CN110721126A - 包含植物提取物的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物来作为有效成分的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物。本发明的组合物可诱导角质细胞外膜的分化，使角质细胞外膜结构蛋白质的表达增加，并且使丝聚蛋白的表达量增加，还使紧密连接结构蛋白质的表达量增加，因此可通过皮肤屏障的增强及皮肤水分调节来使皮肤保湿效果及瘙痒症得以改善。并且，由于上述组合物无细胞毒性及皮肤副作用，因此可安全地适用于皮肤外用药及化妆品组合物。

Description

包含植物提取物的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物
技术领域
本发明涉及包含植物提取物作为有效成分的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物，更详细地，本发明涉及包含垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)、仙人镜(Opunitia ficusindica)及绫缨(Sempervivum tectorum L.)的复合提取物作为有效成分的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物。
背景技术
作为存在于人体的最外部的器官，皮肤起到防止有害物质从外部环境侵入人体内的作用的同时，还起到用于防止体内水分等的生体成分流失的必要的屏障作用。皮肤大致分为表皮、真皮、皮下脂肪三层，表皮由基底层(stratum basale)、棘层(stratumspinosum)、颗粒层 (stratum granulosum)、角质层(stratum corneum)的四层形成。皮肤的水分量在真皮层为70％左右，越靠近表皮层越减少，在表皮的角质层中保留10～20％的水分。
皮肤的表皮层具有皮肤屏障的功能，以防止体内的水分蒸发并防止外部的物质过度侵入体内。尤其，皮肤真皮层的水分最终因被动扩散而转移到角质层并向外部排出。这种经表皮水份丢失 (Transepidermal water loss，TEWL)通过包围角质层的角质化蛋白质包膜(cornified protein envelope)及角化脂质包膜(cornified lipid envelope)来保持适当水平。角质细胞外膜(cornified envelope)由约 10nm厚度的内侧的角质化蛋白质包膜(inner cornified protein envelope)及5nm的外侧的角化脂质包膜(outer cornifiedlipid envelope)形成。角质化蛋白质包膜起到物理屏障的作用，角化脂质包膜形成完整的皮肤屏障结构，充当形成角质细胞之间的脂质的多层结构的支架(scaffold)作用。
角质形成细胞为表皮的主要细胞，并伴随有活跃的增殖及分化过程，源自基底层的干细胞(stem cell)并增殖，细胞分裂后，通常经过14日通过基底层、颗粒层移动至最外层的角质层，并经过分化过程，再经过14日之后，向体外脱落，由此总共经过4周的时间来产生细胞再生。当角质形成细胞随着从基底层经过颗粒层并向角质层移动，变形为呈扁平状的无核的角质细胞，因此包含角蛋白(keratin) 的透明角质颗粒内的蛋白质与细胞质内的其他多个蛋白质交联，从而形成包围角质细胞的角质细胞外膜(cornified envelope，CE)。与角质形成细胞的分化相关表达增加的蛋白质具有谷氨酰胺转胺酶 (Transglutaminase)1及3、外皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、丝聚蛋白(filaggrin)等，当开始分化时，谷氨酰胺转胺酶使外皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)等的结构蛋白质结合在细胞膜的内侧，从而形成在角质层作为皮肤屏障功能的方面上起到最为重要的作用的角质细胞外膜(cornified envelope，CE)。
作为具有使角质细胞外膜与角蛋白纤维相连接的作用的蛋白质，丝聚蛋白(filaggrin)以作为前体的丝聚合蛋白原(profilagrin)的形态存在于透明角质颗粒内，之后通过蛋白质分解酶来进行分解，然后通过脱磷酸化成为丝聚蛋白。丝聚蛋白具有使角蛋白相互附着的作用，使得有助于皮肤屏障的强大的物理支撑。丝聚蛋白通过蛋白质分解酶进行脱氨，并分解为吡咯羧酸(pyrrocarboxylic acid，PCA)或反式尿刊酸(trans-urocanic acid，UCA)等氨基酸。氨基酸作为天然保湿因子，具有保持皮肤保湿，保持角质层的弱酸性，保护来自外部刺激的皮肤损伤的功能。当这种丝聚蛋白因基因突变或后天性因素而减少时，导致皮肤屏障功能异常，导致皮肤水分流失及保护功能异常。
