CN110724184A

CN110724184A - Harp1类多肽介导的细胞内转运及其在调节生物防御机制中的应用

Info

Publication number: CN110724184A
Application number: CN201910569786.1A
Authority: CN
Inventors: 毛颖波; 陈春雨; 陈芳艳; 刘尧倩; 王牧阳; 王凌健; 陈晓亚
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2020-01-24
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: CN110724184B; WO2020001547A1

Abstract

本发明涉及HARP1类多肽介导的细胞内转运及其在调节生物防御机制中的应用。首次揭示HARP1及其类似多肽(HARP1‑like，HL)具有通过细胞壁和细胞膜等复杂结构进入细胞或组织的特性，从而其可被应用于建立高效的运输系统，帮助外源活性分子，进入细胞。所述的HARP1及其类似多肽还具有效应子活性，能够降低植物防御响应。

Description

HARP1类多肽介导的细胞内转运及其在调节生物防御机制中的应用

技术领域

本发明属于生物技术以及植物学领域，更具体地，本发明涉及利用昆虫HARP1类多肽介导的细胞内转运及其在调节生物防御机制中的应用。

背景技术

植食性昆虫是以植物活体为食的昆虫，根据它们的口器和消化道在构造和功能上的不同，可分为以完整植物器官、组织为食和吸食汁液两大类。植食性昆虫多见于鳞翅目、弹尾目、等翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫。根据它们的口器和消化道在构造和功能上的不同，可分为以完整植物器官、组织为食和吸食汁液两大类。很多植食性昆虫只以植物活体为食，很多农业害虫都有这种食性，在农业上造成很大的危害。

植物被昆虫取食后，植物自身可产生一些自体防御，包括直接防御或间接防御。目前已经了解植物体内存在一些防御信号途径来调控植物的自体防御。茉莉酸信号途径是植物体内主要防御信号途径之一，亚麻酸经过十八烷代谢途径，迅速生成信号物质茉莉酸(jasmonic acid)，茉莉酸激活编码蛋白酶抑制剂的基因，产生蛋白酶抑制剂。昆虫诱导植物产生蛋白酶抑制剂需要茉莉酸和乙烯的参与。植物被昆虫取食后，通过系统素或细胞膜信号级联反应，经茉莉酸途径在转录水平上正向调控蛋白酶抑制剂基因的表达，引起蛋白酶抑制剂快速增加，以抵御昆虫取食。

目前本领域中关于植物对病原菌防御反应在细胞水平的研究已取得了许多进展，但是对于植物与昆虫的互作识别的研究仍然有较多困惑，并且较少地能够被运用于农业中，发挥实用价值。因此，本领域还需要进行深入的研究，来切实地将这种植物与昆虫的互作识别应用于植物改良或者病虫害防治等应用中。

此外，本领域中存在一些具有细胞穿膜功能的肽，它们具有携带其它分子穿透细胞、进入到细胞内的能力。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(protein derivedCPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(model peptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类：①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。尽管已经有一些肽的存在，但是本领域中仍然有较多的分子无法藉由上述已知的穿膜肽被引入到细胞内，因此还需要进一步找到更多的、具有普适性的此类肽。

发明内容

本发明的目的在于提供HARP1类多肽介导的细胞内转运的应用；本发明的目的还在于提供HARP1类多肽在调节植物防御机制中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种将外源活性分子引入到细胞或组织中的方法，所述方法包括：(1)将外源活性分子与HARP1或其保守性变异多肽连接，获得连接产物；(2)将步骤(1)的连接产物接触细胞或组织，从而外源活性分子被引入到细胞或组织中。

在一个优选例中，所述的外源活性分子被引入到细胞的细胞质或细胞核中。

在另一优选例中，所述的外源活性分子包括：多肽，核酸，毒素，化合物，或它们的组合。所述的多肽或核酸可以是治疗性的多肽或核酸。

在另一优选例中，所述的外源活性分子包括为多肽，包括：功能性多肽(如酶)或结构多肽。较佳地，所述的外源活性分子是能够改变动物、植物或微生物性状或特性的多肽。例如，所述的外源活性分子包括(但不限于)：转录因子，植物防御蛋白，信号分子，RNA结合蛋白，药物分子(如肽或核酸类的分子)等。

在另一优选例中，所述的连接包括：融合，偶联，吸附，耦合或复合。

在另一优选例中，所述的细胞或组织包括：动物细胞或组织，植物细胞或组织，微生物细胞(包括细胞培养物)。

在另一优选例中，所述的动物包括但不限于：人、哺乳动物、昆虫。

在另一优选例中，所述的植物包括但不限于：单子叶植物、双子叶植物；或所述植物包括但不限于：种子植物、蕨类植物、藻类植物、苔藓植物。

在本发明的另一方面，提供一种降低植物对损伤的防御响应能力的方法，所述方法包括：以HARP1或其保守性变异多肽处理植物；或将HARP1或其保守性变异多肽的编码基因转化植物。

在另一优选例中，所述的HARP1通过抑制茉莉酸信号途径基因或多肽的表达或活性，来降低植物对损伤的防御响应能力。

在另一优选例中，所述的茉莉酸信号途径包括包括：Jasmonate(JA)响应基因、蛋白酶抑制剂基因、次生代谢合成相关转录因子及合酶。

在另一优选例中，所述的Jasmonate响应基因包括：TAT1、VSP2、MYC2。

在另一优选例中，所述的蛋白酶抑制剂基因包括：Gh_Sca005135G01、Gh_A10G2353、Gh_D11G1335。

在另一优选例中，所述的降低植物对损伤的防御响应能力包括：减少有毒化防御物质的产生。

在另一优选例中，HARP1或其保守性变异多肽包括：(a)具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的多肽；(b)起始于SEQ ID NO:2中第21～39位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第119～122位所示氨基酸序列的多肽；或，起始于SEQ ID NO:4中第21～38位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第118～121位所示氨基酸序列的多肽；(c)由(a)或(b)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)或(b)功能的多肽；(d)氨基酸序列与(a)或(b)多肽的氨基酸序列有40％以上(较佳地50％以上、60％以上、70％以上或80％以上；更佳地85％以上，90％以上，95％以上或99％以上)相同性，且具有多肽(a)或(b)功能的多肽；或(e)在(a)或(b)或(c)或(d)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在多肽(b)或(c)或(d)的N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在另一优选例中，(b)中，所述多肽的序列起始于SEQ ID NO:2中第22～38位、第23～37位、第24～38位、第25～37位、第26～36位、第27～35位、第28～34位、第29～33位、第30～31位或第30～32位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第120或121位；或，起始于SEQID NO:4中第22～37位、第23～36位、第24～35位、第25～34位、第26～33位、第27～32位或第28～31位或第29～30位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第119、120位。

在另一优选例中，HARP1或其保守性变异多肽来自于：鳞翅目昆虫；较佳地，所述的鳞翅目昆虫包括夜蛾科昆虫。

在另一优选例中，所述的鳞翅目昆虫包括：小菜蛾，甜菜夜蛾(S.exigua)，烟芽夜蛾(H.virescens)，草地夜蛾(S.frugiperda)，小地老虎(A.ipsilon)，蓓带夜蛾(Mconfigurata)，粉纹夜蛾(T.ni)。

