。
式(IX)化合物可以根据方案3中所述的方法由式(XI)和(XII)化合物制备。
方案3
其中m和Cy如上文所定义，PG1为包含叔丁基、甲基、乙基或苄基的保护基，PG2为包含甲基、乙基或叔丁基的正交保护基，并且X为Cl、Br或I。
式(IX)化合物可以根据方法步骤(v)的烷基化反应由式(XI)和(XII)化合物制备。典型的条件包括无机碱在极性有机溶剂中在室温。优选的条件包括碳酸钾在DMF中。
当Cy为联苯基或三联苯基时，式(XI)化合物可以通过采用Suzuki反应构建联苯基/三联苯基单元制备。优选的条件包括四三苯膦钯(0)或[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)与二氯甲烷络合物，以及碳酸钠、碳酸钾或碳酸氢钠，在二烷和水中，在100-110℃。当采用适合的所需保护基时，例如TBS，这类保护基可以采用氟化物介导的脱保护来脱保护。优选的条件包括TBAF，在THF中，在室温。
可选择的是，当Cy为联苯基/三联苯基时，式(XI)化合物可以通过应用Suzuki反应、采用如上所述和本文的条件构建联苯基/三联苯基单元直接制备。
式(III)、(IIIA)、(IIIB)、(VI)、(VIII)、(XII)、(VII)和(X)化合物为商购可获得的或可以根据本文所述的方法制备。
可以理解，本文所述的某些中间体表示本领域中在先未知的新化合物。因此，根据本发明的另一方面，提供了中间体化合物，其选自如上述所定义的式(II)、(IIB)、(V)、(VA)、(IX)或(XI)化合物。
本领域技术人员可以理解，可以选择上述步骤的适合的组合来得到本文所述实施例和制备例的最高收率。
药物组合物
虽然式(I)化合物可以单独施用，但是优选将其作为药物组合物(例如制剂)存在。
因此，根据另一方面，本发明提供了药物组合物和制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含(例如混合)至少一种本发明化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和任选的其它治疗剂或预防剂，如本文所述。应当理解，当药物组合物包含一种或多种另外的治疗剂时，所述治疗剂可以包含另外不同的式(I)化合物。
药学上可接受的赋形剂可以选自例如载体(例如固体、液体或半固体载体)、辅助剂、稀释剂、填充剂或膨胀剂、成粒剂、包衣剂、释放控制剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增稠剂、矫味剂、甜味剂、掩味剂、稳定剂或常规用于药物组合物中的任何其它赋形剂。下面更详细地阐述了用于多种类型的药物组合物的赋形剂的实例。
本文使用的术语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内适合用于与个体(例如人)的组织接触的化合物、材料、组合物和/或剂型，其不会产生过度的毒性(即一般认为安全(GRAS))、刺激性、过敏响应或其它问题或并发症，具有合理的效益/风险比。每种载体、赋形剂等在与该制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
含有本发明化合物的药物组合物可以根据已知技术配制，参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA。
药物组合物可以是适用于非肠道、鼻内、支气管内、舌下、眼、耳、直肠、阴道内或透皮施用的任何形式。当组合物预计用于非肠道施用时，它们可以配制用于静脉内、肌内、腹膜内、皮下施用，或者通过注射、输注或其它递送方式直接递送到靶器官或组织中。所述递送可以通过快速注射、短期输注或长期输注进行，并且可以通过被动递送或通过使用适当的输注泵或注射器驱动来进行。
适用于非肠道施用的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、共溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、环糊精络合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳剂)、用于形成脂质体的脂质体组分、用于形成聚合物凝胶的可凝胶化聚合物、冻干保护剂以及尤其是用于使活性成分以可溶形式稳定并且使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂的组合。用于非肠道施用的药物制剂还可以采用水性和非水性无菌混悬液的形式，其可以包括助悬剂和增稠剂(R.G.Strickly，Solubilizing Excipients in oraland injectable formulations，Pharmaceutical Research，第21卷(2)2004，第201-230页)。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿、小瓶和预填充注射器，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在即将使用前仅需要添加无菌液体载体，例如注射用水。
药物制剂可以通过将本发明化合物冻干进行制备。冻干是指将组合物冷冻干燥的过程。因此，冷冻干燥和冻干在本文中作为同义词使用。
即时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
用于非肠道注射的本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、混悬液或乳液以及用于在即将使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
适当的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其适当的混合物、植物油(例如葵花油、红花油、玉米油或橄榄油)和可注射有机酯例如油酸乙酯。例如，通过使用增稠剂或包衣材料例如卵磷脂，通过保持需要的粒度(在分散体的情况下)，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
本发明的组合物还可以含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保避免微生物的作用。也可能需要包含调节张力的试剂，例如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过包含能够延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物为适合用于静脉内施用的形式，例如通过注射或输注。对于静脉内或皮下施用，溶液可以原样给药，或者可以在施用前注入输注袋(含有药学上可接受的赋形剂，例如0.9％盐水或5％右旋糖)中。
在另一个优选的实施方案中，药物组合物为适合于皮下(s.c.)施用的形式。
本发明化合物可以与载体一起配制并且以纳米粒的形式施用，纳米粒的增加的表面积有助于它们的吸收。另外，纳米粒提供了直接渗透到细胞内的可能性。纳米粒药物递送系统描述于Ram B Gupta和Uday
B.Kompella编辑的“Nanoparticle Technology for Drug Delivery”，InformaHealthcare,ISBN 9781574448573,公开于2006年3月13日。用于药物递送的纳米粒也描述于J.Control.Release,2003,91(1-2),167-172和Sinha等,Mol.Cancer Ther.August 1,(2006)5,1909。
通常，药物组合物包含约1％(w/w)至约95％(w/w)的活性成分和99％(w/w)至5％(w/w)的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。优选组合物包含约20％(w/w)至约90％(w/w)的活性成分和80％(w/w)至10％的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。药物组合物包含约1％至约95％，优选约20％至约90％的活性成分。本发明的药物组合物可以是例如单位剂量形式，例如安瓿、小瓶、栓剂、预填充注射器、锭剂、片剂或胶囊剂的形式。
药学上可接受的赋形剂可以根据制剂的所需物理形式来选择，并且可以例如选自稀释剂(例如固体稀释剂，例如填充剂或膨胀剂；和液体稀释剂，例如溶剂和共溶剂)、崩解剂、缓冲剂、润滑剂、助流剂、释放控制剂(例如释放阻滞剂或释放延迟聚合物或蜡)、粘合剂、成粒剂、颜料、增塑剂、抗氧化剂、防腐剂、矫味剂、掩味剂、张力调节剂和包衣剂。
本领域技术人员应当具有选择用于制剂中的成分的适当量的专业知识。例如，片剂和胶囊剂通常含有0-20％的崩解剂、0-5％的润滑剂、0-5％的助流剂和/或0-99％(w/w)的填充剂/或膨胀剂(取决于药物剂量)。它们也可以含有0-10％(w/w)的聚合物粘合剂、0-5％(w/w)的抗氧化剂、0-5％(w/w)的颜料。此外，缓释片剂还可以含有0-99％(w/w)控制释放(例如延迟释放)的聚合物(取决于剂量)。片剂或胶囊剂的薄膜包衣通常含有0-10％(w/w)的聚合物、0-3％(w/w)的颜料和/或0-2％(w/w)的增塑剂。
非肠道或皮下制剂通常含有0-20％(w/w)缓冲剂、0-50％(w/w)共溶剂和/或0-99％(w/w)注射用水(WFI)(取决于剂量和是否冷冻干燥)。肌内储库制剂也可以含有0-99％(w/w)的油。
本发明化合物也可以配制成固体分散体。固体分散体是两种或更多种固体的均匀的极细分散相。众所周知固体溶液(分子分散体系)是一种固体分散体类型，用于制药技术(参见(Chiou和Riegelman,J.Pharm.Sci.,60,1281-1300(1971))，并且可用于增加溶出速度和提高水溶性差的药物的生物利用度。
药物制剂可以以单一包装中包含整个疗程的“患者包装”提供给患者，通常为泡罩包装。患者包装比传统处方有优势，其中药剂师可以将患者的药物供给从大量供应中分离出来，因为患者随时可以查看包含在患者包装中的包装插页，而这通常在患者处方中并不存在。已经显示包装说明书的加入可以改善患者对医生指令的依从性。患者包装的一个实例包括预填充注射器。这种预填充注射器已经含有药物。用喷嘴帽密封与针头连接的预填充注射器的前端部分。在注射之前，将喷嘴帽从前端部分移除，并且将针头与其连接。然后通过将柱塞杆推向前端部分滑动垫圈，从而排出药物。
用于鼻递送的组合物包括软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、贴剂、凝胶剂、液体滴剂和植入物(例如眼内植入物)。此类组合物可以根据已知的方法配制。
用于直肠或阴道内施用的制剂的实例包括阴道栓剂和栓剂，其可以例如由含有活性化合物的适合成型的可塑或蜡材料形成。活性化合物的溶液也可以用于直肠施用。
通过吸入施用的组合物可以采取可吸入粉末组合物或者液体或粉末喷雾剂的形式，并且可以采用粉末吸入器装置或气雾分配装置以标准形式施用。此类装置是众所周知的。对于通过吸入施用，粉末制剂通常包含活性化合物以及惰性固体粉末稀释剂例如乳糖。
本发明化合物通常以单位剂量形式存在，因此通常含有足够的化合物以提供所需水平的生物活性。例如，制剂可以含有1纳克至2克的活性成分，例如，从1纳克至2毫克的活性成分。在这些范围内，化合物的特别亚范围为0.1毫克至2克活性成分(更通常为10毫克至1克，例如50毫克至500毫克)或1微克至20毫克(例如1微克至10毫克，例如0.1毫克至2毫克活性成分)。
将活性化合物以足以达到所需治疗效果的量施用于需要的患者(例如人或动物患者)。
治疗用途
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的式(I)化合物，其用于治疗。
可以理解，本发明化合物的治疗用途通过选择抗体或其抗原结合片段来确定。
例如，在抗体或其抗原结合片段为EGFR抗体(例如西妥昔单抗或尼妥珠单抗)或其片段的实施方案中，式(I)化合物用于治疗癌症。
因此，根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的式(I)化合物，其中抗体或其抗原结合片段为EGFR抗体(例如西妥昔单抗或尼妥珠单抗)或其片段的实施方案中，其用于治疗癌症。
根据本发明的另一方面，提供了治疗癌症的方法，该方法包括对有此需要的个体施用如本文所定义的式(I)化合物，其中抗体或其抗原结合片段为EGFR抗体(例如西妥昔单抗或尼妥珠单抗)或其片段。
此外，在抗体或其抗原结合片段为病原特异性抗体或其片段的实施方案中，式(I)化合物用于治疗细菌感染。
因此，根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的式(I)化合物，其中抗体或其抗原结合片段为病原特异性抗体或其片段，其用于治疗细菌感染。
根据本发明的另一方面，提供了治疗细菌感染的方法，该方法包括对有此需要的个体施用如本文所定义的式(I)化合物，其中抗体或其抗原结合片段为病原特异性抗体或其片段。
本发明化合物通常施用于需要此类施用的个体，例如人或动物患者，优选人。