在存在于角质层下层的大部分颗粒层中具有片层体(lamellar body)，在片层体中包含有角质细胞之间的脂质构成成分或脂质成分的前体及催化这种脂质前体的细胞外转化反应的酶、参与角质细胞的脱落的蛋白水解酶、抗菌肽等。并且，在颗粒层中，用于控制通过角质形成细胞之间的空间的液体流动的紧密连接(tight junction)，作为构成其的蛋白质，具有包括作为跨膜蛋白的密封蛋白(claudin)在内的紧密连接蛋白(occludin)、闭塞性小带蛋白(zonula occludens proteins，ZO)、多PDZ结构域蛋白1(multi-PDZ domainprotein 1)、带蛋白(cingulin)等。尤其，密封蛋白的环状结构以填充细胞之间的空间的形态连接，因此不仅调节细胞之间的电解质与水分的流动，还可有效地控制细胞内信号传递路径。这种紧密连接为皮肤屏障，并起到与角质层之间的相互补充的功能。
在干性皮肤的情况下，存在无法阻挡角质细胞之间的凝聚力减弱或因角质层脂质膜成分的异常而引起的皮肤水分的流失的情况，由此，随着皮肤屏障瓦解而导致皮肤的干燥现象。此外，即使为健康的皮肤，也因压力、污染等引起的皮肤屏障功能的异常以及因季节性影响、洗脸、剃毛等引起的水分不足现象而使皮肤状态恶化。因此，通过保持皮肤屏障功能来适当保持水分含量，在对皮肤健康方面上非常重要。
对此，开发并使用了具有可向皮肤供给并保持水分功能的多种皮肤保湿剂，但这种皮肤保湿剂通常由如矿物油、合成香料、化学色素、类固醇等的化学物质来制备，因此不适合于皮肤，稍微不慎会引起皮肤炎症，或者长时间使用时还引起皮肤损伤。
为了解决这种问题，研究开发出利用天然材料的皮肤保湿剂。例如，韩国授权专利第1725043号中公开有利用如草本植物提取物或花水等的天然材料的皮肤保湿剂，韩国授权专利第1575768号中公开有利用天然材料的皮肤保湿佐剂组合物。然而，事实上至今还不存在如下的有效的天然原材料，即，为了从内部及外部的多种因素中保持皮肤的适当的水分而防止通过提供皮肤屏障的功能的皮肤的水分流失，并且可通过角质层内侧的角质细胞之间的紧密连接的水分流动的调节来有效保持水分。
发明内容
技术问题
因此，用于解决上述的问题的本发明的一目的在于，提供包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物。
并且，本发明的再一目的在于，提供上述组合物的化妆品或药剂学用途。
并且，本发明的另一目的在于，提供通过将上述外用药组合物向个体进行给药，来使个体的皮肤保湿并预防或改善因皮肤干燥而引起的症状的方法。
技术方案
作为一实施方式，本发明提供包含垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的混合物作为有效成分的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物。
就本发明而言，垂盆草(Sedum sarmentosum)为以韩国作为原产地的属于蔷薇目景天科的多肉质多年生草本植物。叶子通常各环绕生长三个，无叶柄，呈长椭圆形，两端尖利。在8月至9月开花，花呈黄色，5片花瓣呈披针形，尖头，长于花萼。垂盆草在韩方药名中称为石指草，据悉，干燥的垂盆草煮开之后如喝茶一样喝，可起到解热、解毒效果，吃汁液对肝硬化有疗效，还可用于食物中。
在本发明中，仙人镜(Opuntia ficus indica)为属于仙人掌科的多肉质多年生草本植物，还称为百年草。原产于中南美，还在韩国的济州岛野生。高度达30～40cm，宽度为约10cm。百年草在干旱中也几乎没有死亡的情况，抗寒性也强，因此冬天在韩国的南方地区也生长良好。百年草在4～5月份左右结蓝色的果实，在5～6月份左右， 2～3cm左右的黄色的花短时间开在果实上又掉落，果实长大后，11～ 12月分左右收获紫色果实。
在本发明中，绫缨(Sempervivum tectorum)为起源于欧洲的多肉质植物，并且为蔷薇目景天科的多年生草本植物。上述绫缨以莲座状生长，叶子长4～10cm左右。在夏季，毛茸茸的直立茎中结8～16 多红紫色花朵。通常，被称为石莲花(houseleek)。
在本发明中，“提取物(extract)”是指从天然产物分离的活性成分，即，呈现所需活性的物质。