在另一优选例中，所述的植物包括：能被鳞翅目昆虫取食的植物，存在损伤防御响应机制的植物。

在另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)：十字花科植物，锦葵科植物，禾本科植物以及茄科植物等。

在本发明的另一方面，提供HARP1或其保守性变异多肽的用途，用于将外源活性分子引入到植物细胞或组织中。

在另一优选例中，所述的外源活性分子被引入到植物细胞的细胞质或细胞核中。

在另一优选例中，通过将外源活性分子与HARP1或其保守性变异多肽连接，从而由HARP1或其保守性变异多肽将外源活性分子引入到植物细胞中。

在本发明的另一方面，提供HARP1或其保守性变异多肽的用途，用于降低植物对损伤的防御响应能力。

在本发明的另一方面，提供一种分离的HARP1多肽片段，其为：(i)起始于SEQ IDNO:2中第21～39位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第119～122位所示氨基酸序列的多肽；或，起始于SEQ ID NO:4中第21～38位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第118～121位所示氨基酸序列的多肽；(ii)由(i)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(i)功能的多肽；(iii)氨基酸序列与(i)多肽的氨基酸序列有40％以上(较佳地50％以上、60％以上、70％以上或80％以上；更佳地85％以上，90％以上，95％以上或99％以上)相同性，且具有多肽(i)功能的多肽；或(iv)在(i)或(ii)或(iii)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或添加信号肽序列后形成的多肽。

在另一优选例中，(i)中，所述多肽的序列起始于SEQ ID NO:2中第22～38位、第23～37位、第24～38位、第25～37位、第26～36位、第27～35位、第28～34位、第29～33位、第30～31位或第30～32位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第120或121位；或，起始于SEQID NO:4中第22～37位、第23～36位、第24～35位、第25～34位、第26～33位、第27～32位或第28～31位或第29～30位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第119、120位。

在本发明的另一方面，提供一种提高HARP1多肽将外源活性分子引入到细胞或组织中的效率的方法，包括：对HARP1多肽的N端或C端进行截短，从而获得起始于SEQ ID NO:2中第21～39位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第119～122位所示氨基酸序列的多肽；或，起始于SEQ ID NO:4中第21～38位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第118～121位所示氨基酸序列的多肽。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、蛋白的序列分析发现HARP1在N端具有信号肽。图示HARP1蛋白的全长序列，下划线字体表示HARP1蛋白在N端具有的信号肽序列。

图2、HARP1蛋白的信号肽预测。

图3、HARP1蛋白在棉铃虫口器中大量积累。A：HARP1基因在棉铃虫各组织器官的表达分析。Foregut：前肠；Midgut：中肠；Fat body：脂肪体；Malpighian tubule：马氏管；Ovary：卵巢；Salivary gland：唾液腺。

B：HARP1在棉铃虫中肠(Midgut)；肠液(Gut fluid)及口器分泌物(OS)中的蛋白水平。Gossypol：棉酚，+表示棉铃虫取食含有棉酚的人工饲料，-表示棉铃虫取食不含棉酚的人工饲料。CBB：考马斯亮蓝染色，用于蛋白上样量的测定。

C：取食不同食物的棉铃虫口器分泌物中HARP1蛋白的丰度。AD：人工饲料；GL；无酚棉；GD：有酚棉；AT：拟南芥。

图4、HARP1在被棉铃虫取食后的植物叶片损伤部位有明显分布。图中Mechanicalwounding表示人为的机械损伤，Insect wounding表示植物取食造成的伤口。HARP1在叶片上的信号表现为暗紫色，箭头所指部分为HARP1信号较强区域，标尺表示100μm。

图5、原核纯化的HARP1蛋白能够削弱植物对机械损伤的响应。A：原核表达纯化的HARP1蛋白处理拟南芥叶片伤口后，相较于对照Venus蛋白，HARP1蛋白处理后，JA响应基因TAT1、VSP2、MYC2的诱导水平均明显降低。

B：原核表达纯化的HARP1蛋白处理棉花叶片伤口后，相较于对照Venus蛋白，HARP1蛋白处理后，棉花中三个蛋白酶抑制剂基因的诱导水平均明显降低。

图6、Venus-HARP1融合蛋白能够进入植物细胞并部分定位于细胞核中。A：使用原核纯化的Venus-HARP1融合蛋白及Venus蛋白处理拟南芥叶片伤口处。实验发现，仅有Venus-HARP1融合蛋白在拟南芥叶片伤口处能够检测到，而Venus蛋白几乎检测不到。标尺代表500μm。

B：对Venus-HARP1蛋白信号位点(图A)进一步分析发现，部分蛋白可以进入细胞核中。DAPI染料用于细胞核染色。峰图表示箭头部分荧光强度分布。标尺代表5μm。

C：使用原核纯化的Venus-HARP1融合蛋白及Venus蛋白处理拟南芥根部伤口处。实验结果表明，仅有Venus-HARP1融合蛋白能够在拟南芥下胚轴以及上部叶片检测到信号，而Venus蛋白几乎检测不到。标尺代表500μm。

D：对处理拟南芥根部伤口的材料观察下胚轴，发现部分Venus-HARP1蛋白可以进入细胞核中，而Venus蛋白却未观察到这一现象。标尺代表10μm。

图7、烟草瞬时表达的HARP1蛋白定位于植物细胞核中。35S：GFP-HARP1(GFP-HARP1)以及35S：GFP(GFP)载体顺转入烟草叶片，2天后使用激光共聚焦显微镜观察，标尺代表100μm。

图8、HARP1在鳞翅目昆虫中广泛存在，并在夜蛾科具有较高的相似性。

A：HARP1蛋白广泛分布于鳞翅目昆虫中且在夜蛾科昆虫中更为保守。鳞翅目昆虫中HARP1蛋白系统进化树的构建采用Mega软件完成。

B：夜蛾科昆虫中HARP1及其相似蛋白的序列比对分析。序列比对使用软件VectorNTI Advance中的Align X，采用软件中的Clustal W方法进行。

图9、HARP1类似多肽REPAT38具有与HARP1类似的功能。原核表达纯化的REPAT38蛋白处理植物伤口后，相较于对照Venus蛋白，REPAT38处理后，JA响应基因TAT1、VSP2、MYC2的诱导水平均明显降低。

图10、Venus-REPAT38融合蛋白能够进入拟南芥和烟草细胞。

A：使用原核纯化的Venus-REPAT38融合蛋白及Venus蛋白处理伤处理后的拟南芥，实验显示，仅有Venus-REPAT38融合蛋白能在拟南芥叶片和下胚轴检测到信号，而Venus蛋白几乎检测不到。标尺代表250μm。

B：对融合蛋白处理后拟南芥材料观察下胚轴，Venus-REPAT38融合蛋白能在下胚轴细胞内检测到，而Venus蛋白几乎检测不到。标尺代表50μm。

C：使用原核纯化的Venus-REPAT38融合蛋白、Venus-HARP1融合蛋白及Venus蛋白处理烟草叶片伤口处。Venus-REPAT38和Venus-HARP1融合蛋白能在烟草叶片伤口处及叶片内部检测到信号，而Venus蛋白几乎检测不到。标尺代表250μm。

