ES2954294T3 - Compuestos novedosos y usos terapéuticos de los mismos - Google Patents

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Melanie Glossop
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Abstract

La invención se relaciona con nuevos compuestos con la capacidad de vincular una respuesta inmune a una diana terapéutica definida, con el uso de dichos compuestos en el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas, con composiciones que contienen dichos compuestos, con procesos para su preparación y con nuevos intermedios usados en dichos compuestos. proceso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos novedosos y usos terapéuticos de los mismos
Campo de la invención
La invención que se define en las reivindicaciones se refiere a compuestos novedosos con la capacidad de ligar una respuesta inmunitaria a una diana terapéutico definido, al uso de dichos compuestos en el tratamiento de cáncer y de enfermedades infecciosas, a composiciones que contienen dichos compuestos, y a procesos para su preparación.
Antecedentes de la invención
Existe la necesidad de encontrar formas novedosas de reclutar el sistema inmunitario de un individuo para combatir la enfermedad. El sistema inmunitario humano inspecciona continuamente el cuerpo en busca de señales extrañas para identificar patógenos potencialmente dañinos o células humanas mutadas (que podrían convertirse en una causa de crecimiento canceroso) y orientarlos a su eliminación. Existen anticuerpos naturales que se pueden reclutar para dichos patógenos o células humanas mutadas para impulsar al sistema inmunitario a eliminar la amenaza.
El cáncer es un grupo de enfermedades que involucran un crecimiento celular anormal con el potencial de invadir o diseminarse a otras partes del cuerpo. En 2012, el cáncer se presentó en aproximadamente 14.1 millones de personas. Causó aproximadamente 8.2 millones de muertes o el 14.6% de todas las muertes humanas. Los tipos de cáncer más comunes en los hombres son el cáncer de pulmón, el cáncer de próstata, el cáncer colorrectal y el cáncer de estómago. En las mujeres, los tipos de cáncer más comunes son el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer de pulmón y el cáncer de cuello uterino. Está bien establecido que la respuesta inmunitaria desempeña un papel vital en la identificación y eliminación de células cancerosas. Existen fármacos que combaten el cáncer al estimular el sistema inmunitario de un individuo para ayudar a combatir el cáncer. Existe la necesidad de poder dirigir mejor la respuesta inmunitaria específicamente a la célula cancerosa y generar una gama más amplia de antígenos asociados al tumor del propio paciente. Dirigirse a los anticuerpos naturales preexistentes contra el propio tumor del paciente podría satisfacer esta necesidad. Existe una necesidad urgente de identificar formas novedosas de tratar infecciones bacterianas, víricas y fúngicas. La resistencia a los fármacos antimicrobianos se está convirtiendo en una importante amenaza para la salud mundial. Por ejemplo, se estima que más de 2 millones de personas en los Estados Unidos estaban infectadas con bacterias resistentes a al menos una clase de antibióticos (Centers for Disease Control and Prevention, 2013).
Se divulgó un enfoque innovador para el tratamiento de enfermedades infecciosas en el documento WO 2005/079423 que se describe un ligador de inmunidad que contiene dos restos de unión. El primer resto de unión puede unirse a un componente de respuesta inmunitaria de un individuo. El segundo resto de unión puede unirse a cualquier compuesto o material extraño, como antígenos, patógenos, productos químicos o materiales endógenos, como células alteradas que se encuentran en el cáncer. El efecto resultante de dicha molécula ligadora de inmunidad es que la respuesta inmunitaria preexistente del individuo se desvía hacia la diana, es decir, la célula cancerosa o el patógeno específico. Los ejemplos de dichos primeros restos de unión incluyen compuestos o agentes que son reconocidos por el sistema inmunitario de dicho individuo como extraños y que, por lo tanto, desencadenarían una respuesta inmunitaria.
Los ejemplos típicos de primeros restos de unión incluyen la molécula pequeña hapteno dinitrofenilo (DNP), ramnosa o p-1,6-glucano. Uno ejemplo además de un primer resto de unión es una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil de suero humano (es decir, galactosil-alfa-1,3-galactosilbeta-1,4-N-acetilglucosamina; 'anti-Gal').
Dado que las funciones inmunitarias dependen de la multivalencia, el reclutamiento de anti-Gal dependerá no solo de la concentración de anti-Gal, sino también de la afinidad del anticuerpo por la diana.
Los ejemplos de dichos segundos restos de unión incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a una molécula diana específica. Otros ejemplos de dichos segundos restos de unión incluyen anticuerpos terapéuticos establecidos o fragmentos funcionales de los mismos. El sistema inmunitario puede reconocer las células o los patógenos seleccionados de esta manera como extraños y marcarlos para su destrucción. Así, los anticuerpos naturales pueden movilizarse contra estas células tum orales o patógenos y aprovechar el sistema inmunitario para eliminar la amenaza.
En el documento WO 98/34957 se describe la estimulación de una respuesta inmunitaria usando anticuerpos marcados con el epítopo alfa-galactosil en el presente documento se describen realizaciones en las que la estimulación del sistema inmunitario se basa en la incorporación de epítopos de alfa-galactosil en sitios de glucosilación diseñados dentro de la región constante del anticuerpo. Se ha informado que la producción del anticuerpo diseñado adecuadamente en líneas celulares que expresan alfa-1,3-galactosil transferasa da como resultado la adición de epítopos de alfa-galactosil. En este caso, el número de epítopos incorporados dependía del número de residuos diseñados para la glucosilación. Una desventaja del mismo enfoque es la limitación en el número de residuos de alfa-galactosil que se pueden introducir (limitado por el número de modificaciones de aminoácidos específicas del sitio). Una desventaja adicional del enfoque es que la alfa-1,3-galactosiltransferasa proporciona una población de derivados de carbohidratos que puede no ser óptima para el reclutamiento de anticuerpos anti-galactosil, lo que limita aún más el número de epítopos de reclutamiento inmunitario. Por lo tanto, existe la necesidad de moléculas ligadoras que permitan una carga y presentación optimizadas de epítopos de alfa-galactosil en relación con el resto del anticuerpo, para maximizar la respuesta inmunitaria.
Winter et al (2015) Science 348(6241), 1376-1381 describen la conjugación de ftalimida como una estrategia para la degradación de proteínas diana in vivo. En el documento WO 2013/166110 se describen moléculas de reclutamiento de anticuerpos conjugados con agonista de TLR que se reivindica que reclutan anticuerpos contra células cancerosas.
Por lo tanto, existe una gran necesidad de moléculas ligadoras que contengan grupos espaciadores que se hayan optimizado para controlar el número y la posición de los primeros restos de unión (es decir, la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano) en relación con la posición del segundo resto de unión (es decir, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno). Dichas moléculas ligadoras están diseñadas para atraer anticuerpos naturales de tal manera que puedan optimizar la eficacia del reclutamiento inmunitario mientras minimizan los efectos secundarios potenciales y, por lo tanto, tienen una gran utilidad en la provisión de terapias anticancerosas eficaces y terapias contra agentes infecciosos.
Compendio de la invención
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000003_0001
en donde L representa un resto de unión seleccionado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo;
51 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2)a- o -(CH2 )b-(CH2-CH2-O)c-(CH2 )d , en donde uno a diez de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -O-, -S-, =N(H)-, -C(=O)-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona;
a representa un número entero seleccionado de 1 a 35;
b representa un número entero seleccionado de 0 a 5;
c representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
d representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
52 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2)e- o -(CH2 )f-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)-;
e representa un número entero seleccionado de 1 a 15;
f representa un número entero seleccionado de 1 a 10;
grepresenta un número entero seleccionado de 1 a 20;
h representa un número entero seleccionado de 1 a 5;
z representa un número entero seleccionado de 1 a 30;
X i representa un resto de fijación de fragmento de unión a anticuerpo o antígeno;
Y i e Y2 representan independientemente un enlace, grupo -O-, -S-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -NHSO2-, -SO2NH- o -NHC(O)NH-;
F representa una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano; m representa un número entero seleccionado de 1 a 5; y
Cy representa fenilo, bifenilo, trifenilo, de tal modo que cuando Cy representa bifenilo o trifenilo, dicho grupo -Y1-S1-X1-L puede estar presente en cualquiera de dichos anillos fenilo y dicho grupo o grupos [F-S2-Y2]m pueden estar presentes en cualquiera de dichos anillos fenilo.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Reducción del análisis de la página SDS de los Ejemplos 1-4.
Figura 2: Reducción del análisis de la página SDS de los Ejemplos 5-8.
Figura 3: Análisis del contenido de monómero: SEC para los Ejemplos 1-8.
Figura 4: Datos de M86 IgM para los compuestos de los Ejemplos 1-8.
Figura 5: Datos de M86 IgG para los compuestos de los Ejemplos 1-4.
Figura 6: Demuestra la captura de anticuerpos IgM anti-alfa galactosil en la superficie celular usando el Ejemplo 5 (Figura 6A), el Ejemplo 6 (Figura 6B), el Ejemplo 7 (Figura 6C) y el Ejemplo 8 (Figura 6D) a 10 nM en comparación con 10 nM de cetuximab.
Figura 7: Es una titulación de dosis para los compuestos de los Ejemplos 18 a 23 que reclutan hIVIG anti-alfagalactosil IgG en células A431.
Figura 8: Es una titulación de dosis para los compuestos de los Ejemplos 9 a 24 que reclutan anticuerpos IgM anti-galactosil M86 para células A431.
Figura 9: Datos de deposición de C3b para los compuestos de los Ejemplos 13 a 17, 20, 22, 23 y 24 en células A431 con el 20% de suero humano (HS) o suero humano inactivado por calor (HI HS) 25 pg/ml M86 IgM. Figura 10: Datos de fagocitosis para los compuestos de los Ejemplos 20 y 23.
Figura 11: Es una titulación de dosis para los compuestos de los Ejemplos 25 y 26 que reclutan anticuerpos IgM anti-galactosil M86 contra células Raji.
Figura 12: Análisis de gel SDS-PAGE reductor para conjugados de cetuximab (Ejemplos 9-17).
Figura 13: Análisis de gel SDS-PAGE reductor para conjugados de cetuximab-Fab (Ejemplos 18-24).
Figura 14: Análisis de MS para los Ejemplos 20 (Figura 14A), 22 (Figura 14B) y 23 (Figura 14C).
Figura 15: Reducción de SDS-PAGE (Figura 15A) y análisis SEC para conjugados de rituximab y rituximab-Fab (Ejemplos 25 (Figura 15B) y 26 (Figura 15C)).
Figura 16: Análisis SDS-PAGE (Figura 16A), MS (Figura 16B) y SEC (Figura 16C) de cetuximab-Fab.
Figura 17: SDS-PAGE (Figura 17A) y análisis SEC de rituximab (Figura 17B) y análisis SEC de rituximab-Fab (Figura 17C).
Descripción detallada de la invención
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000005_0001
en donde L representa un resto de unión seleccionado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo;
51 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2)a- o -(CH2 )b-(CH2-CH2-O)c-(CH2 )d , en donde uno a diez de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -O-, -S-, =N(H)-, -C(=O)-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona;
a representa un número entero seleccionado de 1 a 35;
b representa un número entero seleccionado de 0 a 5;
c representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
d representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
52 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2)e- o -(CH2 )f-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )n-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)-;
e representa un número entero seleccionado de 1 a 15;
f representa un número entero seleccionado de 1 a 10;
g representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
h representa un número entero seleccionado de 1 a 5;
z representa un número entero seleccionado de 1 a 30;
X1 representa un resto de fijación de fragmento de unión a anticuerpo o antígeno;
Y1 e Y2 representan independientemente una unión, grupo -O-, -S-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -NHSO2-, -SO2NH- o -NHC(O)NH-;
F representa una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano; m representa un número entero seleccionado de 1 a 5; y
Cy representa fenilo, bifenilo, trifenilo, de tal modo que cuando Cy representa bifenilo o trifenilo, dicho grupo -Y1-S1-X1-L puede estar presente en cualquiera de dichos anillos fenilo y dicho grupo o grupos [F-S2-Y2]m pueden estar presentes en cualquiera de dichos anillos fenilo.
La invención incluye la descripción y el uso de ligadores inmunoconjugados novedosos que permiten la capacidad de mostrar uno o múltiples epítopos de carbohidratos además de la conjugación a sitios únicos o múltiples en un anticuerpo elegido o fragmento del mismo, lo que permite el óptimo reclutamiento de anticuerpos naturales concomitante con mantener la eficacia de unión a la diana. La invención proporciona a un experto en la técnica el ajuste fino del número óptimo de carbohidratos por anticuerpo elegido o fragmento del mismo para un reclutamiento anti-Gal óptimo y mantener la eficacia diana.
Los anticuerpos monoclonales han mejorado en gran medida el resultado de los pacientes que padecen cáncer; sin embargo, ciertas poblaciones de pacientes demuestran resistencia intrínseca a estas terapias y, aunque se pueden observar buenos resultados, estos pueden ser de corta duración y la resistencia adquirida a la terapia con mAb sigue siendo un problema y es deseable una mayor eficacia de los anticuerpos. Los tumores pueden demostrar o desarrollar mecanismos que den como resultado una resistencia o una respuesta reducida al tratamiento con anticuerpos, como, por ejemplo, mediante una mayor expresión del receptor o cambios en la vía de señalización o una respuesta inmunitaria reducida (Reslan, L. Mabs 2009, 3, 222). Por ejemplo, los pacientes pueden mostrar resistencia intrínseca a cetuximab como resultado de la expresión de la mutación KRAS que afecta la señalización de EGFR (Lievre, A, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 374). Es más, cuando los pacientes inicialmente responden bien a cetuximab, la mayoría eventualmente adquirirá resistencia (Bianco, R. Endocr. Relat. Cáncer 2005, S159; Brand, TM. Cáncer Biol. Ther. 2011, 11, 777).
Se observa otro ejemplo de resistencia a un anticuerpo terapéutico en el caso de pacientes con linfoma no Hodgkin tratados con rituximab (un anticuerpo monoclonal anti-CD20). La resistencia a rituximab se observa en alrededor de la mitad de los pacientes sin tratamiento previo. Los pacientes que muestran una respuesta inicial a la terapia con rituximab con frecuencia adquieren resistencia. Los mecanismos de resistencia son complejos y las estrategias para superar la resistencia han mostrado un éxito limitado en los pacientes (Best Pract. Res. clin. Haematol. 2011, 203-216), por lo que sigue existiendo una necesidad apremiante de mejorar la actividad de los anticuerpos terapéuticos para aumentar y prolongar las respuestas de los pacientes.
Se han adoptado muchos enfoques para mejorar la eficacia de los anticuerpos terapéuticos que incluyen conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC, por sus siglas en inglés), conjugados de anticuerpo y toxina (inmunotoxinas) y anticuerpos diseñados con mejores mecanismos efectores, por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada (ADCC, por sus siglas en inglés). A pesar de los mismos esfuerzos, pocas terapias han logrado el éxito clínico y los efectos secundarios, como la toxicidad, siguen siendo un tema clave (Beck, A. Nat. Rev. Drug. Discov. 2017). Así, existe la necesidad de nuevas estrategias para modificar los mAbs para potenciar la eficacia y mejorar los resultados de los pacientes.
El epítopo a-Gal (Gala1,3Gala1,4GlcNAc-R) es un carbohidrato único, producido naturalmente en glucolípidos y glucoproteínas para mostrar múltiples epítopos en oligosacáridos ramificados (J. Immunology(2007), 178 (7), 4676-87). El epítopo alfa-Gal es sintetizado, por ejemplo, por la transferasa alfa1-,3-GT, una enzima conocida por catalizar la síntesis de Gala-1,3-Gal en múltiples sitios de glucosilación (WO 98/34957). Aunque este método es eficiente, la síntesis depende de los sitios de glucosilación existentes o diseñados y solo permite una unidad alfa-Gal por sitio de conjugación.
Por lo tanto, existe una necesidad atractiva de un enfoque modular adecuado para una o múltiples presentaciones de unidades de trisacárido alfa-Gal para aprovechar de manera óptima el sistema inmunitario natural.
Los compuestos de la presente invención comprenden moléculas ligadoras que se han optimizado para controlar y mostrar el número y la posición de los grupos F (es decir, la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano) en relación con la posición del resto de unión L (es decir, el anticuerpo o fragmento del mismo). Por ejemplo, un grupo cíclico rígido tiene la ventaja de proporcionar un andamiaje para el posicionamiento óptimo de uno o más grupos F con respecto a L. Se apreciará que el número exacto y la orientación de los grupos F con respecto a L variarán dependiendo de la naturaleza del grupo L. Asimismo, la presencia del grupo cíclico, que contiene un solo anillo de fenilo, un anillo de bifenilo o un anillo de trifenilo, proporciona la ventaja significativa de presentar múltiples grupos F (es decir, la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano) para potenciar la respuesta inmunitaria resultante del huésped. La presentación química de múltiples grupos de unión se conocía previamente en la técnica, sin embargo, esto se ha logrado usando uno o más grupos de aminoácidos (por ejemplo, consulte el documento WO 2014/178878) o grupos ligadores de ramificación (por ejemplo, consulte el documento US 2014/0112975) en contraste con la presente invención en que se usa un sistema de anillo único de 6 miembros (es decir, fenilo), dos sistemas de anillos de 6 miembros combinados por una unión (bifenilo) o sistemas de anillos de tres miembros combinados por 2 uniones (trifenilo). El efecto técnico de esta distinción es que los compuestos de la presente invención se pueden preparar más fácilmente que los ligadores previamente conocidos en la técnica evitan ventajosamente la presencia de centros quirales y son menos propensos a la degradación por proteasas. En la síntesis de los compuestos de la presente invención tampoco se usan resinas y, por lo tanto, se proporciona la ventaja de ser adecuada para la fabricación farmacéutica a gran escala. Por lo tanto, los compuestos de la invención no solo son terapéuticamente eficaces, sino que proporcionan la ventaja de potenciar la respuesta inmunitaria del huésped y la facilidad y la eficacia de la síntesis con altos rendimientos con escalabilidad. Es más, los ligadores de la presente invención no son lábiles, por lo tanto, típicamente no comprenden componentes de «ligador escindible» como se requiere por muchos compuestos previamente conocidos en la técnica (véase el documento US 8.828.956 , por ejemplo). Asimismo, los ligadores de la presente invención permitieron al experto en la técnica elegir combinaciones de grupos derecha e izquierda específicas con facilidad y eficiencia sintéticas para permitir el número óptimo de grupos F por sitio de conjugación de anticuerpo o fragmento del mismo.
Los fragmentos de anticuerpos monoclonales tales como Fab, Fab', Fab'2, Fab2 , Fab3 , F(ab)2 , Fv, scFv, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, nanocuerpo también son conocidos en el campo de la oncología. Se han informado varias ventajas sobre los mAbs de longitud completa; incluida una mayor penetración en el tumor como resultado de su tamaño más pequeño, una producción más fácil (pueden expresarse en E. coli o levadura, lo que da como resultado una mayor comodidad y una ampliación más eficiente) e inmunogenicidad reducida. Sin embargo, los fragmentos como scFvs o fragmentos Fab pueden sufrir una eficacia reducida en comparación con los mAbs de longitud completa. Por ejemplo, la falta de un dominio Fc en un fragmento Fab elimina el potencial de eficacia impulsada por ADCC, a menudo un componente de la respuesta antitumoral (Nelson, A. L. mAb 2009, 2, 77).
Así, los beneficios de los fragmentos de anticuerpos a menudo se ven contrarrestados por la pérdida de función asociada con ellos. El uso de los ligadores que contienen fenilo de la invención para proporcionar nuevas construcciones en las que se conjuga un número óptimo de restos alfa-Gal con un fragmento de anticuerpo proporciona un nuevo enfoque para potenciar los efectos antitumorales de un fragmento de anticuerpo.
Tanto para mAb como para sus fragmentos, la conjugación específica de sitio controlada es bien conocida en la técnica, por ejemplo, a través de la incorporación de residuos de cisteína adicionales. Este enfoque ofrece varias ventajas, en particular, al permitir la derivatización del mAb o fragmento sin perturbar los epítopos de unión diana y al permitir controlar la carga, es decir, se logra una estequiometría fija (Shen, B. Q. Nat. Biotechnol. 2012, 30, 184). Una limitación de la conjugación específica del sitio es que puede resultar una baja carga del resto conjugado que puede limitar la eficacia. El uso de los ligadores que contienen fenilo de la invención que permiten la presentación de múltiples restos alfa-Gal por sitio de conjugación proporciona un método para lograr proporciones altas de alfa-Gal/anticuerpo (alta carga) incluso cuando el número de sitios de conjugación es bajo.