上述提取物可利用本领域所公知的提取方法及提取溶剂来获得，优选地，可通过以水、碳数为1-4的无水或含水低级醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等)、上述低级醇与水之间的混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、己烷或1，3-丁二醇作为提取溶剂来取得。上述提取方法并不一定限定于此，具有热浴提取、热水提取、冷浸提取、超声波提取、或回流冷却提取方法等。
除了通过由上述提取溶剂提取的方法之外，上述提取物还可通过常规性纯化过程来取得。例如，利用具有恒定分子量截断值的超过滤膜的分离、通过多种色谱法(为了根据尺寸、电荷、疏水性或亲和性的分离制造而成的)的分离等通过额外地进行的多种纯化方法而取得的分级来获取。
并且，在本发明中，上述提取物均包含提取、分级或纯化的各个步骤中取得的所有提取液、分级及纯化产物、它们的稀释液、浓缩液或干燥产物。
在本发明中，上述垂盆草、仙人镜及绫缨可通过提取选自包括全草的叶、根、茎及花组成的组中的一种以上来使用。
作为一具体例，根据本发明的提取物可通过洗涤各个垂盆草、仙人镜或绫缨的全草之后，进行榨汁或热水提取之后过滤来制备。
作为另一具体例，根据本发明的提取物可通过洗涤各个垂盆草、仙人镜及绫缨的全草之后，以规定重量比混合并进行榨汁或热水提取之后过滤来制备。
在本发明中，“皮肤保湿”是指通过防止皮肤的水分向体外蒸发并防止外部物质的过度渗透，来保持皮肤角质层的水分并防止皮肤变得干燥或皮肤表面变得粗糙。
在本发明中，“皮肤镇定”是指治疗、改善或缓解由皮肤干燥引起的瘙痒、干性湿疹、痘疮、特应性疾病等。
本发明的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分，与单独使用这些提取物的情况相比，皮肤保湿及皮肤镇定方面上，呈现出明显的提高效果。上述复合提取物均包含通过混合垂盆草、仙人镜及绫缨来提取的提取物及混合垂盆草、仙人镜及绫缨各自的提取物的提取物。
上述复合提取物的垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物以0.8～1.2∶0.3～0.7∶0.3～0.7的重量比形成，优选地，以 0.9～1.1∶0.4～0.6∶0.4～0.6的重量比形成，更优选地，以1∶0.5∶0.5 的重量比形成。当以这种重量比混合上述提取物时，在皮肤保湿及皮肤镇定的方面上呈现出显著的优秀的效果。
并且，就本发明的组合物而言，以组合物的总重量为基准，上述复合提取物可包含0.00001重量百分比至15重量百分比，更优选地，可包含0.0001重量百分比至10重量百分比，最优选地，可包含0.0001 重量百分比至5重量百分比。当上述含量小于0.0001重量百分比时，皮肤保湿及皮肤镇定等效果微弱，当大于50重量百分比时，随着含量的增加所带来的效果的增加非常微弱，因此为非经济性的。
本发明的组合物具有如下的效果：诱导角质细胞外膜的形成，促进紧密连接结构蛋白质与丝聚蛋白的表达，使得增强皮肤角质层的屏障功能并增强角质细胞之间的紧密连接，从而防止皮肤内水分的流失，增加皮肤保湿，并改善因皮肤干燥引起的瘙痒症及干性湿疹。
因此，作为一具体的实施方式，本发明的上述组合物可用作皮肤保湿及皮肤镇定用化妆品组合物。
上述化妆品组合物除了上述垂盆草、仙人镜及绫缨提取物的混合物之外，还可额外地包含通常用于化妆品组合物的多个成分。例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的常规性佐剂及载体。
上述化妆品组合物可制备成本技术领域中通常所制备的任何剂型，例如，可剂型化为溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、粉剂、皂、含有表面活性剂的清洁剂、油剂、粉末基剂、乳剂基剂、蜡基剂及喷雾剂等，但不限定于此。更详细地，可制备成营养霜、收敛化妆水、柔肤水、洗剂、精华液、营养凝胶或按摩霜的剂型。
当本发明的剂型为糊剂、乳膏或凝胶时，作为载体成分，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
当本发明的剂型为粉剂或喷雾剂时，作为载体成分，可利用滑石、二氧化硅、氢氧化铝，硅酸钙或聚酰胺粉剂，尤其，在喷雾剂的情况下，可额外地包含推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当本发明的剂型为溶液或乳剂时，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，具有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