D：对处理烟草叶片伤口的材料观察内部细胞，Venus-REPAT38和Venus-HARP1融合蛋白能在叶片细胞内检测到，而Venus蛋白几乎检测不到。标尺代表50μm。

图11A～F、Venus-HARP1从伤口处进入细胞及在叶片组织中快速多方式运动。

图12、HARP1进植物细胞的广谱性或多样性研究。

A：生长约24周的无酚棉叶片损伤处理后浸泡Venus-HARP1、Venus 4h后，用PBSA清洗2h后荧光显微镜观察伤口附近结果。图中bar的大小都为200μm。

B：生长约24周的烟草叶片损伤处理后浸泡Venus-HARP1、Venus 4h后，用PBSA清洗2h后荧光显微镜观察伤口附近结果。图中bar的大小都为200μm。

图13、去除N端部分序列能够显著提高蛋白进入植物细胞的效率。A～G分别为Venus-HARP1；Venus-HARP1δC5(去除C端的5aa)；Venus-HARP1δN10(去除信号肽后N端的10aa)；Venus-HARP1δN15(去除信号肽后N端的15aa)；Venus-HARP1δN20(去除信号肽后N端的20aa)；Venus-HARP1δN25(去除信号肽后N端的25aa)；Venus。

图14、HARP1蛋白具有进入动物细胞的能力，并有部分定位细胞核。

图15、HARP1蛋白具有进入人细胞的能力，图示Venus-HARP1进入A549细胞，并部分进入细胞核。

A：A549细胞浸泡Venus-HARP1、Venus 4h后荧光显微镜观察结果。

B：为A中浸泡Venus-HARP1的细胞进一步放大观察结果。

C：为A中浸泡Venus-HARP1的细胞DAPI染色后观察结果。图中bar的大小如图所示。

图16、Venus-HARP1进入293T细胞，并部分进入细胞核。

A：293T细胞浸泡Venus-HARP1、Venus 4h后荧光显微镜观察结果。

B：为A中浸泡Venus-HARP1的细胞进一步放大观察结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现HARP1及其类似多肽(HARP1like，HL)具有通过细胞壁和细胞膜等复杂结构进入细胞以及细胞核的特性，从而其可被应用于建立高效的运输系统，通过蛋白融合等手段，帮助外源活性分子，进入生物体的细胞或组织中，从而改变生物体的性状、特性或状态。所述的HARP1及其类似多肽还具有效应子活性，能够降低植物防御响应，从而减少有毒化防御物质的产生。

HARP1及其类似多肽

植食性昆虫与植物在长期进化过程中建立了复杂的互作信号网络，Jasmonate(JA)是植物主要的防御激素。前期，本发明人发现昆虫口器分泌物可以干扰植物的防御反应，本发明人从中分离得到一个蛋白，称为HARP1蛋白。HARP1保守性变异多肽例如但不限于来自：小菜蛾，甜菜夜蛾(S.exigua)，烟芽夜蛾(H.virescens)，草地夜蛾(S.frugiperda)，小地老虎(A.ipsilon)，蓓带夜蛾(M.configurata)，粉纹夜蛾(T.ni)等鳞翅目昆虫的与HARP1具有同源性的蛋白；一个具体的例子如来自甜菜夜蛾的REPAT38。

本发明所述的HARP1多肽(蛋白)或REPAT38多肽(蛋白)还包括它们的保守性变异多肽、片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“保守性变异多肽”、“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的HARP1多肽或REPAT38多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-50个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-8个；如5个，3个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种HARP1多肽或REPAT38多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，HARP1多肽或REPAT38多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的HARP1多肽或REPAT38多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长HARP1多肽或REPAT38多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长HARP1多肽或REPAT38多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“HARP1多肽”指具有HARP1多肽活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与HARP1多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-50个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

在本发明中，术语“REPAT38多肽”指具有REPAT38多肽活性的SEQ ID NO:4序列的多肽。该术语还包括具有与REPAT38多肽相同功能的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-50个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

编码HARP1多肽或REPAT38多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟HARP1多肽或REPAT38多肽的编码区序列可以与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码基因”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

作为本发明的优选方式，本发明提供了一种HARP1多肽或REPAT38多肽的截短体，其是在HARP1多肽或REPAT38多肽的基础上，去除N端或C端部分序列后获得的多肽。较佳地，所述截短体为去除N端(不包括信号肽)的1～19个，2～18个，3～17个氨基酸后获得的多肽。更具体地例如去除N端(不包括信号肽)4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个氨基酸后获得的多肽。而对于HARP1多肽或REPAT38多肽的C端，一般去除小于5个、小于4个、小于3个或小于2个氨基酸。本发明人意外地发现，所述的截短体能够更为高效地将外源活性分子引入到细胞或组织中。

应理解，虽然本发明的HARP1基因或REPAT38基因分别获自夜蛾科昆虫棉铃虫或甜菜夜蛾，但是获自其它昆虫的与该HARP1基因或REPAT38基因高度同源，如具有40％以上；较佳地50％以上、60％以上、70％以上或80％以上；更佳地85％以上，90％以上，95％以上或99％以上的其它基因也在本发明的范围之内。根据同源比对，本发明人发现HARP1类似多肽(HARP1 like，HL)在鳞翅目昆虫中普遍存在，而在夜蛾科中有很高的保守性。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或HARP1多肽或REPAT38多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含HARP1多肽REPAT38多肽编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是植物细胞或动物细胞。

细胞内转运的应用

本发明提供了一种将外源活性分子引入到细胞或组织中的方法，包括：(1)将外源活性分子与HARP1类多肽连接，获得连接产物；(2)将步骤(1)的连接产物接触细胞或组织，从而外源活性分子被引入到细胞或组织中。较佳地，所述的外源活性分子被引入到细胞的细胞核中。

如本文所用，所述的HARP1类多肽包括REPAT38等HARP1保守性变异多肽，所述保守性变异多肽包括HARP1、REPAT38等多肽的截短体。

如本文所用，所述的“外源活性分子”又称为“功能性分子”，是指一些具有特定的功能，能够改造生物体(包括动物和植物)的性状、结构、特性或状态的一类分子，例如其能够使植物产生至少一个方面性状的改良，又例如可以使疾病状态的动物或人发生疾病的改善；也可以是一类具有指示或报告功能的分子，能够使得生物体的某些器官、组织和细胞被检测到或被定位，例如荧光蛋白，标签蛋白(如myc，HA，His等)。可以被运用的外源活性分子包括：多肽，核酸，化合物(如一些激素)。

本发明的HARP1类多肽可以将外源活性分子引入到细胞或组织中，特别是能够进入到人细胞，这在临床疾病治疗领域将有很大的应用前景。临床上，需要引入外源活性分子(如作为药物)来实施治疗的疾病是较多的。例如肿瘤，可以以HARP1类多肽携带抑制分子或毒素到肿瘤细胞中，从而实现抑制肿瘤的目的。例如一些酶或蛋白功能低下相关的疾病，可以以HARP1类多肽携带活性的酶或蛋白进入到细胞或组织中，来实现缓解或治疗此类疾病的目的。