Definiciones de ligadores
En una realización, S1 representa un espaciador seleccionado de lo siguiente:
-(CH2)a-, en donde uno a cinco (tales como 2, 3 o 5) de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -S-, =N(H)-, -C(=O)-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona (tal como -(CH2)2-NHCO-ciclohexil-CH2-3-pirrolidin-2,5-diona-, -(CH2)2-NHcO-ciclohexil-CH2-3-pirrolidin-2,5-diona-S-(CH2)3-C(=NH)- o -(CH2 )2-NHCO- (CH2 )a-CO-); o
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-, en donde uno a cinco (tal como 2) de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -NHC(O)- o pirrolidin-2,5-diona (tal como -(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-3-pirrolidin-2,5 -diona-).
En una realización adicional, S1 representa un espaciador seleccionado de lo siguiente:
-(CH2)a-, en donde uno a diez de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -O-, -S-, =N(H)-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona (como -(CH2)2-NHCO-ciclohexilo-CH2-pirrolidin-2,5-diona- o-(CH2)2-NHCO-ciclohexil-CH2-pirrolidin-2,5-diona-S-(CH2)3-C(=NH)-).
Se apreciará que a, b, c, d, e, f, g y h se seleccionan para mantener una longitud de ligador adecuada entre los grupos F y L. Los ejemplos de longitudes de ligador adecuadas entre F y L varían de aproximadamente 5 A a aproximadamente 50 A o más de longitud, de aproximadamente 6 A a aproximadamente 45 A, de aproximadamente 7 A a aproximadamente 40 A, de aproximadamente 8 A a aproximadamente 35 A, de aproximadamente 9 A a aproximadamente 30 A, de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A, de aproximadamente 11 A a aproximadamente 20 A, de aproximadamente 12 A a aproximadamente 15 A. Así, en una realización, a, b, c, d, e, f, g y h representan un número entero total no mayor que 45, tal como entre 5 y 45, tal como entre 7 y 42, tal como no mayor que 30, tal como entre 5 y 30, tal como entre 7 y 29.
En una realización, c representa un número entero seleccionado de 1 a 30. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 2 a 30. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 2, 4, 6, 9, 11, 18 o 30. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 6 a 30. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 6, 11, 18 o 30. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 5 a 15. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 6 a 11. En una realización más, a representa un número entero seleccionado de 6, 7 u 11. En otra realización más, a representa un número entero seleccionado de 6. En una realización alternativa, a representa un número entero seleccionado de 7. En una realización alternativa, a representa un número entero seleccionado de 11.
En una realización, b representa un número entero seleccionado de 0 a 3. En una realización más, b representa un número entero seleccionado de 0 o 3. En una realización más, b representa un número entero seleccionado de 1 a 3. En una realización más, b representa un número entero seleccionado de 2 o 3. En otra realización más, b representa un número entero seleccionado de 3.
En una realización, c representa un número entero seleccionado de 1 a 15. En una realización más, c representa un número entero seleccionado de 1 a 12. En una realización más, c representa un número entero seleccionado de 4 a 12. En otra realización más, c representa un número entero seleccionado de 4 o 12. En otra realización más, c representa un número entero seleccionado de 4.
En una realización, d representa un número entero seleccionado de 1 a 15. En una realización más, d representa un número entero seleccionado de 2 a 13. En una realización más, d representa un número entero seleccionado de 2, 5 o 13. En una realización más, d representa un número entero seleccionado de 13. En una realización alternativa, d representa un número entero seleccionado de 3.
En una realización, Y1 representa una unión -C(O)NH- o -C(O)-. En una realización más, Y1 representa -C(O)NH-.
En una realización, S2 representa un espaciador seleccionado de lo siguiente:
-(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)- (tal como -(CH2 )a-NHCO-CH2-, -(CH2 )a-, -(CH2)a-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-, -(CH2)3-NH-CH2- o -(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-); o
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno a tres grupos -C(O)NH- o -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-, -(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-(CH2CH2O)4-NHCO-CH2- o -(CH2)4-NHCO-(CH2)2-(CH2CH2O)4-NHCO-CH2)2-NHCO-CH2-).
En una realización más, S2 representa un espaciador seleccionado de -(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -C(O)NH- o -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-CONH-CH2-, -(CH2)3-NHCO-, -(CH2)3-, -(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2- o -(CH2)3-NH-CH2-) o -(CH2M C H 2-CH2-CH2-O)G-(CH2 )h-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -C(O)NH- o -NHC(O)- (tal como -CH2)3-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2- o -(CH2)4-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-).
En otra realización más, S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2- o -(CH2)3-NHCO-(CH2)a-NHCO-(CH2-); o
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno a tres grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-, -(CH2)3-NHCO-(CH2 )2O)12-(CH2 )2-NHCO-CH2- o -(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-).
En otra realización adicional más, S2 representa un espaciador seleccionado de:
(CH2 )e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)- (tal como -(CH)2)3-NHCO-CH2-); o
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno a tres grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-).
En otra realización adicional más, S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos, tal como uno, de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos, tal como uno, grupos seleccionados de --N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2-).
En otra realización adicional más, S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2); o
-(CH2)r-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )n-, en donde dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-).
En una realización, e representa un número entero seleccionado de 1 a 10. En una realización más, e representa un número entero seleccionado de 3 a 10. En una realización más, e representa un número entero seleccionado de 3, 5, 9 o 10. En una realización más, e representa un número entero seleccionado de 5 a 9. En una realización más, e representa un número entero seleccionado de 5 o 9. En una realización más, e representa un número entero seleccionado de 4 o 10. En una realización adicional más, e representa un número entero seleccionado de 4, 5 o 10. En otra realización adicional más, e representa un número entero seleccionado de 5.
En una realización, f representa un número entero seleccionado de 1 a 8. En una realización más, f representa un número entero seleccionado de 2 a 8. En una realización más, f representa un número entero seleccionado de 2 a 6. En una realización adicional más, f representa un número entero seleccionado de 4 a 8. En una realización adicional más, f representa un número entero seleccionado de 4 u 8. En una realización adicional más, f representa un número entero seleccionado de 4.
En una realización, g representa un número entero seleccionado de 1 a 15. En una realización más, g representa un número entero seleccionado de 4 a 12. En una realización más, g representa un número entero seleccionado de 4 o 12. En una realización más, g representa un número entero seleccionado de 1 a 5. En una realización más, g representa un número entero seleccionado de 1 a 4. En una realización adicional más, g representa un número entero seleccionado de 4.
En una realización, h representa un número entero seleccionado de 1 a 4. En una realización más, h representa un número entero seleccionado de 4.
En una realización, Y2 representa una unión -O- o -NHC(O)-. En otra realización, Y2 representa una unión u -O-. En otra realización más, Y2 representa -O-.
En una realización, m representa un número entero seleccionado de 1 a 4. En una realización más, m representa un número entero seleccionado de 1 a 3. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 1 o 3. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 2 o 3. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 1 o 2. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 1. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 2. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 3. En otra realización más, m representa un número entero seleccionado de 4.
En una realización más, z representa un número entero seleccionado de 1 a 25. En otra realización más, z representa un número entero seleccionado de 1 a 20. En otra realización, z representa un número entero seleccionado de 2 a 20 (tal como 2, 4.9, 5, 7, 8, 10, 11, 14, 15, 17 o 20). En otra realización, z representa un número entero seleccionado de 1 a 8. En una realización más, z representa un número entero seleccionado de 1 a 5. En otra realización más, z representa un número entero seleccionado de 2 a 5. En otra realización más, z representa un número entero seleccionado de 2 o 5. En otra realización más, z representa un número entero seleccionado de 2. En otra realización más, z representa un número entero seleccionado de 5.
En una realización, Cy representa fenilo o bifenilo. En otra realización, Cy representa bifenilo o trifenilo. En otra realización más, Cy representa bifenilo o trifenilo. En otra realización adicional más, Cy representa bifenilo. Según un aspecto más de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I)a o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000009_0001
en donde L representa un resto de unión seleccionado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo;
S1 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)a-, en donde 2, 3 o 5 de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados entre -S-, =N(H)-, -C(=O)- , -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona; o
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-, en donde dos de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -NHC(O) - o pirrolidin-2,5-diona;
a representa un número entero seleccionado de 6, 7 u 11;
b representa un número entero seleccionado de 3;
c representa un número entero seleccionado de 4;
d representa un número entero seleccionado de 3;
S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)-; o -(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2 )h-, en donde dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)-;
e representa un número entero seleccionado de 5;
f representa un número entero seleccionado de 4;
g representa un número entero seleccionado de 4;
h representa un número entero seleccionado de 4;
z representa un número entero seleccionado de 2 a 20;
X1 representa -S- o -N(H)-;
Y1 representa -C(O)NH-;
Y2 representa -O-;
F representa una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano; m representa un número entero seleccionado de 1 o 3; y
Cy representa bifenilo, de tal modo que dicho grupo -Y1-S1-X1-L puede estar presente en cualquiera de dichos anillos fenilo y dicho grupo o grupos [F-S2-Y2]m pueden estar presentes en cualquiera de dichos anillos fenilo. Según un aspecto más de la invención que puede mencionarse, se proporciona un compuesto de fórmula (I)a o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000010_0001
en donde L representa un resto de unión seleccionado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo;
51 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2 )a-, en donde uno a cinco de dichos grupos -CH2-pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -O-, -S-, =N(H)-, - C(O)NH-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona;
a representa un número entero seleccionado de 6 u 11;
52 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2 )e-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2 pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)-; e representa un número entero seleccionado de 5;
z representa un número entero seleccionado de 2 a 5;
X1 representa -S- o -N(H)-;
Y1 representa -C(O)NH-;
Y2 representa -O-;
F representa una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano; m representa un número entero seleccionado de 1 o 3; y
Cy representa bifenilo, de tal modo que dicho grupo -Y1-S1-X1-L puede estar presente en cualquiera de dichos anillos fenilo y dicho grupo o grupos [F-S2-Y2]m pueden estar presentes en cualquiera de dichos anillos fenilo. En una realización más, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) que comprende un compuesto de los Ejemplos 1-26 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización más, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) que es la base libre de un compuesto de los Ejemplos 1-26.
En una realización más, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) que comprende un compuesto de los Ejemplos 1-8 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización más, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) que es la base libre de un compuesto de los Ejemplos 1-8.
Alfa Gal
Las referencias en el presente documento al término «molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano» incluyen restos de azúcar (es decir, carbohidratos) capaces de unirse a un componente de respuesta inmunitaria (es decir, un anticuerpo anti-alfa-galactosil) de dicho ser humano y, en consecuencia, provocar una respuesta inmunitaria en un ser humano. En una realización, dicho anticuerpo anti-alfa-galactosil es un anticuerpo IgG anti-alfa-galactosil o un anticuerpo IgM anti-alfa-galactosil. Los ejemplos de tales moléculas de carbohidrato incluyen compuestos de alfa-galactosil y derivados modificados de los mismos. Otros ejemplos de moléculas de carbohidratos adecuadas incluyen los epítopos de alfa-gal enumerados en el documento US 2012/0003251 como adecuados para su uso en la orientación selectiva y la destrucción de células tumorales. En una realización, F se selecciona de galactosil-alfa-1,3-galactosil-beta-1,4-N-acetilglucosamina, alfa-1,3-galactobiosa, alfa-1,3-beta-1,4-galactotriosa o galilipentasacárido.
En una realización particular, F tiene una estructura como se muestra en una de las siguientes formulas:
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
en donde S2 se refiere al punto de fijación al grupo S2.
En una realización particular, F tiene una estructura como se muestra en la siguiente fórmula:
Figure imgf000011_0003
en donde S2 se refiere al punto de fijación al grupo S2.
Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos
Las referencias en el presente documento a los términos «anticuerpo» o «anticuerpos» se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos, particularmente a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. La inmunoglobulina según la invención puede ser de cualquier clase (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) o subclase (p. ej. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, lgA1 e IgA2) o subclases (isotipos) de molécula de inmunoglobulina (p. ej. IgG en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, o IgA en IgA1 e IgA2).
Dentro del alcance de la presente invención, los términos «anticuerpo» o «anticuerpos» incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena única, biespecíficos, humanos y humanizados, así como fragmentos activos de los mismos. Los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, scFv y Fv, incluidos los productos de una librería de expresión de inmunoglobulina Fab y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término «anticuerpo monoclonal» se refiere a un anticuerpo que es producido en masa en el laboratorio a partir de un solo clon y que reconoce solo un antígeno. Los anticuerpos monoclonales se hacen típicamente fusionando un linfocito B que produce anticuerpos, normalmente de corta duración, con una célula de rápido crecimiento, tal como una célula cancerosa (a veces denominada célula «inmortal»). La célula híbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rápidamente y crea un clon que produce grandes cantidades del anticuerpo. Para el propósito de la presente invención, también se debe entender que «anticuerpo monoclonal» comprende anticuerpos que se producen por un clon madre que aún no ha alcanzado la monoclonalidad completa.
La expresión «anticuerpo quimérico» se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable, es decir, una región de unión, de ratón y al menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, usualmente preparada mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable de ratón y una región constante humana son realizaciones ejemplares. Dichos anticuerpos quiméricos de ratón / ser humano son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina de ratón y segmentos de a Dn que codifican regiones constantes de inmunoglobulina humana. Otras formas de «anticuerpos quiméricos» abarcadas por la presente divulgación son aquellas en las que la clase o subclase se ha modificado o cambiado de la del anticuerpo original. Tales anticuerpos «quiméricos» también se denominan «anticuerpos de clase conmutada». Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican ADN recombinante convencional y técnicas de transfección génica ahora bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patente de EE. UU. n.° 5,202,238 y Patente de EE. UU. n.° 5,204,244.
Como se usa en el presente documento, el término «anticuerpo humanizado» o «versión humanizada de un anticuerpo» se refiere a anticuerpos en los que el marco o las «regiones determinantes de complementariedad» (CDR, por sus siglas en inglés) se han modificado para comprender la CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad en comparación con la de la inmunoglobulina parental. En algunas realizaciones ejemplares, las CDR del VH y el VL se injertan en la región marco del anticuerpo humano para preparar el «anticuerpo humanizado». Véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Las regiones marco variables de cadena pesada y ligera pueden derivar de secuencias de anticuerpos humanos iguales o diferentes. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser secuencias de anticuerpos humanos naturales. Las regiones marco variables de cadenas pesadas y ligeras humanas se enumeran, por ejemplo, en Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000)-Apéndice 1P A.1P.1-A.1P.37 y son accesibles a través de IMGT, el internacional ImMunoGeneTics information System® (http://imgt.cines.fr) o a través de http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk, por ejemplo. Opcionalmente, la región marco puede modificarse mediante mutaciones adicionales. Las CDR ejemplares corresponden a las que representan secuencias que reconocen los antígenos indicados anteriormente para anticuerpos quiméricos. En algunas realizaciones, dicha versión humanizada se quimeriza con una región constante humana. El término «anticuerpo humanizado» tal como se usa en el presente documento también comprende dichos anticuerpos que se modifican en la región constante para generar las propiedades según la divulgación, especialmente en relación con la unión a C1q y/o la unión a FcR, por ejemplo, mediante «conmutación de clase», es decir, cambio o mutación de las partes de Fc (por ejemplo, de IgG1 a IgG4 y/o mutación de IgG1/IgG4).
Como se usa en el presente documento la expresión «anticuerpo humano» incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M. A., y van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). También es posible producir anticuerpos humanizados en ratones transgénicos (por ejemplo, ratón) que son capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena luego de su inmunización. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551­ 2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M. D., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en librerías de presentación de fagos (Hoogenboom, H. R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). También se encuentran disponibles las técnicas de Cole, A., et al. y Boerner, P., et al. para preparar anticuerpos monoclonales humanos (Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Liss, A. R. (1985) p. 77; y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Como ya se ha mencionado, según la divulgación inmediata la expresión «anticuerpo humano» tal como se usa en el presente documento también comprende dichos anticuerpos que se modifican en la región constante para generar las propiedades según la divulgación, por ejemplo, en relación con la unión a C1q y/o la unión a FcR, por ejemplo, mediante «conmutación de clase», es decir, cambio o mutación de las partes de Fc (por ejemplo, de IgG1 a IgG4 y/o mutación de IgG1/IgG4).
Como se usa en el presente documento, «anticuerpo de cadena única» se refiere a moléculas de Fv de cadena única (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están ligados por un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883 o una cadena Fv única biespecífica (WO 03/11161).
Como se usa en el presente documento, el término «anticuerpos biespecíficos» se refiere a anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos diferentes.
Como se usa en el presente documento, el término «fragmentos de anticuerpo» se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, posiblemente un dominio variable del mismo, o al menos un sitio de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen diacuerpos; moléculas de anticuerpos de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Huston, J. S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Los fragmentos de anticuerpos se pueden derivar de un anticuerpo de la presente invención mediante varias técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales purificados pueden escindirse con una enzima, como la pepsina, y someterse a filtración en gel HPLC. La fracción apropiada que contiene fragmentos Fab se puede recoger luego y concentrar mediante filtración por membrana y similares. Para una descripción más detallada de las técnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, véase, por ejemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.
Como se usa en el presente documento, el término «específico» y «específicamente» se usan indistintamente para indicar que otras biomoléculas no se unen significativamente al anticuerpo que se une específicamente a la biomolécula de interés. En algunas realizaciones, el grado de unión a una biomolécula distinta de un péptido que comprende un epítopo dentro de un péptido da como resultado una afinidad de unión insignificante (p. ej., no determinable) por medio de ELISA o una determinación de afinidad.
Por «unión insignificante» se entiende una unión, que es al menos aproximadamente el 85%, particularmente al menos aproximadamente el 90%, más particularmente al menos aproximadamente el 95%, incluso más particularmente al menos aproximadamente el 98%, pero especialmente al menos aproximadamente el 99% y hasta el 100% menos que la unión a un péptido que comprende un epítopo dentro de un péptido.
Como se usa en el presente documento, el término «epítopo» se refiere a un sitio en una molécula diana (por ejemplo, un antígeno, tal como una proteína) a la que se une una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo). Los epítopos pueden formarse tanto a partir de residuos contiguos como no contiguos adyacentes (p. ej., residuos de aminoácidos) de la molécula diana. Los epítopos formados a partir de residuos contiguos (p. ej., residuos de aminoácidos) típicamente también se denominan epítopos lineales. Un epítopo típicamente incluye al menos 5 y hasta aproximadamente 12 residuos, principalmente entre 6 y 10 residuos (p. ej., residuos de aminoácidos).
Como se usa en el presente documento, el término «CDR» se refiere a la región hipervariable de un anticuerpo. Las expresiones «región hipervariable», «HVR» o «HV», cuando se usan en el presente documento, hacen referencia a las regiones del dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Se usa una cantidad de descripciones de regiones hipervariables y se encuentran comprendidas en el presente documento. Las regiones determinantes de complementariedad de Kabat se basan en la variabilidad de la secuencia y son las más usadas comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Las letras «HC» y «LC» que preceden al término «CDR» se refieren, respectivamente, a una CDR de una cadena pesada y una cadena ligera.
Como se usa en el presente documento, los términos «homología» e «identidad» se usan indistintamente. Los cálculos de identidad u homología de secuencia entre secuencias se realizan del siguiente modo.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido o dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean a los efectos de realizar una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para su alineamiento óptimo y a los efectos de la comparación, se pueden obviar las secuencias no homólogas. En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, aún más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70% , 75%, 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Luego, se comparan los residuos aminoácidos o los nucleótidos en posiciones de aminoácido o de nucleótidos correspondientes. Cuando el mismo residuo de aminoácido o nucleótido ocupa una posición en la primera secuencia y la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento, «identidad» de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a «homología» de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesita introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse mediante el uso de un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se incorporó al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna. CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que se debe usar si el médico no está seguro de qué parámetros se deben aplicar para determinar si una molécula está dentro de una limitación de identidad u homología de secuencias de la invención) son una matriz de puntuación BLOSUM 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de cambio de marco de 5.
Alternativamente, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos usando el algoritmo de Meyers et al. (1989) CABIOS 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
Como se usa en el presente documento, el término «sustitución conservativa de aminoácidos» se refiere al reemplazo del residuo aminoácido con otro residuo aminoácido con una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos aminoácidos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales-beta ramificadas (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo murino o un anticuerpo quimérico.
En una realización, el fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de unión a antígeno (Fab) o un fragmento variable de cadena única (scFv). En otra realización, dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y scFv.
Se apreciará que X 1 puede representar cualquier resto de fijación de fragmento de unión a anticuerpo o antígeno adecuado y que la elección de dicho grupo dependerá del residuo de aminoácido seleccionado como punto de fijación dentro del anticuerpo.
En una realización, X 1 representa -S- o -N(H)-. En esta realización, L se conjuga con compuestos de fórmula (I) según una de las tres estructuras siguientes:
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en donde Si y z son como se definen en el presente documento y Ab representa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo terminado con grupos tiol o lisina reactivos. Dichos grupos tiol o cisteína que reaccionan pueden estar disponibles en el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo o pueden introducirse mediante modificaciones específicas del sitio en la cadena peptídica, para proporcionar puntos adicionales de conjugación a través de residuos de aminoácidos diseñados (Nat. Biotechnol. 2008, 925; Nat. Biotechnol. 2012, 184). Alternativamente, los aminoácidos específicos del sitio pueden incorporarse en la cadena peptídica deseada para permitir la reactividad química ortogonal para la conjugación específica del sitio (OPRD (2016), 20, 852-866). Los ejemplos de aminoácidos con reactividad ortogonal incluyen pacetilfenilalanina (pAcPhe, J. Mol. Biol. 2011, 595), para-azidometil-I-fenilalanina (pAMF, Bioconjug. Chem 2014, 351), N6-((2-azidoetoxi)carbonil)-L-lisina (Bioconjug. Chem. 2015, 2249).
