CN110753546A - 治疗或预防急性肺损伤的化合物、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括使用MAP3K2/MAP3K3抑制剂预防或治疗急性肺损伤的方法。本发明进一步包括在本发明中有用的组合物和包括组合物的试剂盒。

Description

治疗或预防急性肺损伤的化合物、组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年4月17日提交的美国临时申请号62/486,232的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
关于联邦资助的研究和开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的HL135805的政府支持下做出的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
据报道，在美国，急性肺损伤(ALI)及其更严重的形式，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发病率约为每年20万，死亡率约为40％。该疾病是肺对直接或间接损害的炎症反应的临床表现，并且特征在于由于弥漫性肺泡损伤、嗜中性炎症和肺中富蛋白质的水肿导致的严重的低氧血症和肺顺应性的显著降低。这些病症的护理很大程度上取决于支持措施。当前缺少有效的药理干预。在患有ALI/ARDS的患者中测试的药理疗法未能降低死亡率。因此，对于该疾病的治疗干预存在明显未满足的医学需求。
ALI的标志之一是肺中嗜中性粒细胞大量存在。中性粒细胞是人体循环中最丰富的白细胞，在抵抗微生物感染的先天免疫中发挥重要作用，并且还导致与炎症相关的组织损伤。在炎症期间，嗜中性粒细胞通过多步骤的过程从循环中募集到损伤和感染的部位，该多步骤的过程包括滚动和牢固粘附在内皮细胞上、血管内蠕动、血球渗出和血管外趋化性。嗜中性粒细胞一旦到达该部位，便会执行许多任务，包括吞噬作用、释放预先形成的颗粒酶以及产生活性氧种类(ROS)。有证据表明嗜中性粒细胞与ALI/ARDS的发病机理有关。尽管嗜中性粒细胞穿过肺泡上皮细胞不会直接引起肺上皮通透性的增加，但是嗜中性粒细胞在肺部水肿中发挥重要作用，其潜在机制尚不完全理解。
尽管嗜中性粒细胞胞外诱捕器和颗粒酶比如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶有助于ALI的病理，包括肺部水肿，但是ROS在ALI/ARDS中的任何作用仍是有争议的。嗜中性粒细胞主要通过吞噬细胞NADPH氧化酶产生ROS，吞噬细胞NADPH氧化酶是NOX家族的成员。它由四种细胞溶质组分(p47phox、p67phox、p40phox和Rac)和两种膜亚基(gp91phox/NOX2和p22phox)组成。当细胞被刺激比如化学诱导剂活化时，细胞溶质组分被募集到膜组分以形成活性全酶，以产生ROS。关键的活化事件之一是细胞溶质p47phox亚基被包括PKC的蛋白激酶磷酸化。磷酸化破坏了涉及内部SH3域的自抑制分子内相互作用，导致其与活化NADPH氧化酶所需的p22phox相互作用。
MAP3K2和MAP3K3是MAP3K超家族的MEK激酶(MEKK)亚组的两个高度保守的成员。它们包含在C末端的激酶域和在N末端附近的PB1域。MAP3K2和MAP3K3的激酶域共享94％的序列同一性，并且预期这两种激酶共享底物。激酶在体外的瞬时表达导致ERK1和ERK2、p38、JNK和ERK5的自动活化和活化。在小鼠中，这些激酶参与心血管发育、淋巴细胞分化和NF-κB调节。然而，尚未研究它们在原代髓样细胞生物学或ALI中的作用。
本领域中需要鉴定可用于治疗或预防患有那些疾病的患者中的ALI/ARDS的新型治疗处理。本发明解决并满足该需求。
发明内容
本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防急性肺损伤(ALI)的方法。本发明进一步提供了在有需要的受试者中治疗或预防肺纤维化的方法。本发明进一步包括一种试剂盒，其包括在本发明的方法中有用的化合物或组合物。
在某些实施方式中，该方法包括将治疗有效量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者。在其他实施方式中，施用途径是口服的。在其他实施方式中，施用途径是肠胃外的。在又其他实施方式中，施用途径是经鼻的。在又其他实施方式中，施用途径是吸入的。在又其他实施方式中，施用途径是气管内的。在又其他实施方式中，施用途径是肺内的。在又其他实施方式中，施用途径是支气管内的。在又其他实施方式中，施用途径选自口服、肠胃外、经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内。在又其他实施方式中，施用途径选自经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内。在又其他实施方式中，使用喷雾器进行施用。
在某些实施方式中，受试者处于重症监护室(ICU)或急诊室(ER)中。在其他实施方式中，急性肺损伤是急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。
在某些实施方式中，受试者被进一步施用治疗、预防或减轻急性肺损伤的症状的至少一种另外的药剂和/或疗法。在其他实施方式中，受试者被进一步施用治疗、预防或减轻肺纤维化的症状的至少一种另外的药剂和/或疗法。
在某些实施方式中，将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物以选自下列的频率施用至受试者：约每天三次、约每天两次、约每天一次、约每两天一次、约每三天一次、约每四天一次、约每五天一次、约每六天一次和约每周一次。在其他实施方式中，将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物配制为干粉掺混物。
在某些实施方式中，将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者不引起与将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物口服/全身施用至患有癌症的受试者相关联的至少一种显著的不良反应、副作用和/或毒性。在其他实施方式中，至少一种不良反应、副作用和/或毒性选自肝毒性、延长的QT间隔和尖端扭转、出血事件、减少或阻碍凝固、动脉血栓形成事件、胃肠穿孔或瘘管、高血压、甲状腺功能减退、蛋白尿、腹泻、头发颜色变化、恶心、厌食和呕吐。
在某些实施方式中，向受试者给药一定量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物，该量低于向患有癌症的受试者口服/全身给药用于癌症治疗的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的量。
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在其他实施方式中，哺乳动物是人。
在某些实施方式中，试剂盒包括帕唑帕尼或其盐或溶剂化物。在其他实施方式中，试剂盒包括施用器。在又其他实施方式中，试剂盒包括其使用说明材料。在又其他实施方式中，试剂盒包括治疗、预防或减轻急性肺损伤和/或肺纤维化的症状的至少一种另外的药剂。在又其他实施方式中，说明材料包括用于治疗或预防受试者中的急性肺损伤和/或肺纤维化的说明书。
本发明进一步提供了一种评估药物在治疗ALI中的疗效的方法。在某些实施方式中，该方法包括使嗜中性粒细胞与药物接触，并在接触之后测量嗜中性粒细胞ROS产生水平。在其他实施方式中，如果在接触之后嗜中性粒细胞ROS产生水平增加，则该药物在治疗ALI中是有效的。
本发明进一步提供了评估药物在治疗患有ALI的受试者中的疗效的方法。在某些实施方式中，该方法包括在施用药物之后测量受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平。在其他实施方式中，如果在施用药物之后受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平高于在施用药物之前受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平，则该药物在治疗受试者中的ALI中是有效的。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的具体实施方式的以下详细描述。出于阐明本发明的目的，在附图中显示了具体实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所显示的实施方式的精确布置和手段。
图1A-1H图解了造血细胞中MAP3K2和髓样细胞中MAP3K3的损失减轻了LPS诱导的肺损伤。图1A图解了HS-DKO嗜中性粒细胞中MAP3K2和3蛋白质的损失。图1B图解了HS-DKO小鼠中降低的肺部通透性。经由鼻内途径用LPS处理HS-DKO和对照WT小鼠。通过在损伤诱导后24小时测量BAL的荧光来测定对FITC标记的白蛋白的肺通透性。图1F图解了HS-DKO小鼠中降低的肺通透性。经由口腔气管插管用HCl处理HS-DKO和对照WT小鼠。通过在损伤诱导后6小时测量BAL的荧光来测定对FITC标记的白蛋白的肺通透性。数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝8)。图1C-1D和1G分别图解了来自图1B和图1F的肺样品的代表性组织学。Br，支气管；V，血管；*，水肿。图1E图解了患有LPS诱导的肺损伤的HS-DKO小鼠显示出延长的存活率，并且图1H图解了患有HCl诱导的肺损伤的HS-DKO小鼠显示出延长的存活率。如图1B和图1F中处理小鼠，并观察其存活率(Mantel-Cox对数秩检验)。
图2A-2K图解了MAP3K2/3-无效嗜中性粒细胞显示正常的趋化性、内皮细胞粘附、整联蛋白表达和活化、浸润和脱粒的发现。图2A-2D图解了MAP3K2/3-无效嗜中性粒细胞显示正常的趋化性的发现。在图2A-2B中显示了来自Dunn室趋化性试验的代表性细胞迁移迹线。在图2C-2D中显示了细胞移动有多快以及它们遵循化学引诱物梯度有多好的易位和方向性参数。n＝50。图2E图解了在剪切流下嗜中性粒细胞与内皮细胞的粘附。n＝3。图2F-2G图解了LFA-1和MAC-1整联蛋白在嗜中性粒细胞上的细胞表面表达。n＝3。图2H图解了嗜中性粒细胞与ICAM-1的结合，这反映了在活化后整联蛋白对嗜中性粒细胞的亲和力。n＝3。图2I图解了嗜中性粒细胞浸润到发炎的腹膜中。n＝5。图2J-2K图解了在刺激后从嗜中性粒细胞细粒释放MMP和MPO。n＝3。
图3A-3E图解了MAP3K2/3依赖激酶活性抑制从嗜中性粒细胞释放ROS的发现。图3A图解了MAP3K2/3的损失增加从嗜中性粒细胞释放ROS的发现。左图中显示了代表性的ROS测量迹线，而右图中总结了从超过五只小鼠的迹线下面积计算出的ROS量(数据表示为平均值±标准误，学生t检验，*p<0.05，n＝3)。重复实验至少3次。图3B图解了WTMAP3K3而不是其激酶死突变体的表达抑制DKO嗜中性粒细胞中ROS产生的发现。用GFP、MAK3K3-GFP、与GFP融合的MAP3K3激酶死(KD)突变体或PB1域-缺失突变体的质粒瞬时转染嗜中性粒细胞。第二天，将GFP阳性细胞分选并用于ROS释放试验。通过Western分析检测MAP3K3及其突变体的表达。数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝3)。图3C-3E图解了在LPS诱导的肺损伤中超氧化物清除剂BHA消除HS-DKO和对照WT小鼠之间的差异的发现。膳食中含有BHA的小鼠遭受LPS诱导的肺损伤。n＝5。