通常，本发明化合物以治疗或预防有用的量并且通常是无毒的量施用。然而，在某些情况下(例如在威胁生命的疾病的情况下)，施用本发明化合物的益处可能胜过毒性作用或副作用的缺点，在这种情况下以与一定程度的毒性相关的量施用本发明化合物可以认为是合理的。
本发明化合物可以在持续的时间内(即长期施用)施用以保持有益的治疗效果，或者可以仅短时间施用(即急性施用)。可选择的是，它们可以以连续方式或以能够提供间歇剂量的方式(例如脉冲方式)施用。
本发明化合物的典型日剂量可以在每千克体重100皮克至100毫克的范围，更通常为每千克体重5纳克至25毫克，并且更通常为每千克体重10纳克至15毫克(例如10纳克/千克至10毫克/千克，并且更通常为1微克/千克至20毫克/千克，例如1微克/千克至10毫克/千克)，但是可以在需要时施用更高或更低剂量。例如，本发明化合物可以每天或者每2或3或4或5或6或7或10或14或21或28天重复施用。可选择的是，本发明化合物可以通过输注每天多次施用。
本发明化合物可以以一定的剂量范围施用，例如1至1500mg，2至800mg或5至500mg，例如2至200mg或10至1000mg，剂量的特别实例包括10、20、50和80mg。本发明化合物可以每天施用一次或多于一次。本发明化合物可以连续施用(即，在治疗方案的持续时间内每天施用而不中断)。或者，本发明化合物可以间歇施用(即，在整个治疗方案持续时间内，连续施用一段时间，例如一周，然后停止一段时间，例如一周，然后连续服用另一段时间，例如一周等)。涉及间歇施用的治疗方案的实例包括其中施用周期为一周、休息一周的治疗方案；或二周施用，休息一周；或三周施用，休息一周；或两周施用，休息两周；或四周施用，休息两周；或一周施用，休息三周-进行一个或多个周期，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个周期。
在一个特别的给药方案中，给予患者本发明化合物的输液，每天一小时，至多十天，特别是一周至多五天，并且以期望的间隔重复治疗，例如二至四周，特别是每隔三周。
更特别的是，患者可以每天一小时的时间输注本发明化合物5天，治疗每三周重复一次。
在另一个特别的给药方案中，患者在30分钟至1小时输注，随后进行可变持续时间的维持输注，例如1至5小时，例如3小时。
在进一步的特别给药方案中，给患者连续输注12小时至5天，并且特别是连续输注24小时至72小时。
然而，最终施用的本发明化合物的量和所用组合物的类型应当与待治疗的疾病或生理状况的性质一致，并且这应当由医师决定。
应该理解，本发明化合物可以作为单一活性剂使用或与其它治疗剂组合使用。例如，可以根据下文所述进行组合试验：Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis ofdose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzymeinhibitors.Adv Enzyme Regulat 1984；22:27-55。
当本发明化合物与1、2、3、4或更多种其它治疗剂(优选一种或两种，更优选一种)在组合治疗中施用时，可以同时或依次施用活性剂。在后一种情况下，两种或更多种活性剂可以在一段时间内以足以确保达到有利效果或协同效果的量和方式施用。当按顺序施用时，它们可以以密集的间隔施用(例如在5-10分钟的时间段)或以更长的间隔施用(例如，间隔1、2、3、4或更多小时，或者当需要时甚至更长的时间间隔)，精确的剂量方案应当与治疗剂的性质一致。这些剂量可以例如在每个疗程中一次、两次或更多次施用，其可以例如每7、14、21或28天重复施用。
应该理解，优选的施用方法和顺序以及组合中每种组分的各自的给药量和方案应当取决于所施用的具体的其它药物活性剂和本发明化合物、其施用途径、待治疗的具体肿瘤和待治疗的具体宿主。本领域技术人员采用常规方法并且参考本文阐述的信息可以容易地确定最佳施用方法和顺序以及给药量和方案。
本发明化合物与一种或多种其它治疗剂以组合形式给予时的重量比可以由本领域技术人员确定。所述比例和确切的施用剂量和频率取决于使用的具体的本发明化合物和其它治疗剂、待治疗的具体病症、待治疗病症的严重程度、具体患者的年龄、体重、性别、饮食、施用时间和一般身体状况、施用方式以及个体可能施用的其它药物，如本领域技术人员所熟知的。此外，显而易见的是，取决于待治疗个体的响应和/或取决于开处本发明化合物的医师的评估，有效的每日量可以降低或增加。本发明化合物和另外的治疗剂的具体重量比范围可以为1/10至10/1，更特别为1/5至5/1，甚至更特别为1/3至3/1。
抗癌疗法
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的实例包括但不限于上皮起源的肿瘤(多种类型的腺瘤和癌，包括腺癌，鳞状细胞癌，移行细胞癌和其它癌)，例如膀胱和泌尿道癌，乳癌，胃肠道癌(包括食道，胃(胃)，小肠，结肠，直肠和肛门的癌)，肝癌(肝细胞癌)，胆囊和胆道系统癌，外分泌胰腺癌，肾癌，肺癌(例如腺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，支气管肺泡癌和间皮瘤)，头颈癌(例如舌癌，口腔前庭癌，喉癌，咽癌，鼻咽癌，扁桃体癌，唾液腺癌，鼻腔癌和鼻旁窦癌)，卵巢癌，输卵管癌，腹膜癌，阴道癌，外阴癌，阴茎癌，宫颈癌，子宫肌层癌，子宫内膜癌，甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)，肾上腺癌，前列腺癌，皮肤癌和附属物癌(例如黑色素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，角棘皮瘤，发育不良性痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病，淋巴瘤)和恶化前血液障碍以及边缘恶性障碍，包括血液系统恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]，慢性淋巴细胞性白血病[CLL]，B细胞淋巴瘤例如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]，滤泡性淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤和白血病，天然杀伤性[NK]细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，毛细胞白血病，意义不明的单克隆丙种球蛋白病，浆细胞瘤，多发性骨髓瘤和移植后的淋巴增殖性障碍)，以及血液系统恶性肿瘤和骨髓谱系的相关病症(例如急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)，慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)，嗜酸性粒细胞增多综合征，骨髓增殖障碍，例如真性红细胞增多症，原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化，骨髓增殖综合征，骨髓发育不良综合征和前髓细胞性白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨肉瘤，例如骨肉瘤，纤维肉瘤，软骨肉瘤，横纹肌肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肉瘤，血管肉瘤，卡波西肉瘤，尤因肉瘤，滑膜肉瘤，上皮样肉瘤，胃肠间质瘤，良性和恶性组织细胞瘤和隆凸性皮肤纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤，神经胶质瘤和成胶质细胞瘤，脑膜瘤，室管膜瘤，松果体肿瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤，肾上腺肿瘤，胰岛细胞瘤，甲状旁腺肿瘤，类癌瘤和甲状腺髓样癌)；眼和附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养层肿瘤(例如畸胎瘤，精原细胞瘤，无性细胞瘤，葡萄胎和绒毛膜癌)；以及小儿和胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤，神经母细胞瘤，威尔曼肿瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其它形式的综合征，其使患者易患恶性肿瘤(例如着色性干皮病)。
在一个实施方案中，癌症为实体瘤。在另一个实施方案中，癌症为乳癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌或肺癌。
在一个实施方案中，癌症包括血液恶性肿瘤。在另一个实施方案中，血液恶性肿瘤是骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病之一。
可以与本发明化合物一起(无论同时或以不同的时间间隔)施用的其它抗癌治疗剂或治疗的实例包括但不限于：
·拓扑异构酶I抑制剂；
·抗代谢剂；
·微管蛋白靶向剂；
·DNA结合剂和拓扑异构酶II抑制剂；
·烷化剂；
·单克隆抗体；
·抗激素剂；
·信号转导抑制剂；
·蛋白酶体抑制剂；
·DNA甲基转移酶；
·细胞因子和类视黄醇；
·染色质靶向疗法；
·放疗；和
·另外的治疗剂或预防剂，例如免疫治疗剂。
本发明化合物还可以与非化学疗法处理例如放疗、光动力疗法、基因疗法、手术和控制饮食联合施用。
为了与另外的化疗剂一起用于联合疗法，可以将本发明化合物和一种、两种、三种、四种或更多种其它治疗剂例如一起配制成含有两种、三种、四种或更多种治疗剂的剂型，即在包含所有组分的单一药物组合物中。在可选择的实施方案中，可以单独配制单独的治疗剂，并且以试剂盒的形式一起提供，任选带有使用说明书。
抗感染疗法
感染物的实例包括任何病原体，例如细菌、真菌、寄生虫或病毒。因此，在一个实施方案中，由感染物介导和/或引起的疾病或障碍为细菌感染。
例如，细菌感染的实例包括以下细菌的感染：葡萄球菌属物种(Staphylococcussp.)例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)(MRSA))，梭状芽孢杆菌属物种(Clostridia sp)(例如艰难梭菌(Clostridium difficile)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)和肉毒梭菌(Clostridium botulinum))，肠杆菌属物种(Enterobacter species)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，志贺氏菌属物种(Shigella sp.)例如志贺氏痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)，弯曲菌属物种(Campylobacter sp.)例如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，肠球菌属物种(Enterococcus sp.)例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)，链球菌属物种(Streptococcal species)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella thyphimurim)，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，衣原体属物种(Chlamydia species)，梅毒螺旋体(Treponemapallidum)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，革兰氏阴性病原体(Gram-negativepathogens)例如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)(并且包括对一类或多类抗生素有耐药性的菌株，特别是多重耐药(MDR)菌株)。
疫苗疗法
根据本发明的另一方面，提供了包含如本文所定义的免疫缀合物的疫苗。
根据本发明的另一方面，提供了包含如本文所定义的免疫缀合物的佐剂。
实施例
现在将通过参考下面实施例中描述的具体实施方案说明本发明，但不限于此。化合物的名称采用自动命名软件包AutoNom(MDL)或ChemDraw或由化学品供应商命名。
提供以下合成方法以说明所使用的方法；对于给定的制备或步骤，所用的前体可能不一定衍生自根据给出的描述中的步骤合成的单独的批次。
分析方法
LCMS
系统1
LCMS Agilent 1100(四元泵)；质谱仪：Waters Micromass ZQ
柱：XBridge C18 4.6×50mm，5μm
溶剂：A＝水；B＝乙腈；C＝在水中的10mm甲酸铵；D＝在乙腈中的0.05％甲酸
柱温：25℃，注射体积：5μL
LCMS方法A：4.5分钟酸性运行
时间(分钟) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/分钟)
0 95 0 0 5 2.0