所述的人细胞可以包括但不限于：肿瘤细胞、体细胞、胚胎细胞。所述体细胞包括但不限于：成纤维细胞、生殖细胞、骨髓细胞、血液细胞等。本发明实施例中论证了人肺癌细胞，人胚胎肾细胞以及动物细胞如果蝇细胞，植物细胞，但是应理解，适用于本发明的技术方案的细胞不限于实施例中所列举的。

本发明所述的HARP1类多肽与外源活性分子的连接方式可以为共价连接或非共价连接。所述的连接包括：融合，偶联，吸附，耦合或复合等。所述的“连接”为“操作性连接”，即两个或多个分子之间具有功能性的空间排列。应理解，只要能够保留HARP1类多肽及外源活性分子的功能、保留良好的穿透细胞膜及体组织屏障的效果，任何连接方式均可包含在本发明中。共价连接通常以形成共价键的方式将两个分子进行连接。而一些非共价连接(不形成共价键)例如偶联、吸附、结合等也可应用。

作为本发明的优选方式，所述的外源活性分子为多肽，包括：功能性多肽(如酶)或结构多肽。当外源活性分子为多肽时，其与HARP1类多肽进行融合，获得融合蛋白。所述的HARP1类多肽与外源活性分子之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸；例如15、10、8、6、5、4、3、2、1个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响HARP1与外源活性分子发挥穿透细胞膜及体组织屏障效果，也不影响外源活性分子的功能。

HARP1类多肽与外源活性分子之间的连接，若以肽键进行连接，则根据需要，外源活性分子可以位于HARP1类多肽的氨基端，也可以位于HARP1类多肽的羧基端。

作为本发明的选择方式，所述的外源活性分子可以是RNA或DNA，例如其是一种能够在生物体内产生针对某一基因具有同源性干扰效应的RNA分子。

作为本发明的选择方式，所述的HARP1类多肽可以通过氨基、羧基或巯基等化学反应实现与外源活性分子的连接，包括但不限于所述多肽与多聚物之间的连接，所述多肽在脂质体或纳米粒子表面的共价修饰、酯化反应、硫化反应等。

所述的非共价连接为静电吸附连接或受体配体反应。所述的静电吸附连接包括但不限于所述细胞穿膜载体与核酸分子之间的静电连接。所述的受体-配体反应指的是分别在HARP1类多肽和外源活性分子上连接在可以特异性匹配的受体与配体，通过受体与配体的高度专一性，实现所述多肽与外源活性分子的连接。如生物素与亲和素之间的专一性匹配。

基于本发明的可以促进外源活性分子通过细胞壁和细胞膜等复杂结构进入细胞以及细胞核的特性。因此，多种外源活性分子均可被应用于与所述的HARP1类多肽连接，来构成复合体。

在本发明的具体实施例中，本发明人发现原核表达的Venus-HARP1融合蛋白能够进入细胞内，并有部分融合蛋白定位在细胞核内。这说明昆虫中的HARP1类多肽可以将与其融合的蛋白，通过细胞壁，细胞膜等多重阻碍，进入到细胞内发挥功能。

适用于以本发明的HARP1类多肽来介导引入外源蛋白的细胞或组织的种类是广谱的，可以是多种生物体细胞，包括植物细胞或组织、动物细胞或组织、微生物细胞(包括其培养物)等。

在本发明的具体实施例中，本发明人还发现，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中的HARP1类似多肽具有与HARP1类似的功能。这些发现说明，HARP1及其类似多肽可作为一种运输系统，通过蛋白融合等手段，帮助外源活性分子，进入细胞，从而改变生物体的性状、结构、特性或状态。

在本发明的具体实施例中，本发明人观测到，所述HARP1类多肽与外源活性分子连接的连接产物从伤口处进入多种细胞。并且，所述HARP1类多肽与外源活性分子连接的连接产物在叶片组织中快速多方式运动。

调节植物防御响应的应用

本发明提供了一种降低植物对损伤的防御响应能力的方法，包括：以HARP1类多肽处理植物；或将HARP1类多肽的编码基因转化植物。所述的降低植物对损伤的防御响应能力包括：减少植物体内有毒化防御物质的产生。

所述的HARP1类多肽通过影响植物体内的防御响应机制来发挥调控作用，所述的防御响应机制包括基于茉莉酸信号途径的机制。本发明人发现HARP1类多肽显著地抑制茉莉酸信号途径基因或多肽的表达或活性。所述的茉莉酸信号途径包括：Jasmonate(JA)响应基因，如TAT1、VSP2、MYC2，这些基因在HARP1类多肽处理或过表达HARP1类多肽后会受到显著的抑制。很多重要的植物防御物质受JA途径的调控已是本领域公知，因此，HARP1类多肽对JA响应的削弱作用，则必然减少植物体内有毒化防御物质的产生。

本发明人发现，体外表达HARP1类多肽并以之处理后的损伤植物中，JA早期响应基因对机械损伤的应答受到抑制；过表达HARP1类多肽的转基因植物，在受到损伤后，也呈现这种JA早期响应基因对机械损伤的应答的抑制。因此，HARP1类多肽在离体或体内条件下均具有明显的效应子活性。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的HARP1类多肽的表达。比如可通过一定的途径将携带HARP1类多肽编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的HARP1类多肽。作为本发明的一种实施方式，将HARP1类多肽的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述HARP1类多肽的植物细胞中，使所述的植物细胞表达HARP1类多肽。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达HARP1类多肽的植物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中用于本实验的引物信息如表1。

表1

实施例1、HARP1蛋白序列分析

通过对取食人工饲料和取食拟南芥的棉铃虫口器分泌物的蛋白质组分析，本发明人得到一个受植物诱导的棉铃虫口器分泌蛋白，命名为HARP1。

通过转录组序列比对，本发明人得到HARP1的核酸序列以及蛋白序列。根据序列信息，合成引物，PCR扩增得到HARP1基因。通过使用Blast以及借助Align X软件对该蛋白的分析。

进一步地，通过序列分析，本发明人发现该蛋白在N端含有一个信号肽，可能具有帮助该蛋白分泌到口器中的作用(图1～2)。

HARP1核苷酸序列(SEQ ID NO:1)如下：

ATGAAGAGCCTTATCCTCGTCGCAGTCCTCGCTGCGCTGGCAGTCTGCAGTGATGCAGCTGCTCTGCAGCAGAACCCTGCCTTCAGGGCCAACATGTACCAGGGAGCCATCAGACCTGGTGACAGACTCCTCTACAGAAACTACTACTACAAAGCTCCCATCGCGAACGCAGTGCAATATCAGGACATCACGTACCGTGGCAGTTCCAGCACTCGGATCTCCTTCATCCAGGCCGTTGAGGTCGGCCAGACCCAGTGGGGCCAACCTTCCCTCAGGTCCGGAGGAGTTAACTTCAGCAACGCCACCATCAGACTGACATCAGCCCGCGGCTGGGGCTACTACTACATGATCGAAATCTGGGGCCGATAA