图4A-4G图解了MAP3K3使p47phox的S208磷酸化以抑制NADPH氧化酶活性的发现。图4A图解了MAP3K3使p47phox磷酸化的发现。使用从HEK293细胞免疫沉淀的重组MAPK3K3和NADPH氧化酶亚基进行体外激酶试验。用HA标记瞬时表达NADPH氧化酶亚基，并使用抗HA抗体进行免疫沉淀。图4B图解了MAP3K3使p47phox的S208磷酸化的发现。使用重组MAP3K3和含有两个SH3域的野生型(WT)或S208E突变的(SE)p47phox(残基151-286)的GST融合片段(p47SH3)进行体外激酶试验。磷酸化的定量通过磷光影像分析仪完成。图4C图解了在重组的ROS产生试验中p47phox的Ser-208的磷酸模拟突变导致降低的活性的发现。COS-7细胞用p22phox、p67phox和p97phox的质粒以及WT p47phox或其S208A(SA)或S208E(SE)突变体一起共转染。显示了PMA诱导的ROS产生。数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝5)。图4D图解了MAP3K3抑制WT p47phox而不是其S208A突变体的发现。在存在或缺少MAP3K3的情况下，COS-7细胞用p22phox、p67phox和p97phox的质粒与WT p47phox(左图)或其S208A(右图)突变体一起共转染。显示了PMA诱导的ROS产生。数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝5)。图4E图解了p47phox的Ser-208的磷酸模拟突变削弱了与p22phox的相互作用的发现。使用携带p22phox(p22C)的Ser-208和MBP融合C端(残基96-164)的Ala或Glu取代的重组GST-p47SH3进行GST下拉试验。Western分析用于检测蛋白质。图4F图解了通过fMLP刺激p47phox的Ser-208的磷酸化的发现。用fMLP(1μM)刺激嗜中性粒细胞不同的持续时间，接着进行Western分析。图4G图解了FMLP-刺激的p47phox磷酸化依赖于MAP3K2/3的发现。
图4H-4K图解了在体外激酶试验中帕唑帕尼通过MEKK2或3抑制p47phox的磷酸化的发现。在存在ATP的情况下，将由大肠杆菌表达系统制备的重组p47phox与重组MAP3K2或3在37℃下温育30分钟。通过蛋白质印迹分析蛋白质。MAP3K2抑制p47的磷酸化的IC50约为20nM，而MAP3K3的IC50约为10nM。这些数字远低于先前报道的帕唑帕尼通过MAP3K2对ATP结合或MEK5磷酸化的MEK5的影响值(图4J-4K)，其高于500nM，参见Ahmad等，2013，J.Biomol.Screen.18:388。
图5A-5F图解了帕唑帕尼抑制MAP3K2/3并诱导类似于遗传MAP3K2/3失活的表型的发现。图5A图解了帕唑帕尼抑制p47phox的Ser-208的磷酸化的发现。在被fMLP(1μM)刺激之前，将嗜中性粒细胞用帕唑帕尼(pazo)预处理10分钟，然后进行Western分析。图5B-5C图解了帕唑帕尼依赖于MAP3K2/3增加嗜中性粒细胞释放ROS的发现。在通过fMLP(1μM)刺激和ROS测量之前，将嗜中性粒细胞用帕唑帕尼(图5C中为20nM)预处理10分钟。数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝3)。图5D-5E图解了帕唑帕尼治疗减轻LPS诱导的肺损伤的发现。在通过LPS诱导肺损伤之前两天，经管饲法用60mg/Kg/天的帕唑帕尼治疗小鼠(C57B1雌性)。在肺损伤诱导后一天，研究肺通透性(图5D)和组织学(图5E)。重复实验两次，结果相似。将来自一个实验的数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝5)。图5F图解了发现帕唑帕尼治疗降低了患有LPS诱导的肺损伤的小鼠的死亡率。如上所述处理C57B1小鼠，并通过Mantel-Cox对数秩检验分析其存活率。
图6包括小图A-D，图解了在HS-DKO的LPS-损伤的肺中AKT被超活化的发现。用磷酸-AKT和CD31(小图A-B)或平滑肌肌动蛋白(SMA；小图C-D)对LPS损伤的肺切片染色。在CD31(比较实心三角形)和与血管(V)相邻的SMA染色(比较空心三角形)共同染色的区域中，磷酸-AKT染色升高。相比之下，HS-DKO和WT样本在肱骨壁上的磷酸-AKT染色(实心箭头)和在肱骨壁旁边由SMA染色的肱骨平滑肌细胞(空心箭头)保持相同。在图13A-13F中显示了单独的CD31和SMA染色的图像。
图7A-7D图解了缺少MAP3K2/3的嗜中性粒细胞经由H2O2增加内皮细胞中的AKT活化的发现。图7A图解了描述MAP3K2/3抑制如何导致嗜中性粒细胞的ROS产生增加和内皮细胞以及周细胞中的AKT超活化的非限制性模型。不希望受到任何理论的限制，AKT的超活化会导致改善的血管完整性和降低的通透性，因此在ALI期间更健康的肺。图7B-7C图解了发现，与WT嗜中性粒细胞相比，MAP3K2/3-缺陷嗜中性粒细胞(DKO)的共培养引起更高的AKT磷酸化，并且过氧化氢酶(Cat)，而不是超氧化物歧化酶(SOD)的存在消除了AKT磷酸化的这种差异。图7D图解了在存在或缺少SOD的情况下与WT或DKO嗜中性粒细胞共培养的小鼠肺内皮细胞的TEER测量。箭头指示添加中性粒细胞的时间点。
图8A-8E图解了造血细胞中的MAP3K2和髓样细胞中的MAP3K3的损失不影响LPS损伤的肺的BALF中浸润的髓样细胞的数量或细胞因子的含量。图8A图解了LPS诱导的肺损伤模型的验证。经由鼻内途径用LPS治疗小鼠。在损伤诱导后24小时，通过测量BALF中的荧光来确定FITC标记的白蛋白的肺通透性。数据表示为平均值±标准差(学生t检验，n＝4)。n＝5。图8B至图8E图解了如何通过流式细胞仪(图8A-8D)和通过ELISA(图8E)分析来自图1A-1E中描述的小鼠的整个肺。
图8F-8J图解了造血细胞中MAP3K2和髓样细胞中的MAP3K3的损失不影响HCl损伤的肺的BALF中浸润的髓样细胞的数量或细胞因子的含量。图8F示出了HCl诱导的肺损伤模型的示意图。图8H-8J图解了如何通过流式细胞仪(图8G-8I)和通过ELISA(图8J)分析整个肺。
图9A-9B图解了在fMLP刺激后ROS从缺少MAP3K2或MAP3K3的嗜中性粒细胞的释放。
图10A-10D图解了在COS-7细胞中重组的ROS生产系统的验证。图10A-10B：如附图中所指示，用NANPH氧化酶亚基的质粒转染COS-7细胞，并且用PMA处理或不用PMA处理。测定ROS的产生和蛋白质表达。图10C图解了WT MAP3K3，而不是其激酶致死突变体，可以抑制重组的COS-7系统中的ROS产生的发现。图10D图解了描绘MAP3K2/3如何抑制ROS的产生的非限制性的示意模型。
图11图解了抗磷酸-S208p47phox抗体的验证。用WT或激酶致死的MAP3K3与WT或S208A p47phox一起共转染HEK293细胞。在第二天进行Western分析。
图12A-12K图解了LPS通过增加肺部通透性诱导肺损伤的发现。图12A-12B图解了帕唑帕尼抑制人嗜中性粒细胞的MEKK3并增加ROS产生的发现。在存在和缺少20nM帕唑帕尼的情况下，用fMLP(100nM)刺激人嗜中性粒细胞。图12B中的数据表示为平均值±标准差(*，P<0.05，学生t检验；n＝5)。图12C-12D图解了BHA消除帕唑帕尼对肺通透性的影响的发现。HS-DKO小鼠以常规咀嚼或含BHA的咀嚼喂养，并且在LPS诱导肺损伤前两天开始经管饲法用60mg/Kg/天的帕唑帕尼治疗。在肺损伤诱导后一天，测定肺通透性。图12C中的数据表示为平均值±标准差(n＝5)。在图12D中显示了代表性的组织学。图12E图解了帕唑帕尼的治疗处理降低了患有LPS诱导的肺损伤的小鼠的死亡率的发现。在通过LPS(80μg/g，32mg/ml)诱导肺损伤后24小时，用1.5mg/Kg帕唑帕尼经鼻内治疗小鼠(C57B1雌性，8周)，并通过Mantel-Cox对数秩检验分析其存活率。图12F-12G图解了帕唑帕尼治疗减轻HCl诱导的肺损伤的发现。在通过HCl(0.05M，2.5μl/g)诱导肺损伤后1小时，用1.5mg/Kg帕唑帕尼经鼻内治疗小鼠(C57B1雌性，8周)。在肺损伤诱导之后六小时，研究肺通透性(图12D)和组织学(图12E)。重复实验两次，结果相似。来自一个实验的数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝5)。图12H图解了帕唑帕尼治疗降低患有LPS诱导的肺损伤的小鼠的死亡率的发现。在用HCl(0.1M，2.5μl/g)诱导肺损伤后1小时，用2.5mg/Kg帕唑帕尼经鼻内治疗小鼠(C57B1雌性，8周)，并通过Mantel-Cox对数秩检验分析其存活率。图12I-12K图解了帕唑帕尼的预防性治疗降低患有HCl诱导的肺损伤的小鼠的肺通透性和死亡率的发现。图12J图解了帕唑帕尼预处理可减轻HCl诱导的肺损伤的发现。在通过HCl(0.05M，2.5μl/g)诱导肺损伤之前0.5小时，用1.5mg/Kg帕唑帕尼经鼻内处理小鼠(C57B1雌性，8周)。在肺损伤诱导后六小时，研究肺通透性。重复实验两次，结果相似。来自一个实验的数据表示为平均值±标准差(学生t检验，*p<0.05，n＝5)。图12K图解了帕唑帕尼预处理降低患有HCl诱导的肺损伤的小鼠的死亡率的发现。在通过HCl(0.1M，2.5μl/g)诱导肺损伤之前0.5小时，用1.5mg/Kg帕唑帕尼经鼻内治疗小鼠(C57B1雌性，8周)，并通过Mantel-Cox对数秩检验分析其存活率。
图13A-13F图解了通过MAP3K2/3失活磷酸-AKT的超活化。图13A图解了在来自HS-DKO小鼠的LPS诱导的肺的蛋白质提取物中S473处AKT的磷酸化的增加。图13B-13C图解了针对图6，图A-D的LPS损伤的肺切片的单独的CD31和SMA染色的补充图像。图13D-13E图解了帕唑帕尼对来自WT和HS-DKO小鼠的肺样品中AKT磷酸化的影响。图13F图解了AKT抑制剂MK-2206消除了帕唑帕尼对LPS损伤的肺的通透性的影响的发现。在存在或缺少60mg/Kg/天帕唑帕尼的情况下，在通过LPS诱导肺损伤前两天开始经管饲法用MK-2206(10mg/Kg)处理小鼠。n＝5。
图14A-14D图解了通过MAP3K2/3失活来活化Rac1。图14A和14B图解了在来自H2O2诱导的小鼠肺内皮细胞(MLEC)的蛋白质提取物中的Rac1活化。图14C-14D图解了与fMLP诱导的MAP3K2/3缺陷嗜中性粒细胞共培养的MLEC中的Rac1活化。
图15图解了安维汀(Avastin)，VEGF抑制剂对HCl-诱导的急性肺损伤具有有限的作用的发现。
图16A-16E图解了发现帕唑帕尼治疗以治疗方式减轻HC(图16A-16C)或LPS诱导的(图16D-16E)肺损伤的发现。图16A和16D图解了WT和p47-HKO小鼠的治疗结果。图16B至图16C图解了帕唑帕尼对通透性的影响，而图16D-16E图解了帕唑帕尼对存活率的有益作用。图16A、16B和16D图解了ROS产生的关键因素p47phox的损失在HCl诱导的肺损伤中加剧了肺通透性(图16A-16B)并降低了存活率(图16D)的发现。通过HCl诱导的肺通透性(图16C)和存活率(图16E)表明，p47phox的损失消除了帕唑帕尼的治疗作用。
图17是图解伊马替尼(4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-N-(4-甲基-3-{[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)苯甲酰胺，或
Figure BDA0002319097360000071
)治疗不减轻HCl诱导的肺损伤的结果的图。在通过HCl诱导肺损伤之后1小时，用1.5mg/Kg伊马替尼或帕唑帕尼鼻内治疗小鼠(C57Bl雌性，8周)。在肺损伤诱导之后6小时，研究肺通透性(D)和组织学(E)。数据表示为平均值±标准差(学生t检验)。伊马替尼具有加剧损伤的趋势。