当本发明的剂型为悬浮液时，作为载体成分，可利用液体稀释剂如水、乙醇或丙二醇等、悬浮剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、偏氢氧化铝纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。
当本发明的剂型为含有表面活性剂的洗涤剂时，作为载体成分，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
以总体化妆品组合物的总重量为基准，本发明的化妆品组合物中可包含0.0001重量百分比至20.0重量百分比的作为有效成分的垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物，优选地，可包含0.001重量百分比至10重量百分比，更优选地，可包含0.001重量百分比至5重量百分比。当上述含量小于0.0001重量百分比时，皮肤保湿及皮肤镇定等的功效不显著，当大于20重量百分比时，随着含量的增加所伴随的效果的增加非常不明显，因此为非经济性的。
本发明的化妆品组合物可增强皮肤角质层的屏障功能并增强角质细胞之间的紧密连接，从而在防止皮肤内水分的流失的同时，可适当调节水分流动，并且可改善及预防因皮肤干燥引起的瘙痒症等。
作为再一具体实施方式，本发明的包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分的组合物可用作皮肤保湿及皮肤镇定用药剂学组合物。
作为具有皮肤保湿及皮肤镇定功效的有效成分，除了上述复合提取物之外，本发明的上述药剂学组合物可包含通常利用于外用药组合物的多个成分。例如，可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香料、乳化剂、悬浮剂、防腐剂及载体。
适合上述药剂学组合物的载体包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。适合的药剂学上可接受的载体及制剂详细记载于Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.，1995)等。
优选地，本发明的药剂学组合物可非口服给药至哺乳动物如大鼠、小鼠、家畜、人类等，给药的所有方式均可预想到，例如，可通过皮肤涂敷等来进行给药。
上述药剂学组合物以药剂学有效量进行给药。在本发明中，药剂学有效量是指足以以可适用于医学治疗或预防的合理利益/风险比例治疗或预防疾病的量，有效剂量水平可取决于疾病的种类及疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康及性别、患者对药物的敏感度、所使用的特定提取物的给药时间、给药路径及排放比例、治疗持续时间、包括所使用的特定提取物与调配或同时使用的药物的要素及其他医学领域中众所周知的要素来确定。通常，在外用药的情况下，以成人为基准时1日1次至5次以1.0ml至3.0ml的量涂敷持续1个月以上为优选。然而，本发明的范围并不由上述给药量来限定。
根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，上述药剂学组合物与药剂学上可接受的载体和/或赋形剂一同进行制剂化，从而能够以单位剂量的形态制备或放入多剂量容器内制备。在这种情况下，根据治疗目的，在药剂学领域中剂型能够以常规的制剂进行剂型化，优选地，可用于以直接涂敷于患部的局部给药为目的的皮肤外用药。在此情况下，软膏、洗剂、喷雾剂、凝胶等的形态为优选。这些皮肤外用药还可包含在可世界适用于治疗部位的支撑基材 (support base)或基质等中，支撑基材的例包含纱布或绷带。
以组合物的总重量为基准，本发明的药剂学组合物中可包含 0.0001重量百分比至20.0重量百分比的上述的垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物，优选地，可包含0.001重量百分比至10重量百分比，更优选地，可包含0.001重量百分比至5重量百分比。当上述含量小于0.0001重量百分比时，皮肤保湿及皮肤镇定等的功效不明显，当大于20重量百分比时，随着含量的增加所伴随的效果的增加非常不明显，因此为非经济性的，从而在剂型的制备上存在困难。
本发明的药剂学组合物可增强皮肤角质层的屏障功能并增强角质细胞之间的紧密连接，从而在防止皮肤内水分的流失的同时，可适当调节水分流动，并且可治疗及预防因皮肤干燥引起的瘙痒症等。
另一方面，本发明的垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物无细胞毒性且无皮肤副作用，因此可安全地适用于化妆品及药剂学组合物。