HARP1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)如下：

MKSLILVAVLAALAVCSDAAALQQNPAFRANMYQGAIRPGDRLLYRNYYYKAPIANAVQYQDITYRGSSSTRISFIQAVEVGQTQWGQPSLRSGGVNFSNATIRLTSARGWGYYYMIEIWGR

实施例2、HARP1蛋白的组织特异性分析

选取4龄的棉铃虫，分别取中肠、唾液腺等组织器官，采用Trizol法提取RNA，以棉铃虫actA3b作为内参基因，进行定量分析。结果发现，转录组水平HARP1在中肠中高表达，而在唾液腺中表达量很低(图3A)。

同时，为了检测HARP1蛋白在棉铃虫中肠、肠液和口器分泌物中的表达水平，本发明人首先用50mM Tris-HCl(pH 9.0)提取4龄棉铃虫中肠的总蛋白，同时提取棉铃虫的肠液及口器分泌物，与中肠总蛋白溶液一起用等体积的氯仿抽提，并用75％乙醇洗涤一遍，最后溶于水中。在15％的蛋白胶中每孔加入等量的蛋白样品，之后用HARP1抗体进行检测。在蛋白水平，HARP1在棉铃虫口水中表达丰度最高，同时HARP1蛋白可以受棉酚等次生化合物诱导(图3B)。

本发明人还考察了取食不同食物(人工饲料，无酚棉，有酚棉，拟南芥)的棉铃虫口器分泌物中HARP1蛋白的丰度。结果显示，不同的植物也可以诱导棉铃虫口水中HARP1蛋白的丰度(图3C)。取食有酚棉或拟南芥的棉铃虫口水中HARP1蛋白的丰度显著更高。

实施例3、HARP1在被棉铃虫取食后的植物叶片损伤部位有明显分布

棉铃虫在取食植物时，口器分泌物会接触植物伤口处。选取四龄初的棉铃虫，通过预先饲喂含有棉酚的人工饲料，然后让其取食生长3周的拟南芥叶片。通过整体的免疫组化方法，将棉铃虫取食的拟南芥叶片快速转移到FAA固定液中，真空抽取至完全沉浸在FAA中，并以固定液固定4小时，同时以人为机械损伤的叶片作为对照。之后，将固定好的叶片利用系列梯度的乙醇溶液进行脱水，然后再使用系列梯度的乙醇溶液进行复水。经过2小时的封闭液(1×PBS，0.1％Tween 20，1％Albumin，Bovine Serum)封闭后，使用HARP1抗体在4℃孵育过夜，PBST洗涤4次后，经Western Blue碱性磷酸酶底物(Promega)处理后显色，使用显微镜观察。

结果表明，棉铃虫取食后的拟南芥伤口处存在HARP1蛋白，而在人为机械损伤的叶片伤口处不存在信号(图4)。

实施例4、原核纯化的蛋白能够削弱植物对机械损伤的响应

以棉铃虫中肠cDNA为模板，以表1中HARP1表达引物为引物，采用PCR的方法扩增出HARP1基因序列，并在HARP1的起始密码子和终止密码子前分别引入BamHΙ和HindΙΙΙ酶切位点，将HARP1导入pET32a多克隆位点BamHΙ和HindΙΙΙ之间，从而获得携带目的片段的重组表达载体，称为pET32a/HARP1。将pET32a/HARP1转化E.coli BL21(DE3)后，挑取阳性单菌落至2mL LB(含100μg/mL Amp)培养基中，37℃，220rpm培养至对数生长期，取200μl转接入200ml培养基中，大摇至OD＝0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续16℃诱导培养过夜。依照Ni-NTA Spin Kit手册(Qiagen，Valencia，CA)，纯化带有His-Tag的重组蛋白。过程如下：收集菌体，重悬于15ml Lysis buffer(50mM Tris-Cl，pH 8.5，100mM NaCl，10mMimidazole)。高压破碎后，离心取上清，过装好的1ml Ni-NTA resin。蛋白用2ml Elutionbuffer(50mM Tris-Cl，pH 8.5，100mM NaCl，250mM imidazole)洗脱，并置换于20mM Tris-Hcl Buffer，pH8.5中，使用Bradeford法，以牛血清蛋白做参照，对蛋白浓度进行定量。采用同样的方法，在E.coli BL21(DE3)中表达并纯化Venus蛋白(Venus序列从pCAMBIA 1302(http://www.cambia.org/daisy/bios/585.html)载体中扩增获得)作为后续实验的对照。

选取生长3周左右的拟南芥第二对真叶进行机械损伤处理，同时在机械损伤的部位涂施原核纯化的HARP1蛋白和Venus蛋白(对照)，4小时后，取样。利用Trizol法提取拟南芥叶片RNA，以拟南芥叶片中S18基因作为内参基因，进行相关基因的定量分析，结果发现，相较于Venus蛋白处理，HARP1蛋白能够明显抑制拟南芥叶片中JA响应基因(包括TAT1、VSP2、MYC2)对机械损伤的响应(图5A)。

采用相同的方法，处理棉花刚生长出的第一片真叶。采用CTAB法提取棉花叶片的RNA，以棉花叶片中的His基因作为内参基因进行相关基因的定量分析，结果发现，相较于Venus蛋白处理，HARP1能明显抑制棉花叶片中蛋白酶抑制剂基因(Gh_Sca005135G01、Gh_A10G2353、Gh_D11G1335)的表达(图5B)。

实施例5、外源的HARP1融合蛋白可以进入植物细胞，并部分定位于细胞核中

采用重组PCR的方法制备、扩增获得Venus-HARP1(5’→3’)融合序列并在Venus-HARP1的起始密码子和终止密码子前分别引入BamHΙ和HindΙΙΙ酶切位点，将Venus-HARP1导入pET32a多克隆位点BamHΙ和HindΙΙΙ之间，从而获得携带目的片段的重组表达载体，称为pET32a/Venus-HARP1。采用实施例4中相同的方法，在E.coli BL21(DE3)中表达并纯化Venus-HARP1蛋白，同时表达Venus蛋白作为后续实验的对照。

选取拟南芥第二片真叶进行机械损伤处理，之后分别置于含有原核纯化的融合蛋白Venus-HARP1及对照Venus的20mM Tris-Hcl Buffer中，蛋白含量事先用Bradeford法调齐(1mg/ml)。孵育1小时后，用PBST溶液(1×PBS+0.1％Tween 20+1％BSA)洗3-4次。随后添加DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)染料进行细胞核染色。处理后的叶片在激光共聚焦扫描显微镜(Olympus FV3000)下进行成像观察并用软件Olympus cellSens(versionDimension 1.18)进行分析。

结果发现，在拟南芥叶片伤口处外源添加原核纯化的Venus-HARP1蛋白可以进入植物细胞，并有一部分蛋白可以进入细胞核中，而外源添加的Venus蛋白则基本没有进入植物细胞中(图6A，B)。

选取生长7天左右的拟南芥幼苗，对其根部进行机械损伤处理，采用浸泡的方法处理幼苗后，置于激光共聚焦扫描显微镜下对其下胚轴部位进行观察，同样发现，原核纯化的Venus-HARP1蛋白可以进入植物细胞，并主要定位在细胞核中，而外源添加的Venus蛋白则基本没有进入植物细胞中(图6C，D)。