Se apreciará que los fragmentos de unión a anticuerpos o antígenos de la presente invención se configurarán para unirse a una diana terapéutica que es una célula cancerosa o un patógeno específico.
En una realización, los fragmentos de unión al anticuerpo o al antígeno están configurados para unirse a una célula cancerosa. En una realización adicional, los fragmentos de unión al anticuerpo o antígeno se unen específicamente a un antígeno asociado a un tumor cuya expresión en la superficie celular en una célula tumoral es diferente a su expresión en una célula sana.
En una realización preferida, el fragmento de unión a anticuerpo o antígeno se une a una diana en una célula cancerosa o patógeno. Las dianas preferidas incluyen: EGf R, HER2, HER3, CD22, EpCAM, PSMA, PSCA, FLT-3, CD30, CD20, CD33, CD23, CD2, CD37, CD25, CD73, CD47, LGR-5, CD80, CD86, CD70, CD74, CD40, CD19, CD79b, CA-125, c-met, CXCR4, DR5, PD-1, PD1L, LeY, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MIP-1A, MIP-1B, KIT, TRAIL receptor (R1 y R2), CXCR4, CEACAM, IGF-1R, anhidrasa carbónica IX, PDGFRa, CD137, CD276, mesotelina, VEGFR, P-cadherina, CD56, Psl bacteriana, lipopolisacárido bacteriano, epítopo galactano-III de LPS bacteriano, PcrV bacteriano, proteína RSV F.
Anticuerpos anti-EGFR
En una realización adicional, el fragmento de unión al anticuerpo o antígeno es un epítopo de unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Es bien sabido que el EGFR se sobreexpresa en varios tipos de cáncer humano. La alta expresión en ciertas células cancerosas hace que EGFR sea una diana atractiva para nuevas terapias. En una realización, el anticuerpo de unión a EGFR o el fragmento de unión a antígeno es un epítopo que se une a cualquiera de la subfamilia de EGFR seleccionada entre: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3) y Her4 (ErbB-4). Los ejemplos de anticuerpos de unión a EGFR adecuados incluyen, entre otros, cetuximab, nimotuzumab, matuzumab, zalutumumab y panitumumab.
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En una realización adicional, el anticuerpo EGFR es cetuximab, un anticuerpo quimérico híbrido de ratón / ser humano que comprende secuencias de cadena tanto pesada como ligera como se divulga en (a) Li et al. (2005) Cáncer Cell 7, 301-11; (b) Dubois et al. (2008) Anal. Chem. 80, 1737-45; y (c) base de datos IMGT disponible en www.imgt.org;www.druqbank.ca o el documento WO 2016/196682.
En otra realización, el anticuerpo de cetuximab o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce y se une específicamente a EGFR y tiene dominios variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos el 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID números: 1 y 2.
En una realización adicional, se pueden seleccionar fragmentos de anticuerpos de unión a EGFR como ejemplos de L. Los ejemplos típicos incluyen, entre otros, cetuximab Fab (Li, S. et al (2005) Cancer Cell 7, 301 -311); cetuximab scFv (US 7,060,808); Panitumumab Fab (Sickmier E. A., et al (2016) PLoSOne 11, 9, e0163366); Panitumumab scFv (US 6,235,883) y D2C7 scFv (US 2013/0022598; Clin Cancer Res 2013, 19(17), 4717-4727).
Anticuerpos anti-CD20
En una realización más, el fragmento de unión a anticuerpo o antígeno es un epítopo de unión a CD20. Se sabe que la eliminación de células que expresan CD20 (por ejemplo, linfocitos B) tiene un beneficio terapéutico en el tratamiento de cánceres hematológicos tales como leucemias y linternas. Los ejemplos de anticuerpos de unión a CD20 adecuados incluyen, entre otros, rituximab, ocrelizumab, ofatumumab y obinutuzumab.
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En una realización más, el anticuerpo CD20 es rituximab, un anticuerpo quimérico híbrido de ratón / ser humano que comprende secuencias de cadena pesada y ligera como se divulga en (a) US 5,736,137, (b) Wang, B. et al (2013) Analyst 138, 3058-3065 y (c) base de datos IMGT disponible en www.imqt.org;www.drugbank.ca. En otra realización, el anticuerpo de cetuximab o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce y se une específicamente a CD20 y tiene dominios variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos el 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID números: 3 y 4.
En una realización adicional, se pueden seleccionar fragmentos de anticuerpos de unión a CD20 como ejemplos de L. Los ejemplos típicos incluyen, entre otros, rituximab Fab (Du, J. et al (2007) J. Biological Chem.
282, 15073-15080).
En una realización adicional, el anticuerpo CD20 o fragmento del mismo se selecciona de rituximab o rituximab Fab.
Dianas de anticuerpos específicos de patógenos
En una realización alternativa, los fragmentos de unión al anticuerpo o al antígeno están configurados para unirse a un patógeno específico. En una realización más, los fragmentos de unión al anticuerpo o al antígeno están configurados para unirse a bacterias S. aureus y Pseudomonas aeruginosa. Los ejemplos de anticuerpos adecuados incluyen, entre otros, los informados en los documentos WO 2015/196011, WO 2012/170807 y WO 2014/074528.
Conjugados
Cualquier anticuerpo o fragmento del mismo divulgado en el presente documento puede conjugarse con los ligadores espaciadores cíclicos descritos en el presente documento que contienen uno o más alfa-Gal. La invención se refiere a la capacidad de elegir el número óptimo de unidades de alfa-Gal por ligador por sitio de conjugación mientras se mantiene la eficacia del anticuerpo o fragmento del mismo. El tipo de conjugación puede ser seleccionado por un experto en la técnica para permitir el mayor rendimiento y pureza del material aislado en función de la funcionalidad terminal del ligador y la reactividad superficial o el sitio reactivo seleccionado del anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la conjugación se facilita mediante la adición de tiol a un resto de maleimida. Alternativamente, la conjugación puede facilitarse mediante la formación de uniones amida entre un grupo amino y un éster activado tal como un éster de NHS.
Cuando un conjugado incluye varios sitios reactivos que conducen a múltiples reacciones de conjugación, debe entenderse que los intervalos antes mencionados pueden referirse al número real o medio de moléculas ligadoras por anticuerpo o fragmento del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término «PLA» (proporción ligador:anticuerpo) se refiere al número real o al número medio de moléculas de ligador que se han conjugado con éxito al anticuerpo o fragmento del mismo. La PLA es equivalente al valor del número entero definido en el presente documento como «z». En la técnica se conocen varios métodos para determinar la carga del ligador. En algunas realizaciones, la PLA se determina mediante la reacción de Mal-vc-PAB-MMAE como una carga útil sustituta para los ligadores y se analiza usando HIC.
Propiedades conjugadas
En cualquiera de las diversas realizaciones descritas en el presente documento, un anticuerpo o fragmento del mismo podrá mantener su eficacia de unión a su diana mientras permita el reclutamiento óptimo de anti-Gal. En una realización, cetuximab mantiene su capacidad para unirse a EGFR mientras se conjuga con un valor medio de hasta cinco, como hasta veinte, en particular, hasta treinta moléculas ligadoras.
En algunas realizaciones, un conjugado de la invención puede exhibir una o más de las siguientes propiedades:
a) Es posible que la conjugación de los ligadores al anticuerpo o fragmento del mismo no altere significativamente la eficacia de unión a la diana sobre la contraparte no conjugada.
b) La conjugación de los ligadores que contienen alfa-Gal puede permitir altos contenidos de PLA sin altos contenidos concomitantes de agregación debido a las propiedades hidrófilas del oligosacárido.
c) La adición de los ligadores que contienen alfa-Gal puede permitir que el anticuerpo o fragmento del mismo sea más estable.
d) Una preferencia por la conjugación de cadena pesada o ligera dependiendo del ligador y/o enfoque de conjugación elegido.
e) La conjugación de un ligador elegido que comprende una gran multiplicidad de unidades de alfa-Gal puede exhibir propiedades óptimas en varios sitios de conjugación con cargas iguales de alfa-Gal.
f) La conjugación de los ligadores con el anticuerpo o fragmento del mismo puede conducir a un perfil farmacocinético mejorado.
Sales y derivados de estas
Una referencia a un compuesto de fórmula (I) y subgrupos del mismo también incluye formas iónicas, sales, solvatos, isómeros (incluyendo isómeros geométricos y estereoquímicos), tautómeros, N-óxidos, ésteres, isótopos y formas protegidas del mismo, por ejemplo, como se indica más adelante; preferiblemente, las sales o tautómeros o isómeros o N-óxidos o solvatos del mismo; y más preferiblemente, las sales o tautómeros o N-óxidos o solvatos del mismo, incluso más preferiblemente las sales o tautómeros o solvatos del mismo. En lo sucesivo, los compuestos y sus formas iónicas, sales, solvatos, isómeros (incluyendo los isómeros geométricos y estereoquímicos), tautómeros, N-óxidos, ésteres, isótopos y formas protegidas de los mismos, tal como se definen en cualquier aspecto de la invención (excepto los compuestos intermedios en procesos químicos) se denominan «compuestos de la invención».
Los compuestos de fórmula (I) pueden existir en forma de sales, por ejemplo, sales de adición de ácido o, en ciertos casos, sales de bases orgánicas e inorgánicas tales como sales de carboxilato, sulfonato y fosfato. Todas estas sales están dentro del alcance de esta invención, y las referencias a compuestos de fórmula (I) incluyen las formas de sal de los compuestos. En una realización, el compuesto de fórmula (I) existe como la sal de fosfato.
Las sales de la presente invención se pueden sintetizar a partir del compuesto original que contiene un resto básico mediante métodos químicos convencionales tales como los métodos descritos en Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, tapa dura, 388 páginas, agosto de 2002. Generalmente, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de base libre de los mismos compuestos con la base o ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se usan medios no acuosos, tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo.
Las sales de adición de ácido (mono- o disales) se pueden formar con un amplia variedad de ácidos, tanto inorgánicos como orgánicos. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen mono- o disales formadas con un ácido seleccionado del grupo que consiste en ácidos acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por ejemplo, L-ascórbico), L-aspártico, bencenosulfónico, benzoico, 4-acetamidobenzoico, butanoico, (+)alcanfórico, alcanforsulfónico, (+)-(1S)-camfor-10-sulfónico, cáprico, caproico, caprílico, cinámico, cítrico, ciclámico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-disulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, fórmico, fumárico, galacárico, gentísico, glucoheptónico, D-glucónico, glucurónico (por ejemplo, D-glucurónico), glutámico (por ejemplo, L-glutámico), a-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, ácidos hidrohálicos (por ejemplo, bromhídrico, clorhídrico, hidriódico), isetiónico, láctico (por ejemplo, (+)-L-láctico, (±)-DL-láctico), lactobiónico, maleico, málico, (-)-L-málico, malónico, (±)-DL-mandélico, metanosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, 1-hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiónico, pirúvico, L-piroglutámico, salicílico, 4-amino-salicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tánico, (+)-L-tartárico, tiociánico, p-toluenosulfónico, undecilénico y valéricos, así como aminoácidos acilados y resinas de intercambio catiónico.
Un grupo particular de sales consiste en las sales formadas a partir de ácido acético, clorhídrico, yodhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítrico, láctico, succínico, maleico, málico, isetiónico, fumárico, bencenosulfónico, toluenosulfónico, metanosulfónico (mesilato), etanosulfónico, naftalenosulfónico, valérico, acético, propanoico, butanoico, malónico, glucurónico y lactobiónico. Una sal particular es la sal hidrocloruro. Otra sal particular es la sal hidrogenosulfato, también conocida como sal hemisulfato.
Las sales incluyen, además, solo a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares.
Cuando los compuestos de la fórmula (I) contienen una función amina, estos pueden formar sales de amonio cuaternario, por ejemplo, mediante reacción con un agente alquilante según procedimientos bien conocidos por el experto. Tales compuestos de amonio cuaternario se encuentran dentro del alcance de la fórmula (I).
Los compuestos de la invención pueden existir como monosales o disales dependiendo del pKa del ácido a partir del cual se forma la sal.
Las formas salinas de los compuestos de la invención son típicamente sales farmacéuticamente aceptables, y se indican ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables en Berge et al., 1977, «Pharmaceutically Acceptable Salts,» J. Pharm. Sci., vol. 66, págs. 1-19. Sin embargo, las sales que no son farmacéuticamente aceptables también pueden prepararse como formas intermedias que después pueden convertirse en sales farmacéuticamente aceptables. Dichas formas de sales no farmacéuticamente aceptables, que pueden ser útiles, por ejemplo, en la purificación o separación de los compuestos de la invención, también forman parte de la invención.
Los expertos en la materia de la química orgánica apreciarán que muchos compuestos orgánicos pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o a partir de los cuales precipitan o cristalizan. Estos complejos son conocidos como «solvatos». Por ejemplo, un complejo con agua se conoce como un «hidrato». Los solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto de la invención están dentro del alcance de la invención.
Los compuestos de fórmula (I) que contienen una función amina también pueden formar N-óxidos. Una referencia en el presente documento a un compuesto de la fórmula (I) que contiene una función amina también incluye el N-óxido.
Cuando un compuesto contiene varias funciones amina, uno o más de un átomo de nitrógeno pueden oxidarse para formar un N-óxido. Son ejemplos particulares de N-óxidos los N-óxidos de una amina terciaria o un átomo de nitrógeno de un heterociclo que contiene nitrógeno.
Los N-óxidos se pueden formar mediante el tratamiento de la amina correspondiente con un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o un perácido (por ejemplo, un ácido peroxicarboxílico), véase, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry, por Jerry March, 4a edición, Wiley Interscience, páginas. Más particularmente, los N-óxidos se pueden hacer mediante el procedimiento de L. W. Deady (Syn. Comm. 1977, 7, 509-514) en el que el compuesto de amina se hace reaccionar con ácido m-cloroperoxibenzoico (mCPBA), por ejemplo, en un disolvente inerte tal como diclorometano.
Se apreciará por los expertos en la materia que ciertos derivados protegidos de compuestos de fórmula (I), que pueden hacerse antes de un paso de desprotección final, pueden no poseer actividad farmacológica como tales, pero, en ciertos casos, pueden administrarse por vía oral o parenteral y después de ello metabolizarse en el organismo para formar compuestos de la invención que son farmacológicamente activos. Por lo tanto, tales derivados pueden describirse como «profármacos». Todos tales solvatos farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención están incluidos dentro del alcance de la invención. Se describen ejemplos de funcionalidad profármaco adecuada para los compuestos de la presente invención en Drugs of Today, volumen 19, número 9, 1983, pág. 499-538 y en Topics in Chemistry, capítulo 31, pág. 306-316 y en «Design of Prodrugs» por H. Bundgaard, Elsevier, 1985, capítulo 1. Además, los expertos en la materia apreciarán que ciertos restos, conocidos por los expertos en la materia como «prorrestos», por ejemplo, como describe H. Bundgaard en «Design of Prodrugs», pueden ponerse en funcionalidades apropiadas cuando tales funcionalidades están presentes dentro de los compuestos de la invención.
También se incluyen dentro del alcance del compuesto y diversas sales de la invención los polimorfos del mismo.
Los compuestos de fórmula (I) pueden existir en una serie de formas isoméricas geométricas diferentes, y las formas tautoméricas y las referencias a los compuestos de fórmula (I) incluyen todas tales formas. Para evitar dudas, cuando un compuesto puede existir en una de varias formas isoméricas geométricas o tautoméricas y solo una se describe o muestra específicamente, todas las demás se abarcan, sin embargo, por la fórmula (I).
La presente invención incluye todos los compuestos de la invención marcados de manera isotópica farmacéuticamente aceptables, es decir, compuestos de fórmula (I), en donde uno o más átomos se reemplazan por átomos que tienen el mismo número atómico, pero una masa atómica o un número másico diferente de la masa atómica o el número másico que usualmente se encuentran en la naturaleza.
Los ejemplos de isótopos adecuados para su inclusión en los compuestos de la invención comprenden isótopos de hidrógeno, tales como 2H (D) y 3H (T), carbono, tales como 11C, 13C y 14C, flúor, tales como 18F, nitrógeno, tales como 13N y 15N, oxígeno, tales como 15O, 17O y 18O.
Determinados compuestos marcados isotópicamente de fórmula (I), por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución en tejido de sustrato y/o fármaco. Los compuestos de fórmula (I) también pueden tener propiedades de diagnóstico valiosas, ya que se pueden usar para detectar o identificar la formación de un complejo entre un compuesto marcado y otras moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o receptores. Los métodos de detección o identificación pueden usar compuestos que están marcados con agentes marcadores tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas (por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, acuorina y luciferasa), etc. Los isótopos radiactivos tritio, es decir,3H (T), y carbono-14, es decir, 14C, son particularmente útiles para esta finalidad en vista de su facilidad de incorporación y medios rápidos de detección.
La sustitución por isótopos más pesados tales como deuterio, es decir2H (D) puede ofrecer algunas ventajas terapéuticas resultantes de su mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, vida media in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos y, por ello, pueden preferirse en algunas circunstancias.
La sustitución con isótopos emisores de positrones, tales como 11C, 18F, 15O y 13N, puede ser útil en estudios de tomografía de emisión de positrones (TEP) para examinar la ocupación de diana.
Los compuestos marcados isotópicamente de fórmula (I) generalmente se pueden preparar mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a los descritos en los Ejemplos y Preparaciones adjuntos usando reactivos marcados isotópicamente apropiados en lugar del reactivo no marcado empleado anteriormente.
Métodos para la preparación de compuestos de fórmula (I)
En esta sección, como en todas las demás secciones de la presente solicitud, a menos que el contexto indique lo contrario, las referencias a la fórmula (I) también incluyen todos los demás subgrupos y ejemplos de los mismos tal como se definen en el presente documento.
Los compuestos pertenecientes a la invención descrita en el presente documento se pueden preparar en una secuencia sintética escalonada como se ilustra en los Procesos y Esquemas a continuación. Las síntesis implican la preparación de varias construcciones centrales que luego permiten la elección de la ramificación y la longitud del ligador con el que conectar los dos restos de unión. Los compuestos de fórmula (I) se pueden preparar según métodos sintéticos bien conocidos por el experto. Por ejemplo, un experto en la materia apreciará que las etapas químicas y la elección de grupos protectores se pueden gestionar en cualquier orden para permitir el éxito sintético.
En algunas realizaciones, un compuesto de fórmula (A) puede comprender un ligador (Sb) que comprenda uno o más componentes ligadores. Los ejemplos de componentes ligadores incluyen, entre otros, 6-maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP), valina-citrulina (vc) alanina-fenilalanina (Ala-Phe), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) y 1-carboxilato de 4-(n-maleimidometil)ciclohexano (SMCC).
En algunas realizaciones, un compuesto de fórmula (A) puede comprender un ligador (SB) que pueda reaccionar con un tiol libre en un anticuerpo para formar una unión covalente. Los compuestos de la invención contemplan expresamente, entre otros, conjugados de anticuerpos preparados con reactivos ligadores: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SlAB, SMCC, SMPB, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB y SVSB. Otros grupos funcionales además de la pirrolidin-2,5-diona (maleimida) que son reactivos con un grupo tiol en un anticuerpo incluyen yodoacetamida, bromocetamida, disulfuro de vinilpiridina, disulfuro de piridilo, isocianato, isotiocianato, ésteres activados, cloruros de sulfonilo y cloruros de ácido.
En algunas modalidades, un ligador tiene una funcionalidad que puede reaccionar con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrofílicos ejemplares incluyen, entre otros, grupos aldehído, cetona y carbonilo. Adicionalmente, un heteroátomo de la funcionalidad reactiva del ligador puede reaccionar con un grupo electrófilo de un anticuerpo. Los ejemplos típicos incluyen, entre otros, hidrazina, oxima, amina, hidrazida, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
En algunas realizaciones, un compuesto de fórmula (A) puede comprender un ligador (Sb) que pueda reaccionar con una amina libre en un anticuerpo para formar una unión covalente. Los compuestos de la invención contemplan expresamente entre otros conjugados de anticuerpos preparados usando agentes activadores de ácido carboxílico tales como: N-hidroxisuccinimida (NHS), tetrafluoroborato de 2-succinimido-1,1,3,3-tetra-metiluronio (TSTU), y hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP).