3.5 0 95 0 5 2.0
4.5 0 95 0 5 2.0
4.6 95 0 0 5 2.0
LCMS方法B：4.5分钟缓冲液运行
时间(分钟) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/分钟)
0 0 5 95 0 2.0
3.5 0 95 5 0 2.0
4.5 0 95 5 0 2.0
4.6 0 5 95 0 2.0
LCMS方法C：8分钟酸性运行
时间(分钟) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/分钟)
0 95 0 0 5 2.0
3.5 5 90 0 5 2.0
8.0 5 90 0 5 2.0
8.10 95 0 0 5 2.0
系统2
LCMS Agilent 1100(四元泵)；质谱仪：PE SCIEX API 2000MS/MS
柱：Agilent Poroshell 120柱，SB-C18，4.6mm×30mm，2.7μm
溶剂：A＝水；B＝在乙腈中的0.1％甲酸
柱温：20℃，注射体积：5μL
LCMS方法D：4.5分钟酸性运行
时间(分钟) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/分钟)
0.5 95 5 0 5 2.0
1.5 0 100 0 5 2.0
4.0 0 100 0 5 2.0
4.3 95 5
4.5 95 5 0 5 2.0
NMR
NMR细节记录在Oxford Instruments AS400上。
缩略语
如果采用如下缩略语，则下列含义适用：
AcOH为乙酸；
aq.为水性；
br s为宽单峰；
δ为以ppm计的化学位移；
d为双峰；
dd为双联双峰；
ddd为双重双联双峰；
DCM为二氯甲烷；
DIPEA为二异丙基乙基胺；
DMF为二甲基甲酰胺；
DMSO为二甲亚砜；
DMSO-d6为全氘代二甲亚砜NMR溶剂；
DSG为二-(N-琥珀酰亚氨基)戊二酸酯；
EtOH为乙醇；
EtOAc为乙酸乙酯；
HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐；
HPLC为高压液相色谱法；
IMS为工业用甲醇化酒精(通常为在EtOH中的5％-10％MeOH)；
μ为微；
m为多重峰；
Mal为马来酰亚胺；
MeCN为乙腈；
MeOH为甲醇；
min为分钟；
mL为毫升；
MMTr为单甲氧基三苯甲基；
MS为质谱法；
NH3为氨或氢氧化铵(28％水溶液)；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；或N-羟基琥珀酰亚氨基；
NMR为核磁共振；
Pd/C为(通常为5％-10％)钯炭氢化催化剂(水-湿润)；
Pd(PPh3)4为四三苯膦钯(0)；
ppm为百万分之几；
q为四重峰；
Rt为保留时间；
s为单峰；
SMCC为4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯；
t为三重峰；
TBAF为四-正-丁基氟化铵；
TBME为叔丁基甲基醚；
TEA为三乙胺；
TBS为叔丁基二甲基甲硅烷基氧基；
TFA为三氟乙酸，并且
THF为四氢呋喃。
如果涉及α-Gal，则如下中间体适用：
3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)胺
Figure BDA0002304261050000551
可以根据Bovin等人(Mendeleev Communications(2002),(4),143-145)所述的方法制备该中间体。
制备例1-19描述了如上文所述方法(a)-(d)和方案1、1A、2和3所述用于由缀合为实施例所需的关键接头分子制备中间体的方法。
制备例1
4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰氨基)乙基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺
Figure BDA0002304261050000552
向4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-氨基乙基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺(制备例3，5.0mg，2.26μmol)在DMSO(400μL)中的溶液中加入SMCC(2.2mg，6.57μmol)在DMSO(100μL)中的溶液。将得到的溶液在室温搅拌18小时，然后真空干燥。将粗残留物直接用于下面的步骤。
LCMS方法B：Rt＝1.97分钟，ES+MS m/z 1118.5[M+H]+
制备例2
2,2’,2”-((5’-((2-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)
Figure BDA0002304261050000561
向2,2’,2”-((5’-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)(制备例4，5.0mg，2.26μmol)在DMSO(400μL)中的溶液中加入SMCC(0.69mg，2.05μmol)在DMSO(100μL)中的溶液。将得到的溶液在室温搅拌18小时，然后真空干燥。取粗残留物直接用于下面的步骤。
LCMS方法B：Rt＝1.57分钟，ES+MS m/z 1218.5[M+2H]+/2，质量理论值：2435.4
制备例3
4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-氨基乙基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺
Figure BDA0002304261050000571
步骤1
向4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸(制备例6，38.3mg，44.7μmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入Et3N(21.8μL，156.4μmol)，然后加入N1-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)乙-1,2-二胺(制备例19，19.3mg，58.1μmol)在DMF(0.5mL)中的溶液。将该反应在室温搅拌1.5小时。
步骤2
滴加0.2M HCl(水溶液)，直至pH 3-4，并且将该溶液在室温搅拌18小时。真空浓缩该反应，并且采用反相柱色谱法纯化，使用在含有0.1％氨的水中的5-40％MeCN洗脱，得到标题化合物，为无色固体(12.4mg，28％)。
LCMS方法B：RT＝1.32分钟，ES+MS M/Z 899.3[M+H]+
制备例4
2,2’,2”-((5’-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)
Figure BDA0002304261050000581
步骤1
向3’,5,5’-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸(制备例5，66.0mg，30.4μmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入Et3N(14.8μL，106.4μmol)，然后加入N1-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)乙-1,2-二胺(制备例19，13.1mg，39.5μmol)在DMF(0.5mL)中的溶液。将该反应在室温搅拌1.5小时。
步骤2
滴加0.2M HCl(水溶液)，直至pH 3-4，将该溶液在室温搅拌18小时。真空浓缩该反应，并且采用反相柱色谱法纯化，使用在含有0.1％氨的水中的5-40％MeCN洗脱，得到标题化合物，为无色固体(47.0mg，70％)。
LCMS方法B：Rt＝1.57分钟，ES+MS m/z 1106.9[M+2H]+/2，质量理论值：2216.1
制备例5
3’,5,5’-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸
Figure BDA0002304261050000591
方法A
向溶于MeOH/水(1:1v/v，7.1mL)中的3’,5,5’-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯(制备例7，71.2mg，31.4μmol)中加入10％Pd/C(7.1mg)。在搅拌的同时将该反应在50psi在室温氢化3小时。将该反应通过Dicalite过滤，并且真空浓缩。将残留物溶于水(2mL)，与SiliCycle DMT树脂(50mg)一起搅拌30分钟，并且过滤，得到无色溶液。真空浓缩该溶液，得到标题化合物，为无色固体(61.2mg，89％)。
LCMS方法B：Rt＝1.27分钟，ES+MS m/z 1088.4[M+2H]+/2，质量理论值：2174.4
MALDI-ToF 2195.8[M-H+Na]+
制备例3还可以根据如下方法制备：
方法B
向溶于水(7mL)中的3’,5,5’-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯(制备例7，278mg，123μmol)中加入TEA(7mL)，并且将该反应在室温剧烈搅拌16小时。真空浓缩该反应，并且采用反相柱色谱法纯化，用5-40％MeCN/含有0.1％NH3的水洗脱，得到标题化合物，为无色固体(224mg，83％)。
制备例6
4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸
Figure BDA0002304261050000601
向溶于MeOH/水(1:1v/v，5mL)中的4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯(制备例8，93.5mg，98.7μmol)中加入Pd/C(10％，10mg)。将该反应放入氢气气氛中(50psi)，并且在室温搅拌3小时。通过经注射器式滤器过滤除去催化剂，并且在减压下除去溶剂，得到粗产物，采用反相柱色谱法纯化，使用在5-40％MeCN/含有0.1％NH3的水洗脱，得到标题化合物，为无色固体(71.6mg 84％)。
LCMS方法A：Rt＝1.83分钟，ES+MS m/z 857.57[M+H]+
制备例7
3’,5,5’-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯
Figure BDA0002304261050000611
向溶于DMSO(1.25mL)和DMF(3.75mL)中的α-Gal(100mg，166μmol)中加入三乙胺(52.1μL，374μmol)和2,2’,2”-((5’-((苄基氧基)羰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三乙酸(制备例9，21.2mg，41.5μmol)。加入HATU(63.1mg，166μmol)在DMF(1.25mL)中的溶液，并且将该反应在室温在氮气中搅拌16小时。真空浓缩该反应，并且采用反相柱色谱法纯化，使用在含有0.1％NH3的水中的10-40％MeCN洗脱，得到标题化合物，为无色固体(71.2mg，76％)。
LCMS方法B：Rt＝1.80分钟，ES+MS m/z 1313.3[M+2H]+/2，质量理论值：2624.3
制备例8
4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯
Figure BDA0002304261050000612
向在DMF(7.5mL)中的2-((3’-((苄基氧基)羰基)-[1,1’-联苯基]-4-基)氧基)乙酸(制备例10，55.0mg，152μmol)中加入TEA(63.4μL，455μmol)，然后加入在DMSO(500μL)中的α-Gal(119mg，197μmol)。加入HATU(86.6mg，228μmol)在DMF(500μL)中的溶液，并且将该反应保持在氮气中在室温搅拌16小时。真空浓缩该反应，并且采用反相柱色谱法纯化，使用7-60％MeCN/含有0.1％NH3的水洗脱，得到标题化合物，为无色固体(93.5mg，65％)。
LCMS方法B：Rt＝2.54分钟，ES+MS m/z 947.62[M+H]+
制备例9
2,2’,2”-((5’-((苄基氧基)羰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三乙酸
Figure BDA0002304261050000621
在室温将溶于DCM/TFA/水(10/10/1v/v/v，5mL)中的2,2’,2”-((5’-((苄基氧基)羰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三乙酸三叔丁酯(制备例11，100mg，147μmol)的溶液搅拌16小时。真空浓缩该反应，溶于MeOH(1mL)，并且用水(10mL)沉淀。通过过滤收集沉淀，用水洗涤，并且真空干燥，得到标题化合物，为无色固体(57.8mg，77％)。