作为另一实施方式，本发明提供通过向个体给药包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分的组合物，来使皮肤保湿并预防、改善或治疗干皮病及由此引起的疾病的方法。
由上述干皮病引起的疾病不限定于此，但可例举有皮肤瘙痒、干性湿疹、痘疮、特应性疾病等。
在本发明中，“改善”或“治疗”是指从个体进行对干皮病及由此引起的疾病的(a)发展的抑制、(b)缓解及(c)消除。
在本发明中，“预防”是指曾经被未诊断为保留有干皮病及由此引起的疾病，但在具有易于患上这种疾病的倾向的个体中抑制疾病的发生。
在本发明中，“个体”是指具有通过给药本发明的上述组合物来使症状得意好转的疾病的包括人类的猴子、牛、马、猪、羊、狗、猫、大鼠、小鼠、猩猩等的哺乳动物。
上述给药为非口服给药，优选地，为软膏、洗剂、喷雾剂、凝胶等的通过涂敷的局部给药，其的剂量等可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、患病状态等的因素由本发明所属技术领域的普通技术人员来容易地变更并使用。
向个体给药根据本发明的上述组合物，从而可使个体的皮肤保湿并可预防、改善及治疗干皮病及由此引起的疾病。
发明的效果
本发明的包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分的皮肤保湿及皮肤镇定用组合物使皮肤角质层的角质细胞外膜结构蛋白质的表达活性化，并通过诱导角质细胞外膜分化来增强皮肤屏障功能，通过丝聚蛋白的表达增加以及增强角质细胞之间的紧密连接功能，来具有调节皮肤内水分及防止水分的流失的效果。并且，上述组合物可阻挡或改善因皮肤功能异常而引起的皮肤的水分流失，因此可使干皮病及由此引起的皮肤瘙痒、干性湿疹、痘疮等得以稳定。此外，由于本发明的组合物源自天然原材料，因此几乎不存在细胞毒性及皮肤副作用，即使长时间使用，也可安心使用，尤其可安全地适用于化妆品及药剂学组合物中。
附图说明
图1为示出将以1∶0.5∶0.5的重量比混合垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的复合提取物的角质细胞外膜结构蛋白质的表达促进效果与各个提取物相比较的图。
图2为示出将1∶0.5∶0.5的重量比混合垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的复合提取物的丝聚蛋白的表达促进程度与各个提取物相比较的图。
具体实施方式
以下，为了助于理解本发明，例举实施例等来进行说明。然而，根据本发明的多个实施例可变形为多种其他形态，本发明的范围不应局限于以下多个实施例来进行解释。本发明的多个实施例是为了更完整地向本发明所属技术领域的普通技术人员解释本发明而提供。
制备例1.天然提取物的制备
洗涤下列表1中所示的20种各个植物的全草之后，进行榨汁，用0.45μm的滤纸(whatman paper)过滤，重复该步骤2次总共提取了3次。经榨汁的滤液冻干之后，并粉碎。
实施例1.具有皮肤屏障增强效果的天然物的选定
1-1.角质细胞外膜分化诱导效果
通过角质细胞外膜形成诱导试验来检测了从上述制备例1提取的各个植物提取物的效果。具体而言，将作为人类角质细胞株的 HaCaT细胞以1×105细胞/孔接种(seeding)在6孔板(well-plate) 中之后，培养至孔充满。接着，将各个试样按照不同浓度(10ppm、50ppm、100ppm)来处理并培养7日之后，去除培养基，每孔各用 100μL的2％的十二烷基硫酸钠(SDS，sodium dodecyl sulfate)处理，并使其在冰上反应3分钟至5分钟。接着，回收细胞，用超声波粉碎机粉碎细胞5秒钟，通过离心分离回收细胞之后，放入包含有20mM 的二硫苏糖醇(DTT，Dithiothreitol)的2％的十二烷基硫酸钠溶液中使之分散，并在90℃温度条件下加热了1小时。然后，在310nm测定吸光度，并测定了角质细胞膜形成程度。使用将未进行任何处理的角质细胞株作为阴性对照组且将仅处理了钙离子(Ca2+)的角质细胞株作为阳性对照组，功效程度以相对于阴性对照组的分化程度来示出。其结果在下列表1中示出。
1-2.密封蛋白-1的表达促进效果