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (I) como se definió anteriormente en el presente documento que comprende:
(a) preparar un compuesto de fórmula (IA) en donde X1 representa -S- haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (III) en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno contiene al menos un grupo tiol reactivo con un compuesto de fórmula (II) en donde S1 termina con maleimida:
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en donde F, S2, Y2, m, z, Cy, Y1 y S1 son como se definieron anteriormente; o
(b) preparar un compuesto de fórmula (IC) en donde X 1 representa -NH2 y S1 contiene -S-CH2-CH2-CH2-C(=NH)-, haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IIIA) en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno contiene al menos un grupo tiol reactivo con un compuesto de fórmula (II) en donde S1 termina con maleimida:
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en donde F, S2, Y2, m, z, Cy, Yi, S, y L son como se definieron anteriormente; o
(c) preparar un compuesto de fórmula (IB) en donde X 1 representa -NH2 haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IIB) en donde S1 termina con un grupo N-hidroxisuccinimida con compuestos de fórmula (IIIB) en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno contiene al menos un grupo amino reactivo:
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en donde F, S2, Y2, m, z, Cy, Y1, S1 y L son como se definieron anteriormente; y/o
(d) interconvertir un compuesto de fórmula (I) o derivado protegido del mismo en un compuesto adicional de fórmula (I) o derivado protegido del mismo.
Los procesos (a) y (b) típicamente comprenden una reacción de tiol-maleimida; una reacción de adición de Michael de un grupo tiol reactivo con una cetona a, p-insaturada como la maleimida.
Las condiciones preferidas comprenden la incubación de los compuestos intermedios ligador-maleimida con anticuerpos o fragmentos de los mismos que contienen un tiol reactivo, en un tampón adecuado como se describe en el presente documento a temperatura ambiente. Las proporciones típicas de ligador:anticuerpo (PLA) dependen del número de grupos tiol libres presentes en el anticuerpo o fragmento del mismo, pero típicamente están entre 2-8.
El proceso (c) típicamente comprende una reacción de formación de uniones amida en presencia de un éster activado. Las condiciones típicas comprenden la incubación del ligador-éster de NHS con anticuerpos o fragmentos de los mismos que contienen un amino reactivo, en un tampón adecuado a temperatura ambiente. Las proporciones típicas de ligador:anticuerpo (PLA) dependen del número de grupos amino libres presentes en el anticuerpo o fragmento del mismo, pero típicamente están entre 2-20.
El proceso (d) comprende típicamente procedimientos de interconversión conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, en compuestos de fórmula (I), un primer sustituyente puede convertirse mediante métodos conocidos por un experto en la materia en un segundo sustituyente alternativo. Es conocido por un experto en la materia un amplio intervalo de interconversiones de grupos funcionales bien conocidos para convertir un compuesto precursor en un compuesto de fórmula (I) y se describen en Advanced Organic Chemistry por Jerry March, 4a edición, John Wiley & Sons, 1992. Por ejemplo, las posibles funcionalizaciones catalizadas por metal tales como el uso de reactivos de organoestaño (la reacción de Stille), reactivos de Grignard y reacciones con nucleófilos de nitrógeno se describen en 'Palladium Reagents and Catalysts' [Jiro Tsuji, Wiley, ISBN 0-470-85032-9] y Handbook of OrganoPalladium Chemistry for Organic Synthesis [volumen 1, editado por Ei-ichi Negishi, Wiley, ISBN 0-471-31506-0].
Si procede, las reacciones descritas anteriormente en los procedimientos (a), (b) y (c) van seguidas o precedidas de una o más reacciones conocidas por el experto en la materia y se realizan en un orden apropiado para conseguir las sustituciones requeridas definidas anteriormente, para proporcionar otros compuestos de fórmula (I). Los ejemplos no limitantes de tales reacciones cuyas condiciones pueden encontrarse en la literatura incluyen:
protección de funciones reactivas,
desprotección de funciones reactivas,
halogenación,
deshalogenación,
desalquilación,
alquilación y arilación de amina, anilina, alcohol y fenol,
reacción de Mitsunobu en grupos hidroxilo,
reacciones de cicloadición en grupos apropiados,
reducción de nitro, ésteres, ciano, aldehídos,
reacciones de acoplamiento catalizadas por metales de transición,
acilación,
sulfonilación/introducción de grupos sulfonilo,
saponificación/hidrólisis de grupos éster,
amidificación o transesterificación de grupos éster,
esterificación o amidificación de grupos carboxílicos,
intercambio de halógenos,
sustitución nucleofílica con amina, tiol o alcohol,
aminación reductora,
formación de oxima en grupos carbonilo e hidroxilamina,
S-oxidación,
N-oxidación,
salificación.
Los compuestos de fórmula (III) pueden contener al menos un grupo tiol reactivo disponible para la reacción. La generación del grupo tiol reactivo puede lograrse mediante la reducción del fragmento de unión al anticuerpo o al antígeno con TCEP.
Las condiciones preferidas comprenden 1.1 eq de TCEP:Ab, 4.2 eq de TCEP:Ab u 8 eq de TCEP:Ab.
Alternativamente, la generación de grupos tiol reactivos puede lograrse mediante la reacción de al menos un residuo de lisina en el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno con un agente tiolante como el reactivo de Traut (2-iminotiolano).
Las condiciones preferidas comprenden 12.2 eq de 2-iminotiolano:Ab para PLA baja y 30.5 eq de 2-iminotiolano:Ab para PLA alta.
Los compuestos de fórmula (II) y (IIB) se pueden preparar según los métodos descritos en el Esquema 1 a partir de compuestos de fórmula (V) y (VI), seguido de reacción con 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) o di(N-succinimidil)glutarato (DSG):
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en donde PG es un grupo protector tal como monometoxitritilo; Si termina con maleimida o NHS, Yi es CONH y S2, Y2, m, Cy y F son como se definieron anteriormente.
Los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula (IV), interconversión de un grupo amino terminal en un grupo maleimido reactivo. Las condiciones preferidas comprenden la reacción del grupo amino terminal con 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) en DMSO a temperatura ambiente. Alternativamente, los compuestos de fórmula (IIB) pueden prepararse a partir de compuestos de fórmula (IV) mediante la interconversión de un grupo amino terminal en un grupo NHS reactivo. Las condiciones preferidas comprenden la reacción con el reticulante di-(N-succinimidil)glutarato en un disolvente orgánico anhidro adecuado tal como DMF y DMSO o una combinación de los mismos.
Los compuestos de fórmula (IV) se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula (V) y (VI), según las etapas del proceso (iii) y (iv), y la etapa de formación de uniones amida seguido de una etapa de desprotección adecuada. Una etapa de formación de unión amida típica comprende la activación de un ácido carboxílico con reactivos que contienen fosfato, reactivos a base de triazina o reactivos que contienen carbodiimida en presencia de una base orgánica en un disolvente orgánico. Las condiciones preferidas comprenden HATU (hexafluorofosfato de 3-óxido de (1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio) con trietilamina o diispropiletilamina en DMF o una mezcla de DMF y DMSO. Cuando PG comprende monometoxitritilo, la reacción de desprotección está mediada por ácido. Las condiciones preferidas comprenden HCl acuoso 0.2 M a temperatura ambiente.
Los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar según los métodos descritos en el Esquema 1A a partir de compuestos de fórmula (VA), seguido de reacción con 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC):
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en donde PG es un grupo protector tal como monometoxitritilo; S i termina con maleimida, Y i es CONH y S2 , Y2 , m, Cy, y F son como se definieron anteriormente.
Los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula (VA) y (VI) según las etapas del proceso (iii) y (iv) como se describió previamente en el Esquema 1. La interconversión del grupo amino terminal en un grupo maleimido reactivo puede lograrse como se describe para la etapa (ii) del proceso en el Esquema 1 usando SMCC.
Los compuestos de fórmula (V) y (VA) (en donde S2 termina con -NHCO-CH2-) se pueden preparar según los métodos descritos en el Esquema 2 a partir de compuestos de fórmula (VIII), (IX) y (IXA).
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en donde m, Cy, Si, S2 y F son como se definieron anteriormente, PGi es un grupo protector que comprende terc-butilo, metilo, etilo o bencilo y PG2 es un grupo protector ortogonal que comprende metilo, etilo o tercbutilo.
Los compuestos de fórmula (V), (IXA) y (VA) se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula (IX) según las etapas (iii) y (iv) del proceso, y la etapa de formación de uniones amida seguida de una reacción de desprotección adecuada. Cuando PG comprende bencilo, la reacción de desprotección está mediada por hidrogenación catalítica. Las condiciones preferidas comprenden el 10% de Pd/C en MeOH/EtOH o agua o cualquier combinación de los mismos en una atmósfera de hidrógeno (entre 103 kPa [15 psi]-483 kPa [70 psi]). Alternativamente, la desprotección puede estar mediada por una reacción de transferencia de fase. Las condiciones preferidas comprenden TEA y agua a temperatura ambiente durante 16 horas.
Cuando PG comprende metilo, etilo o terc-butilo, se emplea una reacción de desprotección mediada por ácido o base según lo requiera el grupo protector. Cuando se requieren condiciones de desprotección mediada por ácido, las condiciones preferidas comprenden TFA, HCl 4 M en dioxano o HCl al 37% en agua con un codisolvente de DCM o agua según sea necesario. Cuando se requieren condiciones mediadas por bases, las condiciones preferidas comprenden hidróxido de sodio o de litio en medios acuosos tales como metanol o THF con agua.
Los compuestos de fórmula (IX) se pueden preparar según los métodos descritos en el Esquema 3 a partir de compuestos de fórmula (XI) y (XII).
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en donde m y Cy son como se definieron anteriormente, PG1 es un grupo protector que comprende terc-butilo, metilo, etilo o bencilo, PG2 es un grupo protector ortogonal que comprende metilo, etilo o terc-butilo y X es Cl, Br o I.
Los compuestos de fórmula (IX) se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula (XI) y (XII) según la etapa (v) del proceso, una reacción de alquilación. Las condiciones típicas comprenden una base inorgánica en un disolvente orgánico polar a temperatura ambiente. Las condiciones preferidas comprenden carbonato de potasio en DMF.
Cuando Cy es bifenilo, o trifenilo, los compuestos de fórmula (XI) se pueden preparar mediante el empleo de una reacción de Suzuki para construir la unidad bi/trifenilo. Las condiciones preferidas comprenden complejo de tetrakistrifenilfosfina paladio (0) o [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) con diclorometano con carbonato de sodio, acetato de potasio o bicarbonato de sodio en dioxano y agua a una temperatura de 100­ 110 °C. Cuando se emplean los grupos protectores requeridos adecuados, tales como t Bs , tales grupos protectores pueden desprotegerse usando una desprotección mediada por fluoruro. Las condiciones preferidas comprenden TBAF en THF a temperatura ambiente.
Alternativamente, en donde Cy es bi/trifenilo, los compuestos de fórmula (XI) pueden prepararse directamente mediante el empleo de una reacción de Suzuki para construir la unidad bi/trifenilo usando las condiciones descritas anteriormente y en el presente documento.
Los compuestos de fórmula (III), (IIIA), (IIIB), (VI), (VIII), (XII), (VII) y (X) están disponibles comercialmente o se preparan según los métodos descritos en el presente documento.
Un experto en la técnica apreciará que se puede elegir la combinación apropiada de etapas descritas anteriormente para generar los rendimientos más altos para los Ejemplos y las Preparaciones descritos en el presente documento.
Composiciones farmacéuticas
Si bien es posible administrar el compuesto de fórmula (I) solo, es preferible presentarlo como una composición farmacéutica (por ejemplo, formulación).
Así, según un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica y métodos para hacer una composición farmacéutica que comprenda (por ejemplo, mezclar) al menos un compuesto de la invención junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y de manera opcional otros agentes terapéuticos o profilácticos, como se describe en el presente documento. Se apreciará que cuando la composición farmacéutica comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales, dichos agentes pueden comprender compuestos diferentes adicionales de fórmula (I).
El excipiente o los excipientes farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar, por ejemplo, de portadores (por ejemplo, un portador sólido, líquido o semisólido), adyuvantes, diluyentes, rellenos o agentes voluminizadores, agentes granulantes, agentes de recubrimiento, agentes controladores de la liberación, agentes aglutinantes, disgregantes, agentes lubricantes, conservantes, antioxidantes, agentes tamponadores, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes aromatizantes, edulcorantes, agentes enmascarantes del sabor, estabilizantes o cualquier otro excipiente usado convencionalmente en composiciones farmacéuticas. A continuación, se exponen con más detalle ejemplos de excipientes para diversos tipos de composiciones farmacéuticas.
La expresión «farmacéuticamente aceptable» como se usa en el presente documento se refiere a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, ser humano) sin una toxicidad excesiva (es decir, generalmente reconocidos como seguros (GRAS)), irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, proporcional a una proporción beneficio/riesgo correspondiente razonable. Cada portador, excipiente, etc. también debe ser «aceptable» en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación.
Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la invención se pueden formular según técnicas conocidas, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, EE. UU.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma adecuada para administración parenteral, intranasal, intrabronquial, sublingual, oftálmica, ótica, rectal, intravaginal o transdérmica. Cuando las composiciones están destinadas a la administración parenteral, se pueden formular para la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o para el suministro directo en un órgano o tejido diana mediante inyección, perfusión u otros medios de suministro. El suministro puede realizarse mediante inyección en bolo, perfusión a corto plazo o perfusión a largo plazo y puede realizarse mediante suministro pasivo o mediante la utilización de una bomba de perfusión o un controlador de jeringa adecuados.
Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, codisolventes, agentes tensioactivos, mezclas de disolventes orgánicos, agentes de complejación de ciclodextrina, agentes emulsionantes (para formar y estabilizar formulaciones de emulsión), componentes liposómicos para formar liposomas, polímeros gelificables para formar geles poliméricos, protectores de liofilización y combinaciones de agentes para, entre otras cosas, estabilizar el principio activo en una forma soluble y dar la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral también pueden tomar la forma de suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes (R. G. Strickly, Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, vol. 21(2) 2004, páginas 201-230).
Las formulaciones se pueden presentar en contenedores de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas, viales y jeringas precargadas, y se pueden almacenar en un estado deshidratado por congelación (liofilizado) que solo requiere la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso.
La formulación farmacéutica se puede preparar liofilizando un compuesto de la invención. Liofilización se refiere al procedimiento de deshidratación de una composición mediante congelación. Por lo tanto, deshidratación por congelación y liofilización se usan en el presente documento como sinónimos.
Las disoluciones y suspensiones de inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para inyección parenteral también pueden comprender disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, así como polvos estériles para reconstitución en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso.
Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de maíz o aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales espesantes o de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Las composiciones de la presente invención también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes para ajustar la tonicidad tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realización preferida de la invención, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para la administración i. v., por ejemplo, mediante inyección o perfusión. Para la administración intravenosa o subcutánea, la disolución se puede dosificar tal como está, o se puede inyectar en una bolsa de perfusión (que contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina al 0.9% o dextrosa al 5%), antes de la administración.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para la administración subcutánea (s. c.).
El compuesto de la invención puede formularse con un portador y administrarse en forma de nanopartículas, ayudando la superficie aumentada de las nanopartículas a su absorción. Es más, las nanopartículas ofrecen la posibilidad de penetración directa en la célula. Los sistemas de suministro de fármacos en nanopartículas se describen en Nanoparticle Technology for Drug Delivery», editado por Ram B Gupta and Uday B. Kompella, Informa Healthcare, ISBN 9781574448573, publicado el 13 de marzo de 2006. Las nanopartículas para suministro de fármacos también se describen en J. Control. Release, 2003, 91 (1-2), 167-172 y en Sinha et al., Mol. 1 de agosto, (2006) 5, 1909.
Las composiciones farmacéuticas comprenden típicamente de aproximadamente el 1% (p/p) a aproximadamente el 95% (p/p) de principio activo y del 99% (p/p) al 5% (p/p) de un excipiente farmacéuticamente aceptable o combinación de excipientes. Preferiblemente, las composiciones comprenden de aproximadamente el 20% (p/p) a aproximadamente el 90% (p/p) de principio activo y del 80% (p/p) al 10% de un excipiente o combinación de excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 95%, preferiblemente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 90% de principio activo. Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden estar, por ejemplo, en forma de dosis unitaria, tal como en forma de ampollas, viales, supositorios, jeringas precargables, grageas, comprimidos o cápsulas.
El excipiente o los excipientes farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar según la forma física deseada de la formulación y, por ejemplo, se seleccionan de diluyentes (por ejemplo, diluyentes sólidos tales como rellenos o agentes voluminizantes; y diluyentes líquidos tales como disolventes y codisolventes), disgregantes, agentes tamponadores, lubricantes, agentes auxiliares de flujo, agentes controladores de la liberación (por ejemplo, polímeros o ceras retrasantes o retardantes de la liberación), aglutinantes, agentes granulantes, pigmentos, plastificantes, antioxidantes, conservantes, agentes aromatizantes, agentes enmascarantes del sabor, agentes de ajuste de la tonicidad y agentes de recubrimiento.
El experto tendrá la experiencia para seleccionar las cantidades apropiadas de ingredientes para su uso en las formulaciones. Por ejemplo, los comprimidos y las cápsulas típicamente contienen del 0-20% de disgregantes, del 0-5% de lubricantes, del 0-5% de agentes auxiliares de flujo y/o del 0-99% (p/p) de rellenos y/o agentes voluminizantes (dependiendo de la dosis del fármaco). También pueden contener del 0-10% (p/p) de aglutinantes poliméricos, del 0-5% (p/p) de antioxidantes, del 0-5% (p/p) de pigmentos. Los comprimidos de liberación lenta contienen, además, del 0-99% (p/p) de polímeros de control de la liberación (dependiendo de la dosis). Los recubrimientos de película del comprimido o cápsula típicamente contienen del 0-10% (p/p) de polímeros, del 0-3% (p/p) de pigmentos y/o del 0-2% (p/p) de plastificantes.
Las formulaciones parenterales o subcutáneas típicamente contienen del 0-20% (p/p) de tampones, del 0-50% (p/p) de codisolventes y/o del 0-99% (p/p) de agua para inyección (API) (dependiendo de la dosis y si se deshidrata por congelación). Las formulaciones para depósitos intramusculares también pueden contener del 0-99% (p/p) de aceites.
Los compuestos de la invención también se pueden formular como dispersiones sólidas. Las dispersiones sólidas son fases dispersas homogéneas extremadamente finas de dos o más de sólidos. Las disoluciones sólidas (sistemas de dispersión molecular), un tipo de dispersión sólida, son bien conocidas para su uso en tecnología farmacéutica (véase (Chiou y Riegelman, J. Pharm. Sci., 60, 1281-1300 (1971)) y son útiles para aumentar las tasas de disolución y aumentar la biodisponibilidad de fármacos poco solubles en agua.
Las formulaciones farmacéuticas se pueden presentar a un paciente en «paquetes para pacientes» que contienen todo un plan de tratamiento en un solo envase, usualmente un paquete blíster. Los paquetes tienen una ventaja sobre las prescripciones tradicionales, en las que un farmacéutico divide el suministro de un paciente de un producto farmacéutico a partir de un suministro a granel, por que el paciente siempre tiene acceso al prospecto contenido en el paquete, normalmente ausente en las prescripciones de los pacientes. Se ha demostrado que la inclusión de un prospecto mejora el cumplimiento del paciente con las instrucciones del médico. Un ejemplo de un paquete para pacientes incluye una jeringa precargada. Tales jeringas precargadas ya contienen la sustancia farmacéutica. La porción frontal de una jeringa precargada a la que se va a fijar una aguja está sellada con una tapa de boquilla. Antes de la inyección, la tapa de la boquilla se retira de la porción frontal y se fija una aguja a la misma. Luego se desliza una junta empujando una varilla de émbolo hacia la porción frontal de modo que se expulse el fármaco.
Las composiciones para suministro nasal incluyen ungüentos, cremas, pulverizaciones, parches, geles, gotas e insertos líquidos (por ejemplo, insertos intraoculares). Tales composiciones se pueden formular según métodos conocidos.
Los ejemplos de formulaciones para administración rectal o intravaginal incluyen pesarios y supositorios que pueden estar, por ejemplo, formados a partir de un material conformable moldeable o ceroso que contiene el compuesto activo. También se pueden usar disoluciones del compuesto activo para administración rectal.
Las composiciones para administración por inhalación pueden adoptar la forma de composiciones en polvo inhalables o pulverizaciones líquidas o en polvo, y pueden administrarse en forma estándar usando dispositivos inhaladores de polvo o dispositivos dispensadores de aerosol. Tales dispositivos son ampliamente conocidos. Para la administración por inhalación, las formulaciones en polvo típicamente comprenden el compuesto activo junto con un diluyente sólido inerte en polvo tal como lactosa.