LCMS方法A：Rt＝2.48分钟，ES-MS m/z 509.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 13.05(3H,br s),7.90(1H,s),7.55-7.45(3H,m),7.45-7.30(4H,m),6.80(2H,d),6.50(1H,t),5.40 2H,s),4.85(2H,s).4.75(4H,s)。
制备例10
2-((3’-((苄基氧基)羰基)-[1,1’-联苯基]-4-基)氧基)乙酸
Figure BDA0002304261050000622
根据对制备例9所述的方法采用制备例12制备标题化合物，并且采用反相柱色谱法纯化，使用5-40％MeCN/含有0.1％NH3的水洗脱。
LCMS方法B：Rt＝2.43分钟，ES+MS m/z 363.2[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 13.00(1H,s),8.15(1H,t),7.90-7.85(2H,m),7.65-7.55(3H,m),7.50-7.45(2H,m),7.45-7.30(3H,m),7.00-6.95(2H,m),5.40(2H,s),4.70(2H,s)。
制备例11
2,2’,2”-((5’-((苄基氧基)羰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三乙酸三叔丁酯
Figure BDA0002304261050000631
向溶于DMF(10mL)中的3’,5,5’-三羟基-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯(制备例13，356mg，1.06mmol)中加入溴乙酸叔丁酯(625μL，4.23mmol)和碳酸钾(1.17g，8.47mmol)。将得到的混悬液在氮气中搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物溶于水(10mL)，并且用EtOAc(2×10mL)萃取。用盐水(10mL)、2M NaOH水溶液(10mL)洗涤合并的有机层，经MgSO4干燥，并且真空浓缩。采用硅胶柱色谱法纯化残留物，使用在庚烷中的7-60％EtOAc洗脱，得到标题化合物，为澄清无色胶状物(618mg，86％)。
LCMS方法C：Rt＝4.34分钟，未观察到质量离子
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.85(1H,s),7.55-7.50(1H,m),7.45-7.25(6H,m),6.70(2H,d),6.45-6.40(1H,m),5.35(2H,s),4.55(2H,s),4.50(4H,s),1.45(27H,s)
制备例12
4’-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯
Figure BDA0002304261050000632
向4’-羟基-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯(制备例14，368mg，1.21mmol)和溴乙酸叔丁酯(178μL，1.21mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入碳酸钾(200mg，1.45mmol)，并且将该反应在室温搅拌20小时，然后在50℃搅拌2小时。真空浓缩该反应，并且使得到的残留物在水(20mL)和DCM(20mL)之间分配。分离有机层，并且再用DCM(20mL)萃取水层。用水(10mL)洗涤合并的有机萃取物，经硫酸钠干燥，并且真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残留物，使用在己烷中的0-15％EtOAc洗脱，得到标题化合物，为油状物(510mg，100％)。
LCMS方法D：Rt＝3.85分钟，未观察到质量离子
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.25(1H,t),8.01-7.99(1H,dt),7.76-7.71(1H,m),7.58-7.31(8H,m),7.06-6.95(2H,m),5.39(2H,s),4.56(2H,s),1.50(9H,s)。
制备例13
3’,5,5’-三羟基-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯
Figure BDA0002304261050000641
向溶于THF(12mL)中的粗3’,5’-双((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-羟基-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯(制备例16，1.27g，2.46mmol)中滴加TBAF溶液(1M，在THF中，6.15mL，6.15mmol)。将该反应在室温在氮气中搅拌90分钟，然后用EtOAc(100mL)稀释。用水(2×50mL)洗涤有机相，经MgSO4干燥，并且真空浓缩。采用硅胶柱色谱法纯化残留物，使用在DCM中的5％MeOH洗脱，得到标题化合物，为淡棕色固体(356mg，43％，3步)。
LCMS方法A：Rt＝2.66分钟，ES-MS m/z 335.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 7.60(1H,t),7.45-7.40(2H,m),7.40-20(4H,m),7.15-7.10(1H,m),6.45(2H,d),6.20(1H,t),5.30(2H,s)。
制备例14
4’-羟基-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯
Figure BDA0002304261050000642
向苄基氯(295μL，2.56mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入4’-羟基联苯基-3-甲酸(500mg，2.33mmol)和碳酸钾(322mg，2.33mmol)。将该反应混合物在室温搅拌20小时，然后真空浓缩。使残留物在水(20mL)和乙醚(20mL)之间分配。分离有机层，并且用乙醚(20mL)再萃取水层。用水(10mL)洗涤合并的有机萃取物，经硫酸钠，并且真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残留物，使用在己烷中的0-30％EtOAc洗脱，得到标题化合物，为白色固体(378mg，53％)。
LCMS方法D：Rt＝3.48分钟，ES+MS m/z 305.0[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.26-8.24(1H,m),8.03-7.98(1H,m),7.75-7.71(1H,m),7.51-7.43(5H,m),7.42-7.31(3H,m),6.95-6.90(2H,m),5.40(2H,s)。
制备例15
3-溴-5-羟基苯甲酸苄酯
向溶于DMF(25mL)中的3-溴-5-羟基苯甲酸(4.08g，18.8mmol)的溶液中加入K2CO3(2.60g，18.8mmol)，并且5分钟后，历经10分钟滴加苄基溴(2.24mL，18.8mmol)。将该反应在室温在氮气中搅拌16小时。再加入K2CO3(520mg，3.76mmol)和苄基溴(450μL，3.79mmol)，并且将该反应搅拌3小时。真空浓缩该反应，并且使残留物在EtOAc(30mL)和水(30mL)之间分配。用EtOAc(2×20mL)萃取水层，并且用盐水(30mL)洗涤合并的有机层。经MgSO4干燥有机层，并且真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残留物，使用在庚烷中的5％EtOAc洗脱，得到标题化合物，为无色固体(3.88g，67％)。
LCMS方法A：Rt＝3.36分钟，ES-MS m/z 307.2[M-H]-
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.75(1H,t),7.50-7.45(1H,m),7.45-7.30(5H,m),7.20(1H,t),5.30(2H,s),5.30(1H,br s)。
制备例16
3’,5’-双((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-羟基-[1,1’-联苯基]-3-甲酸苄酯
Figure BDA0002304261050000661
用氮气给溶于二
Figure BDA0002304261050000663
烷/水(30mL，5:1v/v)的3-溴-5-羟基苯甲酸苄酯(制备例15，755mg，2.46mmol)、碳酸钠(912mg，8.60mmol)和((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(叔丁基二甲基硅烷)(制备例17，1.87g，2.95mmol)的混合物脱气30分钟。加入Pd(PPh3)4(284mg，246μmol)，并且在氮气中将该反应加热至100℃达90分钟。冷却至室温后，加入EtOAc(100mL)和水(50mL)。分离各层，并且用EtOAc(2×25mL)反洗涤水相。经MgSO4干燥合并的有机相，并且真空浓缩。用庚烷(100mL)处理残留物，并且将得到的混合物超声5分钟，然后过滤以除去固体。真空浓缩滤液，得到粗标题化合物，为澄清棕色油状物(1.27g)，直接用于下面的步骤。
LCMS方法C：Rt＝5.47分钟，ES+MS m/z 565.4[M+H]+
制备例17
((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(叔丁基二甲基硅烷)
Figure BDA0002304261050000662
采用氮气给1,3-双((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯(制备例18，1.00g，2.95mmol)和双(频哪醇基)二硼(750mg，2.95mmol)溶于异己烷(15mL)的溶液脱气1小时。加入[Ir(OMe)(COD)]2(19.6mg，59.1μmol)和4,4’-二-叔丁基-2,2’-联吡啶(15.9mg，59.0μmol)，并且密封反应，并且加热至110℃达16小时。冷却该反应，真空浓缩，并且直接用于下面的步骤(1.87g)。
LCMS方法C：Rt＝6.19分钟，ES+MS m/z 465.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.85(2H,d),6.40(1H,t),1.25(12H,s),0.95(18H,s),0.15(12H,s)。
制备例18
1,3-双((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯
Figure BDA0002304261050000671
向溶于DCM(40mL)中的间苯二酚(2.00g，18.2mmol)和咪唑(3.71g，54.5mmol)中加入叔丁基二甲基氯硅烷(8.21g，54.5mmol)。沉淀形成，再加入DCM(40mL)，然后在室温在氮气中搅拌16小时。过滤该反应，并且真空浓缩滤液。采用硅胶柱色谱法纯化残留物，用在庚烷中的0-10％EtOAc洗脱，得到标题化合物，为无色油状物(6.18g，>99％)。
LCMS方法C：Rt＝5.39分钟，ES+MS m/z 339.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.95(1H,t),6.35(2H,dd),6.25(1H,t),1.85(18H,s),0.10(12H,s)。
制备例19
N1-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)乙-1,2-二胺
Figure BDA0002304261050000672
向乙二胺(54.0mL，809.6mmol)在DCM(175mL)中的溶液中缓慢加入MMT氯化物(25.0g，81.0mmol)在DCM(175mL)中的溶液，历经1小时，同时搅拌。将得到的溶液在室温搅拌16小时。用碳酸钾水溶液(400mL)和盐水(400mL)洗涤该反应。收集有机层，经硫酸镁干燥，并且真空浓缩，得到标题化合物，为粘稠淡黄色油状物(26.1g，97％)。
LCMS方法B：Rt＝2.73分钟，未观察到电离
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.52-7.42(4H,m),7.40-7.34(2H,m),7.31-7.22(4H,m),7.20-7.15(2H,m),6.84-6.77(2H,m),3.80(3H,s),2.84-2.78(2H,m),2.27-2.18(2H,m)。