图18是图解帕唑帕尼抑制博莱霉素诱导的肺纤维化的结果的条形图。一次用0.05单位博莱霉素处理小鼠(C57Bl雌性，8周)。在一周以后，给小鼠口服60mg/kg帕唑帕尼，持续五天，并且通过测量羟基脯氨酸的水平来确定肺纤维化。
具体实施方式
本发明部分涉及出乎意料的发现：通过MAP3K2和/或MAP3K3抑制从嗜中性粒细胞产生的增加的活性氧种类(ROS)产生在急性损伤期间保护了肺。通常认为ROS会加剧组织损伤。然而，如本文所表明，嗜中性粒细胞中NADPH氧化酶衍生的ROS的适度升高可改善急性肺损伤(ALI)临床表现并降低小鼠的死亡率。MAP3K2和MAP3K3通过在丝氨酸208磷酸化p47phox被鉴定为嗜中性粒细胞NADPH氧化酶的新型负调节剂。缺少MAP3K3及其同系物MAP3K2的嗜中性粒细胞产生大量的ROS，同时显示出正常的趋化性、对内皮细胞的粘附、浸润和脱粒。在小鼠ALI模型中，发现髓样细胞中MAP3K3和造血细胞中MAP3K2的遗传损失可保护小鼠避免肺部水肿和死亡，并伴随着肺血管中增强的AKT活化。这些表型可以通过MAP3K2/3抑制剂帕唑帕尼来概括。
因此，这些目前的研究为ROS在ALI中的作用提供了新的思路，并揭示了调节ROS产生的先前未知的机制。此外，它为ALI的治疗干预提供了潜在的靶标和药物，ALI是一种目前尚缺少药物治疗的威胁生命的疾病。在非限制性方面，这些结果支持将帕唑帕尼雾化施用至患有ALI的受试者的治疗潜力。在某些实施方式中，例如通过治疗，逆转或改善弥漫性肺泡损伤和/或水肿，在受伤的肺内靶向施用帕唑帕尼可减弱或完全消除ALI。
本发明提供了一种在受试者中治疗或预防肺纤维化和/或急性肺损伤的方法，其包括将治疗有效量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者。在某些实施方式中，例如使用吸入器将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物直接递送到肺中。这允许在感染的肺部区域内有效地递送最佳药物剂量，最大化其治疗效果并最小化全身性施用引起的潜在副作用。在某些实施方式中，帕唑帕尼的局部递送使非肺组织中ROS产生增加的任何可能的副作用最小化。
如本文所述，鉴定了在吞噬NADPH氧化酶的负调节中蛋白激酶MAP3K2和3的先前未知的功能。这些激酶使p47phox的Ser-208磷酸化。与先前已知的p47phox中的磷酸化位点相反，该磷酸化阻止了p47phox与p22phox的相互作用并导致NADPH氧化酶活性的抑制(图10D)。如所预期的，MAP3K2/3的遗传损失或它们的药理抑制作用导致增加的ROS产生。增加的ROS保护小鼠免于LPS诱导的ALI。
目前的结果表明，增加的ROS的药理诱导可以在疾病模型中起到保护作用。ROS的不利影响已引起了大部分关注，因为过量的ROS可能会损害脂质、蛋白质和DNA。在本发明之时，尚不清楚ROS产生的增加是否能有效地遏制炎症反应并提供有益的治疗效果，特别是以临床实用的方式。本研究表明，MAP3K2和MAP3K3的遗传或药理抑制会导致嗜中性粒细胞中ROS产生的增加，并减轻小鼠的肺损伤，后者取决于ROS。FDA批准的抑制MAP3K2/3的小分子药物帕唑帕尼在人和小鼠嗜中性粒细胞中均升高ROS，并减轻小鼠中的肺损伤表型，提供了获得治疗益处的临床可行方式。不希望受到任何理论的束缚，一旦它在细胞外释放，ROS就可以转化为H2O2，因为肺组织中大量存在超氧化物歧化酶(SOD)，并且H2O2对肺血管的完整性具有中等水平的保护作用，导致在损伤期间通透性和水肿的降低。在某些非限制性实施方式中，通过MAP3K2/3的遗传损失或其被帕唑帕尼的药理抑制，增加的ROS产生表示最佳的情况，其中ROS足以活化保护性AKT磷酸化，但不是高到足以引起不可逆的损害。在某些实施方式中，嗜中性粒细胞中增加的ROS产生可以用作用于治疗受试者中ALI的药物疗效的读数(readout)。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材料。
如本文所使用，以下每个术语具有与其在该部分中相关的含义。
如本文所使用，冠词“一个(a)”和“一个(an)”用于指代一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
如本文所使用，“约”在指代可测量值比如量、持续时间等时，意指包括与规定值相差±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且仍更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适合执行所公开的方法。
如本文所使用，短语“急性肺损伤”或“ALI”是指由急性低氧性呼吸衰竭伴双侧肺浸润组成的综合征，其与肺部和非肺部风险因素均相关，并且不是主要由于左心房高血压引起的。
如本文所使用，短语“急性呼吸窘迫综合征”或“ARDS”是指特征在于更严重的低氧血症的急性肺损伤的亚型。
如果疾病或病症的症状的严重性、患者经历这种症状的频率或两者都降低，则“减轻”该疾病或病症。
在一个方面，与受试者有关的术语“共同施用的(co-administered)”和“共同施用(co-administration)”是指向受试者施用本发明的化合物或其盐，以及同样可以治疗本发明所考虑的病症或疾病的化合物。在某些实施方式中，作为单一治疗方法的一部分，共同施用的化合物被分开施用或以任何种类的组合施用。可以以任何种类的组合将共同施用的化合物配制成在各种固体、凝胶和液体制剂下的固体和液体的混合物，以及溶液。
如本文所使用，术语“组合物”或“药物组合物”是指在本发明中有用的至少一种化合物与药学上可接受的载体的混合物。药物组合物有利于将化合物施用至患者或受试者。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气溶胶、肠胃外、眼内、经鼻、肺和局部施用。
如本文所使用，“疾病”是其中动物不能维持内稳态的动物的健康状态，并且如果疾病没有得到改善，则动物的健康继续恶化。
如本文所使用，动物中的“病症”是其中动物能够维持内稳态的健康状态，但是与不存在该病症时相比，该动物的健康状态是较不利的。如果不及时治疗，病症不一定会导致动物健康状态进一步下降。
如本文所使用，术语“有效量”、“药物有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需生物学结果的药剂的量。该结果可以是减少和/或减轻疾病的体征、症状或病因，或生物系统的任何其他期望的改变。本领域普通技术人员可以使用常规实验确定在任何个体情况中的适当治疗量。
如本文所使用的术语“说明材料”包括出版物、记录、图表或可用于传达试剂盒中本发明的组合物和/或化合物的有用性的任何其他表达介质。试剂盒的说明材料可以例如粘附(affix)在包含本发明的化合物和/或组合物的容器上，或者与包含化合物和/或组合物的容器一起运输。可选地，说明材料可以与容器分开运输，以使接收者配合地使用说明材料和化合物。说明材料的递送可以例如通过出版物或其他传达试剂盒有用性的表达介质的物理递送，或者可以可选地通过电子传输，例如通过计算机，比如通过电子邮件，或从网站下载实现。
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文可互换使用，并且是指适于本文描述的方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
如本文所使用，术语“帕唑帕尼”是指5-((4-((2,3-二甲基-2H-吲哚-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲苯磺酰胺，或其盐和/或溶剂化物：
Figure BDA0002319097360000101
如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料，比如载体或稀释剂，即，可以将材料施用至个体，而不会引起不期望的生物效应或以有害的方式与其中所包含的组合物的任何组分相互作用。
如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”是指在患者体内或向患者运载或运输本发明中有用的化合物，使得其可以执行其预期的功能的药学上可接受的材料、组合物或载体，比如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或封装材料。通常，将这种构建体从身体的一个器官或一部分运载或运输到身体的另一器官或一部分。从与制剂的其他成分——包括本发明中有用的化合物——相容的意义上讲，每种载体必须是“可接受的”，并且对患者无害。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶(powdered tragacanth)；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；油，比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；乙二醇，比如丙二醇；多元醇，比如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。
如本文所使用，“药学上可接受的载体”还包括与本发明中有用的化合物的活性相容的并且患者生理上可接受的任何和所有包衣、抗细菌和抗真菌剂、吸收延迟剂等。补充活性化合物也可并入组合物中。
“药学上可接受的载体”可以进一步包括在本发明中有用的化合物的药学上可接受的盐。可用于实践本发明的药物组合物中包括的其他其他成分是本领域已知的，并且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Genaro，Ed.，Mack Publishing Co.，1985，Easton，PA)中描述，其通过引用并入本文。
如本文所使用，术语“预防(prevent,preventing or prevention)”是指避免或延迟与在开始施用药剂或化合物时未发展出这种症状的受试者的疾病或病症相关的症状的发作。
如本文所使用，术语“ROS”是指活性氧种类。ROS的非限制性实例是过氧化物、超氧化物、羟基自由基和单线态氧。
术语“盐”包含在本发明的方法中有用的游离酸和/或游离碱的加成盐。术语“药学上可接受的盐”是指具有在药物应用中提供效用的范围内的毒性特征的盐。然而，药学上不可接受的盐可具有特性，比如高结晶度，其在本发明的实践中具有效用，比如例如在本发明的方法中有用的化合物和/或组合物的合成、纯化或配制过程中的效用。可以由无机酸或有机酸制备合适的药学上可接受的酸加成盐。无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸(包括硫酸盐和硫酸氢盐)和磷酸(包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐)。合适的有机酸可以选自脂族、脂环族、芳族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、丙二酸、糖精、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、帕莫酸(embonic)(帕莫酸(pamoic))、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、三氟甲磺酸、对氨基苯磺酸、环己胺磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖和半乳糖醛酸。本发明的化合物和/或组合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括例如金属盐，包括碱金属、碱土金属和过渡金属盐，比如例如钙、镁、钾、钠和锌盐。药学上可接受的碱加成盐还包括由碱性胺制成的有机盐，比如例如N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(也称为N-甲葡糖胺)和普鲁卡因。所有这些盐可已通过使例如，合适的酸或碱与化合物和/或组合物反应由相应地化合物制备。