El compuesto de la invención generalmente se presentará en forma farmacéutica unitaria y, como tal, típicamente contendrá suficiente compuesto para proporcionar el grado deseado de actividad biológica. Por ejemplo, una formulación puede contener de 1 nanogramo a 2 gramos de principio activo, p. ej., de 1 nanogramo a 2 miligramos de principio activo. Dentro de los mismos intervalos, los subintervalos particulares del compuesto son 0.1 miligramos a 2 gramos de principio activo (más usualmente de 10 miligramos a 1 gramo, por ejemplo, 50 miligramos a 500 miligramos), o 1 microgramo a 20 miligramos (por ejemplo, 1 microgramo a 10 miligramos, por ejemplo, 0.1 miligramos a 2 miligramos de principio activo).
El compuesto activo se administrará a un paciente que lo necesite (por ejemplo, un paciente humano o animal) en una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado.
Usos terapéuticos
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I) como se define en el presente documento para su uso en terapia.
Se apreciará que el uso terapéutico de los compuestos de la invención está determinado por la selección del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
Por ejemplo, en la realización cuando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo EGFR (por ejemplo, cetuximab o nimotuzumab) o un fragmento del mismo, el compuesto de fórmula (I) es para uso en el tratamiento del cáncer.
Así, según otro aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I) como se define en el presente documento, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo EGFR (p. ej., cetuximab o nimotuzumab) o un fragmento del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer.
Asimismo, en la realización cuando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo específico de patógeno o un fragmento del mismo, el compuesto de fórmula (I) es para uso en el tratamiento de una infección bacteriana.
Así, según otro aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I) como se define en el presente documento, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo específico de patógeno o un fragmento del mismo, para usar en la tratamiento de una infección bacteriana.
El compuesto de la invención generalmente se administra a un sujeto que necesita tal administración, por ejemplo, un paciente humano o animal, preferiblemente un ser humano.
El compuesto de la invención se administrará típicamente en cantidades que sean terapéutica o profilácticamente útiles y que generalmente no sean tóxicas. Sin embargo, en ciertas situaciones (por ejemplo, en el caso de enfermedades potencialmente mortales), los beneficios de administrar un compuesto de la invención pueden compensar las desventajas de cualquier efecto tóxico o efectos secundarios, en cuyo caso puede considerarse deseable administrar un compuesto de la invención en cantidades que estén asociadas con un grado de toxicidad.
El compuesto de la invención puede administrarse durante un período prolongado (es decir, administración crónica) para mantener efectos terapéuticos beneficiosos o puede administrarse solo durante un período corto (es decir, administración aguda). Alternativamente, se pueden administrar de manera continua o de una manera que proporcione dosis intermitente (por ejemplo, de manera pulsátil).
Una dosis diaria típica del compuesto de la invención puede estar en el intervalo de 100 picogramos a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal, más típicamente de 5 nanogramos a 25 miligramos por kilogramo de peso corporal, y más habitualmente de 10 nanogramos a 15 miligramos por kilogramo (por ejemplo, de 10 nanogramos a 10 miligramos, y más típicamente de 1 microgramo por kilogramo a 20 miligramos por kilogramo, por ejemplo, de 1 microgramo a 10 miligramos por kilogramo) por kilogramo de peso corporal, aunque se pueden administrar dosis más altas o más bajas cuando sea necesario. El compuesto de la invención puede administrarse diariamente o de forma repetida cada 2, o 3, o 4, o 5, o 6, o 7, o 10 o 14, o 21, o 28 días, por ejemplo. Alternativamente, el compuesto de la invención se puede administrar mediante perfusión, múltiples veces al día.
El compuesto de la invención se puede administrar en un intervalo de dosis, por ejemplo, de 1 mg a 1500 mg, de 2 mg a 800 mg o de 5 mg a 500 mg, por ejemplo, de 2 mg a 200 mg o de 10 mg a 1000 mg, incluyendo ejemplos particulares de dosis 10 mg, 20 mg, 50 mg y 80 mg. El compuesto de la invención se puede administrar una o más veces al día. El compuesto de la invención se puede administrar continuamente (es decir, tomarse todos los días sin interrupción durante la duración del tratamiento). Alternativamente, el compuesto de la invención se puede administrar de forma intermitente (es decir, tomarse de forma continua durante un período dado, tal como una semana, luego suspenderse durante un período, tal como una semana, y luego tomarse de forma continua durante otro período, tal como una semana y así sucesivamente, durante toda la duración del tratamiento). Los ejemplos de tratamiento que implican administración intermitente incluyen regímenes en donde la administración se realiza en ciclos de una semana sí, una semana no; o dos semanas sí, una semana no; o tres semanas sí, una semana no; o dos semanas sí, dos semanas no; o cuatro semanas sí, dos semanas no; o una semana sí, tres semanas no- durante uno o más ciclos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más ciclos.
En un programa de dosificación particular, a un paciente se le dará una perfusión de un compuesto de la invención durante períodos de una hora diaria durante hasta diez días, en particular, hasta cinco días durante una semana, y el tratamiento se repetirá en un intervalo deseado tal como de dos a cuatro semanas, en particular, cada tres semanas.
Más particularmente, a un paciente se le puede dar una perfusión de un compuesto de la invención durante períodos de una hora diaria durante 5 días y el tratamiento se repite cada tres semanas.
En otro programa de dosificación particular, a un paciente se le da una perfusión durante 30 minutos a 1 hora seguida de perfusiones de mantenimiento de duración variable, por ejemplo, de 1 a 5 horas, por ejemplo, 3 horas.
En un programa de dosificación particular adicional, a un paciente se le da una perfusión continua durante un período de 12 horas a 5 días, y, en particular, una perfusión continua de 24 horas a 72 horas.
En última instancia, sin embargo, la cantidad de compuesto de la invención administrada y el tipo de composición usada serán proporcionales a la naturaleza de la enfermedad o afección fisiológica que se esté tratando y estarán a discreción del médico.
Se apreciará que el compuesto de la invención puede usarse como un único agente o en combinación con otros agentes terapéuticos. Se pueden realizar experimentos de combinación, por ejemplo, como se describe en Chou TC, Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regulat 1984; 22: 27-55.
Cuando el compuesto de la invención se administra en politerapia con otro, otros dos, tres, cuatro o más agentes terapéuticos (preferiblemente uno o dos, más preferiblemente uno), los agentes se pueden administrar simultánea o secuencialmente. En este último caso, los dos o más agentes se administrarán dentro de un período y en una cantidad y manera que sea suficiente para asegurar que se logra un efecto ventajoso o sinérgico. Cuando se administran secuencialmente, se pueden administrar a intervalos estrechamente espaciados (por ejemplo, durante un período de 5-10 minutos) o a intervalos más largos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más horas de diferencia, o incluso períodos más largos de separación cuando sea necesario), siendo la pauta posológica precisa proporcional a las propiedades del agente o agentes terapéuticos. Estas dosis se pueden administrar, por ejemplo, una vez, dos veces o más por plan de tratamiento, que se pueden repetir, por ejemplo, cada 7, 14, 21 o 28 días.
Se apreciará que el método preferido y el orden de administración y las cantidades y pautas posológicas respectivas para cada componente de la combinación dependerán del otro agente medicinal y compuesto particular de la invención que se administra, su vía de administración, el tumor particular que se está tratando y el hospedador particular que se está tratando. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente el método, el orden de administración y las cantidades y la pauta posológica óptimos usando métodos convencionales y en vista de la información expuesta en el presente documento.
La proporción en peso del compuesto de la invención y el otro u otros agentes terapéuticos más cuando se dan como una combinación puede ser determinada por el experto en la materia. Dicha proporción y la dosis y la frecuencia de administración exactas dependen del compuesto particular de la invención y del otro o los otros agentes terapéuticos usados, la afección particular que se está tratando, la gravedad de la afección que se está tratando, la edad, el peso, el género, la dieta, el tiempo de administración y la condición física general del paciente en particular, el modo de administración, así como otros medicamentos que el individuo pueda estar tomando, como es bien conocido por los expertos en la materia. Asimismo, es evidente que la cantidad diaria efectiva puede reducirse o aumentarse dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescribe el compuesto de la presente invención. Una proporción en peso particular para el compuesto de la invención y otro agente terapéutico puede ser de 1/10 a 10/1, más en particular de 1/5 a 5/1, incluso más en particular de 1/3 a 3/1.
Terapia contra el cáncer
Los ejemplos de cánceres (y sus contrapartidas benignas) que se pueden tratar (o inhibir) incluyen, entre otros, tumores de origen epitelial (adenomas y carcinomas de diversos tipos, incluyendo adenocarcinomas, carcinomas escamosos, carcinomas de células transicionales y otros carcinomas) tales como carcinomas de la vejiga y el tubo urinario, mama, tubo gastrointestinal (incluyendo esófago, estómago (gástrico), intestino delgado, colon, recto y ano), hígado (carcinoma hepatocelular), vesícula biliar y sistema biliar, páncreas exocrino, riñón, pulmón (por ejemplo, adenocarcinomas, carcinomas pulmonares microcíticos, carcinomas pulmonares no microcíticos, carcinomas broncoalveolares y mesoteliomas), cánceres de cabeza y cuello (por ejemplo, cánceres de la lengua, cavidad bucal, laringe, faringe, nasofaringe, amígdala, glándulas salivares, cavidad nasal y senos paranasales), ovario, trompas de falopio, peritoneo, vagina, vulva, pene, cuello uterino, miometrio, endometrio, tiroides (por ejemplo, carcinoma folicular de tiroides), glándula suprarrenal, próstata, piel y anexos (por ejemplo, melanoma, carcinoma de linfocitos Basales, carcinoma de células escamosas, queratoacantoma, nevo displásico); trastornos hematológicos malignos (es decir, leucemias, linfomas) y trastornos hematológicos premalignos y trastornos de malignidades de bajo potencial, incluyendo trastornos hematológicos malignos y afecciones del linaje linfoide relacionadas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda [ALL], leucemia linfocítica crónica [CLL], linfomas de linfocitos B tales como linfoma difuso de linfocitos B grandes [DLBCL], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células del manto, linfomas y leucemias de linfocitos T, linfomas de linfocitos T citolíticos naturales [NK], linfomas de Hodgkin, tricoleucemia, gamopatía monoclonal de significado incierto, plasmacitoma, mieloma múltiple y trastornos linfoproliferativos postrasplante), y trastornos hematológicos malignos y afecciones del linaje mieloide relacionadas (por ejemplo, leucemia mielógena aguda [AML], leucemia mielógena crónica [CML], leucemia mielomonocítica crónica [CMML], síndrome hipereosinofílico, trastornos mieloproliferatrivos tales como policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria, síndrome mieloproliferativo, síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica); tumores de origen mesenquimal, por ejemplo, sarcomas del tejido blando, hueso o cartílago tales como osteosarcomas, fibrosarcomas, condrosarcomas, rabdomiosarcomas, leiomiosarcomas, liposarcomas, angiosarcomas, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, sarcomas sinoviales, sarcomas epitelioides, tumores estromales gastrointestinales, histiocitomas benignos y malignos y dermatofibrosarcoma protuberante; tumores del sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, astrocitomas, gliomas y glioblastomas, meningiomas, ependimomas, tumores pineales y neurinomas); tumores endocrinos (por ejemplo, tumores de la pituitaria, tumores de la glándula suprarrenal, insulinomas, tumores paratiroideos, tumores carcinoides y carcinoma medular de la tiroides); tumores oculares y de los anexos (por ejemplo, retinoblastoma); tumores de las células germinales y trofoblásticos (por ejemplo, teratomas, seminomas, disgerminomas, molas hidatidiformes y coriocarcinomas); y tumores pediátricos y embrionarios (por ejemplo, meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms y tumores neuroectodérmicos primitivos); o síndromes congénitos o de otro tipo, que dejan al paciente susceptible a un tumor maligno (por ejemplo, xeroderma pigmentoso).
En una realización, el cáncer es un tumor sólido. En otra realización, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de próstata o cáncer de pulmón.
En una realización, el cáncer comprende un tumor maligno hematológico. En otra realización, el tumor maligno hematológico es mieloma, linfoma no Hodgkin o leucemia linfocítica crónica.
Los ejemplos de otros agentes terapéuticos o tratamientos contra el cáncer que se pueden administrar (simultáneamente o en diferentes intervalos de tiempo) junto con los compuestos de la invención incluyen, entre otros:
Inhibidores de la topoisomerasa I.
Antimetabolitos.
Agentes dirigidos a la tubulina.
Inhibidores de ligandos de ADN y topoisomerasa II.
Agentes alquilantes.
Anticuerpos monoclonales.
Antihormonas.
Inhibidores de la transducción de señales.
Inhibidores de proteasomas.
ADN metiltransferasas.
Citocinas y retinoides.
Terapias dirigidas a la cromatina.
Radioterapia; y
Otros agentes terapéuticos o profilácticos, como agentes de inmunoterapia.
Los compuestos de la invención también se pueden administrar junto con tratamientos no quimioterápicos tales como radioterapia, terapia fotodinámica, terapia génica, cirugía y dietas controladas.
Para uso en politerapia con otro agente quimioterápico, el compuesto de la fórmula (I) y uno, dos, tres, cuatro o más agentes terapéuticos adicionales diferentes se pueden formular, por ejemplo, juntos en una forma farmacéutica que contiene dos, tres, cuatro o más agentes terapéuticos, es decir, en una composición farmacéutica unitaria que contiene todos los componentes. En una realización alternativa, los agentes terapéuticos individuales se pueden formular independientemente y presentar juntos en forma de un estuche, opcionalmente con instrucciones para su uso.
Terapia antiinfecciosa
Los ejemplos de agentes infecciosos incluyen cualquier patógeno tal como una bacteria, un hongo, un parásito o un virus. Así, en una realización, la enfermedad o el trastorno mediado y/o causado por un agente infeccioso es una infección bacteriana.
Los ejemplos de infección bacteriana incluyen infección por las siguientes bacterias: Staphylococcus sp. tal como Staphylococcus aureus (incluyendo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)), Clostridia sp. (por ejemplo, Clostridium difficile, Clostridium tetani y Clostridium botulinum), especies de Enterobacter, Mycobacterium tuberculosis, Shigella sp. tal como Shigella dysenteriae, Campylobacter sp. tal como Campylobacter jejuni, Enterococcus sp. tal como Enterococcus faecalis, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Bordetella pertussis, especies estreptocócicas, Salmonella thyphimurim, Salmonella enterica, especies de Chlamydia, Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Borrelia burgdorferi, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Helicobacter pylori, patógenos gramnegativos, tales como Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella neumoniae y Escherichia coli (incluyendo cepas que son resistentes a una o más clases de antibióticos, especialmente cepas multifarmacorresistentes (MFR).
Ejemplos
La invención se ilustrará ahora, pero sin limitación, mediante referencia a las realizaciones específicas descritas en los siguientes ejemplos. Los compuestos se nombran usando un paquete de nomenclatura automatizado tal como AutoNom (m Dl ) o ChemDraw o como los nombre el proveedor de productos químicos.
Se proporcionan los siguientes procedimientos sintéticos para ilustrar los métodos usados; para una preparación o etapa dada, el precursor usado puede no derivar necesariamente del lote individual sintetizado según la etapa en la descripción dada.
Procedimientos analíticos
CL-EM
Sistema 1
Sistema CL-EM Agilent 1100 (bomba cuaternaria); espectrómetro de masas: Waters Micromass ZQ Columna: XBridge C184.6 mm x 50 mm, 5 pm.
Disolvente: A = agua; B = acetonitrilo, C = formiato de amonio 10 mm en agua; D = ácido fórmico al 0.05% en acetonitrilo
Temperatura de la columna: 25 °C, volumen de inyección: 5 pl
Método A CL-EM A: rocesamiento ácido de 4.5 minutos
Figure imgf000033_0001
Método B CL-EM: rocesamiento tam onado de 4.5 minutos
Figure imgf000033_0002
Métod L-EM: r mi n i min
Figure imgf000033_0003
Sistema 2
CL-EM Agilent 1100 (bomba cuaternaria); espectrómetro de masas: PE SCIEX API 2000 MS/MS Columna: columna Agilent Poroshell 120, SB-C18, 4.6 mm x 30 mm, 2.7 pm
Disolvente: A = agua; B = 0.1% de ácido fórmico en acetonitrilo
Temperatura de la columna: 20 °C, volumen de inyección: 5 pl
Método D CL-EM: rocesamiento ácido de 4.5 minutos
Figure imgf000033_0004
Figure imgf000034_0001
RMN
Los detalles de RMN se registraron en un Oxford Instruments AS400.
Abreviaturas
Cuando se han usado las siguientes abreviaturas, se aplican los siguientes significados: AcOH es ácido acético;
ac. es acuoso;
s a es un singlete ancho;
8 es el desplazamiento químico en ppm;
d es doblete;
dd es doblete de dobletes
ddd es doblete de dobletes de dobletes;
DCM es diclorometano;
DIPEA es diisopropiletilamina;
DMF es dimetilformamida;
DMSO es dimetilsulfóxido;
DMSO-d6 es un disolvente de RMN de dimetilsulfóxido perdeuterado;
DSG es glutarato de di-(N-succinimidilo);
EtOH es etanol;
EtOAc es acetato de etilo;
HATU es hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; HPLC es cromatografía líquida a presión elevada
IMS es alcohol metilado industrial (típicamente del 5%-10% e MeOH en EtOH);
|j es micro;
m es multiplete;
MaI es maleimida;
MeCN es acetonitrilo;
MeOH es metanol;
min es minutos;
ml es mililitro;
MMTr es monometoxitritilo;
EM es espectrometría de masas;
NH3 es amoníaco o hidróxido de amonio (disolución acuosa al 28%);
NHS es N-hidroxisuccinimida; o N-hidroxisuccinimidilo;
RMN es resonancia magnética nuclear;
Pd/C es (típicamente del 5%-10%) catalizador de hidrogenación de paladio sobre carbón vegetal (humedecido con agua);
Pd(PPh3)4 es tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0 );
ppm es partes por millón;
c es cuartete;
t. r. es tiempo de retención;
s es singlete;
SMCC es 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo;
t es triplete;
TBAF es fluoruro de tetra-n-butilamonio
TBME es terc-butil metil éter;
TEA es trietilamina;
TBS es terc-butildimetilsililoxi,
TFA es ácido trifluoroacético;
THF es tetrahidrofurano.
Cuando se hace referencia a alfa-Gal , se aplica el siguiente compuesto intermedio:
3-((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amina
Figure imgf000035_0001
Este compuesto intermedio se puede preparar según los métodos descritos por Bovin et al (Mendeleev Communications (2002), (4), 143-145).
Con las preparaciones 1-19 se describen los métodos usados para preparar los compuestos intermedios a partir de las moléculas ligadoras clave requeridas para la conjugación en los Ejemplos, como se describe en los procesos (a)-(d) y los Esquemas 1, 1A, 2 y 3 como se describe de ahora en adelante.
Preparación 1.
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-N-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxamido)etil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
Figure imgf000036_0001
A una disolución de ácido 4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-N-(2-aminoetil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida (Preparación 3, 5.0 mg, 2.26 |jmol) en DMSO (400 |jl) se añadió una disolución de SMCC (2.2 mg, 6.57 jm ol) en DMSO (100 jl). Se agitó la disolución resultante durante 18 horas a temperatura ambiente y luego se secó al vacío. El residuo bruto se usó directamente en la siguiente etapa.
Método B de CL-EM: t. r. = 1.97 min, ES+ EM m/z 1118.5 [M+H]+
Preparación 2.
2,2,2',2"-((5'-((2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxamido)etil)carbamoil)-[1,1'-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))tris(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)acetamida)
Figure imgf000036_0002
A una disolución de 2,2',2"-((5-((2-aminoetil)carbamoil)-[1,1-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))tris(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)acetamida) (Preparación 4, 5.0 mg, 2.26 jm ol) en DMSO (400 j l) se le añadió una disolución de SMCC (0.69 mg, 2.05 jm ol) en DMSO (100 jl). Se agitó la solución resultante durante 18 horas a temperatura ambiente. El residuo bruto se tomó directamente para la siguiente etapa.
CL-EM (Método B) t. r. = 1.57 minutos, ES+ EM m/z 1218.5 [M+2H]+/2; masa teórica: 2435.4
Preparación 3.
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-N-(2-aminoetil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
Figure imgf000036_0003
Etapa 1
A una disolución de ácido 4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico (Preparación 6, 38.3 mg, 44.7 |jmol) en DMF (0.5 ml) se añadió Et3N (21.8 jl, 156.4 |jmol) seguido de una disolución de N1-((4-metoxifenfl)difenilmetil)etano-1,2-diamina (Preparación 19, 19.3 mg, 58.1 jm ol) en DMF (0.5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas.
Etapa 2
Se añadió gota a gota HCl 0.2 M (acuoso) hasta pH 3-4 y la disolución se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró al vacío y se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con MeCN del 5-40% en agua con 0.1% de amoníaco proporcionando el compuesto del título como un sólido incoloro (12.4 mg, 28%). Método B de CL-EM: t. r. = 1.32 min, ES+ EM m/z 899.3 [M+H]+
Preparación 4.
