CN110747142B

CN110747142B - 一株天然耐铵固氮微生物lq3及其应用

Info

Publication number: CN110747142B
Application number: CN201911102353.1A
Authority: CN
Inventors: 陈三风; 李琴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110747142A

Abstract

本发明涉及固氮微生物技术领域，具体涉及一株天然耐铵固氮微生物LQ3及其应用。本发明提供一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LQ3，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18073。该菌含有固氮酶结构基因nifH，在高浓度铵(50‑300mM)条件下能够保持较高的固氮活性并进行高效的生物固氮，打破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，可在农业生产中推广使用，有效减少化肥的使用量。

Description

一株天然耐铵固氮微生物LQ3及其应用

技术领域

本发明涉及固氮微生物技术领域，具体涉及一株天然耐铵固氮微生物LQ3及其应用。

背景技术

氮素是植物生长必需的大量元素。地球表面的氮素含量丰富,但大多数以惰性氮气的形式存在于大气中,不能被生物体所利用。为了保障粮食作物及蔬菜瓜果的高产，多需大量使用化学氮肥。但长期过量施用化学氮肥，会导致土壤恶化、环境污染和产品品质下降，阻碍农业经济的可持续发展。

生物固氮是指少数原核微生物在体内固氮酶作用下，将空气中的氮气还原成铵的过程。但生物固氮的效率受环境中铵的影响，高浓度的铵抑制固氮作用。换言之，在贫瘠的土壤里，固氮微生物能充分发挥固氮作用，而在肥沃的土壤里，固氮微生物则只生长而不固氮。通常，固氮微生物只有在氨同化机制被化学或遗传改造修饰的情况下,才能在过量铵存在下表达固氮酶。几乎所有的天然固氮菌只能够在低铵条件下进行固氮。目前报道的固氮微生物在高浓度铵条件下的固氮活性均较低。获得在高浓度铵条件下能够高效固氮的微生物，使固氮微生物在贫瘠和肥沃的土壤里都能充分发挥固氮作用，对在农业生产中减少化肥的用量，具有重要的应用价值。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一株天然耐铵固氮微生物LQ3及其应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一株耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LQ3，该菌株于2019年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.18073。

本发明提供的耐铵固氮类芽孢杆菌LQ3在LD固体培养基上菌落为圆形，边缘光滑略带粘性且发黄，直径大约为1.5-2.5mm。

本发明提供的耐铵固氮类芽孢杆菌LQ3含有结构基因为nifH，编码该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LQ3的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供包含所述类芽孢杆菌LQ3的菌剂。

本发明中，所述包含类芽孢杆菌LQ3的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述包含类芽孢杆菌LQ3的菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。

本发明通过实验证实，类芽孢杆菌LQ3能够耐受50～300mM的高浓度铵，在所处环境中NH₄ ⁺的浓度达到50～300mM时仍能够保持较高的固氮活性、进行高效的生物固氮。