如本文所使用，化合物的“溶剂化物”是指通过化合物与一个或多个溶剂分子缔合而形成的实体。溶剂化物包括水、醚(例如四氢呋喃、甲基叔丁醚)或醇(例如乙醇)的溶剂化物，乙酸盐等。在某些实施方式中，本文描述的化合物以与溶剂比如水和乙醇的溶剂化形式存在。在其他实施方式中，本文描述的化合物以非溶剂化形式存在。
“治疗性”治疗是施用于表现出病理学迹象的受试者以减少或消除那些迹象的治疗。
如本文所使用，术语“治疗(treatment or treating)”定义为将治疗剂，即本发明的化合物(单独或与另一种药剂组合)应用或施用到患者，或来自患有本文所考虑的病症、本文所考虑的病症的症状或可能发展本文所考虑的病症的患者的分离的组织或细胞系(例如用于诊断或离体应用)应用或施用治疗剂，目的在于缓解、治愈、减轻、解除、改变、补救、改善、改善或影响本文考虑的病症、本文考虑的病症的症状或发展本文考虑的病症的可能性。基于由药物基因组学领域获得的知识，可以具体地调整(tailor)或修改这种治疗。
如本文所使用，术语“特异性结合(specifically bind or specificallybinds)”是指第一分子优先结合第二分子(例如，特定的受体或酶)，但不一定仅结合该第二分子。
本文使用以下非限制性缩写：ALI，急性肺损伤；ARDS，急性呼吸窘迫综合症；BSA，牛血清白蛋白；DMEM，杜氏改良伊格尔培养基；fMLP，N-甲酰基-L-甲硫氨酰基-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸；HBSS，Hanks平衡盐；HRP，辣根过氧化物酶；LPS，脂多糖；MAP3K2或MEKK2，有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶2；MAP3K3或MEKK3，有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶3；MEK，有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶；MEKK，MEK激酶；PBS，磷酸盐缓冲盐水；PFA，多聚甲醛；PMA，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；RBC，红细胞；ROS，活性氧种类；TG，巯基乙酸盐。
遍及本公开内容，可以以范围格式来呈现本发明的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围比如1到6的描述应视为已明确公开了子范围，比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.1、5.3、5.5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
化合物和组合物
在某些实施方式中，帕唑帕尼或其盐或溶剂化物在本发明的方法中是有用的。在其他实施方式中，在美国专利号7,105,530、7,262,203、7,858,626和8,114,885中叙述了本发明中有用的化合物和/或组合物；所有这些通过引用以其整体并入本文。本发明还考虑了包括帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的组合物。
方法
本发明包括在有需要的受试者中预防或治疗急性肺损伤的方法。本发明包括在有需要的受试者中预防或治疗肺纤维化的方法。
在某些实施方式中，该方法包括将治疗上有效量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者。在其他实施方式中，施用途径是口服的。在其他实施方式中，施用途径是肠胃外的。在又其他实施方式中，施用途径是经鼻的。在又其他实施方式中，施用途径是吸入的。在又其他实施方式中，施用途径是气管内的。在又其他实施方式中，施用途径是肺内的。在又其他实施方式中，施用途径是支气管内的。在又其他实施方式中，施用途径选自口服、肠胃外、经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内。在又其他实施方式中，施用途径选自经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内。在又其他实施方式中，使用喷雾器进行施用。在又其他实施方式中，急性肺损伤是急性呼吸窘迫综合症。
在某些实施方式中，将本发明的组合物施用至受试者，约每天三次、约每天两次、约每天一次、约每两天一次、约每三天一次、约每四天一次、约每五天一次、约每六天一次和/或约每周一次。
在某些实施方式中，使用选自经鼻、吸入、气管内、肺内、支气管内和吸入的施用途径在受试者中治疗急性肺损伤所需的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的剂量低于在受试者中口服治疗癌症(比如但不限于晚期肾细胞癌)所需的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的剂量。在其他实施方式中，按照受试者的体重，根据帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的质量，在本发明的方法中使用的剂量与治疗癌症所需的口服剂量为约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或1:100。在又其他实施方式中，药物的剂量为约5-200mg/天。
在某些实施方式中，将化合物和/或组合物施用至受试者不引起与化合物和/或组合物的全身施用相关的显著的不良反应、副作用和/或毒性。不良反应、副作用和/或毒性的非限制性实例包括但不限于肝毒性(其可通过血清转氨酶水平和胆红素的增加来证明和/或检测)、延长的QT间隔和尖端扭转、出血事件、减少或阻碍凝固、动脉血栓形成事件、胃肠穿孔或瘘管、高血压、甲状腺功能减退、蛋白尿、腹泻、头发颜色变化(褪色)、恶心、厌食和呕吐。
在某些实施方式中，受试者在重症监护室(ICU)中接受治疗。在其他实施方式中，受试者在急诊室(ER)中接受治疗。在又其他实施方式中，受试者靠呼吸机维持。
在某些实施方式中，受试者被进一步施用治疗、预防或减轻肺纤维化的症状和/或急性肺损伤的至少一种另外的药剂。
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在其他实施方式中，哺乳动物是人。
本发明进一步提供了一种评估药物在治疗ALI中的疗效的方法。在某些实施方式中，该方法包括使嗜中性粒细胞与药物接触，并在接触之后测量嗜中性粒细胞ROS产生水平。如果在接触之后嗜中性粒细胞ROS产生水平增加，则该药物在治疗ALI中是有效的。
本发明进一步提供了评估药物在治疗患有ALI的受试者中的疗效的方法。在某些实施方式中，该方法包括在施用药物之后测量受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平。如果在施用药物之后受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平高于在施用药物之前受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平，则该药物在治疗受试者中的ALI中是有效的。
试剂盒
本发明包括一种试剂盒，其包括帕唑帕尼或其盐或溶剂化物、施用器和其使用说明材料。试剂盒中包括的说明材料包括用于预防或治疗肺纤维化和/或急性肺损伤，或本发明中考虑的任何其他疾病或病症的说明书。说明材料叙述了应该施用至受试者的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的量和频率。在其他实施方式中，试剂盒进一步包括疗、预防或减轻肺纤维化和/或急性肺损伤的症状的至少一种另外的药剂。
组合疗法
在某些实施方式中，本发明的化合物可与可用于治疗或预防肺纤维化和/或急性肺损伤的至少一种另外的化合物和/或疗法结合用于本发明的方法。这种另外的化合物可以包括本文中鉴定的化合物或已知治疗、预防或减轻肺纤维化和/或急性肺损伤的症状的化合物，例如商业上可获得的化合物。
本发明中考虑的另外的疗法的非限制性实例包括低潮气量通气，这是用于ALI/ARDS的标准护理疗法。
例如，可以使用合适的方法，比如例如Sigmoid-Emax方程(Holford和Scheiner，19981，Clin.Pharmacokinet.6：429-453)、Loewe可加性方程(Loewe和Muischnek，1926，Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114：313-326)和中值效应方程(Chou和Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.22:27-55)计算增效作用。上面提到的每个方程都可以应用于实验数据以生成相应的图，从而帮助评估药物组合的效果。与上述方程相关的相应曲线分别是浓度-效果曲线、等效线图曲线和组合指数曲线。
施用/剂量/制剂
施用方案可能会影响有效量的构成。可以在本发明所考虑的疾病或病症发作之前或之后将治疗制剂施用至受试者。此外，可以每天或顺序施用若干分开的剂量以及交错剂量，或者可以连续输注该剂量，或者可以是推注。此外，治疗制剂的剂量可以通过治疗或预防情况的紧急程度所指示的成比例地增加或减少。
可以使用已知的方法，以有效治疗本发明所考虑的疾病或病症的剂量和时间段，将本发明的组合物施用至患者，优选地为哺乳动物，更优选地为人。实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据以下因素而变化，比如患者的疾病或病症的状态；患者的年龄、性别和体重；以及治疗化合物治疗本发明中考虑的疾病或病症的能力。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，如由治疗情况的紧急程度所指示，可以每天施用若干分开的剂量，或者可以成比例地减少剂量。用于治疗本发明的化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约0.01和5,000mg/kg体重/每天。本领域普通技术人员将能够研究相关因素，并做出治疗化合物的有效量的决定，而无需过度的实验。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得对于实现特定患者、组合物和施用方式的期望的治疗反应有效的活性成分的量，而对患者是无毒的。
本发明化合物的治疗有效量或剂量取决于患者的年龄、性别和体重，患者当前的医疗状况以及本发明中考虑的疾病或病症的进展。
具有本领域普通技术的医生，例如内科医生或兽医，可以容易地确定所需药物组合物的有效量并对其开处方。例如，内科医生或兽医可以以低于获得所需水平开始在药物组合物中使用的本发明的化合物的剂量，并逐渐增加剂量直到实现期望的效果。
本发明的化合物的合适的剂量可以在每天约0.01mg至约5,000mg的范围中，比如每天约0.1mg至约1,000mg，例如约1mg至约500mg，比如约5mg至约250mg。该剂量可以以单剂量或多剂量施用，例如每天1至4次或更多次。当使用多剂量时，每个剂量的量可以相同或不同。例如，每天1mg的剂量可以以两个0.5mg的剂量施用，在给药之间具有约12小时的间隔。