制备例20
4’-(2-((2-(3-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰氨基)乙基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺
Figure BDA0002304261050000681
将制备例24在DMF中的溶液(100mM)加入到等体积的在DMF中的Mal-PEG4-NHS(80mM，0.8当量)中，并且将该反应保持在室温静置2小时。储存该反应，终浓度为50mM，并且直接用于缀合步骤。
制备例21
3,3’,3”-((((2,2’,2”-((5’-((2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三(乙酰基))三(氮烷二基))三(乙-2,1-二基))三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)丙酰胺)
将制备例25在DMF:DMSO(3:1，25mM)中的溶液中加入到等体积的在DMF中的Mal-PEG4-NHS(80mM，0.8当量)中，并且将该反应保持在室温静置2小时。储存该反应，终浓度为20mM，并且直接用于缀合步骤。
制备例22
5-((2-(4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰氨基)乙基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0002304261050000691
将4’-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-氨基乙基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺(制备例3，21.76mg，24mmol)溶于1:1无水DMF:DMSO(1062μL)中，同时搅拌。加入二-(N-琥珀酰亚氨基)戊二酸酯(39.49mg，120mmol)，为300mM在1:1无水DMF:DMSO(400μL)中的溶液。将该反应在室温在正氮气气氛中搅拌1小时。采用反相柱色谱法纯化该反应(10×250mm Hichrom ACE10)，用在1％TFA水溶液中1-50％MeCN洗脱。冷冻期望的级分至干，历经24小时，得到标题化合物，为无水玻璃状物(23mg，88％)。
MS m/z 1110.3[M+H]+
制备例23
5-氧代-5-((2-(3’,5,5’-三(2-((2-(3-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰氨基)乙基)氨基)戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0002304261050000701
根据对制备例22所述的方法采用制备例25制备标题化合物并且直接用于缀合步骤。
制备例24
4’-(2-((2-(3-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-氨基乙基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺
Figure BDA0002304261050000702
根据对制备例3所述的方法采用4’((2,2-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2-18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸(WO2017060729)制备标题化合物。
LCMS(方法B)：Rt＝1.66分钟；ES+MS m/z 1145.4[M+H]+
制备例25
3,3’,3”-((((2,2’,2”-((5’-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-[1,1’-联苯基]-3,3’,5-三基)三(氧基))三(乙酰基))三(氮烷二基))三(乙-2,1-二基))三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)丙酰胺)
Figure BDA0002304261050000711
根据对制备例3所述的方法采用3’,5,5’-三((2,2-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酸制备标题化合物(WO2017060729)。
LCMS(方法B)：Rt＝1.52分钟；ES+MS m/z 1479.0[M+2H]+/2；理论质量：2958.0
实施例
材料和方法：
vcMMAE(vcE)：ADCB TOX001，在DMA中10mM
TCEP–Biovectra Cat 1300Lot：42359
N-乙酰基半胱氨酸-Sigma A7250Lot：WXBC3104V
二甲基乙酰胺-Sigma-Aldrich 271012Lot：STBF9638V
KNE缓冲液：50mM KPI，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 7.5
PBS：Sigma，P5368#SLBQ7495，使用WFI重构：Sigma W3500#RNBF6963
1.76M HEPES，pH 10.8
2-亚氨基硫杂环戊烷HCl：Sigma I6256#SLBS1775V
聚山梨酯80：Sigma-Aldrich P8074#BCBG4547V
LAR为接头:抗体比
DAR为药物:抗体比
SEC为尺寸排阻色谱法
通过尺寸排阻HPLC(SEC)的单体含量
通过色谱法评价每种缀合物的聚集物含量，使用TOSOH TSKgel G3000SWXL 7.8mm×30cm，5μm柱，0.5mL/分钟，在10％IPA，0.2M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.95中。纯净上样并且在214、252和280nm采集数据。全部报道的数据在280nm。
疏水相互作用色谱法(HIC)
HIC使用TOSOH Butyl-NPR 4.6mm×3.5cm，2.5μm柱进行，0.8mL/分钟，12-分钟，线性梯度：流动相A-1.5M(NH4)2SO4，25mM NaPi，pH6.95±0.05；和流动相B-75％25mM NaPi，pH6.95±0.05，25％IPA。纯净上样，达到至多10uL的最大载量，并且在280、252和214nm采集数据；全部报道的数据为214nm。
聚合反相色谱法(PLRP)
反相使用Polymer Labs PLRP-S 2.1mm×50mm，5μm，
Figure BDA0002304261050000721
柱进行，0.25mL/分钟/80℃，25-分钟线性梯度：0.1％TFA 25％MeCN-0.1％TFA50％MeCN。通过将10ug样品与5uL 0.1M DTT混合并且使用0.5M Tris/Cl，pH 8.0构成50uL并且在37℃温育15分钟还原样品。用49％乙腈、49％水、2％甲酸1:1稀释还原的样品以终止还原，并且在正在进行的PLRP分析期间稳定样品。将20uL该样品上柱用于分析，并且全部数据在214nm报道。
注意：HIC和PLRP不能解析单个接头的载量，这归因于α-Gal的亲水性。接头:Ab比(LAR)通过初始硫羟基-反应性抗体的等分部分和完成的反应混合物的vcE追踪来确定。
有代表性的实施例的数据示例在图1-3和12-17中。
抗体缀合物(西妥昔单抗)
西妥昔单抗(Merck Serono；Lot No：223155，exp：09/2020，分子量为152,000Da用于如下的缀合。计算基于Abs0.1％280nm为1.45cm-1mg/mL-1、UV分析为4.7mg/mL和通过在214nm的SEC的校准曲线。
用于还原西妥昔单抗、然后与包含马来酰亚胺的接头缀合的通用方法(实施例1- 4)
给西妥昔单抗(4.7mg/mL)补充6％0.5M Tris-Cl，0.025M EDTA，pH 8.5，并且与1.1当量TCEP:mAb(平均值为LAR＝2)或4.2TCEP:mAb(平均值为LAR＝5)在室温分别温育90分钟和120分钟。
为了分析还原程度，使还原样品的等分部分与摩尔过量的替代负载Mal-vc-PAB-MMAE缀合以测定DAR(采用HIC分析)。
向还原样品中加入8当量的接头-马来酰亚胺，并且将该反应在室温温育60分钟。温育后，通过添加N-乙酰基半胱氨酸(10mM水溶液)30分钟使反应停止。用G25树脂纯化样品入PBS，并且用采用Vivaspin6装置用10DIA体积的膜渗滤除去未结合的接头。
实施例1
Figure BDA0002304261050000731
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：2
％单体[SEC]：98.8％(参见图3)
前体：制备例1
实施例2
Figure BDA0002304261050000732
Av.LAR：5；Av.α-Gal单元的总数：5
％单体[SEC]：99.4％(参见图3)
前体：制备例1
实施例3
Figure BDA0002304261050000741
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：6
％单体[SEC]：99.5％(参见图3)
前体：制备例2
实施例4
Figure BDA0002304261050000742
Av.LAR：5；Av.α-Gal单元的总数：15
％单体[SEC]：99.0％(参见图3)
前体：制备例2
西妥昔单抗赖氨酸相互转化为硫羟基、然后与包含马来酰亚胺的接头缀合的通用 方法(实施例5-8)
使西妥昔单抗(4.7mg/mL)结合至蛋白质A树脂(GE Healthcare,HiTrapMabSelect SURE 1mL)，然后用50mM KPI，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 7.5洗涤柱，并且用4CV0.1M甘氨酸pH 3洗脱mAb。给包含靶蛋白的洗脱的级分(通过UV280吸光度合并)补充20％1.76M HEPES pH 10.8。然后将西妥昔单抗与12.2当量2-亚氨基硫代环戊烷:mAb(对于低LAR样品)或30.5当量2-亚氨基硫代环戊烷:mAb(对于高LAR样品)在23℃温育120分钟。
将样品的等分部分在5mM His，50mM海藻糖pH 6.0中进行缓冲液交换，并且与摩尔过量的替代负载Mal-vc-PAB-MMAE缀合，以便测定DAR。通过NAP25缓冲液交换入5mM His，50mM海藻糖pH 6.0，然后偶联，使剩余的硫羟基化混合物猝灭。在23℃采用4当量接头-马来酰亚胺:硫羟基和最终5％DMA进行接头-马来酰亚胺缀合120分钟。温育时，将样品通过G25树脂缓冲液交换入PBS。通过10DV膜渗滤(Vivaspin6)除去过量接头。
采用Ellman测定的整个试验期间监测游离硫羟基的量。
实施例5
Figure BDA0002304261050000751
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：2
％单体[SEC]：95.0％(参见图3)
前体：制备例1
实施例6
Figure BDA0002304261050000752
Av.LAR：4.9；Av.α-Gal单元的总数：4.9
％单体[SEC]：90.3％(参见图3)
前体：制备例1
实施例7
Figure BDA0002304261050000761
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：6
％单体[SEC]：90.4％(参见图3)
前体：制备例2
实施例8
Figure BDA0002304261050000762
Av.LAR：4.9；Av.α-Gal单元的总数：14.7
％单体[SEC]：80.8％(参见图3)
前体：制备例2
还原西妥昔单抗、然后与包含马来酰亚胺的接头缀合用于得到平均LAR＝8的通用 方法(实施例9-11)
给西妥昔单抗(4.7mg/mL)补充6％0.5M Tris-Cl，0.025M EDTA(pH8.5)至约pH＝7.5，并且与8当量TCEP:mAb一起在室温温育90分钟。
为了分析还原程度，使还原的样品的等分部分与摩尔过量的替代负载Mal-vc-PAB-MMAE缀合，以测定DAR(采用HIC分析)。
向还原的样品中加入16或32当量的接头-马来酰亚胺并且在室温温育60分钟。温育后，通过添加N-乙酰基半胱氨酸(10mM水溶液)30分钟使反应猝灭，并且用G25将样品纯化入PBS，并且采用Vivaspin6 30kDa PES装置用10DIA体积的膜渗滤除去剩余的未结合接头。
实施例9
Figure BDA0002304261050000771
Av.LAR：8；Av.α-Gal单元的总数：8
SEC分析：Rt＝15.3分钟，98.3％单体含量
前体：制备例1
实施例10
Figure BDA0002304261050000772