本发明提供所述类芽孢杆菌LQ3或包含所述类芽孢杆菌LQ3的菌剂在生物固氮中的应用。

优选地，所述生物固氮为在铵离子浓度大于20mM的高铵浓度条件下的生物固氮。

更优选地，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为30～450mM。

更优选地，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为50～400mM。

更优选地，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为50～300mM。

本发明通过实验证实，类芽孢杆菌LQ3能够有效促进植物的根、茎等组织生长。

本发明提供所述类芽孢杆菌LQ3或包含所述类芽孢杆菌LQ3的菌剂在促进植物生长或提高植物产量中的应用。

优选地，所述促进植物生长为促进根或茎的伸长，或者为提高植株的重量。

优选地，上述应用为将类芽孢杆菌LQ3施用于所述植物。

本发明提供所述类芽孢杆菌LQ3或包含所述类芽孢杆菌LQ3的菌剂在肥料制备中的应用。

本发明提供所述类芽孢杆菌LQ3或包含所述类芽孢杆菌LQ3的菌剂在选育固氮微生物中的应用。

上述在选育固氮微生物中的应用可为利用类芽孢杆菌LQ3通过诱变、基因工程改造等育种方法进行固氮微生物的选育。

本发明还提供一种促进植物生长或提高植物产量的方法，其为：通过对所述植物施用所述类芽孢杆菌LQ3或包含所述类芽孢杆菌LQ3的菌剂促进植物生长或提高植物产量。

优选地，所述类芽孢杆菌LQ3的施用可为采用所述类芽孢杆菌LQ3的菌悬液浸泡种子或采用所述类芽孢杆菌LQ3的菌悬液浇灌所述植物；或者将化肥与类芽孢杆菌LQ3的菌悬液联合施用于所述植物。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌LQ3，该菌株在高浓度铵条件下能够保持较高的固氮活性、进行高效的生物固氮(该菌株在无铵条件下的固氮酶活性为4250.98nmol C₂H₄/mg protein h，在100mM高铵条件下的固氮酶活性为1363.81nmol C₂H₄/mg protein h，而现有技术中的天然固氮菌一般只能够在0～5mM NH₄ ⁺范围内才具有固氮酶活性)，打破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，使固氮微生物在贫瘠和肥沃的土壤里都能充分发挥固氮作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中类芽孢杆菌LQ3在无氮平板上的菌落形态。

图2为本发明实施例1中类芽孢杆菌LQ3的nifH基因和16S rDNA的扩增产物的电泳图，其中，M：ladder；1：PCR扩增得到的固氮酶结构基因nifH条带；2:PCR扩增得到的16SrDNA条带。

图3为本发明实施例2中类芽孢杆菌LQ3在不同铵浓度条件下的固氮酶活性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1类芽孢杆菌LQ3的分离、培养和鉴定

1、类芽孢杆菌LQ3分离：

类芽孢杆菌LQ3分离自安徽省宣城市宣州区沈村镇双塘村葡萄树根际土壤样品中。

2、类芽孢杆菌LQ3的培养

培养基的制作：无氮液体培养基(1L)：20g蔗糖；12.06g K₂HPO₄；3.4g KH₂PO₄；0.2gMgSO₄·7H₂O；0.01g NaCl；0.01g FeCl₃；0.002g NaMoO₄·2H₂O；H₂O定容至1L。120℃灭菌20min。固体培养基的制作是在每100毫升液体培养基中加入1.5g琼脂。

将类芽孢杆菌LQ3接种到固体或液体培养基中，30℃培养箱培养2天。类芽孢杆菌LQ3的菌落形态如图1所示。

3、类芽孢杆菌LQ3的鉴定

(1)细菌总DNA的提取：从菌株类芽孢杆菌LQ3的纯培养物中提取基因组DNA，基因组提取采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)进行,按照试剂盒说明书进行操作。

(2)菌株的鉴定

以步骤(1)提取的细菌基因组DNA为模板，以nifH F：GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG和nifH R：CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC为引物(其中，V代表A、G、C；Y代表C、T；S代表G、C)，PCR扩增固氮酶结构基因nifH，得到了大小约为290bp的条带。将此条带进行回收纯化后，送交公司进行测序。基因nifH的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。将测序结果在GenBank数据库的在线的BLAST比对，结果和Paenibacillussonchi X19-5的同源性为97％。

以步骤(1)提取的细菌基因组DNA为模板，以原核生物的模式菌株大肠杆菌的16SrDNA序列设计引物16S F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT和16SR:TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCC，PCR扩增16S rDNA序列。结果得到了1.45kb左右的条带，将此条带进行回收纯化，并送交测序。16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示，将测序结果进行在线的BLAST比对，结果显示该菌株属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。

上述PCR的扩增体系如下：10×PCR buffer：5μL，dNTP：1.25μL，正向引物：1.25μL，反向引物：1.25μL，模板DNA：5μL，Taq DNA聚合酶：0.75μL。

上述PCR的扩增条件如下：

nifH基因的扩增：

16S rDNA的扩增：

固氮酶结构基因nifH及16S rDNA的PCR扩增产物的电泳检测结果见图2。

类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LQ3，该菌株于2019年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.18073。