用于施用的本发明的化合物可以在约1μg至约10,000mg、约20μg至约9,500mg、约40μg至约9,000mg、约75μg至约8,500mg、约150μg至约7,500mg、约200μg至约7,000mg、约3050μg至约6,000mg、约500μg至约5,000mg、约750μg至约4,000mg、约1mg至约3,000mg、约10mg至约2,500mg、约20mg至约2,000mg、约25mg至约1,500mg、约30mg至约1,000mg、约40mg至约900mg、约50mg至约800mg、约60mg至约750mg、约70mg至约600mg、约80mg至约500mg的范围中，和在其之间的任何和所有完整增量或局部增量。
在一些实施方式中，本发明的化合物的剂量为约1mg和约2,500mg。在一些实施方式中，用于本文描述的组合物的本发明的化合物的剂量小于约10,000mg、或小于约8,000mg、或小于约6,000mg、或小于约5,000mg、或小于约3,000mg、或小于约2,000mg、或小于约1,000mg、或小于约500mg、或小于约200mg、或小于约50mg。类似地，在一些实施方式中，如本文所描述的第二化合物的剂量小于约1,000mg、或小于约800mg、或小于约600mg、或小于约500mg、或小于约400mg、或小于约300mg、或小于约200mg、或小于约100mg、或小于约50mg、或小于约40mg、或小于约30mg、或小于约25mg、或小于约20mg、或小于约15mg、或小于约10mg、或小于约5mg、或小于约2mg、或小于约1mg、或小于约0.5mg，和其任何和所有完整增量或局部增量。
在某些实施方式中，将本发明的组合物以每天1至5次或更多次的剂量施用至患者。在另一个实施方式中，将本发明的组合物以包括但不限于每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次的剂量范围施用至患者。本领域技术人员容易显而易见，本发明的组合物的各种组合的施用频率在个体与个体之间不同，这取决于许多因素，包括但不限于年龄、待治疗的疾病或病症、性别、整体健康和其他因素。因此，本发明不应被解释为限于任何具体的剂量方案，并且要施用至任何患者的精确剂量和组合物是通过主治医生考虑有关患者的所有其他因素来确定的。
应当理解，在非限制性实例中，可以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天施用每天给药的化合物的量。例如，每隔一天施用一次，则可以在周一开始每天5mg的剂量，在周三施用第一个随后每天5mg的剂量，在周五施用第二个每天5mg的剂量等。
在患者的状况确实有所改善的情况下，根据医生的判断，可选地连续施用本发明的抑制剂；可选地，暂时降低或暂时中止所施用的药物的剂量，持续一定时间段内(即，“休药期”)。休药期的长度任选地在2天和1年之间变化，包括，仅作为实例，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在休药期期间的剂量减少包括10％-100％，包括，仅作为实例，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的状况发生改善，必要时可施用维持剂量。随后，根据疾病或病症，施用的剂量或频率或二者降低到保留改善的疾病的水平。在某些实施方式中，患者在症状和/或感染的任何复发时需要长期间歇治疗。
用于本发明的方法的化合物可以配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指适合作为接受治疗的患者的单位剂量的物理离散单位，其中每个单位包含经计算以产生期望的治疗效果的预定量的活性物质，其任选地与合适的药物载体结合。单位剂型可以是单次日剂量或多次日剂量(例如，每天约1至4次或更多次)中的一个。当使用多次日剂量时，每个剂量的单位剂型可以相同或不同。
任选地在细胞培养物或实验动物中确定这种治疗方案的毒性和治疗疗效，包括但不限于LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)的确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其表示为LD50和ED50之间的比。从细胞培养试验和动物研究获得的数据任选地用于阐述用于人的剂量范围。这种化合物的剂量优选地位于循环浓度的范围内，该循环浓度包括具有最小毒性的ED50。剂量任选地在该范围内变化，这取决于采用的剂型和使用的施用途径。
在某些实施方式中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体来配制本发明的组合物。在某些实施方式中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的本发明的化合物和药学上可接受的载体。
载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如，通过使用包衣比如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以维持合适的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现防止微生物作用。在许多情况下，在组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、氯化钠或多元醇，比如甘露糖醇和山梨糖醇。
在某些实施方式中，本发明涉及包装的药物组合物，其包括单独或与第二药物制剂组合容纳本发明的治疗有效量的化合物的容器；以及使用该化合物治疗、预防或减轻本发明中考虑的疾病或病症的一种或多种症状的说明书。
制剂可以与常规赋形剂，即适合于本领域已知的任何合适的施用方式的药学上可接受的有机或无机载体物质混合使用。可以对药物制剂进行灭菌，并且如果需要，与助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、调味剂和/或芳香族物质等混合。它们也可以在需要时与其他活性剂，例如止痛剂组合。
本发明的任何组合物的施用途径包括经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内。
合适的组合物和剂型包括例如分散体、悬浮液、溶液、糖浆剂、颗粒剂、珠剂、粉末、丸剂、用于经鼻或口服施用的液体喷雾、干粉或用于吸入的气雾制剂等。应当理解，可用于本发明的制剂和组合物不限于本文描述的特定制剂和组合物。
本发明的药物制剂的粉状和粒状制剂可使用已知的方法制备。这种制剂可以直接施用至受试者，例如用于形成适合施用至受试者的材料。这些制剂中的每一种可进一步包括分散剂或湿润剂、悬浮剂和防腐剂中的一种或多种。这些制剂中还可包括另外的赋形剂，比如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂。
本发明的药物组合物可以在适于经由口腔肺的部施用的制剂中制备、包装或出售。这样的制剂可以包括干燥颗粒，其包括活性成分并且具有范围在约0.5至约7纳米，优选地约1至约6纳米的直径。这种组合物方便地为干粉形式，使用包括可将推进剂流引导至其中以分配粉末的干粉储箱的装置，或使用自推进溶剂/粉末分配容器，比如包括密封容器中溶解或悬浮在低沸点推进剂中的活性成分的装置，用于施用。优选地，这种粉末包括颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，和按数量计至少95％的颗粒具有小于7纳米的直径。更优选地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，和按数量计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物优选地包括固体细粉稀释剂，比如糖，并且以单位剂型方便地提供。
低沸点推进剂通常包括具有在大气压下低于65℉的沸点的液体推进剂。通常，推进剂可以占组合物的50至99.9％(w/w)，并且活性成分可以占组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂可进一步包括另外的成分，比如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选地与包括活性成分的颗粒具有相同数量级的粒径)。
配制用于肺部递送的本发明的药物组合物还可以以溶液或悬浮液的液滴形式提供活性成分。这样的制剂可以被制备、包装或出售为任选地无菌的包括活性成分的水性溶液或稀醇溶液或悬浮液，并且可以使用任何喷雾或雾化装置方便地施用。这种制剂可以进一步包括一种或多种另外的成分，包括但不限于调味剂，比如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂或防腐剂，比如羟基苯甲酸甲酯。通过该施用途径提供的液滴优选具有范围在约0.1至约200纳米的平均直径。
本发明的药物组合物可以使用吸入器递送，比如在美国专利号US 8,333,192B2中描述的那些，其通过引用以其整体并入本文。
在某些实施方式中，本发明的组合物包括包含左旋甲状腺素钠水合物的稳定的干粉掺混物；乳糖颗粒，包括乳糖H2O、明胶和淀粉玉米；羟甲基淀粉钠；硬脂酸镁；和硅化滑石，包括纯化滑石和胶体二氧化硅。在其他实施方式中，干粉包括的左旋甲状腺素钠的量为每100mg干粉4至0.02mg。在又其他实施方式中，干粉包括的乳糖的量为每100mg干粉制剂高于90mg。在又其他实施方式中，干粉包括由乳糖H2O、明胶和淀粉玉米组成的乳糖颗粒，其中按重量mg计的比为：“乳糖H2O”：“明胶”：“淀粉玉米”为55-75：0.20-0.80：20-40。在又其他实施方式中，干粉包括的羟甲基淀粉钠的量为每100mg干粉4-8mg。在又其他实施方式中，干粉包括的硬脂酸镁的量为每100mg干粉0.5-2mg。在又其他实施方式中，干粉包括的硅化滑石的量为每100mg干粉2mg，其中硅化滑石包括的纯化滑石和胶体二氧化硅的量为对于2mg的硅化滑石，0.667mg的滑石纯化和1.333mg的胶体二氧化硅。在又其他实施方式中，掺混物进一步包括色淀。在又其他实施方式中，干粉包括的羟甲基淀粉钠的量为每100mg干粉5-6mg。在又其他实施方式中，干粉包括的硬脂酸镁的量为每100mg干粉1mg。
本文描述的可用于肺部递送的制剂也可用于本发明的药物组合物的鼻内递送。
适于鼻内施用的另一种制剂是包括活性成分并且具有约0.2至500微米的平均颗粒的粗粉。这样的制剂以服用鼻烟的方式施用，即通过从保持靠近鼻孔的粉末的容器通过鼻道快速吸入。适用于鼻腔施用的制剂可以例如包括约少至0.1％(w/w)和多至100％(w/w)的活性成分，并且可以进一步包括本文描述的一种或多种另外的成分。
另外的施用形式
本发明中的另外的剂型包括在美国专利号6,340,475；6,488,962；6,451,808；5,972,389；5,582,837；和5,007,790中描述的剂型。本发明中的另外的剂型还包括在美国专利申请号20030147952；20030104062；20030104053；20030044466；20030039688；和20020051820中描述的剂型。本发明中的另外的剂型还包括在PCT申请号WO 03/35041；WO03/35040；WO 03/35029；WO 03/35177；WO 03/35039；WO 02/96404；WO 02/32416；WO 01/97783；WO 01/56544；WO 01/32217；WO 98/55107；WO 98/11879；WO 97/47285；WO 93/18755；和WO 90/11757中描述的剂型。
控释制剂和药物递送系统
在某些实施方式中，本发明的制剂可以是但不限于短期、快速补偿(rapid-offset)以及控制的例如持续释放、延迟释放和脉动释放制剂。
术语持续释放在其常规含义上是指可在延长的时间段内提供逐渐释放药物的药物制剂，并且尽管不一定，但是在延长的时间段内可导致基本上恒定的药物的血液水平。该时间段可以长达一个月或更长，并且应该是长于以推注形式施用的相同量的药剂的释放。
对于持续释放，可以将化合物与向化合物提供持续释放特性的合适的聚合物或疏水材料一起配制。这样，用于本发明方法的化合物可以例如通过注射以微粒形式施用，或者通过植入以晶片或圆盘形式施用。