通过实时聚合酶链反应来测定了作为对上述制备例1中所提取的各个植物提取物的紧密连接(tight junction)结构蛋白质的密封蛋白(claudin-1，CLDN-1)表达促进效果。具体而言，将人类角质细胞株以1×105细胞/孔接种(seeding)于6孔板中之后，在包含有10％的血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基，Dulbecco’s modified Eagle’smedium)中培养了24小时。然后，替换为无血清的培养基，并将各个试样按照不同浓度(10ppm、50ppm、100ppm)进行处理，培养4日之后回收了细胞。利用NA提取试剂盒(RNeasy，Mini kit，Qiagen，德国)，从经回收的细胞提取了RNA之后，利用 cDNA合成试剂盒(amfiRivert cDNA Synthsis Platinum Master Mix， Gendepot，美国)合成了cDNA。利用经合成的按照各个条件的cDNA，将密封蛋白-1(claudin-1，CLDN-1)的信使RNA(mRNA)表达程度通过实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction)来进行了确认。作为上述试验中所使用的各个基因引物，使用了正向引物 (forward primer)：5`-AACGCGGGGCTGCAGCTGTTG-3`(序列1)，反向引物(reverse primer)：5`-GGATAGGGCCTTGGTGTTGGGT-3` (序列2)。其结果在下列表1中示出。
表1
Figure BDA0001731980760000121
如上述表1中所示可知，在总共20种的植物提取物中，基于具有角质细胞膜形成诱导效果与紧密连接蛋白质密封蛋白(claudin)-1 的表达效果的植物提取物的上述试验结果，选定了其效果优秀的垂盆草、仙人镜、绫缨。
实施例2.被选定的植物的混合组成比的确立
在实施例1中，根据被选定的垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的混合组成比，试验了是否可呈现出角质细胞外膜形成诱导效果及紧密连接结构蛋白质的表达促进效果的提高作用。
2-1.混合物的制备
如下列表3及表3所示，通过以多种重量比混合从上述制备例1 选定的垂盆草提取物、仙人镜提取物、绫缨提取物，并制备了多个试样。
表2
Figure BDA0001731980760000131
Figure BDA0001731980760000141
表3
Figure BDA0001731980760000142
Figure BDA0001731980760000151
2-2.角质细胞外膜形成诱导效果与紧密连接结构蛋白质的表达促进效果
以与上述实施例1-1及1-2相同的方法测定了在上述实施例2-1 中制备的各个试样的角质细胞外膜形成诱导效果与紧密连接结构蛋白质表达促进效果。将其结果在表4及表5中示出。
表4
Figure BDA0001731980760000161
Figure BDA0001731980760000171
表5
Figure BDA0001731980760000181
如表4及表5所示，确认了在处理了以1∶0.5∶0.5的重量比混合了垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的试样(#001)的皮肤角质细胞中，角质细胞外膜形成程度大大增加。并且，还可以确认紧密连接结构蛋白质CLDN-1的表达程度也增加的情况。
即，当混合垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物来进行处理时，与仅处理单一提取物1种的情况相比，呈现出复合性的提高效果，并确认了同时促进角质细胞外膜形成、紧密连接结构蛋白质表达的呈现出理想化的功效的试样为以1∶0.5∶0.5的组成比混合了垂盆草提取物、仙人镜提取物、绫缨提取物的试样#001。
实施例3.复合提取物(#001)的皮肤屏障增强效果试验
为了在上述实施例2中被选定的复合提取物(#001)的皮肤屏障增强效果试验，对角质细胞外膜结构蛋白质的表达促进效果进行了确认，这通过实时聚合酶链反应来进行了测定。
具体而言，向6孔板中以1×105细胞/孔接种(seeding)作为人类角质细胞株的HaCaT细胞之后，培养了24小时。然后，将试样按照不同浓度(10ppm、50ppm、100ppm)处理培养4日之后，回收细胞，利用总RNA提取试剂盒(RNeasy，Mini kit，Qiagen，德国)来提取RNA之后，利用cDNA合成试剂盒(amfiRivert cDNA Synthsis Platinum Master Mix，Gendepot，美国)来合成了cDNA。利用经合成的各个条件下的cDNA，通过实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction)确认了外皮蛋白(IVL)、兜甲蛋白(loricrin，LOR)、谷氨酰胺转胺酶-1(transglutaminase-1，TGM-1)的mRNA 表达程度。使用了将未进行任何处理的角质细胞株作为阴性对照组且将仅处理了钙离子(Ca2+)的角质细胞株作为阳性对照组。在下列表 6中示出上述试验中所使用的各个基因引物。作为阳性对照组，使用了处理了Ca2+的皮肤角质细胞。其结果在图1中示出。