实施例2类芽孢杆菌LQ3在不同条件下的固氮酶活性的测定

1、固氮酶活性测定

将类芽孢杆菌LQ3接种于5mL的LD培养基中，30℃培养过夜，按1％的接种量转接到500mL三角瓶中，30℃培养8h，然后收集菌体，并用适量不同铵浓度培养基(测酶活的基本培养基中添加不同浓度的NH₄Cl)悬浮菌体，调整OD₆₀₀到0.4。将4mL菌液接种到厌氧培养管，用抽气装置抽出空气并充入氩气，向厌氧管中注入10％乙炔,30℃培养,每隔2h取100μL气体注入气象色谱仪测定乙烯含量。

测酶活的基本培养基(1L)为：26.3g Na₂HPO₄·12H₂O；3.4g KH₂PO₄；10μg生物素；26mg CaCl₂·2H₂O；30mg MgSO₄；0.33mg MnSO₄·H₂O；36mg柠檬酸铁；7.6mg Na₂MoO₄·2H₂O；10μg对氨基苯甲酸；0.3g谷氨酸；4g葡萄糖。谷氨酸和葡萄糖115℃灭菌30min后单独加入，其他试剂可配好后121℃灭菌20min。

2、蛋白含量的测定方法(Bradford,1976)

(1)溶液的配置

Bradford储存液：100mL 95％乙醇，200mL 88％磷酸，350mg考马斯亮蓝G250；

Bradford工作液：425mL双蒸水，15mL 95％乙醇，30mL88％磷酸，30mL Bradford储存液；滤纸过滤，保存于棕色瓶中，室温放置。可保存数周，但使用前需过滤。

(2)标准曲线的制作

取1ml Bradford工作液于试管中，分别加入8μL的0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的BSA溶液，混匀，放置3～5min，显蓝色。测定OD₅₉₅值。以加入8μL水的1mL Bradford工作液作为对照。以OD₅₉₅值为纵坐标，BSA溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。得到标准曲线方程y＝0.6.5853x-0.1067，R²＝0.9986。

(3)蛋白含量检测

离心收集菌体，加200μL 0.5M的NaOH煮沸5min，再加200μL 0.5M的HCl混合均匀后离心吸取上清液8μL，加入到1mL Bradford工作液中，混匀，放置5min，显色。测定OD₅₉₅值。将OD₅₉₅值带入标准曲线方程中，计算蛋白浓度。

3、1nmol乙烯的标定

(1)准备120mL血清瓶2个，标为1#、2#瓶；

(2)将血清瓶灌满水，并用插有针头的胶塞塞好，防止气泡产生，取下胶塞，倒出100mL水(用容量瓶量取)，换上新胶塞，这样瓶中的空气体积即为100mL；

(3)向1#瓶中注射2.24mL(标准状况下为2.24mL，非标准状况下，根据公式：PV＝nRT来计算注入量)乙烯，再从1#瓶中取出1mL气体注入2#瓶中，从2#瓶中取出100μL气体打入气相色谱仪(仪器型号HP6890)，所显示的峰面积即为1nmol乙烯的量，据此可计算出记录纸上每单位峰面积代表多少nmol乙烯。

(4)固氮酶活的计算公式为：

类芽孢杆菌LQ3菌株在不同铵浓度条件下的固氮酶活性检测结果见图3，LQ3菌株在无铵(0mM)条件下具有最高的固氮活性,其固氮酶活性为4250.98nmol C₂H₄/mg proteinh；在5-20mM铵浓度条件下几乎检测不到固氮酶活；但是随着铵浓度的继续增加又恢复固氮酶活性,在100mM铵离子浓度条件下又出现较高的固氮活性,其固氮酶活性为1363.81nmolC₂H₄/mg protein h；并且在200mM铵离子浓度条件下仍能够保持较高的固氮活性,其固氮酶活性为775.03nmol C₂H₄/mg protein h；在300mM铵离子浓度条件下的固氮酶活性为401.39nmol C₂H₄/mg protein h。