在本发明的某些实施方式中，使用持续释放制剂将本发明的化合物单独地或与另一种药物制剂组合施用至患者。
在本文中术语延迟释放在其常规含义上用于指在药物施用后的一定延迟后提供药物的初始释放的药物制剂，并且尽管不是必须的，但是可以包括从约10分钟直至大约12小时的延迟。
在本文中术语脉动释放在其常规含义上用于指在药物施用后以产生脉冲等离子分布的这种方式提供药物释放的药物制剂。
术语立即释放在其常规含义上用于指在药物施用之后立即提供药物释放的药物制剂。
如本文所使用，短期是指在药物施用之后至多并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟的任何时间段，以及其任何或所有完整增量或局部增量。
如本文所使用，快速补偿是指在药物施用之后至多并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟的任何时间段，以及其任何和所有完整增量或局部增量。
仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体过程、实施方式、权利要求和实施例的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内，并由所附的权利要求书涵盖。例如，应该理解的是，用本领域公认的替代方案并且仅使用常规实验对反应和/或治疗状况的改进在本申请的范围内。
应当理解，无论在本文何处提供数值和范围，这些数值和范围所涵盖的所有数值和范围都意在包含在本发明的范围内。此外，本申请还考虑了落入这些范围内的所有值以及该值的范围的上限或下限。
以下实施例进一步说明了本发明的方面。然而，它们决不是对本文所述的本发明的教导或公开内容的限制。
实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且本发明决不应解释为限于这些实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
方法：
材料
下述试剂购买自Sigma：N-甲酰基-L-甲硫氨酰基-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(fMLP)、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、脂多糖(LPS)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、溶血卵磷脂、多聚甲醛(PFA)、FITC白蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)和异鲁米诺。Percoll购买自GEHealthcare(瑞典Uppsala)，牛血清白蛋白(BSA)购买自American Bio(Natick，MA)，GMCSF购买自Peprotech，脂质体试剂盒和细胞微量染料购买自Thermo Fisher。下述材料购买自GIBCO：杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Hanks平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲液(PBS)。
研究中使用的商业抗体为：GST抗体(2624，细胞信号传导)，His抗体(2366，细胞信号传导)，HA抗体(MMS-101R，Covance)，Myc抗体(MMS-150R，Covance)，抗磷酸化-AKT抗体(4060和2965，细胞信号传导)，抗AKT抗体(9272，细胞信号传导)，抗MEKK3抗体(5727，细胞信号传导)，抗p47phox抗体(17875，Santa Cruz)，抗CD31抗体(102502，BioLegend)，抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(ab8211，Abcam)，和抗β-肌动蛋白抗体(4967，细胞信号传导)。兔子多克隆抗S208p47phox从Abiocode获取。蛋白质A/g PLUS-琼脂糖小球购买自Sant CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA)。用于细胞因子测量的ELIS试剂盒购买自eBioscience(San Diego，CA)。用于MAP3K3和p67phox的cDNA从ADDGENE获取，和用于p47phox和gp91phox的cDNA从Open Biosystems获取。
小鼠
先前在Guo等2002，Mol.Cell Biol.22:5761-5768中描述了MEKK2-/-小鼠，而在Wang等2009，J.Immunol.182:3597-3608中描述了MEKK3fl/fl小鼠。MEKK2-/-和MEKK3fl/fl二者均在C57Bl背景中。通过将MEKK3fl/fl小鼠与来自Jackson Lab的B6.129-Lyzstm1(cre)Ifo/J小鼠杂交产生髓样细胞特异性MEKK3KO小鼠，MEKK3m/m。通过将MEKK2-/-小鼠与MEKK3m/m小鼠杂交产生双敲除(DKO)小鼠，MEKK2-/-MEKK3m/m。野生型(WT)小鼠，C57BL6，购买自Taconiclaboratories(Germantown，NY)。含BHA(W218308，Sigma-Aldrich)的食物(0.75％w/w BHA)由Harlan Laboratories从2018S膳食定制，并通过照射灭菌。
嗜中性粒细胞制备和转染
根据批准的方案在CO2室中对小鼠安乐死，从小鼠长骨中收获骨髓，用ACK缓冲液(155mMNH4Cl、10mM KHCO3和127μM EDTA)裂解红细胞(RBC)，细胞在由81％、62％和45％Percoll层组成的不连续Percoll梯度上分层，并从81％和62％Percoll层之间的分裂间期分离细胞。将细胞在HBSS中洗涤并用于各种试验。
对于嗜中性粒细胞转染，将嗜中性粒细胞(3x106细胞/100μl)和至多1.6μg的DNA悬浮在提供的核转染溶液中，并在Nucleofector装置2b(瑞士Lonza)中电穿孔。然后在37℃下在含有5％CO2的潮湿空气中将样品在培养基(RPMI 1640，10％FBS(V/V)，GMCSF 25ng/ml)中培养过夜。
Dunn室趋化性试验
将WT(用细胞微量钙黄绿素橙红染料染色)和DKO中性粒细胞(1.25x106细胞/ml)悬浮在试验缓冲液(HBSS中0.25％的BSA，含Ca2+和Mg2+)中，并且反之亦然。然后将细胞的等分试样在纤维蛋白原涂布的盖玻片上粘附15分钟，将盖玻片在Dunn室上倒置，试验缓冲液在内孔中，和fMLP(10μM)在外孔中，在Olympus BX61显微镜下以30秒间隔记录时间推移的图像，持续30分钟。如在Konstandin等2006，J.Immunol.Meth.310:67-77中所报道，分析了细胞轨迹。
整联蛋白表达试验
将源自骨髓的嗜中性粒细胞再悬浮在流式细胞仪缓冲液(含有1％BSA的PBS)，用fMLP(5μM)刺激指定的持续时间，用4％PFA定影，并且然后用FITC标记的抗LFA-1或抗Mac-1染色。通过BD LSR II流式细胞仪分析样品。
ICAM-1结合试验
按照Wang等2008，J.Clin.Invest.118:195-204中描述的进行试验。通过在PBS中在4℃下温育Cy5缀合的AffiniPure山羊抗人Fcγ片段特异性IgG F(ab')2片段(JacksonImmunobiology)和ICAM-1-Fc(100μg/ml，R和D)，持续30分钟，产生ICAM-1-Fc-F(ab’)2复合物。将嗜中性粒细胞以0.5×106个细胞/ml再悬浮于含有0.5％BSA、0.5mMMg2+和0.9mMCa2+的PBS中，在存在或不存在fMLP的情况下与ICAM-1-Fc-F(ab’)2复合物混合，持续图例中指定的持续时间。加入4％多聚甲醛终止反应。5分钟后，通过添加3ml冰冷的FACS缓冲液停止定影。沉淀细胞，再悬浮在300μl的FACS缓冲液中，并在流式细胞仪上分析。
嗜中性粒细胞浸润到发炎的腹膜中和流室粘附试验
对于腹膜炎浸润模型，分别用2.5μM CFSE[5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯]和2.5μM Far-Red DDAO SE标记纯化的野生型和突变型嗜中性粒细胞，并且亦然。将具有不同荧光标记的WT和突变细胞以1：1的比例混合，并注入野生型同窝幼仔的眼眶后静脉窦中，野生型同窝幼仔在两小时前注射2ml的3％巯基乙酸盐(TG)。一个半小时后，对小鼠实施安乐死。收集它们腹膜中的细胞，并通过细胞计数和流式细胞仪进行分析。呈现的数据是实验与相互荧光标记的组合。
为了研究嗜中性粒细胞在剪切应力下对内皮细胞的粘附性，将小鼠内皮细胞(Wang等2008，J.Clin.Invest.118:195-204)在10μg/ml纤连蛋白涂布的盖玻片上培养至融汇(confluency)，并用50ng/ml TNFα处理，持续4小时。用PBS冲洗包含内皮细胞层的盖玻片，并置于流室装置(GlycoTech)中。如本文其他地方所描述，标记了不同荧光标记的WT和突变细胞以1∶1的比例混合，并以1dyn/cm2的剪切流速流入室中。然后研究了粘附的细胞并在荧光显微镜下计数。
ROS释放试验
将嗜中性粒细胞悬浮在反应混合物(HBSS中0.25％的BSA，含有Ca2+和Mg2+，10mM异鲁米诺，100μ/ml HRP)中，将细胞分布在96孔板的孔中，并用fMLP(10μM)刺激。在读板仪(Perkin Elmer)中连续记录异鲁米诺增强的化学发光。对于在COS-7细胞中复原的ROS生产系统，使用PMA(2μM)进行刺激。
嗜中性粒细胞细胞脱粒试验
在37℃下将一百万个嗜中性粒细胞与10μM CB温育5分钟，然后用fMLP(500nM)刺激，持续另外的10分钟。通过将其置于冰上来停止反应，并在4℃下将该悬浮液以500xg离心，持续5分钟。分别使用EnzChek髓过氧化物酶活性试验试剂盒和EnzChek明胶酶/胶原酶试验试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)测定上清液中的MPO和MMP含量(Li等2009，Blood 113:4930-4941；Lee等2007，Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.292:L799-812)。
LPS诱导的肺损伤
用氯胺酮/甲苯噻嗪(1gm/kg和100mg/kg)麻醉小鼠，并吸入以液滴形式置于鼻孔的50μl的LPS(1mg/ml)。小鼠的姿势保持直立。在损伤诱导之后22小时，通过眼眶后静脉注射100μl的FITC标记的白蛋白(10mg/ml)，并且在损伤诱导之后24小时，通过放血使小鼠安乐死。为了获得支气管肺泡灌洗液，将1ml的PBS滴注到肺部，并经由气管导管重新取回。在一些实验中，在诱导肺损伤之前，首先在小鼠中为小鼠喂食食品中的抗氧化剂BHA(HarlanLaboratory Services)，持续7天。
酸吸入诱导的肺损伤
将小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(1gm/kg和100mg/kg)麻醉，并从其切牙垂直悬挂在定制的支架上，用于口腔气管滴注。将22G导管(Jelco，Smiths Medical)引导至声带下方1.5cm，并滴入2.5μl/g的0.05M HCl。在诱导损伤之后两小时，经由眼眶后静脉注射100μl的FITC标记的白蛋白(10mg/ml)。在诱导损伤之后6小时进行测量。对照动物以相同的方式接受盐水，而不是HCl。在存活实验中，小鼠经口气管接受2.5μl/g的0.1M HCl，并且观察期延长到长达30小时。为了研究药理干预，在滴注HCl后1小时使用MEKK2/3抑制剂帕唑帕尼。
GST下拉试验