2,2',2"-((5'-((2-aminoetil)carbamoil)-[1,1'-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))tris(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)acetamida)
Figure imgf000037_0001
Etapa 1
A una disolución de ácido 3',5,5'-tris(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico (Preparación 5, 66.0 mg, 30.4 jm ol) en DMF (0.5 ml) se añadió Et3N (14.8 jl, 106.4 jm ol) seguido por una disolución de N1-((4-metoxifenil)difenilmetil)etano-1,2-diamina (Preparación 19, 13.1 mg, 39.5 jm ol) en DMF (0.5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas.
Etapa 2
Se añadió gota a gota HCl 0.2 M (acuoso) hasta pH 3-4 y la disolución se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró al vacío y se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con MeCN del 5-40% en agua con 0.1% de amoníaco proporcionando el compuesto del título como un sólido incoloro (47.0 mg, 70%).Método B de CL-EM: t. r. = 1.57 min, ES+ EM m/z 1106.9 [M+2H]+/2, masa teórica: 2216.1
Preparación 5.
Ácido 3',5,5'-Tris(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico
Figure imgf000038_0001
Método A:
A 3',5,5'-tris(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1 '-bifenil]-3-carboxilato de bencilo (Preparación 7, 71.2 mg, 31.4 |jmol) disuelto en MeOH/agua (1:1 v/v, 7.1 ml) se añadió el 10% de Pd/C (7.1 mg). La reacción se hidrogenó a 345 kPa (50 psi) con agitación durante 3 horas a temperatura ambiente. La reacción se filtró a través de Dicalite y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en agua (2 ml), se agitó con resina SiliCycle DMT (50 mg) durante 30 minutos y se filtró para dar una disolución incolora. La disolución se concentró al vacío para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (61.2 mg, 89%).CL-EM (Método B) t. r. = 1.27 minutos, ES+ EM m/z 1088.4 [M+2H]+/2, masa teórica: 2174.4 MALDI-ToF 2195.8 [M-H+Na]+
La preparación 3 también se puede preparar según el siguiente método:
Método B:
A 3',5,5'-tris(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2- il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de bencilo (Preparación 7, 278 mg, 123 jm ol) disuelto en agua (7 ml) se añadió TEA (7 ml) y se agitó la reacción vigorosamente durante 16 horas a temperatura ambiente. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con MeCN al 5-40%/agua con 0 ,1 % de NH3 proporcionando el compuesto del título como un sólido incoloro (224 mg, 83%).
Preparación 6.
Ácido 4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico
Figure imgf000038_0002
A 4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1 '-bifenil]-3-carboxilato de bencilo (Preparación 8 , 93.5 mg, 98.7 jm ol) disuelto en MeOH/agua(1:1 v/v, 5 ml) se añadió Pd/C (10%, 10 mg). La reacción se puso en una atmósfera de hidrógeno (50 psi, 345 kPa) y se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. El catalizador se eliminó por filtración a través de un filtro de jeringa y el disolvente se eliminó a presión reducida para dar el producto bruto que se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con una concentración del 5-40% de MeCN/agua con 0.1% de NH3 para producir el compuesto del título como un sólido incoloro (71.6 mg 84%).
CL-EM (Método A) t. r. = 1.83 minutos, ES+ EM m/z 857.57 [M+H]+
Preparación 7.
3',5,5'-tris(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4s,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1 '-bifenil]-3- carboxilato de bencilo
Figure imgf000039_0001
A alfa-Gal (100 mg, 166 pmol) disuelto en DMSO (1.25 ml) y DMF (3.75 ml) se le añadió trietilamina (52.1 pl, 374 pmol) y ácido 2,2',2"-((5'-((benciloxi)carbonil)-[1,1 '-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))triacético (Preparación 9, 21.2 mg, 41.5 pmol). Se añadió una disolución de HATU (63.1 mg, 166 pmol) como una disolución en DMF (1.25 ml) y la reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente en nitrógeno. La reacción concentró al vacío y se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con MeCN del 10-40% en agua con 0.1% de NH3 proporcionando el compuesto del título como un sólido incoloro (71.2 mg, 76%).
Método B de CL-EM: t. r. = 1.80 min, ES+ EM m/z 1313.3 [M+2H]+/2, masa teórica: 2624.3
Preparación 8.
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4s,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1 '-bifenil]-3-carboxilato de bencilo
Figure imgf000039_0002
Al ácido 2-((3'-((benciloxi)carbonil)-[1,1'-bifenil]-4-il)oxi)acético (Preparación 10, 55.0 mg, 152 pmol) en DMF (7.5 ml) se añadió TEA (63.4 pl, 455 pmol) seguido por alfa-Gal (119 mg, 197 pmol) en DMSO (500 pl). Se añadió HATU (86 .6 mg, 228 pmol) como una disolución en DMF (500 pl) y la reacción se dejó agitar durante 16 horas en nitrógeno a temperatura ambiente. La reacción se concentró al vacío y se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con una concentración del 7-60% de MeCN en agua con el 0.1% de NH3 proporcionando el compuesto del título como un sólido incoloro (93.5 mg, 65%).
CL-EM (Método B) t. r. = 2.54 minutos, ES+ EM m/z 947.62 [M+H]+
Preparación 9.
Ácido 2,2',2"-((5'-((benciloxi)carbonil)-[1,1'-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))triacético
Figure imgf000040_0001
Una disolución de 2,2',2"-((5'-((benciloxi)carbonil)-[1,1 '-bifenil]-3,3',5-trM)tris(oxi))triacetato de tri-terc-butilo (Preparación 11, 100 mg, 147 |jmol) disuelta en DCM/TFA/agua (10/10/1 v/v/v, 5 ml) se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró al vacío, se disolvió en MeOH (1 ml) y se precipitó con agua (10 ml). El precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó al vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro (57.8 mg, 77%).
CL-EM Método A: t. r. = 2.48 min, ES- EM m/z 509.3 [M-H]-RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 8 ppm 13.05 (3H, s a), 7.90 (1H, s), 7.55-7.45 (3H, m), 7.45-7.30 (4H, m), 6.80 (2H, d), 6.50 (1H, t), 5.402H, s), 4.85 (2H, s), 4.75 (4H, s).
Preparación 10.
Ácido 2-((3'-((benciloxi)carbonil)-[1,1 '-bifenil]-4-il)oxi)acético
Figure imgf000040_0002
El compuesto del titulo se preparó según el método descrito para la Preparación 9 usando la Preparación 12 y se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa eluyendo con una concentración del 5-40% de MeCN/agua con NH3 al 0.1%.
Método B de CL-EM: t. r. = 2.43 min, ES+ EM m/z 363.2 [M+H]+
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 8 ppm 13.00 (1H, s), 8.15 (1H, t), 7.90-7.85 (2H, m), 7.65-7.55 (3H, m), 7.50-7.45 (2H, m), 7.45-7.30 (3H, m), 7.00-6.95 (2H, m), 5.40 (2H, s), 4.70 (2H, s).
Preparación 11.
2,2',2"-((5'-((benciloxi)carbonil)-[1,1'-bifenil]-3,3',5-triN)tns(oxi))triacetato de tri-terc-butilo
Figure imgf000040_0003
Al 3',5,5'-trihidroxi-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de bencilo (Preparación 13, 356 mg, 1.06 mmol) disuelto en DMF (10 ml) se añadió bromoacetato de terc-butilo (625 jl, 4.23 mmol) y carbonato de potasio (1.17 g, 8.47 mmol). La suspensión resultante se agitó durante 16 horas en nitrógeno antes de concentración al vacío. El residuo se disolvió en agua (10 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), NaOH acuoso 2 M (10 ml), se secaron en MgSO4 y se concentraron al vacío. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc en una concentración del 7-60% en heptano proporcionando el compuesto del título como una goma incolora clara (618 mg, 86%).
CL-EM Método C: t. r. = 4.34 min, no se observan iones de masa
RMN 1H (400 MHz, CDCla): 8 ppm 7.85 (1H, s), 7.55-7.50 (1H, m), 7.45-7.25 (6H, m), 6.70 (2H, d), 6.45-6.40 (1H, m), 5.35 (2H, s), 4.55 (2H, s), 4.50 (4H, s), 1.45 (27H, s)
Preparación 12.
4'-(2-(terc-butoxi)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de bencilo
Figure imgf000041_0001
A una disolución de 4'-hidroxi-[1,1 '-bifenil]-3-carboxilato de bencilo (Preparación 14, 368 mg, 1.21 mmol) y bromoacetato de terc-butilo (178 pl, 1.21 mmol ) en DMF (5 ml) se añadió carbonato de potasio (200 mg, 1.45 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas seguido de 50 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo resultante se dividió entre acetato de etilo (20 ml) y DCM (20 ml). La capa orgánica se separó y se extrajo la capa acuosa de nuevo con DCM (20 ml). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con agua ( 10 ml), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron al vacío. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc en una concentración del 0-15%, en hexano, proporcionando el compuesto del título como un aceite (510 mg, 100%). CL-EM Método D: t. r. = 3.85 min, no se observan iones de masa
RMN 1H (400 MHz, CDCla): 8 ppm 8.25 (1H, t), 8.01-7.99 (1H, dt), 7.76-7.71 (1H, m), 7.58-7.31 (8 H, m), 7.06­ 6.95 (2H, m), 5.39 (2H, s), 4.56 (2H, s), 1.50 (9H, s).
Preparación 13.
3',5,5'-trihidroxi-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de bencilo
Figure imgf000041_0002
A una disolución de 3',5'-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-5-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de bencilo bruto (Preparación 16, 1.27 g, 2.46 mmol) disuelto en THF (12 ml) se añadió gota a gota disolución de TBAF (1 M en THF, 6.15 ml, 6.15 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 90 minutos en nitrógeno antes de diluir con EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con agua (2 * 50 ml), se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con MeOH al 5% en DCM para proporcionar el compuesto del título como un sólido marrón pálido (356 mg, 43% en 3 etapas).
CL-EM Método A: t. r. = 2.66 min, ES' EM m/z 335.3 [M-H]-RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 ppm 7.60 (1H, t), 7.45-7.40 (2H, m), 7.40-20 (4H, m), 7.15-7.10 (1H, m), 6.45 (2H, d), 6.20 (1H, t), 5.30 (2H, s).
Preparación 14.
4'-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de bencilo
Figure imgf000041_0003
A una disolución de cloruro de bencilo (295 pl, 2.56 mmol) en DMF (5 ml) se le añadió ácido 4-rndroxibifeml-3-carboxílico (500 mg, 2.33 mmol) y carbonato de potasio (322 mg, 2.33 milimol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas y luego se concentró al vacío. El residuo se repartió entre agua (20 ml) y dietil éter (20 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con dietil éter (20 ml). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con agua (10 ml), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron al vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna de sílice eluyendo con una concentración del 0-30% de EtOAc en hexano, proporcionando el compuesto del título en forma de un sólido blanco (378 mg, 53%).
CL-EM Método D: t. r. = 3.48 min, ES+ EM m/z 305.0 [M+H]+
RMN 1H(400 MHz, CDCla): 8 ppm 8.26-8.24 (1H, m), 8.03-7.98 (1H, m), 7.75-7.71 (1H, m), 7.51-7.43 (5H, m), 7.42-7.31 (3H, m), 6.95-6.90 (2H, m), 5.40 (2H, s).
Preparación 15.
3-bromo-5-hidroxibenzoato de bencilo
Figure imgf000042_0001
A una disolución de ácido 3-bromo-5-hidroxibenzoico (4.08 g, 18.8 mmol) disuelto en DMF (25 ml) se le añadió K2CO3 (2.60 g, 18.8 mmol) y después de 5 minutos bromuro de bencilo (2.24 ml, 18.8 mmol) gota a gota durante 10 minutos. Se agitó la reacción en nitrógeno a temperatura ambiente durante 16 h. Se añadieron más K2CO3 (520 mg, 3.76 mmol) y bromuro de bencilo (450 pl, 3.79 mmol) y la reacción se agitó durante 3 horas. La reacción se concentró al vacío y el residuo se dividió entre EtOAc (30 ml) y agua (30 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 5% en heptano proporcionando el compuesto del título como un sólido incoloro (3.88 g, 67%).
CL-EM Método A: t. r. = 3.36 min, ES' EM m/z 307.2 [M-H]-
RMN 1H (400 MHz, CDCla): 8 ppm 7.75 (1H, t), 7.50-7.45 (1H, m), 7.45-7.30 (5H, m), 7.20 (1H, t), 5.30 (2H, s), 5.30 (1H, s a).
Preparación 16.
3',5'-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-5-hidroxi-[1, 1 '-bifenil]-3-carboxilato de bencilo
Figure imgf000042_0002
Una mezcla de 3-bromo-5-hidroxibenzoato de bencilo (Preparación 15, 755 mg, 2.46 mmol), carbonato de sodio (912 mg, 8.60 mmol) y ((5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborlan-2-il)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(tercbutildimetilsilano) (Preparación 17, 1.87 g, 2.95 mmol) disuelto en dioxano/agua (30 ml, 5 :1 v/v) se desgasificó durante 30 minutos con nitrógeno. Se añadió Pd(PPh3)4 (284 mg, 246 pmol) y la reacción se calentó hasta 100 °C durante 90 minutos en nitrógeno. Después de enfriarse a temperatura ambiente, se añadieron EtOAc (100 ml) y agua (50 ml). Se separaron las capas y se retrolava la fase acuosa con EtOAc (2 x 25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y se concentraron al vacío. El residuo se trató con heptano (100 ml) y la mezcla resultante se sonicó durante 5 minutos antes de filtrar para eliminar el sólido. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar el compuesto del título bruto como un aceite marrón claro (1.27 g) que se usó directamente en la siguiente etapa.
Método CL-EM C: t. r. = 5.47 min, ES+ EM m/z 565.4 [M+H]+
Preparación 17.
((5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(terc-butildimetilsilano)
Figure imgf000043_0001
Una disolución de 1,3-bis((terc-butildimetMsilil)oxi)benceno (Preparación 18, 1.00 g, 2.95 mmol y bis(pinacolato)diboro (750 mg, 2.95 mmol) disuelto en isohexano (15 ml) desgasificado durante 1 hora usando nitrógeno. Se añadieron [Ir(OMe)(COD)]2 (19.6 mg, 59.1 jm ol) y 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridina (15.9 mg, 59.0 |jmol) y la reacción se selló y se calentó a 110 °C durante 16 horas. La reacción se enfrió, se concentró al vacío y se usó directamente en la etapa siguiente (1.87 g).
Método CL-EM C: t. r. = 6.19 min, ES+ EM m/z 465.4 [M+H]+
RMN 1H (400 MHz, CDCb): 8 ppm 6.85 (2H, d), 6.40 (1H, t), 1.25 (12H, s), 0.95 (18H, s), 0.15 (12H, s).
Preparación 18.
1,3-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)benceno
Figure imgf000043_0002
A resorcinol (2.00 g, 18.2 mmol) e imidazol (3.71 g, 54.5 mmol) disueltos en DCM (40 ml) se añadió tercbutildimetilclorosilano (8.21 g, 54.5 mmol). Se formó un precipitado y se añadió más DCM (40 ml) antes de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente en nitrógeno. Se filtró la reacción y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc en una concentración del 0-10% en heptano proporcionando el compuesto del título como un aceite incoloro (6.18 g, >99%).
CL-EM Método C: t. r. = 5.39 min, ES+ EM m/z 339.3 [M+H]+
RMN 1H (400 MHz, CDCla): 8 ppm 6.95 (1H, t), 6.35 (2H, dd), 6.25 (1H, t), 1.85 (18H, s), 0.10 (12H, s).
Preparación 19.
N1-((4-metoxifenil)difenilmetil)etano-1,2-diamina
Figure imgf000043_0003
A una disolución de etilendiamina (54.0 ml, 809.6 mmol) en DCM (175 ml) se le añadió lentamente una disolución de cloruro de MMT (25.0 g, 81.0 mmol) en DCM (175 ml) durante 1 hora con agitación. Se agitó la disolución resultante durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se lavó con disolución acuosa de carbonato de potasio al 10% (400 ml y salmuera (400 ml). La capa orgánica se recogió, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo pálido (26.1 g, 97%).
CL-EM Método B: t. r. = 2.73 min, no se observa ionización
RMN 1H(400 MHz, CDCb): 8 ppm 7.52-7.42 (4H, m), 7.40-7.34 (2H, m), 7.31-7.22 (4H, m), 7.20-7.15 (2H, m), 6.84-6.77 (2H, m), 3.80 (3H, s), 2.84-2.78 (2H, m), 2.27-2.18 (2H, m).
Preparación 20.
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-3-oxopropoxi)etil)amino)-2-oxoetoxi)-N-(2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)etil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
Figure imgf000044_0001
Se anadio una disolución de la Preparación 24 en DMF (100 mM) a un volumen igual de Mal-PEG4-NHS en DMF (80 mM, 0.8 eq) y la reacción se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se almacenó como una concentración final de 50 mM y se usó directamente en la etapa de conjugación.
Preparación 21.
3,3',3"-((((2,2',2"-((5'-((2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)etil)carbamoilH1,1'-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))tris(acetil))tris(azanediil))tris(etane-2,1 -diil))tris(oxi))tris(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)propanamida)
Figure imgf000044_0002
Se añadió una disolución de la Preparación 25 en DMF:DMSO (3:1,25 mM) a un volumen igual de Mal-PEG4-NHS en DMF (80 mM, 0.8 eq) y la reacción se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se almacenó como una concentración final de 20 mM y se usó directamente en la etapa de conjugación.
Preparación 22
5-((2-(4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamido)etil)amino)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo
Figure imgf000044_0003
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4s,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-2-oxoetoxi)-N-(2-aminoetil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida (Preparación 3, 21.76 mg, 24 mmol) se disolvió en 1:1 Dm F:DMSO anhidro (1062 pl) con agitación. Se añadió glutarato de di-(N-succinimidilo) (39.49 mg, 120 mmol) como una disolución 300 mM en DMF:DMSO anhidro 1:1 (400 pl). Se agitó la reacción en nitrógeno a temperatura ambiente durante 1 h en atmósfera positiva en nitrógeno. La reacción se purificó usando cromatografía en columna de fase inversa (10 x 250 mm Hichrom ACE 10) eluyendo con MeCN en una concentración del 1-50% en TFA al 1% en agua. Las fracciones deseadas se liofilizaron hasta sequedad durante 24 horas para proporcionar el compuesto del título como un vidrio incoloro (23 mg, 88%).
EM m/z 1110.3 [M+H]+
Preparación 23.
5-oxo-5-((2-(3',5,5'-tris(2-((2-(3-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-3-oxopropoxi)etil)amino)-2-oxoetoxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamido)etil)amino)pentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo
Figure imgf000045_0001
El compuesto del título se preparó según el método descrito para la Preparación 22 usando la Preparación 25 y se llevó directamente a la etapa de conjugación.
Preparación 24.
4'-(2-((2-(3-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)amino)-3-oxopropoxi)etil)amino)-2-oxoetoxi)-N-(2-aminoetil)-[1, 1 '-bifenil]-3-carboxamida
Figure imgf000045_0002
El compuesto del título se preparó según el método descrito para la Preparación 3 usando ácido 4'((2,2-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-2-18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,19-diazadocosil)oxi)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico (documento (WO2017060729).CL-EM (Método B) t. r. = 1.66 minutos, ES+ EM m/z 1145.4 [M+H]+
Preparación 25.
3,3',3"-((((2,2',2"-((5'-((2-aminoetil)carbamoil)-[1,r-bifenil]-3,3',5-triil)tris(oxi))tris(acetil))tris(azanediil))tris(etane-2,1-diil))tris(oxi))tris(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)propil)propanamida)
Figure imgf000045_0003
El compuesto del título se preparó según el método descrito para la Preparación 3 usando ácido 3',5,5'-tris((2,2-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-4-hidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,19-diazadocosil)oxi)-[1,1 '-bifenil]-3-carboxílico (WO2017060729).
CL-EM (Método B) t. r. = 1.47 minutos, ES+ MS m/z 1479.0 [M+2H]+/2; masa teórica: 2958.0
Ejemplos
Materiales y métodos
vcMMAE (vcE): ADCB TOX001, 10 mM en DMA
TCEP. Biovectra Cat 1300 Lote: 42359
N-acetilcisteína. Sigma A7250 Lote: WXBC3104V
Dimetilacetamida. Sigma-Aldrich 271012 Lote: STBF9638V
Tampón KNE: KPI 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5
PBS: Sigma, P5368 número SLBQ7495, reconstituido usando WFI: Sigma W3500 número RNBF6963 1.76 M HEPES, pH 10.8
2-lminotiolano HCl: Sigma I6256 número SLBS1775V
Polisorbato 80: Sigma-Aldrich P8074 número BCBG4547V
PLA es la proporción ligador:anticuerpo
PFA es proporción fármaco:anticuerpo
SEC es cromatografía de exclusión por tamaño
Contenido de monómero por HPLC de exclusión por tamaño (SEC)
El contenido agregado de cada conjugado se evaluó mediante cromatografía en una columna TOSOH TSKgel G3000SWXL de 7.8 mm * 30 cm, 5 pm a 0.5 ml/min en IPA al 10%, fosfato de potasio 0.2 M, cloruro de potasio 0.25 M, pH 6.95. Las muestras se cargaron netas y los datos se recogieron a 214 nm, 252 nm y 280 nm. Todos los datos informados son a 280 nm.