实施例6、烟草瞬时表达的HARP1蛋白定位于植物细胞核中

通过PCR的方法，在HARP1序列的两端分别加入BamH1和Sal1酶切位点，将HARP1导入植物表达载体YUKHS-GFPL(骨架为pCambia 1300，在多克隆位点EcoR1与Sac1间加入35Spromoter，在Sac1与Kpn1间加入GFP序列)中，得到的载体称为35S:GFP-HARP1表达载体，原先的载体YUKHS-GFPL称为35S:GFP表达载体。

采用冻融法，将得到的载体分别转入农杆菌GV3101(购自唯地生物)中，挑取单菌落接至3ml LB培养基中(含25μg/ml利福平Rif，100μg/ml庆大霉素Gent，50μg/ml卡那霉素Kan)28℃，220rpm，过夜培养。5000rpm离心10分钟，菌体重悬于瞬转缓冲液(10mM MES，10mMMgCl₂，150μM乙酰丁香酮)中，调至OD＝0.8，静置3小时后，注射入烟草叶片，2天后，取烟草叶片在激光共聚焦扫描显微镜下进行亚细胞定位观察。

烟草瞬转实验显示，GFP-HARP1在烟草叶片中定位于细胞核中(图7)。

实施例7、HARP1对植物没有明显的生长抑制作用，过表达植物没有明显的表型

本发明人同时通过PCR的方法，在HARP1序列的两端分别加入BamH1和Sal1酶切位点，将HARP1导入植物表达载体YUKHS-6MYC(骨架为pCambia 1300，在多克隆位点EcoR1与Sac1间加入35S promoter，在Kpn1与Sma1间加入6MYC标签序列)中，得到的载体称为35S:6MYC-HARP1表达载体。

采用花芽浸泡法(floral dip)进行拟南芥植物的转化。具体过程如下：采用冻融法，将得到的载体分别转入农杆菌GV3101中，如前所述，挑取单菌落并转接培养至得到200ml菌液。5000rpm离心10分钟，菌体重悬于250ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株花芽部分在菌液中浸泡1分钟，平放于塑料盆内，保湿，避光，14～20小时后置于温室中正常培养至开花结籽。T₀代种子用75％乙醇洗涤5分钟，20％漂水(白猫公司，上海)处理15分钟，无菌水清洗3～4遍后，铺在1/2MS固体培养基上(含50μg/ml Hygo)，置于拟南芥培养箱中培养1周后，挑取绿色抗性苗移栽到营养土中生长，4周后，取生长情况相似的叶片提取总蛋白，采用Western方法，使用6MYC抗体(购自翊圣公司)检测转基因植物的基因表达水平。

实验检测发现，在获得的HARP1表达量较高的转基因Line中，转基因植物的生长发育相较于野生型没有明显的区别。

实施例8、HARP1在鳞翅目昆虫中广泛存在，HARP1类似多肽具有与HARP1相似的功能

通过进一步的序列比对，以及对鳞翅目昆虫HARP1类似多肽的进一步搜集，本发明人获得了小菜蛾，甜菜夜蛾(S.exigua)，烟芽夜蛾(H.virescens)，草地夜蛾(S.frugiperda)，小地老虎(A.ipsilon)，蓓带夜蛾(M.configurata)，粉纹夜蛾(T.ni)等鳞翅目昆虫的HARP1相似蛋白。进一步本发明人发现HARP1类多肽在夜蛾科昆虫中广泛存在，并且通过Mega软件(Tamura et al.，2011)以及Align X软件的分析，表明HARP1类多肽在夜蛾科昆虫中具有很高的保守性(图8)。

通过PCR的方法，本发明人得到了甜菜夜蛾中的HARP1相似蛋白REPAT38，并采用相同的方法，将其构建入pET-32a载体中，并在E.coli BL21(DE3)中表达并纯化REPAT38蛋白和Vennus蛋白。

REPAT38核苷酸序列(SEQ ID NO:3)如下：

ATGAAGAGTCTGATTCTGGTTGCGGTGCTCGCCGCCCTCGCTGTCTGCAATGACGCAGCCGCTCTTCAAGAACCTGCCTTCAGGGCTAACCTTTACCAGGGAGCCATCAGACCCGGAGACAGACTGCTCCACAGCAACTACTACTACAAAAGCCCCATTGCTAACGCTGTACAGTACCAGGACATCACCTACCGTGGTAACTCTAGCACCAGGATCTCCTACATCCAAGTCACCGAGGTCGGCTACACCCAGTGGGGTATCCCATCCCTCAGGGCTGGTGGTGTTAACTTCAACCACGCTACCATCAGGCTGACTTCTCAAAGAGGCTACGGTTACTACTACCGTGTTGAGATTTGGGGTCGTTAA

REPAT38氨基酸序列(SEQ ID NO:4)如下

MKSLILVAVLAALAVCNDAAALQEPAFRANLYQGAIRPGDRLLHSNYYYKSPIANAVQYQDITYRGNSSTRISYIQVTEVGYTQWGIPSLRAGGVNFNHATIRLTSQRGYGYYYRVEIWGR

采用如实验例6中相同的方式处理拟南芥第二对真叶，并检测JA早期响应基因的诱导情况。结果发现，甜菜夜蛾中的HARP1相似蛋白REPAT38具有和HARP1相似的功能，均能抑制拟南芥对机械损伤的响应(图9)。

采用重组PCR的方法制备、扩增获得Venus-REPAT38融合序列，并在Venus-REPAT38(5’→3’)的起始密码子和终止密码子前分别引入BamHΙ和SalΙ酶切位点，将Venus-REPAT38导入pET32a多克隆位点BamHΙ和SalΙ之间，从而获得携带目的片段的重组表达载体，称为pET32a/Venus-REPAT38。采用实施例4中相同的方法，在E.coli BL21(DE3)中表达并纯化Venus-REPAT38蛋白，同时表达Venus蛋白作为后续实验的对照。Venus-REPAT38融合蛋白处理拟南芥和烟草的浓度及方法同实施例5。

选取生长7天左右的拟南芥幼苗，对其子叶进行机械损伤处理，采用浸泡的方法处理幼苗后，置于激光共聚焦扫描显微镜下对其进行观察，发现，原核纯化的Venus-REPAT38蛋白可以进入拟南芥细胞，而外源添加的Venus蛋白则基本没有进入拟南芥细胞中(图10A，B)。

选取生长两周左右的烟草叶片，用枪头戳取烟草小圆片叶片，采用浸泡的方法处理烟草叶片后，置于激光共聚焦扫描显微镜下对其进行观察，发现，原核纯化的Venus-REPAT38、Venus-HARP1融合蛋白可以进入烟草叶片细胞，而外源添加的Venus蛋白则基本没有进入烟草细胞中(图10C，D)。