重组蛋白在大肠杆菌中表达并通过亲和层析纯化。然后在4℃下将蛋白质在200μl的结合缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mMNaCl，1％Triton，0.12％SDS，1mM二硫苏糖醇，10％甘油，1x蛋白酶抑制剂混合物)中温育，在摇床上过夜。第二天早晨，将谷胱甘肽珠粒添加到蛋白质混合物，持续另外的2小时。在大量洗涤之后，珠粒上的蛋白质被SDS/PAGE分解，并且通过蛋白质印迹检测。
MAP3K3激酶试验
在50μl反应缓冲液(100mMTris-HCl pH 7.4，50mM EGTA，100mMMgCl2)中，将100ng的重组MAP3K3与免疫沉淀的底物蛋白[γ-33P]-ATP(10μCi)和冷ATP(50μM)在37℃下温育，持续30分钟。通过添加SDS加样缓冲液停止反应。将样品煮沸5分钟。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并通过磷光影像分析仪可视化和量化。
过继性骨髓移植
从WT和DKO供体小鼠的长骨中收获骨髓，用ACK缓冲液(155mMNH4Cl，10mM KHCO3和127μM EDTA)裂解RBC，将细胞悬浮在无菌生理盐水中，并且然后静脉内注射到辐照的(9.5Grays，γ射线)受体WT小鼠(5x106个细胞/小鼠)中。向小鼠提供高压灭菌的食物和包含磺胺嘧啶(48mg/ml)的水，持续4周。这些小鼠(HS-DKO和WT对照)在移植后8周用于实验目的。
人嗜中性粒细胞
根据制造商的协议，使用EasySep人嗜中性粒细胞富集试剂盒(StemcellTechnologies)对人血液样品的血沉棕黄层经历中性粒细胞富集。简而言之，将耗尽抗体混合物与血沉棕黄层混合，随后与磁性颗粒一起温育。然后随着将无标记的嗜中性粒细胞倒入另一个圆锥管中，使用EasySep磁铁来固定不需要的细胞。沉淀富集的嗜中性粒细胞，并再悬浮于试验缓冲液(含Ca2+和Mg2+，0.25％BSA的Hanks缓冲液)中，用于ROS产生试验。
嗜中性粒细胞与内皮细胞的双层共培养
首先将小鼠内皮细胞(MEFC；Paik等，2004，Genes Dev.18:2392-2403)铺在Transwell插入物(24孔型，0.4-μm孔径，Corning，Inc.353095)的聚碳酸酯膜(25,000个细胞/cm2)的外部，并且将其倒置放置在培养板的孔中。在内皮细胞粘附后，将Transwell插入物倒置并重新插入平板的孔中。接种24小时后，用无血清培养基替换该培养基。在2小时后，将SOD(60U/ml)、过氧化氢酶(100U/ml)或模拟物添加到下室中，持续30分钟。然后将用5μMfMLP刺激的小鼠嗜中性粒细胞铺在插入物的顶表面(6×106个细胞/cm2)上，持续30分钟。在温育期结束时，刮擦插入物顶部的嗜中性粒细胞，并用SDS-PAGE样品缓冲液裂解插入物的另一侧的内皮细胞，用于Western分析。
跨内皮电阻(TEER)测量
用10μg/ml的聚D-赖氨酸(PDL)涂布ECIS 8W10E+阵列(Applied BioPhysics)，并用无菌水洗涤。将完整的EBM-2培养基(300μl)加入每个孔中，用于快速的阻抗背景检查。随后，将永生化的小鼠肺内皮细胞(Murata等，2007，J.Biol.Chem.282:16631-16643)以60,000个细胞/孔的密度接种在涂布阵列中的300μl的EBM-2培养基中，并且在37℃下在二氧化碳培养箱中温育它们。在ECIS系统(Applied BioPhysics)上连续记录细胞层的电阻，直到达到约600-700欧姆的稳定电阻，在此之后从孔中移除培养基，并用100μl的试验缓冲液(含Ca2+和Mg2+、0.25％BSA的Hanks缓冲液)替换。允许细胞在37℃下重新平衡，持续2小时，然后将1μl的SOD(60U/ml)、过氧化氢酶(100U/ml)或模拟物添加至孔中，持续30分钟，随后将50μl的小鼠嗜中性粒细胞添加在含有5μM fMLP的试验缓冲液中。在整个实验中实时收集数据。在4kHz的交流频率下分析所有ECIS测量值，通过沿着整个频率范围(1kHz–64kHz)进行频率扫描，将该4kHz的频率确定为对于该细胞类型最敏感的频率。将TEER值相对于与用模拟物处理的WT嗜中性粒细胞共培养的那些值进行标准化。
统计方法
用Prism软件分析数据。对于两个样品，使用t检验；对于多个样品，使用方差分析，将p值设置为<0.05为显著。
实施例1：MAP3K2/3-缺陷减轻LPS诱导的肺损伤
基因表达分析表明，MAP3K3基因在人髓样细胞(www dot biogps dot org)中特异性表达。另外，其表达在吸入了内毒素的人类受试者的肺分泌液中的嗜中性粒细胞中下调。由于嗜中性粒细胞在急性肺损伤中的重要性，所以使用小鼠急性肺损伤(ALI)模型研究了MAP3K3在髓样细胞功能和急性肺损伤中的作用。
在小鼠中，Map3k3基因在各种造血细胞中大量表达，其表达在髓样细胞(www dotimmgen dot org)中最高。通过将Map3k3fl/fl和溶菌酶-Cre小鼠杂交产生Map3k3的髓样特异性敲除(KO)。然而，Map3k3缺陷未观察到显著的嗜中性粒细胞或肺损伤表型。不希望受到任何理论的束缚，MAP3K3的功能可能被其紧密同系物MAP3K2所补偿，MAP3K2也在小鼠髓样细胞(www dot immgen dot org)中表达，并且与MAP3K3一样，可以通过Western分析在嗜中性粒细胞中容易地检测到(图1A)。
因此，两种激酶都被灭活，并且随后通过使Map3k2-/-小鼠与髓样特异性Map3k3-/-小鼠杂交产生了总体MAP3K2敲除(KO)和髓样特异性MAP3K3KO小鼠系(DKO)。为了限制来自非造血细胞的MAP3K2的贡献，进行了DKO骨髓(BM)向致命照射的野生型(WT)受体小鼠的过继转移。所得小鼠命名为HS-DKO。Western分析显示，从HS-DKO小鼠分离的嗜中性粒细胞中缺少MAP3K2和MAP3K3蛋白(图1A)。
HS-DKO小鼠经历LPS诱导的肺损伤。该鼠模型概括了人ALI的特征(hallmark)，包括进入肺泡间隙的嗜中性粒细胞流入、肺部水肿、增加的肺通透性(图8A)和高死亡率。当经由鼻腔滴注用LPS治疗接受WT BM转移的HS-DKO小鼠和对照WT小鼠时，与野生型(WT)对照小鼠相比，HS-DKO小鼠维持明显减少的肺损伤，这由降低的通透性、水肿和肺泡壁增厚来证明(图1B-1D)。与WT对照小鼠相比，HS-DKO小鼠还显示出降低的死亡率(图1E)。当使用HCl-ALI模型时，也观察到了相同的结果。MEKK2/3的缺少降低了肺通透性和损伤并延长了存活率(图1F-1H)。在HS-DKO和WT对照小鼠之间的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的髓样细胞数目没有显著差异(图8B-8D)。另外，BALF中的TNFα、IL-1β或IL-6的含量没有显著差异(图8E)。当使用HCl模型时，BALF中没有观察到髓样浸润或IL-1b水平的差异(图8F-J)。总之，这些结果表明，髓样细胞中的MAP3K3和造血细胞中的MAP3K2的缺少在很大程度上影响肺部通透性，而不是损伤肺中的髓样浸润或细胞因子产生。
实施例2：MAP3K2/3-缺陷特异性改变嗜中性粒细胞ROS释放
与缺少MAP3K2/3-缺陷对嗜中性粒细胞向BALF中浸润的影响一致，该缺陷不影响体外的嗜中性粒细胞趋化性(图2A-2D)。它既不影响嗜中性粒细胞与内皮细胞的粘附(图2E)，也不影响β2整联蛋白的表达或活化(图2F-2H)。WT或MAP3K2/3缺陷的嗜中性粒细胞在发炎的腹膜中的浸润之间也没有差异，发炎的腹膜是用于体内测试嗜中性粒细胞浸润的模型(图2I)。另外，MAP3K2/3-缺陷不会改变嗜中性粒细胞脱粒(图2J-2K)。然而，MAP3K2/3-缺陷导致在刺激后由嗜中性粒细胞增加的ROS产生(图3A)。在MAP3K2/3缺陷的嗜中性粒细胞中表达WT，但没有表达激酶致死的MAP3K3可以抑制ROS的释放，从而证实了MAP3K3参与了ROS释放的调节(图3B)。该结果还表明MAP3K3调节的ROS释放取决于其激酶活性。当给小鼠喂食ROS清除剂丁基化羟基茴香醚(BHA)并经历LPS诱导的损伤时，HS-DKO和WT对照小鼠之间的通透性和水肿的差异消失(图3C-3E)，这表明MAP3K2/3-缺陷的保护作用取决于ROS。
还研究了单个的MAP3K2和MAP3K3 KO对嗜中性粒细胞释放ROS的影响。MAP3K3 KO显示出ROS释放增加的趋势，而MAP3K2 KO没有显著的作用(图9A-9B)。这些结果证实这两种激酶确实在功能上是多余的。
实施例3：MAP3K3使p47phox磷酸化以抑制ROS的产生
鉴于吞噬细胞的NADPH氧化酶是嗜中性粒细胞中ROS产生的主要来源，测试了MAP3K3是否通过这种酶复合物起作用。首先研究了NADPH氧化酶是否可以作为MAP3K3的底物。产生了MAP3K3的重组蛋白和NADPH氧化酶的几个亚基，并进行了体外激酶试验。MAP3K3仅可使p47phox磷酸化，而不能使p22phox或p67phox磷酸化(图4A)。尽管MAP3K3的磷酸化位点共有序列是未知的，但使用Scansite run程序以及对于相关的激酶MAP3K5的报告的肽阵列数据分析p47phox序列，以鉴定可能的磷酸化位点。该分析预测Ser-208是先前观察到的那些中的最佳得分位点(Obenauer,等，2003，Nucleic Acids Res.31:3635-3641)。当该位点突变时，MAP3K3介导的磷酸化显著降低(图4B)，表明该残基确实可以被MAP3K3磷酸化。
接下来评估这种磷酸化对NDAPH氧化酶活性的影响。通过表达NADPH氧化酶亚基p47phox、p67phox、p40phox、NOX2和p22phox来重构COS-7细胞中的NADPH氧化酶活性(Price等，2002，Blood 99:2653-2661)。这些蛋白质在COS-7细胞中未被表达或表达不足。加入PMA后，可以从重构的COS-7细胞中检测到ROS的产生，并且该ROS的产生完全取决于p47phox的外源表达(图10A-10B)。WT MAP3K3，而不是其激酶致死的突变体的表达抑制该系统中ROS的产生(图10C)。因此，与嗜中性粒细胞中发生的类似，重构了可被MAP3K3抑制的ROS生产系统。当在该重构系统中使用模拟磷的p47phox S208E突变体代替WT时，与WT p47phox相比，产生的ROS非常低(图4C)。相反，不可磷酸化的S208A p47phox突变体在ROS重构试验中显示出与WTp47phox相似的活性(图4C)。此外，在表达WT p47phox的细胞中，MAP3K3的表达抑制ROS的产生，而在表达不可磷酸化的S208A p47phox的细胞中没有抑制ROS的产生(图4D)。这些结果共同表明，在S208处MAP3K3介导的p47phox的磷酸化抑制NADPH氧化酶活性。
因为Ser-208位于p47phox的两个SH3域之间，这两个SH3域在活化NADPH氧化酶复合物期间参与了与p22phox的相互作用(图10D)，所以在某些非限制性实施方式中，Ser-208的磷酸化会干扰这一相互作用，这是NADPH氧化酶活化的关键步骤。实际上，在共免疫沉淀试验中，拟磷酸化的Ser-208向Glu的突变消除了p47phox与p22phox的相互作用。
实施例4：p47phox的Ser-208在嗜中性粒细胞中被磷酸化
为了检测p47phox在嗜中性粒细胞中是否被MAP3K2/3磷酸化，产生了对p47phox的磷酸化Ser-208有特异性的抗体。验证试验表明该抗体对Ser-208-磷酸化的p47phox具有很大的特异性，因为Ser-208向丙氨酸的突变显著减少了抗体的检测(图11A-11G)。使用该抗体，我们在Ser-208处检测到p47phox磷酸化的时间依赖性增加(图4F)。在p47phox磷酸化中fMLP刺激增加的时间过程与在Ser-473处的AKT磷酸化的时间过程一致(图4F)。另外，观察到MAP3K3蛋白的丰度增加，这可能反映了其活化。在缺少MAP3K2/3的嗜中性粒细胞中没有观察到由该抗体检测到的fMLP诱导的p47phox磷酸化的增加(图4G)，这表明fMLP经由MAP3K2/3诱导在Ser-208处的p47phox的磷酸化。不希望受到任何理论的限制，抗体在DKO嗜中性粒细胞中检测到的条带可能反映了由抗体检测到的非磷酸化的p47phox或其他蛋白激酶检测到的Ser-208的基础磷酸化。