表6
Figure BDA0001731980760000191
如图1所示，在处理了以1∶0.5∶0.5的重量比混合垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的试样(#001)的皮肤角质细胞中，角质细胞外膜形成程度得意提高，作为角质细胞外膜结构蛋白质的外皮蛋白(IVL)、兜甲蛋白(LOR)、谷氨酰胺转胺酶-1(TGM-1) 的表达程度与阴性对照组相比，分别增加了4.2倍、3.9倍、3.2倍 (fold)。并且，与分别仅处理单一提取物1种的情况相比，呈现出了复合性的提高效果。
实施例4.复合提取物(#001)的丝聚蛋白表达促进效果的测定
以与上述实施例1-2相同的方法测定了对在上述实施例2中被选定的复合提取物的丝聚蛋白(FLG)表达促进效果。试验时所使用的引物使用了正向引物(forward primer)：5`-CTGAGGCTGGAAGTGGAAG-3`(序列9)，反向引物(reverse primer)：5`-CTTTAGGGTAGTGGTAGAAG-3`(序列10)的序列。将未处理试样的皮肤角质细胞作为阴性对照组来使用，作为阳性对照组，使用了处理了Ca2+的条件。丝聚蛋白表达促进程度通过实时聚合酶链反应来进行了判断。其结果在图2中示出。
如图2所示，在处理了以1∶0.5∶0.5的重量比混合垂盆草提取物、仙人镜提取物及绫缨提取物的试样(#001)的皮肤角质细胞中，与阴性对照组相比较，丝聚蛋白表达促进效果提高了丝聚蛋白基因的表达量3.1倍(fold)，与阳性对照组相比，呈现出达到81％以上的效果。并且，与分别仅处理单一提取物1种的情况相比，呈现出了复合性的提高效果。
实施例5.复合提取物(#001)的细胞毒性试验
调查了在上述实施例2中被选定的复合提取物(#001)的对人体的安全性。具体而言，利用作为人类角质细胞株的HaCaT细胞进行了细胞毒性试验(MTT)。在HaCaT细胞中，将在上述实施例2中被选定的复合提取物(#001)分别以10ppm、50ppm、100ppm、200ppm、500ppm、1000ppm的浓度处理，培养了3日之后，通过抗肿瘤细胞毒性测定(MTT assay)来测定了生存率。其结果在下列表7中示出。
表7
Figure BDA0001731980760000201
实验结果，复合提取物(#001)在500ppm以下的浓度中，未呈现出细胞毒性，在1000ppm的浓度下确认了细胞生存率降低的情况。
实施例6.复合提取物(#001)的对皮肤的安全性试验
在实施例5的细胞毒性试验中判定复合提取物(#001)无细胞毒性，因此为了确认实际在人体皮肤中也是否安全，而进行了皮肤安全性验证试验。
6-1.包含复合提取物(#001)的皮肤外用剂的制备
为了复合提取物(#001)的皮肤安全性试验，以下列表8的成分及含量制备了含有复合提取物(#001)的皮肤外用药之后，进行了皮肤安全性及临床功效验证试验。首先，混合了纯化水、甘油、丁二醇并在70℃温度下溶解(水部分)，在70℃温度下，溶解了上述3种成分与其余成分(油部分)。将上述油部分添加至水部分中，利用高速搅拌仪(Tokushu Kika，Japan)搅拌并乳化，去除气泡之后，冷却至室温，以此制备了皮肤外用药。
表8
6-2.皮肤累计刺激试验
以健康的30名成人为对象，将以上述6-1的方法制备的皮肤外用药每隔一天对前臂进行总共9次的24小时的斑贴，并测定了复合提取物(#001)是否对皮肤带来刺激。作为对照组，使用了以角鲨烷为基底的不含有复合提取物(#001)的皮肤外用药。
斑贴方法利用了芬兰斑试器(Finn chamber，Epitest Ltd.芬兰)，在腔室中滴入各个上述皮肤外用药各15μL之后，进行了斑贴。利用一下式1来将每次出现在皮肤中的反应程度进行分数化，其结果在下列表9中示出。
式1：
平均反应度＝[[{(反应指数×反应度)/(被检测总人数×最高分数(4分))}]×100]/检测次数(9次)
此时，根据反应程度，±为1分，+为2分，++为4分的分数，平均反应度小于3时，判定为安全的组合物。
表9
Figure BDA0001731980760000221