实施例3固氮类芽孢杆菌LQ3菌株对黄瓜的促生作用实验

将在测酶活的基本培养基中培养获得的菌液离心收集菌体，然后用去离子水悬浮调整其细胞密度OD₆₀₀为1.0，即得菌悬液。将发芽的植物种子浸泡于菌悬液中30min,然后将其移栽至小盆(无菌营养土:蛭石为1:1)中。待植株生长2周后,每株植物再各浇15mL菌悬液。植物生长4周后,收获植株，用流动水清洗植株根部的土，测定植物根和茎的长度及干重，以去离子水处理组作为对照组，结果如表1所示。

表1类芽孢杆菌LQ3对黄瓜的促生效果

由表1结果可知，与对照组相比，类芽孢杆菌LQ3菌悬液处理的黄瓜的根长和茎长分别比对照组提高了28.21％和26.04％，根和茎的干重也比对照组分别提高了47.06％和73.68％。由此可见，类芽孢杆菌LQ3不仅促进黄瓜茎和根的伸长,而且显著增加植株的干重，可以作为一种促进植物生长作用的生物固氮肥料在生产中得到应用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一株天然耐铵固氮微生物LQ3及其应用

<130> KHP191115707.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgtatcgac caggcacaga actcggtcct ggagctggca gccgaactgg gctcagtaga 60

ggatttggaa ctggaggatg tgctgcagac cggctttggc gacattatca atgtagagtg 120

cggcggacct gaaccgggtg taggctgtgc agggcgcggt atcattactg ccatcaactt 180

cctggagcag gaaggcgcct atcaggatct ggacttcgta tcctatgacg tattgggcga 240

cgttgtatgc ggcggtttcg ccatgccgat ccgcgaaaac aaggcccaga 290

<210> 2

<211> 1453

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acatagtcga gctatacatg cagtcgagcg gagcttatcc ttcggggtaa gcttagcggc 60

ggacgggtga gtaacacgta ggcaacctac cctctagact gggataacta ccggaaacgg 120

tagctaatac cggataattc cttgatccac ctgggtttgg gatgaaaggc ggagcaatct 180

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cggtagagta actgctgccg gagtgacggt acctgagaag aaagccccgg ctaactacgt 480

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gcgcgcaggc ggctgcttaa gtctggtgtt taaaccttgg gctcaacctg gggtcgcact 600

ggaaactggg cagcttgagt acagaagagg aaagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctgggctgt aactgacgct 720

gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

gatgagtgct aggtgttagg ggtttcgata cccttggtgc cgaagttaac acagtaagca 840

ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac 900

aagcagtgga gtatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 960

tccaactaac gaagcagaga tgcattaggt gcccttcggg gaaagttgag acaggtggtg 1020

catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgacttta gttgccagca ggtgaagctg ggcactctag agtgactgcc ggtgacaaac 1140

cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200

actacaatgg ccggtacaac gggaagcgaa gccgcgaggt ggagccaatc ccagcaaagc 1260

cggtctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat tgctagtaat 1320

cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tacaacaccc gaagtcggtg gggtaacccg caaggtggcc agccgccgaa 1440

ggtggagaac tca 1453

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgcgatc cvaaggccga ytcvacccg 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgvgccttg ttytcgcgga tsggcatggc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtttgat cctggctcag aacgaacgct 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28

Claims

1.一株耐铵固氮类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）LQ3，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18073。

2.包含权利要求1所述的类芽孢杆菌LQ3的菌剂。

3.权利要求1所述的类芽孢杆菌LQ3或权利要求2所述的菌剂在生物固氮中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物固氮为在铵离子浓度大于20 mM的高铵浓度条件下的生物固氮。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为30~450mM。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高铵浓度条件的铵离子浓度为50~400mM。

7.权利要求1所述的类芽孢杆菌LQ3或权利要求2所述的菌剂在促进植物生长或提高植物产量中的应用。

8.权利要求1所述的类芽孢杆菌LQ3或权利要求2所述的菌剂在肥料制备中的应用。

9.权利要求1所述的类芽孢杆菌LQ3或权利要求2所述的菌剂在选育固氮微生物中的应用。

10.一种促进植物生长或提高植物产量的方法，其特征在于，对所述植物施用权利要求1所述的类芽孢杆菌LQ3或权利要求2所述的菌剂。