Av.LAR：8；Av.α-Gal单元的总数：8
SEC分析：Rt＝14.8分钟，98.5％单体含量
前体：制备例20
实施例11
Figure BDA0002304261050000773
Av.LAR：8；Av.α-Gal单元的总数：8
SEC分析：Rt＝14.1分钟，97.0％单体含量
前体：制备例21
西妥昔单抗与包含N-羟基琥珀酰亚胺的接头的直接赖氨酸缀合的通用方法(实施 例12-16)
将西妥昔单抗(20mg)与蛋白质A树脂(GE Healthcare，HiTrap MabSelect Sure，1mL)结合，并且用pH＝8的50mM KPi，50mM NaCl和2mM EDTA溶液洗涤柱。用pH＝3的100mM柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体，并且将缓冲液交换至赖氨酸缀合缓冲液(50mM NaPi，150mM NaCl，2mM EDTA，pH＝8)中，浓度至约6mg/mL。通过SEC分析该溶液，以提供适合赖氨酸缀合的溶液形式的西妥昔单抗(18.2mg，91％收率，6.4mg/mL，100％单体含量)。
将上述西妥昔单抗溶液与5、10、15、20或38摩尔当量的制备例22(含6％v/v DMF共溶剂)在30℃温育2小时。通过添加甘氨酸至1mM来猝灭反应，并且将缀合物缓冲液交换至PBS中，并且进行渗滤，以去除过量的接头。
实施例12
Figure BDA0002304261050000781
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：2
SEC分析：Rt＝15.0分钟。单体含量未测定
前体：制备例22(5当量)
实施例13
Figure BDA0002304261050000782
Av.LAR：5；Av.α-Gal单元的总数：5
SEC分析：Rt＝14.9分钟。单体含量未测定
前体：制备例22(10当量)
实施例14
Figure BDA0002304261050000791
Av.LAR：8；Av.α-Gal单元的总数：8
SEC分析：Rt＝14.8分钟。单体含量未测定
前体：制备例22(15当量)
实施例15
Figure BDA0002304261050000792
Av.LAR：10；Av.α-Gal单元的总数：10
SEC分析：Rt＝14.7分钟。单体含量未测定
前体：制备例22(20当量)
实施例16
Figure BDA0002304261050000793
Av.LAR：15；Av.α-Gal单元的总数：15
SEC分析：Rt＝14.2分钟，94.3％单体含量
前体：制备例22(38当量)
实施例17
Figure BDA0002304261050000801
根据通用方法3，采用60当量的制备例22(含10％v/v DMF)制备实施例17达2小时，然后再采用40当量的制备例22(含4％v/v DMF)达2小时。
Av.LAR：20；Av.α-Gal单元的总数：20
SEC分析：Rt＝13.9分钟，98.4％单体含量
前体：制备例22
Fab片段缀合物(西妥昔单抗)
西妥昔单抗消化为西妥昔单抗-Fab
将西妥昔单抗(60mg，4.7mg/mL)缓冲液交换到消化缓冲液(20mM NaPi，20mM半胱氨酸，10mM EDTA，pH＝7)中，并且以20mg/mL浓缩至3mL。将固定化的木瓜蛋白酶(3mL，Thermo Fisher#20341，载量：250ug/mL树脂，活性：16-40BAEE/mg木瓜蛋白酶)在消化缓冲液中平衡，并且在37℃与浓缩的西妥昔单抗一起温育15小时。通过过滤收集消化产物，并且通过蛋白A柱洗脱。使未结合的Fab片段穿柱，并且收集流出物。Fab片段通过vivaspin离心(10kDa MWCO过滤器)不连续渗滤至50mM NaPi，150mM NaCl和2mM EDTA，pH＝8中。达到的最终浓度为5.6mg/mL(参见图16)。
还原西妥昔单抗-Fab、然后与包含马来酰亚胺的接头缀合以得到LAR＝2的通用方 法(实施例18和19)
在室温通过加入5摩尔当量的TCEP(10mM，在水中)还原缀合缓冲液(50mM NaPi，150mM NaCl和2mM EDTA，pH＝8)中5.6mg/mL的西妥昔单抗Fab达90分钟。加入制备例20(5摩尔当量)或制备例21(7.5摩尔当量)的溶液，并且将反应在室温温育1小时。将缀合物用PBS进行缓冲液交换，并且用PBS渗滤，得到期望的物质。通过SEC和SDS-PAGE分析缀合物。
实施例18
Figure BDA0002304261050000811
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：2
SEC分析：Rt＝18.2分钟，94.7％单体含量
前体：制备例20
实施例19
Figure BDA0002304261050000812
Av.LAR：2；Av.α-Gal单元的总数：6
SEC分析：Rt＝17.4分钟，91.7％单体含量
前体：制备例21
西妥昔单抗-Fab与包含NHS的接头的赖氨酸缀合以得到平均LAR＝7-14的通用方 法(实施例20-24)
将在缀合缓冲液(50mM NaPi，150mM NaCl和2mM EDTA，pH＝8)中5.6mg/mL的西妥昔单抗-Fab与制备例22(15、30和40当量)和制备例23(20当量)(含9％v/v DMF助溶剂)一起在30℃温育2小时。通过添加甘氨酸至1mM来猝灭反应，并且将缀合物缓冲液交换至PBS中，并且进行渗滤，以除去过量的接头。
实施例20
Figure BDA0002304261050000821
Av.LAR：7；Av.α-Gal单元的总数：7
SEC分析：Rt＝18.0分钟，99％单体含量
前体：制备例22(15当量)
实施例21
Figure BDA0002304261050000822
Av.LAR：5；Av.α-Gal单元的总数：15
SEC分析：Rt＝17.4分钟，99％单体含量
前体：制备例23(20当量)
实施例22
Figure BDA0002304261050000823
Av.LAR：11；Av.α-Gal单元的总数：11
SEC分析：Rt＝17.3分钟，96.9％单体含量
前体：制备例22(30当量)
实施例23
Figure BDA0002304261050000831
Av.LAR：14；Av.α-Gal单元的总数：14
SEC分析：Rt＝17.1分钟，95.7％单体含量
前体：制备例22(40当量)
实施例24
Figure BDA0002304261050000832
根据通用方法4、采用60当量的制备例22(含20％v/v DMF)制备实施例24达2小时，然后再与40当量的制备例22(含4％v/v DMF)达2小时。
Av.LAR：17；Av.α-Gal单元的总数：17
SEC分析：Rt＝15.9分钟，90.2％单体含量
前体：制备例22(60+40当量)
抗体缀合物(利妥昔单抗)
在聚山梨醇酯80(0.7mg/mL)和柠檬酸钠脱水物(7.35mg/mL)、氯化钠(9mg/mL)和水中配制的利妥昔单抗(Roche-Rituxan,Lot No:B6105B92UI)。
利妥昔单抗与包含N-羟基琥珀酰亚胺的接头的直接赖氨酸缀合的通用方法(实施 例25)
用500mM磷酸盐缓冲液(50mM NaPi，150mM NaCl，2mM EDTA，pH＝8)将利妥昔单抗的pH调节至pH＝7.9。
将上述利妥昔单抗溶液与40摩尔当量的制备例22(含10％v/v DMF助溶剂)在30℃一起温育2小时，然后第二次添加40摩尔当量的制备例22(含4％v/v DMF)。通过添加甘氨酸至1mM来猝灭反应，然后将缀合物进行缓冲液交换至PBS中，并且进行渗滤，以除去过量的接头。
实施例25
Av.LAR：20；Av.α-Gal单元的总数：20
SEC分析：Rt＝14.4分钟，98.5％单体含量
前体：制备例22
Fab片段缀合物(利妥昔单抗)
利妥昔单抗消化为利妥昔单抗-Fab
将利妥昔单抗(60mg，4.7mg/mL)缓冲液交换到消化缓冲液的(20mM NaPi，20mM半胱氨酸，10mM EDTA，pH＝7)中，并且浓缩至20mg/mL。将固定化的木瓜蛋白酶(w/w 1/160，Thermo Fisher#20341，载量：250ug/mL树脂，活性：16-40BAEE/mg木瓜蛋白酶)在消化缓冲液中平衡，并且与浓缩的利妥昔单抗在37℃温育5-18小时。通过过滤收集消化产物，并且通过蛋白A柱洗脱。使未结合的Fab片段穿过色谱柱，并且收集流出物。Fab片段通过vivaspin离心(10kDa MWCO过滤器)不连续渗滤至50mM NaPi，150mM NaCl和2mM EDTA，pH＝8中。达到的最终浓度为11.7mg/mL。
在30℃，将上述利妥昔单抗-Fab溶液与40摩尔当量的制备例22(含25％v/v DMF共溶剂)一起温育2小时，然后第二次加入40摩尔当量的制备例22(含9％v/v DMF)。通过添加甘氨酸至1mM来猝灭反应，并且将缀合物缓冲液交换至PBS中，并且进行渗滤，以除去过量的接头。
实施例26
Figure BDA0002304261050000851
Av.LAR：14；Av.α-Gal单元的总数：14
SEC分析：Rt＝16.9分钟，87.5％单体含量
前体：制备例22
采用Α-半乳糖基IgM抗体的流式细胞术测定
流式细胞仪用于证明L(作为西妥昔单抗)与人类细胞系上的受体和F(作为能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)结合。众所周知，A431细胞用于捕获EGFR结合mAb(西妥昔单抗)，因为众所周知该细胞显著过表达EGFR受体。藻红蛋白(PE)标记的抗人IgM二抗用于检测α-半乳糖基IgM抗体与该化合物的结合。
收获A431细胞(ATCC CRL-1555)，并且以5×106个细胞/mL重悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma D8662)+0.1％BSA(牛血清白蛋白-Sigma A2153)中。然后将5×105个细胞与如下所述的多种浓度的化合物或单独的缓冲液在室温一起温育，以450rpm摇动1小时。
用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入32μg/mL的50μL在PBS+0.1％BSA中的抗-α半乳糖基IgM抗体(绝对抗体Ab00532-15.0)，并且在4℃温育1小时。将细胞进一步用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤，然后在4℃用100μL 1:40稀释的抗-人IgM-PE(Biolegend314508)处理1小时。最后用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤后，将细胞重悬于200μL PBS+0.1％BSA中，并且在流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)上进行评估。用Kaluza软件包(Beckman Coulter)分析来自所有样品的数据。
图4显示了采用10nM的实施例1(图4A)、实施例2(图4B)、实施例3(图4C)、实施例4(图4D)、实施例5(图4E)、实施例6(图4F)、实施例7(图4G)和实施例8(图4H)的细胞表面的抗-α半乳糖基IgM抗体的捕获。荧光强度(PE)的位移因分子每个末端的结合事件而发生。
采用α-半乳糖基IgG抗体的流式细胞术测定
流式细胞仪用于证明L(作为西妥昔单抗)与人细胞系上的受体和F(作为能够与人抗α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)结合。A431细胞用于捕获EGFR结合mAb(西妥昔单抗)，因为众所周知该细胞显著过表达EGFR受体。藻红蛋白(PE)标记的α-半乳糖基IgG抗体用于检测化合物的结合。
收获A431细胞(ATCC CRL-1555)，并且以5×106个细胞/mL重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma D8662)+0.1％BSA(牛血清白蛋白-Sigma A2153)中。然后将5×105个细胞与10nM的化合物，单独的缓冲液或10nM的西妥昔单抗在室温温育，以450rpm摇动1小时。用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入575μg/mL的50μL在PBS+0.1％BSA中的PE标记的抗-α半乳糖基IgG抗体，并且在4℃温育1小时。抗-α半乳糖基IgG抗体(绝对抗体Ab00532.10.0)已由Cambridge Research Biochemicals定制为用PE标记。最后用2×200μLPBS+0.1％BSA洗涤后，将细胞重悬于200μL PBS+0.1％BSA中，并且在流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)上进行评估。用Kaluza软件包(Beckman Coulter)分析来自所有样品的数据。
图5显示了与单独的缓冲液相比，采用10nM的实施例1(图5A)、实施例2(图5B)、实施例3(图5C)和实施例4(图5D)的细胞表面的抗-α半乳糖基IgG抗体的捕获。荧光强度(PE)的位移因分子每个末端的结合事件而发生。