实施例9、Venus-HARP1从伤口处进入细胞及在叶片组织中快速多方式运动

本实施例中，研究Venus-HARP1进入植物细胞或植物组织的方式及其在细胞或组织内的运动方式。

1、Venus-HARP1从伤口处进入植物细胞

方法步骤：采用如实施例5和8的方法，选取生长三周左右拟南芥叶片，用枪头戳取拟南芥小圆片叶片，采用浸泡的方法处理叶片后，置于激光共聚焦扫描显微镜下观察伤口附近的荧光信号。

结果如图11A～B，Venus-HARP1从伤口处进入拟南芥细胞；而Venus蛋白本身，在不连接HARP1的情况下，则无法进入拟南芥细胞内。

2、Venus-HARP1在叶片组织中快速多方式运动

方法步骤：将实施例9-1中处理后的叶片在激光共聚焦扫描显微镜下进一步放大观察，观察时选取固定焦平面，进行无间隔时间序列扫描，拍摄30秒内观察区域中荧光信号的变化情况。

结果如图11C～F，Venus-HARP1能从伤口处进入拟南芥叶片组织，进入组织间隙的HARP可以跨过表皮细胞壁和细胞膜，能在叶肉细胞和间隙间穿梭，可以沿着细胞间隙进入细胞内，也能从细胞内分泌至伤口外，这表明了其能快速多方式运动。

上述结果提示，HARP1能以外泌体的形式在细胞间扩散。

实施例10、HARP1进入植物细胞具有广谱性

本实施例中，研究HARP1进植物细胞的广谱性或多样性。

生长约4周的无酚棉、烟草叶片，进行损伤处理后，浸泡Venus-HARP1、Venus 4h，用PBSA清洗2h，荧光显微镜观察伤口及其附近区域。

如图12A～B，Venus-HARP1能从伤口处进入锦葵科的棉花和茄科的烟草细胞，表明HARP1能够进入不同的植物组织，其进入植物细胞或组织具有广谱性。

因此，利用HARP1构建的转运体系可适用于多种植物中。

实施例11、去除N端部分序列能够显著提高蛋白进入植物细胞的效率

本实施例中，对于HARP1进行改造，去除其信号肽后N端10、15、20、25个氨基酸，或去除其C端的5个氨基酸，测试序列如下：

A：Venus-HARP1；

B：Venus-HARP1δC5(去除C端的5aa)；

C：Venus-HARP1δN10(去除N端的信号肽及信号肽后10aa)；

D：Venus-HARP1δN15(去除N端的信号肽及信号肽后15aa)；

E：Venus-HARP1δN20(去除N端的信号肽及信号肽后20aa)；

F：Venus-HARP1δN25(去除N端的信号肽及信号肽后25aa)；

G：Venus。

结果如图13A～G，不同截短的HARP1进植物细胞效率不同，N端截短10个氨基酸的HARP1更易从伤口进入植物组织，大幅提高蛋白进入植物细胞的效率。C端截短5个或N端截短20个及以上的氨基酸抑制HARP1进入植物组织，表明HARP1的蛋白序列会影响其进入细胞。通过利用不同序列的HARP1可进一步提高该载体的递送效率。

实施例12、HARP1蛋白具有侵染动物细胞的能力

原核表达Venus-HARP1，纯化融合蛋白。将该融合蛋白与果蝇S2细胞孵育，以原核表达的Venus做对照，进行平行实验。

孵育4小时后，用PBS洗去细胞表面多余蛋白，用荧光染料DAPI显示细胞核，在显微镜下观察。

结果如图14，发现Venus本身不具备进入S2细胞的能力，而Venus-HARP1能够进入S2细胞，并有部分定位于细胞核。

实施例13、Venus-HARP1进入人源细胞

1、Venus-HARP1进入人肺癌细胞

将Venus-HARP1融合蛋白与人肺癌细胞A549孵育，以原核表达的Venus做对照，进行平行实验。

孵育4小时后，用PBS洗去细胞表面多余蛋白，用荧光染料DAPI显示细胞核，在显微镜下观察，并进行DAPI然后和观察。

结果如图15所示，Venus-HARP1进入A549细胞，并部分进入细胞核；而Venus本身不具备进入细胞的能力。

2、Venus-HARP1进入人胚胎肾细胞

将Venus-HARP1融合蛋白与人胚胎肾细胞293T孵育，以原核表达的Venus做对照，进行平行实验。

结果如图16所示，Venus-HARP1进入293T细胞，并部分进入细胞核；而Venus本身不具备进入细胞的能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> HARP1类多肽介导的细胞内转运及其在调节植物防御机制中的应用

<130> 182367Z1

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgaagagcc ttatcctcgt cgcagtcctc gctgcgctgg cagtctgcag tgatgcagct 60

gctctgcagc agaaccctgc cttcagggcc aacatgtacc agggagccat cagacctggt 120

gacagactcc tctacagaaa ctactactac aaagctccca tcgcgaacgc agtgcaatat 180

caggacatca cgtaccgtgg cagttccagc actcggatct ccttcatcca ggccgttgag 240

gtcggccaga cccagtgggg ccaaccttcc ctcaggtccg gaggagttaa cttcagcaac 300

gccaccatca gactgacatc agcccgcggc tggggctact actacatgat cgaaatctgg 360

ggccgataa 369

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Lys Ser Leu Ile Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ser Asp Ala Ala Ala Leu Gln Gln Asn Pro Ala Phe Arg Ala Asn Met

20 25 30

Tyr Gln Gly Ala Ile Arg Pro Gly Asp Arg Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr

35 40 45

Tyr Tyr Lys Ala Pro Ile Ala Asn Ala Val Gln Tyr Gln Asp Ile Thr

50 55 60

Tyr Arg Gly Ser Ser Ser Thr Arg Ile Ser Phe Ile Gln Ala Val Glu

65 70 75 80

Val Gly Gln Thr Gln Trp Gly Gln Pro Ser Leu Arg Ser Gly Gly Val

85 90 95

Asn Phe Ser Asn Ala Thr Ile Arg Leu Thr Ser Ala Arg Gly Trp Gly

100 105 110

Tyr Tyr Tyr Met Ile Glu Ile Trp Gly Arg

115 120

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> 甜菜夜蛾(Spodoptera exigua )

<400> 3

atgaagagtc tgattctggt tgcggtgctc gccgccctcg ctgtctgcaa tgacgcagcc 60

gctcttcaag aacctgcctt cagggctaac ctttaccagg gagccatcag acccggagac 120

agactgctcc acagcaacta ctactacaaa agccccattg ctaacgctgt acagtaccag 180

gacatcacct accgtggtaa ctctagcacc aggatctcct acatccaagt caccgaggtc 240

ggctacaccc agtggggtat cccatccctc agggctggtg gtgttaactt caaccacgct 300

accatcaggc tgacttctca aagaggctac ggttactact accgtgttga gatttggggt 360

cgttaa 366

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 甜菜夜蛾(Spodoptera exigua )

<400> 4

Met Lys Ser Leu Ile Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Asn Asp Ala Ala Ala Leu Gln Glu Pro Ala Phe Arg Ala Asn Leu Tyr