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC, por sus siglas en inglés)
La HIC se realizó en una columna TOSOH Butyl-NPR de 4.6 mm * 3.5 cm, 2.5 pm a 0.8 ml/min con un gradiente lineal de 12 minutos entre la fase móvil A: 1.5 M (NH4)2SO4, NaPi 25 mM, pH 6.95 ± 0.05 y fase móvil B: NaPi 25 mM al 75%, pH 6.95 ± 0.05, IPA al 25%. Las muestras se cargaron netas hasta una carga máxima de 10 ul y los datos se recogieron a 280 nm, 252 nm y 214 nm; todos los datos informados son de 214 nm.
Cromatografía polimérica de fase inversa (PLRP, por sus siglas en inglés)
La fase inversa se realizó en una columna Polymer Labs PLRP-S de 2.1 mm * 50 mm, 5 pm, 1000 A a 0.25 ml/min/80 °C con un gradiente lineal de 25 minutos entre el 0.1% de TFA el 25% de MeCN y el 0.1% de TFA el 50% de MeCN. Las muestras se redujeron mezclando 10 ug con 5 ul de DTT 0.1 M y completando hasta 50 ul con tris/CI 0.5 M, pH 8.0 e incubando a 37 °C durante 15 minutos. Las muestras reducidas se diluyeron 1:1 con acetonitrilo al 49%, agua al 49% y ácido fórmico al 2% para detener la reducción y estabilizar la muestra en espera del análisis PLRP. Se cargaron 20 ul de esta muestra en la columna para su análisis y todos los datos se informan a 214 nm.
Nota: Con HIC y PLRP no se pueden resolver las cargas de ligadores individuales debido a la hidrofilia de alfa-Gal. La proporción ligador:Ab (PLA) se determinó por seguimiento vcE de una alícuota del anticuerpo inicial reactivo con tiol y la mezcla de reacción completa.
Los datos para los respectivos Ejemplos se ejemplifican en las Figuras 1-3 y 12-17.
Conjugados de anticuerpos (cetuximab)
Se usó cetuximab (Merck Serono; Lote número 223155, exp: 09/2020, con un peso molecular de 152.000 Da para las siguientes conjugaciones. Los cálculos se basaron en un Abs0.1% 280 nm de 1.45 cm'1 mg/ml-1, un análisis UV de 4.7 mg/ml y curvas de calibración por SEC a 214 nm.
Método general para la reducción de cetuximab seguida de conjugación con maleimida que contiene ligadores (Ejemplos 1-4)
Se complementó cetuximab (4.7 mg/ml) con Tris-Cl 0.5 M al 6%, EDTA 0.025 M, pH 8.5, y se incubó con 1.1 eq de TCEP:mAb (para un valor medio de PLA = 2) o 4.2 TCEP:mAb (para PLA medio = 5) a temperatura ambiente durante 90 minutos y 120 minutos respectivamente.
Para analizar el grado de reducción, se conjugó una alícuota de la muestra reducida con un exceso molar de carga útil sustituta Mal-vc-PAB-MMAE para determinar PFA (usando análisis HIC).
A la muestra reducida se añadieron 8 eq de ligador-maleimida y la reacción se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, la reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de N-acetilcisteína (disolución acuosa 10 mM) durante 30 minutos. Las muestras se purificaron con resina G25 en PBS y el ligador no unido restante se eliminó con 10 volúmenes DIA de diafiltración de membrana usando el dispositivo Vivaspin6.
Ejemplo 1
Figure imgf000047_0001
Av. PLA: 2; Av. número total de unidades alfa-Gal: 2
% Monómero [SEC]: 98.8% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 1
Ejemplo 2
Figure imgf000047_0002
Av. PLA: 5; Av. número total de unidades alfa-Gal: 5
% Monómero [SEC]: 99.4% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 1
Ejemplo 3
Figure imgf000047_0003
Av. PLA: 2; Av. número total de unidades alfa-Gal: 6
% Monómero [SEC]: 99.5% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 2
Ejemplo 4
Figure imgf000048_0001
Av. PLA: 5; Av. número total de unidades alfa-Gal: 15
% Monómero [SEC]: 99.0% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 2
Método general para la interconversión de cetuximab lisina en tiol seguida de conjugación a ligadores que contienen maleimida (Ejemplos 5-8)
Se unió cetuximab (4.7 mg/ml) a la resina de proteína A (GE Healthcare, HiTrap MabSelect SURE 1 ml), luego se lavó la columna con KPI 50 mM, NaCl 50 mM, EDt A 2 mM, pH 7.5 y el mAb se eluyó con 4CV 0.1 M de glicina a pH 3. Las fracciones eluidas que contenían la proteína diana (combinación por absorbancia UV280) se complementaron con un 20% de HEPES 1.76 M a pH 10.8. Luego, se incubó el cetuximab con 12.2 eq de 2-iminotiolano:mAb (para muestras de PLA baja) o 30.5 eq de 2-iminotiolano:mAb (para muestras de PLA alta) durante 120 minutos a 23 °C.
Una alícuota de las muestras se intercambió con tampón en His 5 mM, trehalosa 50 mM pH 6.0 y se conjugó con un exceso molar de carga útil sustituta Mal-vc-PAB-MMAE para determinar la PFA. La mezcla de tiolación restante se enfrió rápidamente a través del intercambio de tampón NAP25 en His 5 mM, trehalosa 50 mM a pH 6.0 antes del acoplamiento. La conjugación de ligador-maleimida se realizó usando 4 eq de ligadormaleimida:tiol con DMA al 5% final durante 120 minutos a 23 °C. Tras la incubación, se cambió el tampón de las muestras a PBS a través de resina G25. El exceso de ligador se eliminó mediante diafiltración en membrana 10DV (Vivaspin6).
La cantidad de tiol libre puede controlarse durante todo el experimento usando el ensayo de Ellman.
Ejemplo 5
Figure imgf000048_0002
Av. PLA: 2; Av. número total de unidades alfa-Gal: 2
% Monómero [SEC]: 95.0% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 1
Ejemplo 6
Figure imgf000049_0001
Av. LAR: 4.9; Av. número total de unidades alfa-Gal: 4.9
% Monómero [SEC]: 90.3% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 1
Ejemplo 7
Figure imgf000049_0002
Av. PLA: 2; Av. número total de unidades alfa-Gal: 6
% Monómero [SEC]: 90.4% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 2
Ejemplo 8
Figure imgf000049_0003
Av. PLA: 4.9; Av. número total de unidades alfa-Gal: 14.7
% Monómero [SEC]: 80.8% (ver Figura 3)
Precursor: Preparación 2
Método general para la reducción de cetuximab seguida de conjugación con ligadores que contienen maleimida para obtener una PLA media = 8 (Ejemplos 9-11)
Se complementó el cetuximab (4.7 mg/ml) con Tris-Cl 0.5 M al 6%, EDTA 0.025 M (pH 8.5) hasta aproximadamente pH = 7.5 y se incubó con 8 eq de TCEP:mAb a temperatura ambiente durante 90 minutos.
Para analizar el grado de reducción, se conjugó una alícuota de la muestra reducida con un exceso molar de carga útil sustituta Mal-vc-PAB-MMAE para determinar la PFA (usando análisis HIC).
A la muestra reducida se añadieron 16 eq o 32 eq de ligador-maleimida y la reacción se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, la reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de N-acetilcisteína (disolución acuosa 10 mM) durante 30 minutos y las muestras se purificaron con resina G25 en PBS y el ligador no unido restante se eliminó con 10 volúmenes DIA de diafiltración de membrana usando el dispositivo PES de 30 kDa Vivaspin6.
Ejemplo 9
Figure imgf000050_0001
Av. PLA: 8; Av. número total de unidades alfa-Gal: 8
Análisis SEC: t. r. = 15.3 minutos, contenido de monómero del 98.3%
Precursor: Preparación 1
Ejemplo 10
Figure imgf000050_0002
Av. PLA: 8; Av. número total de unidades alfa-Gal: 8
SEC Analysis: t. r. = 14.8 minutes, contenido de monómero del 98.5%
Precursor: Preparación 20
Ejemplo 11
Figure imgf000050_0003
Av. PLA: 8; Av. número total de unidades alfa-Gal: 8
Análisis SEC: t. r. = 14.1 minutos, contenido de monómero del 97.0%
Precursor: Preparación 21
Método general para la conjugación directa con lisina de cetuximab a ligadores que contienen N-hidroxisuccinimida (Ejemplos 12-16)
Se unió cetuximab (20 mg) a resina de proteína A (GE Healthcare, HiTrap MabSelect Sure, 1 ml) y la columna se lavó con una disolución de KPi 50 mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM a pH= 8. El anticuerpo se eluyó con tampón de citrato 100 mM a pH = 3 y el tampón se intercambió por tampón de conjugación de lisina (NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH = 8) con una concentración de aproximadamente 6 mg/ml. La disolución se analizó mediante SEC para proporcionar cetuximab en una disolución adecuada para la conjugación de lisina (18.2 mg, 91% de rendimiento, a 6.4 mg/ml, 100% de contenido de monómero).
La disolución anterior de cetuximab se incubó con 5, 10, 15, 20 o 38 equivalentes molares de la Preparación 22 con codisolvente de DMF al 6% v/v durante 2 horas a 30 °C. La reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de glicina a 1 mM y los conjugados se intercambiaron con tampón en PBS y se diafiltraron para eliminar el exceso de ligador.
Ejemplo 12
Figure imgf000051_0001
Av. PLA: 2; Av. numero total de unidades alfa-Gal: 2
Análisis SEC: t. r. = 15.0 minutos. Contenido de monómero no determinado.
Precursor: Preparación 22 (5 eq)
Ejemplo 13
Figure imgf000051_0002
Av. PLA: 5; Av. número total de unidades alfa-Gal: 5
Análisis SEC: t. r. = 14.9 minutos. Contenido de monómero no determinado.
Precursor: Preparación 22 (10 eq)
Ejemplo 14
Figure imgf000051_0003
Av. PLA: 8; Av. número total de unidades alfa-Gal: 8
Análisis SEC: t. r. = 14.8 minutos. Contenido de monómero no determinado.
Precursor: Preparación 22 (15 eq)
Ejemplo 15
Figure imgf000052_0001
Av. PLA: 10; Av. número total de unidades alfa-Gal: 10
Análisis SEC: t. r. = 14.7 minutos. Contenido de monómero no determinado.
Precursor: Preparación 22 (20 eq)
Ejemplo 16
Figure imgf000052_0002
Av. PLA: 15; Av. número total de unidades alfa-Gal: 15
SEC Analysis: t. r. = 14.2 minutos, contenido de monómero del 94.3%
Precursor: Preparación 22 (38 eq)
Ejemplo 17
Figure imgf000052_0003
El Ejemplo 17 se preparó según el Método general 3 usando 60 equivalentes de
Preparación 22 (con DMF al 10% v/v) durante 2 horas seguido de 40 eq más de Preparación 22 (con DMF al 4% v/v) durante 2 horas.
Av. PLA: 20; Av. número total de unidades alfa-Gal: 20
Análisis SEC: t. r. = 13.9 minutos, contenido de monómero del 98.4%
Precursor: Preparación 22
Conjugados de fragmentos Fab (cetuximab)
Digestión de cetuximab a cetuximab-Fab
Al cetuximab (60 mg, 4,7 mg/ml) se le intercambió de tampón por tampón de digestión (NaPi 20 mM, cisteína 20 mM, EDTA 10 mM a pH=7) y se concentró a 3 ml a 20 mg/ml. La papaína inmovilizada (3 ml, Thermo Fisher número 20341, carga: 250 ug/ml de resina, actividad: 16-40 BAEE/mg de papaína) se equilibró en tampón de digestión y se incubó con cetuximab concentrado a 37 °C durante 15 horas. Los productos de la digestión se recogieron por filtración y se eluyeron a través de una columna de proteína A. Los fragmentos Fab que no se unían pasaron a través de la columna y se recogió el flujo. Los fragmentos Fab se sometieron a diafiltración discontinua mediante centrifugación vivaspin (filtro MWCO de 10 kDa) en NaPi 50 mM, NaCI 150 mM y EDTA 2 mM a pH = 8. La concentración final alcanzada fue de 5.6 mg/ml (véase la Figura 16).
Método general para la reducción de cetuximab-Fab seguida de conjugación con ligadores que contienen maleimida para obtener PLA = 2 (Ejemplos 18 y 19)
Se redujo el cetuximab-Fab a 5.6 mg/ml en tampón de conjugación (NaPi 50 mM, NaCl 150 mM y EDTA 2 mM a pH = 8) mediante la adición de 5 equivalentes molares de TCEP (10 mM en agua) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se añadió una disolución de la Preparación 20 (5 equivalentes molares) o la Preparación 21 (7.5 equivalentes molares) y la reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los conjugados se intercambiaron con tampón y se diafiltraron con PBS para proporcionar los materiales deseados. Los conjugados fueron analizados por SEC y SDS-PAGE.
Ejemplo 18
Figure imgf000053_0001
Av. PLA: 2; Av. número total de unidades alfa-Gal: 2
Análisis SEC: t. r. = 18.2 minutos, contenido de monómero del 94.7%
Precursor: Preparación 20
Ejemplo 19
Figure imgf000053_0002
Av. PLA: 2; Av. número total de unidades alfa-Gal: 6
Análisis SEC: t. r. = 17.4 minutos, contenido de monómero del 91.7%
Precursor: Preparación 21
Método general para la conjugación con lisina de cetuximab-Fab a ligadores que contienen NHS para obtener un PLA medio = 7-14 (Ejemplos 20-24)
Se incubó cetuximab-Fab a 5.6 mg/ml en tampón de conjugación (NaPi 50 mM, NaCl 150 mM y EDTA 2 mM a pH = 8) con la Preparación 22 (15, 30 y 40 equivalentes) y la Preparación 23 (20 equivalentes) con codisolvente DMF al 9% v/v a 30 °C durante 2 horas. La reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de glicina a 1 mM y los conjugados se intercambiaron con tampón en PBS y se diafiltraron para eliminar el exceso de ligador. Ejemplo 20
Figure imgf000054_0001
Av. PLA: 7; Av. número total de unidades alfa-Gal: 7
Análisis SEC: t. r. = 18.0 minutos, contenido de monómero del 99%
Precursor: Preparación 22 (15 eq)
Ejemplo 21
Figure imgf000054_0002
Av. PLA: 5; Av. número total de unidades alfa-Gal: 15
Análisis SEC: t. r. = 17.4 minutos, contenido de monómero del 99%
Precursor: Preparación 23 (20 eq)
Ejemplo 22
Figure imgf000054_0003
Av. PLA: 11; Av. número total de unidades alfa-Gal: 11
Análisis SEC: t. r. = 17.3 minutos, contenido de monómero del 96.9%
Precursor: Preparación 22 (30 eq)
Ejemplo 23
Figure imgf000054_0004
Av. PLA: 14; Av. número total de unidades alfa-Gal: 14
Análisis SEC: t. r. = 17.1 minutos, contenido de monómero del 95.7%
Precursor: Preparación 22 (40 eq)
Ejemplo 24
Figure imgf000055_0001
El Ejemplo 24 se preparó según el Método general 4 usando 60 equivalentes de la Preparación 22 (con el 20% v/v de DMF) durante 2 horas, seguido de 40 equivalentes más de la Preparación 22 (con el 4% v/v de DMF) durante 2 horas.
Av. PLA: 17; Av. número total de unidades alfa-Gal: 17
Análisis SEC: t. r. = 15.9 minutos, contenido de monómero del 90.2%
Precursor: Preparación 22 (60 eq 40 eq)
Conjugados de anticuerpos (rituximab)
Rituximab (Roche-Rituxan, número de lote: B6105B92UI) formulado en polisorbato 80 (0.7 mg/ml) con citrato de sodio deshidratado (7.35 mg/ml), cloruro de sodio (9 mg/ml) y agua.
Método general para la conjugación directa con lisina de rituximab a ligadores que contienen N-hidroxisuccinimida (Ejemplo 25)
Se ajustó el pH del rituximab a pH = 7.9 con tampón de fosfato 500 mM (NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH = 8).
La disolución anterior de rituximab se incubó con 40 equivalentes molares de la Preparación 22 con codisolvente de DMF al 10% v/v durante 2 horas a 30 °C seguido de una segunda adición de 40 equivalentes molares de la Preparación 22 (con el 4% v/v de DMF). La reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de glicina a 1 mM y los conjugados se intercambiaron con tampón en PBS y se diafiltraron para eliminar el exceso de ligador.
Ejemplo 25
Figure imgf000055_0002
Av. PLA: 20; Av. número total de unidades alfa-Gal: 20
Análisis SEC: t. r. = 14.4 minutos, contenido de monómero del 98.5%
Precursor: Preparación 22
Conjugados de fragmentos Fab (rituximab)
Digestión de rituximab a rituximab-Fab
Al rituximab (60 mg, 4.7 mg/ml) se le intercambió de tampón por tampón de digestión (NaPi 20 mM, cisteína 20 mM, EDTA 10 mM a pH = 7) y se concentró a 20 me/ml. La papaína inmovilizada (p/p 1/160,, Thermo Fisher número 20341, carga: 250 ug/ml de resina, actividad: 16-40 BAEE/mg de papaína) se equilibró en tampón de digestión y se incubó con rituximab concentrado a 37 °C durante 5-18 horas. Los productos de la digestión se recogieron por filtración y se eluyeron a través de una columna de proteína A. Los fragmentos Fab que no se unían pasaron a través de la columna y se recogió el flujo. Los fragmentos Fab se sometieron a diafiltración discontinua mediante centrifugación vivaspin (filtro MWCO de 10 kDa) en NaPi 50 mM, NaCl 150 mM y EDTA 2 mM a pH = 8. La concentración final alcanzada fue de 11.7 mg/ml.
La disolución anterior de rituximab-Fab se incubó con 40 equivalentes molares de la Preparación 22 con codisolvente de DMF al 25% v/v durante 2 horas a 30 °C seguido de una segunda adición de 40 equivalentes molares de la Preparación 22 (con el 9% v/v de DMF). La reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de glicina a 1 mM y los conjugados se intercambiaron con tampón en PBS y se diafiltraron para eliminar el exceso de ligador.
Ejemplo 26
Figure imgf000056_0001
Av. PLA: 14; Av. número total de unidades alfa-Gal: 14
Análisis SEC: t. r. = 16.9 minutos, contenido de monómero del 87.5%
Precursor: Preparación 22
Ensayo de citometría de flujo usando anticuerpo IgG alfa-galactosil
Se usó citometría de flujo para demostrar la unión de L (como cetuximab) a un receptor en la estirpe celular humana y F (como la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano). Las células A431 se usan para capturar el mAb de unión a EGFR (cetuximab), ya que se sabe que las células sobreexpresan significativamente el receptor de EGFR. Se usó un anticuerpo secundario IgM antihumano marcado con ficoeritrina (PE) para detectar la unión del anticuerpo IgM alfa-galactosil al compuesto.
Se recogieron células A431 (ATCC CRL-1555) y se resuspendieron a 5 * 106 células/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma D8662) 0.1 % de BSA (albúmina de suero bovino, Sigma A2153). Luego, se incubaron 5 * 105 células con el compuesto a varias concentraciones como se describe a continuación o con tampón solo a temperatura ambiente, agitando a 47 rad/s (450 rpm) durante 1 hora.
Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS BSA al 0.1%, antes de añadir 50 pl de un anticuerpo IgM antialfa-galactosil (anticuerpo absoluto Ab00532-15.0) a 32 pg/ml en PBS 0.1% de BSA e incubando a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron además con 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA antes de tratarlas con 100 pl. de dilución 1:40 de IgM-PE antihumano (Biolegend 314508) a 4 °C durante 1 hora. Después de un lavado final de 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, las células se resuspendieron en 200 pl de Pb S 0.1% de BSA y se evaluaron en un citómetro de flujo (FC500 Beckman Coulter). Los datos de todas las muestras se analizaron en el paquete de software Kaluza (Beckman Coulter).
La Figura 4 demuestra la captura de anticuerpos IgM anti-alfa-galactosil en la superficie celular usando el Ejemplo 1 (Figura 4A), el Ejemplo 2 (Figura 4B), el Ejemplo 3 (Figura 4C), el Ejemplo 4 (Figura 4D), Ejemplo 5 (Figura 4E), Ejemplo 6 (Figura 4F), Ejemplo 7 (Figura 4G) y Ejemplo 8 (Figura 4H) a 10 nM. El desplazamiento de la intensidad de fluorescencia (PE) ocurre debido al evento de unión en cada extremo de la molécula.