图6显示了与10nM西妥昔单抗相比，采用10nM的实施例5(图6A)、实施例6(图6B)、实施例7(图6C)和实施例8(图6D)的细胞表面的抗-α半乳糖基IgG抗体的捕获。荧光强度(PE)的位移因分子每个末端的结合事件而发生。
采用来自hIVIG和A431细胞的α-半乳糖基IgG抗体的流式细胞术测定
流式细胞仪用于证明L(作为Fab片段)与在人细胞系(A431)上表达的EGFR和F(作为能够结合人抗α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子)结合。藻红蛋白(PE)标记的抗-人IgG二抗用于检测α-半乳糖基IgG抗体与化合物的结合。
收获A431细胞(ATCC CRL-1555)，并且以5×106个细胞/mL重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma D8662)+0.1％BSA(牛血清白蛋白-Sigma A2153)中。然后在室温将5×105个细胞与至多1000nM浓度的一系列化合物，单独的缓冲液或1000nM未结合的Fab片段温育，以450rpm摇动1小时。用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入在PBS+0.1％BSA中的50μL hIVIG抗-Gal IgG(70μg/mL)(自人IVIG定制纯化)，并且在4℃温育1小时。
用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入100μL IgG-PE二抗(克隆HP6017，Biolegend 409393)。将细胞在黑暗中在4℃温育30分钟。
最后用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤后，将细胞重悬于200μL PBS+0.1％BSA中，并且在流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)上进行评估。用Kaluza软件包(1.5a版，BeckmanCoulter)分析来自所有样品的数据。
图7显示了与观察到最少募集的未结合的Fab片段相比，实施例18-23的与剂量相关的、化合物驱动的抗-Gal IgG抗体从hIVIG募集至A431细胞。
采用α-半乳糖基IgM抗体和A431细胞的流式细胞术测定
按照上述流式细胞仪测定方案，与西妥昔单抗和/或未缀合的Fab片段相比，在至多1000nM的一系列浓度测试化合物。
图8显示了与未结合的Fab片段和/或西妥昔单抗相比，剂量相关的、化合物驱动的α-半乳糖基IgM抗体募集到A431细胞。
采用C3b抗体的流式细胞术测定
流式细胞仪用于证明化合物与目标细胞系的结合以及C3b补体组分募集至细胞。
A431细胞用于捕获EGFR结合抗体或抗体片段，因为众所周知该细胞显著过表达EGFR受体。
加入多种浓度的化合物后，与藻红蛋白(PE)缀合的抗-C3b抗体用于检测C3b分子从血清中募集到细胞中。
收获A431细胞(ATCC CRL-1555)，并且以5×106个细胞/mL重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma D8662)+0.1％BSA(牛血清白蛋白-Sigma A2153)中。然后将5×105个细胞与至多10000ng/mL的一系列浓度的化合物，单独的缓冲液或多种浓度的西妥昔单抗Fab片段和/或西妥昔单抗一起在室温温育，以450rpm摇动1小时。用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后添加100μL PBS和100μL 20％人血清(HS)(Patricell 23590)或热灭活人血清(HIHS)(含25μg/mL M86IgM(绝对抗体))，并且在37℃温育25分钟。
用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入100μL抗-C3b-PE(3E7/C3b，Biolegend 846104)。将细胞在黑暗中在4℃温育30分钟。
最后用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤后，将细胞重悬于200μL PBS+0.1％BSA中，并且在流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)上进行评估。用Kaluza软件包(1.5a版，BeckmanCoulter)分析来自所有样品的数据。
图9显示了与西妥昔单抗Fab片段和/或西妥昔单抗相比，使用多种浓度的实施例13-17、20、22、23和24的A431细胞上C3b的沉积。当采用热灭活的人血清时，对所有实施例观察到均较背景<5倍的位移(代表性HI HS数据如本文所示)。
巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用
吞噬作用用来证明L(作为西妥昔单抗的Fab片段)与细胞系上的受体和F(作为能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)结合的功能作用。据报道表达EGFR的A431细胞用作靶细胞。单核细胞衍生的巨噬细胞用作效应细胞。纯化的hIVIG用作抗-Gal抗体的来源。由于靶细胞的吞噬作用，所测得的整合强度增加。在对照条件下(单独的细胞或未缀合的Fab片段存在下)没有观察到这种增加。
在96-孔板(Corning 3603)中原位分化效应细胞。简言之，来自白细胞减少系统腔室中保留的每个健康供体的血液均购自国家卫生局(National Health Service(Addenbrooke’s Hospital,Cambridge,UK)。按照制造商的说明书(STEMCELLTechnologies 07861)，采用LymphoprepTM系统分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒II(STEMCELL Technologies 17858)进行阳性选择来从PBMC中分离单核细胞，将其以100ng/mL重悬于补充有重组人GM-CSF(Peprotech 300-03)的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(STEMCELL Technologies 10961)中，并且以20,000个细胞/孔铺板于细胞培养温育箱(5％CO2，37℃)中。分化5天后，巨噬细胞用100ng/mL IFN-y(Peprotech 300-02)和1ng/mL脂多糖(Invitrogen tlrl-eblps)再经过2天极化成M1表型。在补充有10％胎牛血清(
Figure BDA0002304261050000891
10500-064)的Dulbecco改良Eagle培养基(
Figure BDA0002304261050000892
61965-026)中培养A431细胞(ATCC CRL-1555)，并且用作靶细胞。用细胞解离缓冲液(
Figure BDA0002304261050000897
13151014)收获靶细胞，在37℃以1.0μL/1.0×106个细胞计数和标记10mM pHrodoGreen STP酯(Thermo Fisher Scientific P35369)。将细胞在完全培养基中洗涤，计数，然后在RT在摇动下用一系列浓度的
实施例23、实施例20或西妥昔单抗-Fab处理1小时。然后在无培养基的培养基中洗涤细胞，在冰上与70μg/mL hIVIG(自人IVIG定制纯化)一起温育30分钟，在Dulbecco磷酸盐溶液(
Figure BDA0002304261050000898
14190-094)中洗涤并且在37℃在(Sartorius)中与效应细胞共培养(靶标:效应细胞比例为5:1)，至多12小时。每两个小时获取一次图像。使用
Figure BDA0002304261050000894
ZOOM软件(版本2016A，Sartorius)分析数据。使用GraphPad Prism(版本6)作图。
图10显示了与未缀合的Fab片段相比，在1nM实施例20和实施例23存在下代表性的化合物介导的吞噬作用。靶细胞(表达EGFR的A431细胞)被效应细胞(巨噬细胞)吞噬。整合强度的增加因靶细胞的化合物驱动的吞噬作用而发生。
采用α-半乳糖基IgM抗体对Raji细胞的流式细胞术测定
流式细胞仪用于证明L(作为利妥昔单抗或利妥昔单抗Fab)与人细胞系上的受体和F(作为能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子)结合。Raji细胞用于捕获结合CD20的mAb或Fab，因为众所周知该细胞显著过表达CD20受体。藻红蛋白(PE)标记的抗人IgM二抗用于检测α-半乳糖基IgM抗体与化合物的结合。
收获Raji细胞(
Figure BDA0002304261050000895
CCL-86TM)，并且以5×106个细胞/mL重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(
Figure BDA0002304261050000896
14190-094)+0.1％BSA(牛血清白蛋白-Sigma A2153)中。然后将5×105个细胞与如下所述的多种浓度的化合物或单独的缓冲液在室温一起温育，以450rpm摇动1小时。
用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入32μg/mL的50μL在PBS+0.1％BSA中的抗-α半乳糖基IgM抗体(绝对抗体Ab00532-15.0)，并且在4℃温育1小时。将细胞进一步用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤，然后在4℃用100μL 1:40稀释的抗-人IgM-PE(Biolegend314508)处理1小时。最后用2×200μL PBS+0.1％BSA洗涤后，将细胞重悬于200μL PBS+0.1％BSA中，并且在流式细胞仪(BD FACSVerseTM,BD)上进行评估。用
Figure BDA0002304261050000901
LLC软件包分析来自所有样品的数据。使用GraphPad Prism(版本6)作图。
图11显示了与利妥昔单抗及其Fab片段相比，剂量相关的化合物驱动的α-半乳糖基IgM抗体募集至Raji细胞。
Figure IDA0002304261100000011
Figure IDA0002304261100000021
Figure IDA0002304261100000031
Figure IDA0002304261100000041
Figure IDA0002304261100000061
Figure IDA0002304261100000071

Claims (38)

1.免疫缀合物，其包含抗体或其抗原结合片段，其通过接头与碳水化合物分子连接，所述碳水化合物分子能够结合人抗-α-半乳糖基抗体，其特征在于所述接头包含至少一个苯基环，所述苯基环能够显示出与能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的一个或多个碳水化合物表位。
2.如权利要求1中所定义的免疫缀合物，其中所述接头包括苯基、联苯基或三联苯基；或为联苯基。
3.如权利要求1或权利要求2中所定义的免疫缀合物，其为式(A)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002304261040000011
其中F为能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；Cy为苯基、联苯基或三联苯基；SA和SB表示为F和L的最佳距离而选择的间隔基；m表示选自1-5的整数；z表示选自1-10的整数；并且L为抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求1-3任一项中所定义的免疫缀合物，其为式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自-(CH2)a-或-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团，其中所述-CH2-基团的1-10个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-O-、-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自1-35的整数；
b表示选自0-5的整数；
c表示选自1-20的整数；
d表示选自1-20的整数；
S2表示间隔基，其选自-(CH2)e-或-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团，其中所述-CH2-基团的1-3个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-；