20 25 30

Gln Gly Ala Ile Arg Pro Gly Asp Arg Leu Leu His Ser Asn Tyr Tyr

35 40 45

Tyr Lys Ser Pro Ile Ala Asn Ala Val Gln Tyr Gln Asp Ile Thr Tyr

50 55 60

Arg Gly Asn Ser Ser Thr Arg Ile Ser Tyr Ile Gln Val Thr Glu Val

65 70 75 80

Gly Tyr Thr Gln Trp Gly Ile Pro Ser Leu Arg Ala Gly Gly Val Asn

85 90 95

Phe Asn His Ala Thr Ile Arg Leu Thr Ser Gln Arg Gly Tyr Gly Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Arg Val Glu Ile Trp Gly Arg

115 120

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

cgaacgcagt gcaatatcag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

ggctgatgtc agtctgatgg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

aagttgctgc gctggtagta g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

agttcgtagg acttctccag g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ccagcgatcg tttattgctt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

agtctttcct ctgcgaccag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ccctcaaaga cgtcaatggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

acacgacacg acaagtccaa 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

accctcctct ctagtattcc c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

acttgtacac cacttgcctc a 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

caaggaggag tgtttgggat gc 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

gtcgaaaaat taagttctcg ggag 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

ttggtgtggt aactacgatt gc 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

caccagctcc agctctattc tt 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

cggtggtgtg aagaagccct at 22

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

aatttcacga acaagcctct ggaa 24

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

ccatcgtcct tttcgt 16

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

accgttgttg tttcgc 16

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

atgaaaacca caacagtttc gg 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

aacatgaact acttgttgaa tc 22

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

ggcaaagatg gagaga 16

<210> 26

<211> 16

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

gtagggggac gaacaa 16

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

cgggatccat gaagagcctt atcctcg 27

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 28

cgagctctta tcggccccag atttc 25

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 29

ggaattcatg aagagtctga ttctggttgc 30

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 30

cccaagcttt taacgacccc aaatctcaac ac 32

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 31

cgggatccat ggtagatctg actagtaaag 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 32

cgagctctta tttgtatagt tcatccatgc 30

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 33

gggatccatg gtgagcaagg gcgag 25

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 34

ggccctgaag gcagggttca tggtggatct agctgcctcg 40

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 35

cgaggcagct agatccacca tgaaccctgc cttcagggcc 40

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 36

cccaagcttt tatcggcccc agatttcga 29

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 37

cgcggatcca tggtgagcaa gggcgagga 29

<210> 38

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 38

tgaaggcagg ttcttgaggt ggatctagct gcct 34

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 39

aggcagctag atccacctca agaacctgcc ttca 34

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 40

acgcgtcgac acgaccccaa atctcaacac ggt 33

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 41

tcccccggga tgaaccctgc cttcagggcc 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 42

acgcgtcgac tcggccccag atttcgatca 30

<210> 43

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 43

cgggatccat gaaccctgcc ttcagggcc 29

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 44

acgcgtcgac ttatcggccc cagatttc 28

Claims

1.一种将外源活性分子引入到细胞或组织中的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将外源活性分子与HARP1或其保守性变异多肽连接，获得连接产物；

(2)将步骤(1)的连接产物接触细胞或组织，从而外源活性分子被引入到细胞或组织中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源活性分子被引入到细胞的细胞质或细胞核中。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源活性分子包括：多肽，核酸，毒素，化合物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞或组织包括：动物细胞或组织，植物细胞或组织，微生物细胞。

5.一种降低植物对损伤的防御响应能力的方法，其特征在于，所述方法包括：以HARP1或其保守性变异多肽处理植物；或将HARP1或其保守性变异多肽的编码基因转化植物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的HARP1通过抑制茉莉酸信号途径基因或多肽的表达或活性，来降低植物对损伤的防御响应能力。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的茉莉酸信号途径包括包括：Jasmonate响应基因、蛋白酶抑制剂基因、次生代谢合成相关转录因子及合酶。

8.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，HARP1或其保守性变异多肽包括：

(a)具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；

(b)起始于SEQ ID NO:2中第21～39位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第119～122位所示氨基酸序列的多肽；或，起始于SEQ ID NO:4中第21～38位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第118～121位所示氨基酸序列的多肽；

(c)由(a)或(b)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)或(b)功能的多肽；

(d)氨基酸序列与(a)或(b)多肽的氨基酸序列有40％以上相同性，且具有多肽(a)或(b)功能的多肽；或

(e)在(a)或(b)或(c)或(d)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在多肽(b)或(c)或(d)的N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，(b)中，所述多肽的序列起始于SEQ ID NO:2中第22～38位、第23～37位、第24～38位、第25～37位、第26～36位、第27～35位、第28～34位、第29～33位、第30～31位或第30～32位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第120或121位；或，起始于SEQ ID NO:4中第22～37位、第23～36位、第24～35位、第25～34位、第26～33位、第27～32位或第28～31位或第29～30位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第119、120位。

10.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，HARP1或其保守性变异多肽来自于：鳞翅目昆虫；较佳地，所述的鳞翅目昆虫包括夜蛾科昆虫。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的鳞翅目昆虫包括：小菜蛾，甜菜夜蛾(S.exigua)，烟芽夜蛾(H.virescens)，草地夜蛾(S.frugiperda)，小地老虎(A.ipsilon)，蓓带夜蛾(M configurata)，粉纹夜蛾(T.ni)。

12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：

能被鳞翅目昆虫取食的植物；

存在损伤防御响应机制的植物；

锦葵科植物，茄科植物，十字花科植物，禾本科植物。

13.HARP1或其保守性变异多肽的用途，用于将外源活性分子引入到细胞或组织中。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的外源活性分子被引入到细胞的细胞质或细胞核中。

15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，通过将外源活性分子与HARP1或其保守性变异多肽连接，从而由HARP1或其保守性变异多肽将外源活性分子引入到细胞或组织中。

16.HARP1或其保守性变异多肽的用途，用于降低植物对损伤的防御响应能力。

17.一种分离的HARP1多肽片段，其为：

(i)起始于SEQ ID NO:2中第21～39位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第119～122位所示氨基酸序列的多肽；或，起始于SEQ ID NO:4中第21～38位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第118～121位所示氨基酸序列的多肽；

(ii)由(i)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(i)功能的多肽；

(iii)氨基酸序列与(i)多肽的氨基酸序列有40％以上相同性，且具有多肽(i)功能的多肽；或

(iv)在(i)或(ii)或(iii)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或添加信号肽序列后形成的多肽。

18.如权利要求17所述的多肽片段，其特征在于，(i)中，所述多肽的序列起始于SEQ IDNO:2中第22～38位、第23～37位、第24～38位、第25～37位、第26～36位、第27～35位、第28～34位、第29～33位、第30～31位或第30～32位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第120或121位；或，起始于SEQ ID NO:4中第22～37位、第23～36位、第24～35位、第25～34位、第26～33位、第27～32位或第28～31位或第29～30位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第119、120位。

19.一种提高HARP1多肽将外源活性分子引入到细胞或组织中的效率的方法，包括：对HARP1多肽的N端或C端进行截短，从而获得起始于SEQ ID NO:2中第21～39位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:2中第119～122位所示氨基酸序列的多肽；或，起始于SEQ ID NO:4中第21～38位中任一氨基酸，终止于SEQ ID NO:4中第118～121位所示氨基酸序列的多肽。