进行体外激酶试验以确定帕唑帕尼抑制MEKK2和3的IC50。帕唑帕尼以约10nM的IC50抑制MEKK3，而以20nM的IC50抑制MEKK2(图4H-4I)。这些值比只有公开的MEKK2/3底物，MEK5的IC50(>1μM)低得多(图4J-4K)。
实施例5：帕唑帕尼抑制MAP3K2/3并减轻肺损伤
帕唑帕尼是FDA批准的用于靶向癌症疗法的药物。它抑制许多受体酪氨酸激酶，包括VEGF、FGF、PDGF和SCF的受体(Keisner和Shah，2011，Drugs 71:443-454)。它还以与其最初预期的靶标相当的疗效抑制MAP3K2(Ahmad等，2013，J.Biomol.Screen.18:388-399)。在嗜中性粒细胞中测试了帕唑帕尼，并且发现抑制由磷酸特异性抗体检测到的在Ser-208处的p47phox磷酸化(图5A)。帕唑帕尼也消除了由fMLP诱导的MAP3K3蛋白含量的增加(图5A)。因为MAP3K3经由自身磷酸化活化，所以该结果与MAP3K3稳定化可能是其活化的结果的观点一致，并进一步证实帕唑帕尼通过MAP3K起作用。用帕唑帕尼治疗WT(图5B)，而不是MAP3K2/3缺陷(图5C)小鼠嗜中性粒细胞导致ROS产生的增加，这表明帕唑帕尼经由MAP3K2/3增加ROS的产生。另外，帕唑帕尼增加了来自人嗜中性粒细胞的ROS产生(图12A-12B)。向经历LPS诱导的损伤的WT小鼠喂食帕唑帕尼。与MAP3K2/3 HS-DKO类似，帕唑帕尼治疗显示出降低的肺通透性(图5D)、肺泡壁增厚和水肿(图5E)。更重要的是，帕唑帕尼治疗以预防性(图5F)或治疗性(图12E)的方式降低了死亡率。对于预防性治疗，帕唑帕尼在肺损伤前两天服用，而药物在损伤后24小时服用。
使用由酸吸入诱导的急性肺损伤的另一模型。酸吸入诱导的ALI，也称为吸入性肺炎，是由肺部吸入胃中的酸性物引起的。意识障碍患者(例如药物过量、癫痫发作、脑血管意外、镇静、麻醉程序)经常会发生这种情况，并且占麻醉相关死亡总数的30％。在该吸入诱导的ALI模型中，帕唑帕尼治疗降低了肺通透性(图12F)、肺泡壁增厚和水肿(图12G)。另外，治疗显著延长了存活率(图12H)。因此，这些数据一起清楚地表明帕唑帕尼在两种不同的ALI模型中抑制MAP3K2/3并提供有效的治疗。
还测试了帕唑帕尼在HCl模型中的预防作用。帕唑帕尼有效地降低通透性并延长存活率(图12I-12J)。
还测试了另一种酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼，发现其在降低HCl诱导的肺损伤中对降低肺通透性是无效的(图17)。该结果表明，其他酪氨酸激酶抑制剂不具有(share)目前描述的帕唑帕尼的有益作用。
实施例6：帕唑帕尼经由MEKK2/3，p47，而不是VEGFR减轻肺损伤
图12C-12D图解了帕唑帕尼经由MEKK2/3减轻肺损伤的发现，因为该药物在缺少这些激酶的小鼠中对肺损伤没有效果。另外，帕唑帕尼在缺少p47phox的小鼠中显示没有效果(图16C和16E)，p47phox是在嗜中性粒细胞中产生ROS的关键亚基。缺少p47phox的小鼠更容易受到肺损伤的事实(图16A-16B和16D)与嗜中性粒细胞ROS在肺损伤中给予保护的发现一致。
帕唑帕尼也抑制VEGFR。在本模型中测试了中和抗VEGFR抗体的作用，并且显示对遭受肺损伤的小鼠的存活率没有影响(图15)。因此，帕唑帕尼对VEGFR的抑制对减轻肺损伤中没有发挥重要作用。
实施例7：MAPK2/3抑制增加肺AKT活化
AKT信号传导通过防止毛细血管渗漏和清除肺泡液在ALI小鼠模型中发挥保护作用。此外，ROS刺激内皮细胞中的AKT活化，以增强血管屏障的完整性。因此在LPS处理的肺样品中研究了在Ser-473处的AKT磷酸化，与对照相比，在HS-DKO样品中发现了升高的AKT磷酸化(图13A)。由于WT和DKO嗜中性粒细胞之间的AKT磷酸化没有差异(图5A)，不希望受到任何理论的限制，因此在肺样品中观察到的AKT磷酸化的差异可能是由于非造血肺细胞的差异。来自LPS处理的小鼠的肺切片的免疫荧光显示较高的AKT磷酸化水平，由CD31染色标记的肺部血管和毛细血管(图6(小图A-B)和图13B)以及由平滑肌肌动蛋白染色标记的血管平滑肌细胞(图6(小图C-D)和图13C)中的HS-DKO样品。相反，在WT和HS-DKO样品之间，支气管上皮和平滑肌细胞的磷酸-AKT染色是可比较的(图6(小图A-B)和图13B-13C)。此外，帕唑帕尼治疗概括了HS-DKO对AKT磷酸化的影响；该抑制剂增加了LPS损伤的肺中的AKT磷酸化(图13D)。帕唑帕尼的这种作用取决于MAP3K2和3的存在，因为该抑制剂对HS-DKO肺中的AKT磷酸化几乎没有作用(图13E)。此外，用AKT抑制剂MK-2206(8-[4-(1-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-2H-[1,2,4]三唑[3,4-f][1，6]萘啶-3-酮)治疗小鼠消除了帕唑帕尼对通透性的影响(图13F)。
上述数据与ROS可以刺激内皮细胞中AKT磷酸化的认识一起支持非限制性模型(图7A)，以表明在急性肺损伤期间，MAP3K2/3缺陷的嗜中性粒细胞释放更多的ROS，其增加了内皮细胞和血管平滑肌细胞中的AKT活化，导致改善的血管完整性和降低的通透性。为了进一步检验该非限制性假设，用小鼠肺内皮细胞进行了WT和DKO嗜中性粒细胞的共培养。与用活化的WT嗜中性粒细胞共培养相比，与fMLP活化的DKO嗜中性粒细胞共培养的小鼠内皮细胞具有升高的磷酸-AKT(图7B)。过氧化氢酶的存在可以消除这种磷酸-AKT的升高，但是超氧化物歧化酶(SOD)不能(图7C)。过氧化氢酶催化H2O2转化为水，而SOD将超氧化物转化为H2O2。此外，活化的DKO中性粒细胞与小鼠内皮细胞的共培养相对于活化的WT中性粒细胞增加了跨内皮电阻(TEER)，并且TEER的这种差异也可以通过添加过氧化氢酶来消除(图7D)。因此，这些结果一起支持这样的结论，活化的DKO中性粒细胞可以经由H2O2升高共培养的内皮细胞中的磷酸-AKT并改善内皮连接完整性，并且与图7A中描述的非限制性模型一致。
已知AKT可以经由RAC1小GTP酶的活化来调节内皮连接的完整性，测试了H2O2是否可以活化小鼠内皮细胞中的RAC。实际上，已发现H2O2活化内皮细胞中的RAC1。此外，缺少MEKK2/3的嗜中性粒细胞的共培养导致相对于WT嗜中性粒细胞更高的RAC1活化，这表明MEKK2/3KO嗜中性粒细胞可以引起内皮细胞中RAC1的超活化。这些发现与图7A中描绘的假设一致。
ALI的长期不利影响是纤维化。因此测试了帕唑帕尼是否可以抑制肺纤维化。在该研究中使用了博来霉素诱导的肺纤维化模型：Gan等,2012,Nat.Cell Biol.14:686。发现帕唑帕尼抑制肺纤维化(图18)，表明帕唑帕尼在遏制ALI中的作用机制是多方面的。
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用以其整体并入本文。
虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但是显然，本领域技术人员可以设计本发明的其他实施方式和变型，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。

Claims (19)

1.一种在有需要的受试者中治疗或预防急性肺损伤(ALI)的方法，所述方法包括使用选自口服、肠胃外、经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内的施用途径将治疗有效量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者。
2.一种在有需要的受试者中治疗或预防肺纤维化的方法，所述方法包括使用选自口服、肠胃外、经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内的施用途径将治疗有效量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者。
3.权利要求1或2所述的方法，其中使用喷雾器进行所述施用。
4.权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者处于重症监护室(ICU)或急诊室(ER)中。
5.权利要求1所述的方法，其中所述急性肺损伤是急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述受试者被进一步施用治疗、预防或减轻急性肺损伤的症状的至少一种另外的药剂和/或疗法。
7.权利要求2所述的方法，其中所述受试者被进一步施用治疗、预防或减轻肺纤维化的症状的至少一种另外的药剂和/或疗法。
8.权利要求1或2所述的方法，其中将所述帕唑帕尼或其盐或溶剂化物以选自下列的频率施用至受试者：约每天三次、约每天两次、约每天一次、约每两天一次、约每三天一次、约每四天一次、约每五天一次、约每六天一次和约每周一次。
9.权利要求1或2所述的方法，其中所述帕唑帕尼或其盐或溶剂化物配制为干粉掺混物。
10.权利要求1或2所述的方法，其中将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物施用至受试者不引起与将帕唑帕尼或其盐或溶剂化物口服/全身施用至患有癌症的受试者相关联的至少一种显著的不良反应、副作用和/或毒性。
11.权利要求10所述的方法，其中所述至少一种不良反应、副作用和/或毒性选自肝毒性、延长的QT间隔和尖端扭转、出血事件、减少或阻碍凝固、动脉血栓形成事件、胃肠穿孔或瘘管、高血压、甲状腺功能减退、蛋白尿、腹泻、头发颜色变化、恶心、厌食和呕吐。
12.权利要求1或2所述的方法，其中向受试者给药一定量的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物，所述量低于向患有癌症的受试者口服/全身给药用于癌症治疗的帕唑帕尼或其盐或溶剂化物的量。
13.权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
14.权利要求13所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
15.一种试剂盒，其包括帕唑帕尼或其盐或溶剂化物、施用器和其使用说明材料，其中所述说明材料包括使用选自经鼻、吸入、气管内、肺内和支气管内的施用途径治疗或预防受试者中的急性肺损伤和/或肺纤维化的说明书。
16.权利要求15所述的试剂盒，其中所述帕唑帕尼或其盐或溶剂化物配制为干粉掺混物。
17.权利要求15所述的试剂盒，进一步包括治疗、预防或减轻急性肺损伤和/或肺纤维化的症状的至少一种另外的药剂。
18.一种评估药物在治疗ALI中的疗效的方法，所述方法包括使嗜中性粒细胞与药物接触并在接触之后测量嗜中性粒细胞ROS产生水平，其中，如果在接触之后所述嗜中性粒细胞ROS产生水平增加，则所述药物在治疗ALI中是有效的。
19.一种评估药物在治疗患有ALI的受试者中的疗效的方法，所述方法包括在施用所述药物之后测量受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平，其中，如果在施用所述药物之后受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平高于在施用所述药物之前受试者中的嗜中性粒细胞ROS产生水平，所述药物在治疗受试者中的ALI中是有效的。
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