e表示选自1-15的整数；
f表示选自1-10的整数；
g表示选自1-20的整数；
h表示选自1-5的整数；
z表示选自1-30的整数；
X1表示抗体或抗原结合片段连接部分；
Y1和Y2独立地表示键、-O-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NHSO2-、-SO2NH-或-NHC(O)NH-基团；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1-5的整数；并且
Cy表示苯基、联苯基、三联苯基，其中当Cy表示联苯基或三联苯基时，所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任意所述苯基环上，并且所述一个或多个[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
5.如权利要求4中所定义的免疫缀合物，其中S1表示间隔基，其选自：
-(CH2)a-，其中所述-CH2-基团的1-5个(例如2、3或5个)可以任选被一个或多个选自-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮的基团取代(例如-(CH2)2-NHCO-环己基-CH2-3-吡咯烷-2,5-二酮-、-(CH2)2-NHCO-环己基-CH2-3-吡咯烷-2,5-二酮-S-(CH2)3-C(＝NH)-或-(CH2)2-NHCO-(CH2)3-CO-)；或
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述-CH2-基团的1-5个(例如2个)可以任选被一个或多个选自-NHC(O)-或吡咯烷-2,5-二酮的基团取代(例如-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-3-吡咯烷-2,5-二酮-)。
6.如权利要求4或权利要求5中所定义的免疫缀合物，其中X1表示-S-或-N(H)-。
7.如权利要求4-6任一项中所定义的免疫缀合物，其中a表示选自1-30；或2-30；或2、4、6、9、11、18或30；或6-30；或6、11、18或30；或5-15；或6-11；或6、7或11；或6；或7；或11的整数。
8.如权利要求4-7任一项中所定义的免疫缀合物，其中b表示选自0-3；或0或3；或1-3；或2或3；或3的整数。
9.如权利要求4-8任一项中所定义的免疫缀合物，其中c表示选自1-15；或1-12；或4-12；或4或12；或4的整数。
10.如权利要求4-9任一项中所定义的免疫缀合物，其中d表示选自1-15；或2-13；或2、5或13；或13；或3的整数。
11.如权利要求4-10任一项中所定义的免疫缀合物，其中Y1表示键、-C(O)NH-或-O-；或-C(O)NH-。
12.如权利要求4-11任一项中所定义的免疫缀合物，其中S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被1或2个选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-的基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-、-(CH2)3-、-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-、-(CH2)3-NH-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1-3个任选被1-3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)；
或S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-、-(CH2)3-、-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-或-(CH2)3-NH-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-或-(CH2)4-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-)；
或S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被1或2个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1-3个任选被1-3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)；
或S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个任选被1或2个选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-的基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的1-3个任选被1-3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)；
或S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1或2个、例如1个任选被1或2个、例如1个选自-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-的基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-)；
或S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1个任选被-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的2个任选被-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)。
13.如权利要求4-12任一项中所定义的免疫缀合物，其中e表示选自1-10；或3-10；或3、5、9或10；或5-9；或5或9；或4-10；或4、5或10；或5的整数。
14.如权利要求4-13任一项中所定义的免疫缀合物，其中f表示选自1-8；或2-8；或2-6；或4-8；或4或8；或4的整数。
15.如权利要求4-14任一项中所定义的免疫缀合物，其中g表示选自1-15；或4-12；或4或12；或1-5；或1-4；或4的整数。
16.如权利要求4-15任一项中所定义的免疫缀合物，其中h表示选自1-4；或4的整数。
17.如权利要求4-16任一项中所定义的免疫缀合物，其中Y2表示键、-O-或-NHC(O)-；或键或-O-；或-O-。
18.如权利要求4-17任一项中所定义的免疫缀合物，其中m表示选自1-4；或1-3；1或3；或2或3；或1或2；或1；或2；或3；或4的整数。
19.如权利要求4-18任一项中所定义的免疫缀合物，其中z表示选自2-20；或2；或4.9；或5；或7；或8；或10；或11；或14；或15；或17；或20的整数。
20.如权利要求4-19任一项中所定义的免疫缀合物，其中Cy表示苯基或联苯基；或联苯基或三联苯基；或苯基或三联苯基；或联苯基。
21.式(I)a化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002304261040000051
L表示结合部分，其选自抗体或其抗原结合片段；
S1表示间隔基，其选自：
-(CH2)a-，其中所述-CH2-基团的2、3或5个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-S-、＝N(H)-、-C(＝O)-、-NHC(O)-、环己基或吡咯烷-2,5-二酮；或
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述-CH2-基团的2个可以任选被一个或多个基团取代，所述基团选自-NHC(O)-或吡咯烷-2,5-二酮；
a表示选自6、7或11的整数；
b表示选自3的整数；
c表示选自4的整数；
d表示选自3的整数；
S2表示间隔基，其选自：
-(CH2)e-，其中所述-CH2-基团的1个任选被-NHC(O)-基团取代；或
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述-CH2-基团的2个任选被-NHC(O)-基团取代；
e表示选自5的整数；
f表示选自4的整数；
g表示选自4的整数；
h表示选自4的整数；
z表示选自2-20的整数；
X1表示-S-或-N(H)-；
Y1表示-C(O)NH-；
Y2表示-O-；
F表示能够结合人抗-α-半乳糖基抗体的碳水化合物分子；
m表示选自1或3的整数；并且
Cy表示联苯基，其中所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，并且所述一个或多个[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
22.如权利要求1-21任一项中所定义的免疫缀合物，其中抗体为多克隆抗体。
23.如权利要求1-22任一项中所定义的免疫缀合物，其中抗体为人源化抗体、人抗体、鼠抗体或嵌合抗体。
24.如权利要求1-23任一项中所定义的免疫缀合物，其中其抗原结合片段为抗原结合片段(Fab)或单链可变片段(scFv)。
25.如权利要求24中所定义的免疫缀合物，其中所述片段选自Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2和scFv。
26.如权利要求1-25任一项中所定义的免疫缀合物，其中抗体或其抗原结合片段选自EGFR抗体或其片段，例如西妥昔单抗、西妥昔单抗Fab或尼妥珠单抗，特别是EGFR抗体或其片段，其与SEQ ID NOS：1-4具有至少80％的序列同一性。
27.如权利要求1-25任一项中所定义的免疫缀合物，其中抗体或其抗原结合片段选自CD20抗体或其片段，例如利妥昔单抗或利妥昔单抗Fab。
28.如权利要求1-25任一项中所定义的免疫缀合物，其中抗体或其抗原结合片段选自病原特异性抗体或其片段。
29.如权利要求1-28任一项中所定义的免疫缀合物，其中F选自半乳糖基-α-1,3-半乳糖基-β-1,4-N-乙酰基葡糖胺，α1-3半乳二糖，α1-3-β1-4-半乳三糖或Galili五糖。
30.如权利要求1或权利要求21中所定义的化合物或其药学上可接受的盐，其选自实施例1-26的任意一个。
31.药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-30任一项中所定义的化合物或其药学上可接受的盐。
32.如权利要求31中所定义的药物组合物，其还包含一种或多种另外的治疗剂。
33.如权利要求1-30任一项中所定义的化合物或其药学上可接受的盐，其用于疗法。
34.如权利要求26中所定义的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症。
35.如权利要求27中所定义的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症，例如血液癌症，特别是白血病和淋巴瘤。
36.如权利要求28中所定义的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗细菌感染。
37.用于制备如权利要求4中所定义的式(I)化合物的方法，该方法包括：
(a)制备式(IA)化合物，其中X1表示-S-，通过使式(III)化合物，其中抗体或抗原结合片段包含至少一个反应性硫羟基，与式(II)化合物反应来进行，其中S1被吡咯烷-2,5-二酮终止：
Figure FDA0002304261040000081
其中F、S2、Y2、m、Cy、Y1和S1如权利要求4中所定义；或
(b)制备式(IC)化合物，其中X1表示-NH2，并且S1包含-S-CH2-CH2-CH2-C(＝NH)-，通过使式(IIIA)化合物，其中抗体或抗原结合片段包含至少一个反应性硫羟基，与式(II)化合物反应来进行，其中S1被吡咯烷-2,5-二酮终止：
Figure FDA0002304261040000082
其中F、S2、Y2、m、Cy、Y1、S1和L如权利要求4中所定义；或
(c)制备式(IB)化合物，其中X1表示-NH2，通过使式(IIB)化合物，其中S1被N-羟基琥珀酰亚胺终止，与式(IIIB)化合物反应来进行，其中抗体或抗原结合片段包含至少一个反应性氨基：
其中F、S2、Y2、m、Cy、Y1、S1和L如权利要求4中所定义；和/或
(d)式(I)化合物或其保护的衍生物相互转化为另外的式(I)化合物或其保护的衍生物。
38.如权利要求37中所定义的式(II)或(IIB)化合物或如本文所定义的式(V)、(VA)、(IX)或(XI)化合物。
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