Ensayo de citometría de flujo usando anticuerpo IgG anti-alfa-galactosil
Se usó citometría de flujo para demostrar la unión de L (como cetuximab) a un receptor en una estirpe celular humana y F (como la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano). Las células A431 se usan para capturar el mAb de unión a EGFR (cetuximab), ya que se sabe que las células sobreexpresan significativamente el receptor de EGFR. Se usó un anticuerpo secundario IgG alfa-galatosil marcado con ficoeritrina (PE) para detectar la unión del compuesto.
Se recogieron células A431 (ATCC CRL-1555) y se resuspendieron a 5 * 106 células/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma D8662) 0.1 % de BSA (albúmina de suero bovino, Sigma A2153). Luego, se incubaron 5 * 105 células con el compuesto a 10 nM, con tampón solo o 10 nM de cetuximab a temperatura ambiente, agitando a 47 rad/s (450 rpm) durante 1 hora. Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, antes de añadir 50 pl de anticuerpo anti-alfa-galactosil IgG marcado con PE a 575 pg/ml en PBS 0.1% de BSA e incubar a 4 °C durante 1 hora. El anticuerpo IgG anti-alfa galactosil (anticuerpo absoluto Ab00532.10.0) ha sido marcado de manera personalizada con PE por Cambridge Research Biochemicals. Después de un lavado final de 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, las células se resuspendieron en 200 pl de PBS 0.1% de BSA y se evaluaron en un citómetro de flujo (FC500 Beckman Coulter). Los datos de todas las muestras se analizaron en el paquete de software Ataluza (Beckman Coulter).
La Figura 5 demuestra la captura de anticuerpos IgG anti-alfa-galactosil en la superficie celular usando el Ejemplo 1 (Figura 5A), el Ejemplo 2 (Figura 5B), el Ejemplo 3 (Figura 5C) y el Ejemplo 4 (Figura 5D) a 10 nM en comparación con el tampón solo. El desplazamiento de la intensidad de fluorescencia (PE) ocurre debido al evento de unión en cada extremo de la molécula.
La Figura 6 demuestra la captura de anticuerpos IgM anti-alfa-galactosil en la superficie celular usando el Ejemplo 5 (Figura 6A), el Ejemplo 6 (Figura 6B), el Ejemplo 7 (Figura 6C) y el Ejemplo 8 (Figura 6D) a 10 nM en comparación con 10 nM de cetuximab. El desplazamiento de la intensidad de fluorescencia (PE) ocurre debido al evento de unión en cada extremo de la molécula.
Ensayo de citometría de flujo usando anticuerpos alfa-galactosil IgG de células hlVIG y A431
Se usó citometría de flujo para demostrar la unión de L (como fragmento Fab) a EGFR expresado en una estirpe celular humana (A431) y F (como la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo antialfa-galactosil humano). Se usó un anticuerpo secundario IgG antihumano marcado con ficoeritrina (PE) para detectar la unión de anticuerpo IgM alfa-galactosil al compuesto.
Se recogieron células A431 (ATCC CRL-1555) y se resuspendieron a 5 * 106 células/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma D8662) 0.1 % de BSA (albúmina de suero bovino, Sigma A2153). Luego, se incubaron 5 * 105 células con un intervalo de concentraciones del compuesto hasta 1000 nM, con tampón solo o 1000 nM de fragmento Fab no conjugado a temperatura ambiente, agitando a 47 rad/s (450 rpm) durante 1 hora. Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, antes de añadir 50 pl de hM G anti-Gal IgG (70 pg/ml) (purificación personalizada de IVIG humana) en PBS 0.1% de BSA e incubar a 4 °C durante 1 hora.
Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS BSA al 0.1%, antes de añadir 100 pl de anti-IgG-PE secundario (clon HP6017, Biolegend 409393). Las células se incubaron a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad.
Después de un lavado final de 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, las células se resuspendieron en 200 pl de PBS 0.1% de BSA y se evaluaron en un citómetro de flujo (FC500 Beckman Coulter). Los datos de todas las muestras se analizaron en el paquete de software Kaluza (versión 1.5a, Beckman Coulter).
La figura 7 demuestra el reclutamiento dirigido por el compuesto relacionado con la dosis de anticuerpos IgG anti-Gal de hIVIG a células A431 para los Ejemplos 18-23 en comparación con el fragmento Fab no conjugado donde se observa un reclutamiento mínimo.
Ensayo de citometría de flujo usando anticuerpos alfa-galactosil IgG de células A431
Los compuestos se probaron en un intervalo de concentraciones, hasta 1000 nM, siguiendo el protocolo de ensayo de citometría de flujo anterior, en comparación con cetuximab y/o el fragmento Fab no conjugado.
La Figura 8 demuestra el reclutamiento dirigido por el compuesto, relacionado con la dosis, de anticuerpos IgM alfa-galactosil hacia células A431, en comparación con el fragmento Fab no conjugado y/o cetuximab.
Ensayo de citometría de flujo con anticuerpos C3b
Se usó citometría de flujo para demostrar la unión de los compuestos a una estirpe celular de interés y el reclutamiento del componente del complemento C3b a la célula.
Se usaron células A431 para capturar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a EGFR, ya que es bien sabido que las células sobreexpresan significativamente el receptor de EGFR.
Se usó el anticuerpo anti-C3b conjugado con ficoeritrina (PE) para detectar el reclutamiento de moléculas C3b a las células del suero después de la adición del compuesto a concentraciones variables.
Se recogieron células A431 (ATCC CRL-1555) y se resuspendieron a 5 * 106 células/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma D8662) 0.1 % de BSA (albúmina de suero bovino, Sigma A2153). Luego, se incubaron 5 * 105 células con un intervalo de concentraciones del compuesto hasta 1000 ng/ml, con tampón solo o concentraciones variables de cetuximab fragmento Fab y/o cetuximab a temperatura ambiente, agitando a 47 rad/s (450 rpm) durante 1 hora. Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, antes de añadir 100 pl de PBS y 100 pl de suero humano (SH) al 20% (Patricell 23590) o suero humano inactivado por calor (HIHS) con 25 pg/ml de M86 IgM (anticuerpo absoluto) e incubando a 37 °C durante 25 minutos.
Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS BSA al 0.1%, antes de añadir 100 pl de anti-C3b-PE (3E7/C3b, Biolegend 846104). Las células se incubaron a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad. Después de un lavado final de 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, las células se resuspendieron en 200 pl de PBS 0.1% de BSA y se evaluaron en un citómetro de flujo (FC500 Beckman Coulter). Los datos de todas las muestras se analizaron en el paquete de software Kaluza (versión 1.5a, Beckman Coulter).
La Figura 9 demuestra el contenido de depósito de C3b en células A431 con concentraciones variables de los Ejemplos 13-17, 20, 22, 23 y 24, en comparación con el fragmento Fab de cetuximab y/o cetuximab. Se observó un desplazamiento de <5 veces sobre el fondo para todos los ejemplos cuando se empleó suero humano inactivado por calor (aquí se muestran los datos HI HS representativos).
Fagocitosis de células diana por macrófagos
La fagocitosis se usó para demostrar el efecto funcional de la unión de L (como el fragmento Fab de cetuximab) a un receptor en una estirpe celular y F (como la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo humano anti-alfa-galactosil). Las células A431, de las que se ha informado que expresan EGFR, se usaron como células diana. Se usaron macrófagos derivados de monocitos como células efectoras. Se usó hlVIG purificada como fuente de anticuerpos anti-Gal. El aumento medido en la intensidad integrada se produce debido a la fagocitosis de las células diana. No se observa dicho aumento en condiciones de control (células solas o en presencia del fragmento Fab no conjugado). Las células efectoras se diferenciaron in situ en placas de 96 pocillos (Corning 3603). Brevemente, la sangre de cada donante sano retenida en una cámara del sistema de leucorreducción se adquirió del Servicio Nacional de Salud (Hospital de Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) se aislaron usando el sistema Lymphoprep™ siguiendo las instrucciones del fabricante (STEMCELL Technologies 07861). Los monocitos se aislaron de PBMC mediante selección positiva usando el EasySep™ Human CD14 Positive Selection Kit II (STEMCELL Technologies 17858), resuspendidos en ImmunoCult™-SF Macrophage Medium (STEMCELL Technologies 10961) complementado con GM-CSF humano recombinante (Peprotech 300-03) a 100 ng/ml y se sembraron en placa a 20000 células/pocillo en una incubadora de cultivo celular (5% de CO2, 37 °C). Después de 5 días de diferenciación, los macrófagos se polarizaron hacia el fenotipo M1 con 100 ng/ml de IFN-y (Peprotech 300-02) y 1 ng/ml de lipopolisacárido (Invitrogen tlrl-eblps) durante dos días más. Se cultivaron células A431 (ATCC CRL-1555) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco® 61965-026) complementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco® 10500-064), y se usaron como células diana. Las células diana se recogieron usando un tampón de disociación celular (Gibco® 13151014), se contaron y marcaron con éster pHrodo Green STP 10 mM (Thermo Fisher Scientific P35369) a 1 pl por 1.0 x106 células durante 30 minutos a 37 °C. Las células se lavaron en medio completo, se contaron y luego se trataron con un intervalo de concentraciones del Ejemplo 23, Ejemplo 20 o cetuximab-Fab durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación.
Luego, las células se lavaron en medio libre. Se incubaron con 70 pg/ml de hIVIG (purificación personalizada de IVIG humana) durante 30 minutos en hielo, se lavaron en disolución de fosfato de Dulbecco (Gibco® 14190­ 094) y se cocultivaron con células efectoras (proporción diana:efector 5:1) durante un máximo de 12 horas a 37 °C enIncuCyte® (Sartorius). Las imágenes se adquirieron cada dos horas. Los datos se analizaron usando el software lncuCyte®ZOOM (versión 2016A, Sartorius). Los gráficos se produjeron con GraphPad Prism (versión 6).
La Figura 10 demuestra la fagocitosis mediada por compuestos representativos en presencia del Ejemplo 20 y el Ejemplo 23 1 nM, en comparación con el fragmento Fab no conjugado. Las células diana (células a 431 que expresan EGFR) fueron fagocitadas por las células efectoras (macrófagos). El aumento de la intensidad integrada se produce debido a la fagocitosis impulsada por compuestos de las células diana.
Ensayo de citometría de flujo usando anticuerpo IgG alfa-galactosil en células Raji
Se usó citometría de flujo para demostrar la unión de L (como rituximab or rituximab Fab) a un receptor en una estirpe celular humana y F (como la molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfagalactosil humano). Las células Raji se usan para capturar el mAb o Fab que se une a CD20, ya que es bien sabido que las células sobreexpresan significativamente el receptor CD20. Se usó un anticuerpo secundario IgM antihumano marcado con ficoeritrina (PE) para detectar la unión de anticuerpo IgM alfa-galactosil al compuesto.
Se recogieron células Raji (ATCC® CCL-86™) y se resuspendieron a 5 * 106 células/ml en disolución salina tamponada con fosfato (Pb S) (Gibco® 14190-094) 0.1% de BSA (albúmina de suero bovino, Sigma A2153). Luego, se incubaron 5 * 105 células con el compuesto a varias concentraciones como se describe a continuación o con tampón solo a temperatura ambiente, agitando a 47 rad/s (450 rpm) durante 1 hora.
Las células se lavaron con 2 * 200 pl de PBS BSA al 0.1%, antes de añadir 50 pl de un anticuerpo IgM antialfa-galactosil (anticuerpo absoluto Ab00532-15.0) a 32 pg/ml en PBS 0.1% de BSA e incubando a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron además con 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA antes de tratarlas con 100 pl de dilución 1:40 de IgM-PE antihumano (Biolegend 314508) a 4 °C durante 1 hora. Después de un lavado final de 2 * 200 pl de PBS 0.1% de BSA, las células se resuspendieron en 200 pl de Pb S 0.1% de BSA y se evaluaron en un citómetro de flujo (BD FACSVerse™, BD). Los datos de todas las muestras se analizaron en el paquete de software FlowJo®, LLC. Los gráficos se produjeron con GraphPad Prism (versión 6).
La Figura 11 demuestra el reclutamiento dirigido por el compuesto, relacionado con la dosis, de anticuerpos IgM alfa-galactosil contra células Raji, en comparación con rituximab y su fragmento Fab.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000060_0001
en donde L representa un resto de unión seleccionado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo;
51 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2)a- o -(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d, en donde uno a diez de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -O-, -S-, =N(H)-, -C(=O)-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona;
a representa un número entero seleccionado de 1 a 35;
b representa un número entero seleccionado de 0 a 5;
c representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
d representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
52 representa un espaciador seleccionado de un grupo -(CH2)e- o -(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)-;
e representa un número entero seleccionado de 1 a 15;
f representa un número entero seleccionado de 1 a 10;
g representa un número entero seleccionado de 1 a 20;
h representa un número entero seleccionado de 1 a 5;
z representa un número entero seleccionado de 1 a 30;
X1 representa un resto de fijación de fragmento de unión a anticuerpo o antígeno;
Y1 e Y2 representan independientemente una unión, un grupo -O-, -S-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -NHSO2-, -SO2NH- o -NHC(O)NH-;
F representa una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano; m representa un número entero seleccionado de 1 a 5; y
Cy representa fenilo, bifenilo, trifenilo, de tal modo que cuando Cy representa bifenilo o trifenilo, dicho grupo -Y1-S1-X1-L puede estar presente en cualquiera de dichos anillos fenilo y dicho grupo o grupos [F-S2-Y2]mpueden estar presentes en cualquiera de dichos anillos fenilo.
2. El compuesto como se define en la reivindicación 1, en donde:
S1 representa un espaciador seleccionado de:
- (CH2)a-, en donde uno a cinco (tales como 2, 3 o 5) de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -S-, =N(H)-, -C(=O)-, -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona (como -(CH2)2-NHCO-ciclohexil-CH2-3-pirrolidin-2,5-diona-, -(CH2)2-NHCO-ciclohexil-CH2-3-pirrolidin-2,5-diona-S-(CH2)3-C(=NH)- o -(CH2)2-NHCO-(CH2)a-CO-); o
- (CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-, en donde uno a cinco (tal como 2) de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -NHC(O)- o pirrolidin-2,5-diona (tal como -(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-3-pirrolidin-2,5-diona-); y/o
X1 representa -S- o -N(H)-; y/o
a representa un número entero seleccionado de 1 a 30; o 2 a 30; o 2, 4, 6, 9, 11, 18 o 30; o 6 a 30; o 6, 11, 18 o 30; o 5 a 15; o 6 a 11; o 6, 7 u 11; o 6; o 7; u 11; y/o
b representa un número entero seleccionado de 0 a 3; o 0 o 3; o 1 a 3; o 2 o 3; o 3; y/o
c representa un número entero seleccionado de 1 a 15; o 1 a 12; o 4 a 12; o 4 o 12; o 4; y/o
d representa un número entero seleccionado de 1 a 15; o 2 a 13; o 2, 5 o 13; o 13; o 3; y/o
Y1 representa una unión, -C(O)NH- u -O-; o -C(O)NH-; y/o
S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2-, - (CH2)3-, -(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-, -(CH2)3-NH-CH2- o-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-); o
-(CH2)HCH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno a tres grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-, -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2- o -(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-);
o S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2-están opcionalmente sustituidos por un grupo -C(O)NH-o -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2-, -(CH2)3-NHCO-, -(CH2)3-, - (CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2- o -(CH2)3-Nh -CH2-) o -(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2-están opcionalmente sustituidos por un grupo -c (o )NH- o -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2- o -(CH2)4-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-);
o S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2- o -(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-); o
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno a tres grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-, -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2- o -(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-);
o S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2-); o
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde uno a tres de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno a tres grupos -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-;
o S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno o dos , tal como uno, de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por uno o dos grupos, tal como uno, seleccionados de -N(H)-, -C(O)NH- y- NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2-); o S2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-CH2-); o
-(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)- (tal como -(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-); y/o
e representa un número entero seleccionado de 1 a 10; o 3 a 10; o 3, 5, 9 o 10; o 5 a 9; o 5 o 9; o 4 a 10; o 4, 5 o 10; o 5; y/o
f representa un número entero seleccionado de 1 a 8; o 2 a 8; o 2 a 6; o 4 a 8; o 4 o 8; o 4; y/o
g representa un número entero seleccionado de 1 a 15; o 4 a 12; o 4 o 12; o 1 a 5; o 1 a 4; o 4; y/o h representa un número entero seleccionado de 1 a 4; o 4; y/o
Y 2 representa una unión, -O- o -NHC(O)-; o una unión u -O-; u -O-; y/o
m representa un número entero seleccionado de 1 a 4; o 1 a 3; 1 o 3; o 2 o 3; o 1 o 2; o 1; o 2; o 3; o 4; y/o z representa un número entero seleccionado de 2 a 20; o 2; o 4.9; o 5; o 7; o 8; o 10; o 11; o 14; o 15; o 17; o 20; y/o
Cy representa fenilo o bifenilo; o bifenilo o trifenilo; o fenilo o trifenilo; o bifenilo.
3. El compuesto como se define en la reivindicación 1, que es un compuesto de fórmula (I)a o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000062_0001
L representa un resto de unión seleccionado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; 5 1 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)a-, en donde 2, 3 o 5 de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -S-, =N(H)-, -C(=O)- , -NHC(O)-, ciclohexilo o pirrolidin-2,5-diona; o
-(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-, en donde dos de dichos grupos -CH2- pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos seleccionados de -NHC(O) - o pirrolidin-2,5-diona;
a representa un número entero seleccionado de 6, 7 u 11;
b representa un número entero seleccionado de 3;
c representa un número entero seleccionado de 4;
d representa un número entero seleccionado de 3;
5 2 representa un espaciador seleccionado de:
-(CH2)e-, en donde uno de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)-; o -(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-, en donde dos de dichos grupos -CH2- están opcionalmente sustituidos por un grupo -NHC(O)-;
e representa un número entero seleccionado de 5;
f representa un número entero seleccionado de 4;
g representa un número entero seleccionado de 4;
h representa un número entero seleccionado de 4;
z representa un número entero seleccionado de 2 a 20;
X1 representa -S- o -N(H)-;
Yi representa -C(O)NH-;
Y2 representa -O-;
F representa una molécula de carbohidrato capaz de unirse a un anticuerpo anti-alfa-galactosil humano; m representa un número entero seleccionado de 1 a 3; y
Cy representa bifenilo, de tal modo que dicho grupo -Y1-S1-X1-L puede estar presente en cualquiera de dichos anillos fenilo y dicho grupo o grupos [F-S2-Y2]m pueden estar presentes en cualquiera de dichos anillos fenilo.
4. El compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es: un anticuerpo policlonal; o
un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo murino o un anticuerpo quimérico.
5. El compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de unión a antígeno (Fab) o un fragmento variable de cadena única (scFv), tal como en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y scFv.
6. El compuesto según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de un anticuerpo EGFR o un fragmento del mismo, como cetuximab, cetuximab Fab o nimotuzumab, en particular, un anticuerpo EGFR o fragmento de los cuales tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID números 1 a 4.
7. El compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de un anticuerpo CD20 o un fragmento del mismo, tal como rituximab o rituximab Fab.
8. El compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de un anticuerpo específico de patógeno o un fragmento del mismo.
9. El compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde F se selecciona de galactosil-alfa-1,3-galactosil-beta-1,4-N-acetilglucosamina, alfa-1,3-galactobiosa, alfa-1,3-beta-1,4-galactotriosa o galilipentasacárido.
10. El compuesto como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se selecciona de uno cualquiera de los Ejemplos 1-26:
Ejemplo 1
Figure imgf000063_0001
Ejemplo 3
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
11. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que de manera opcional comprende adicionalmente otro u otros agentes terapéuticos más.
12. El compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.
13. El compuesto como se define en la reivindicación 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de:
cáncer, como cánceres hematológicos, en particular, leucemias y linfomas; o
una infección bacteriana.
14. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1, que comprende:
(a) preparar un compuesto de fórmula (IA) en donde X 1 representa -S- haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (III)en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno contiene al menos un grupo tiol
Figure imgf000069_0002
en donde F, S2, Y2, m, Cy, Y1 and S1 son como se definieron en la reivindicación 1; o
(b) preparar un compuesto de fórmula (IC) en donde X 1 representa -NH2 y S1 contiene -S-CH2-CH2-CH2-C(=NH)-, haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IIIA) en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno contiene al menos un grupo tiol reactivo con un compuesto de fórmula (II) en donde S1 termina con pirrolidin-2,5-diona:
Figure imgf000069_0003
en donde F, S2, Y2, m, Cy, Y1, S1 y L son como se definieron en la reivindicación 1; o
(c) preparar un compuesto de fórmula (IB) en donde X 1 representa -NH2 haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IIB) en donde S1 termina con un grupo N-hidroxisuccinimida con compuestos de fórmula (IIIB) en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno contiene al menos un grupo amino reactivo:
Figure imgf000070_0001
(d) interconvertir un compuesto de fórmula (I) o derivado protegido del mismo en un compuesto adicional de fórmula (I) o derivado protegido del mismo.
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