试验结果，对照组与试验组1及试验组2的情况时，对应于±、 +、++的人数分别为0人、0人、0人。根据上述式1计算的结果，对照组、试验组1及2的平均反应度均为0.00，均呈现出3以下，因此被判定为安全的组合物。
实施例7.复合提取物(#001)的皮肤保湿能力增加效果
以患有干皮病的30～40年龄段的试验者35名为基准，进行了试验。具体而言，将包含以下制备例1-3的复合提取物(#001)的乳膏在脸部涂抹每日2次4周之后，与不包含复合提取物的条件相比来测定了保湿能力程度。涂抹乳膏之前与涂抹后经过1周、2周、4周的时间点，终止涂敷后经过2周的6周之后，在恒温(25℃)、恒湿(相对湿度为40％)条件下，利用皮肤水分测量仪测定了皮肤水分量。其结果在下列表10中示出，以涂抹乳膏之前的测定值为基准，测定值的增加部分用百分比表示。
表10
试验结果，在涂抹对照组的条件下，直至涂抹第四周呈现除了约 31％左右的水分增加率，但停止涂抹之后，减少了14％。反之，在涂抹了包含有复合提取物(#001)的乳膏的试验组的情况下，直至第四周呈现出了48％的水分增加率，停止涂抹之后，减少了皮肤水分量，但确认到了保持着规定水平。
实施例8.复合提取物(#001)的皮肤瘙痒症缓解效果
作为临床有效性评估，对患有因干皮病引起的瘙痒症的30～40 年龄段的试验者35名为基准进行了试验，8周期间涂抹包含有复合提取物(#001)的乳膏之后，与未包含复合提取物的条件相比，通过瘙痒改善度测定及问卷评估来对皮肤瘙痒症的缓解效果进行了确认。测定了作为皮肤疼痛瘙痒程度测定法的视觉模拟评分法(visual analogue scale，VAS)变化率。
通过以下制备例1-3的方法制备含有复合提取物(#001)的乳膏之后，以35名的试验者为对象，分成两组，1日2次，使用了8周上述乳膏。作为对照组，替代复合提取物而使用了含有纯化水的用以下制备例1-3的方法制备的乳膏。其值在下列表11中示出。
表11
Figure BDA0001731980760000232
Figure BDA0001731980760000241
试验结果，涂抹作为对照组的未包含复合提取物(#001)的乳膏的条件与涂抹作为试验组的包含有复合提取物的乳膏8周的条件相比较时，确认了疼痛瘙痒程度改善了32％。
以下，示例出用于包含有本发明的垂盆草提取物、仙人镜提取物、绫缨的组合物的制剂例。
制剂例1：化妆品制剂
1-1.柔肤水
表12
Figure BDA0001731980760000242
Figure BDA0001731980760000251
1-2.营养化妆水
表13
成分 重量百分比
复合提取物(#001) 0.05
蜂蜡 4.0
聚山梨酯60 1.5
脱水山梨糖醇倍半油酸酯 0.5
液体石蜡 5.0
角鲨烷 5.0
辛酸/癸酸甘油三酯 5.0
甘油 3.0
丁二醇 3.0
丙二醇 3.0
羧乙烯聚合物 0.1
三乙醇胺 0.2
防腐剂、微量色素、微量香料和纯净水 69.65
总计 100.0
1-3.营养霜
表14
Figure BDA0001731980760000252
Figure BDA0001731980760000261
1-4.按摩霜
表15
成分 重量百分比
复合提取物(#001) 0.5
蜂蜡 10.0
聚山梨酯60 1.5
脱水山梨糖醇倍半油酸酯 0.8
液体石蜡 40.0
角鲨烷 5.0
辛酸/癸酸甘油三酯 4.0
甘油 5.0
丁二醇 3.0
丙二醇 3.0
三乙醇胺 0.2
防腐剂、微量色素、微量香料和纯净水 27.45
总计 100.0
1-5.面膜
表16
Figure BDA0001731980760000262
Figure BDA0001731980760000271
以上，详细描述了本发明的特定的部分，这些具体的描述对本发明所属技术领域的普通技术人员仅为优选实例，显而易见的是本发明的范围不限定于此。因此，本发明的实质上的范围应由所附的发明要求保护范围及其的等同替代物来进行定义。

Claims (7)

1.一种皮肤保湿及皮肤镇定用化妆品组合物，其特征在于，
包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的皮肤保湿及皮肤镇定用化妆品组合物，其特征在于，
上述复合提取物中的垂盆草、仙人镜及绫缨的重量比为0.8～1.2∶0.3～0.6∶0.3～0.6。
3.一种皮肤保湿及皮肤镇定用药剂学组合物，其特征在于，
包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分。
4.根据权利要求3所述的皮肤保湿及皮肤镇定用药剂学组合物，其特征在于，
上述复合提取物中的垂盆草、仙人镜及绫缨的重量比为0.8～1.2∶0.3～0.6∶0.3～0.6。
5.一种将包含垂盆草、仙人镜及绫缨的复合提取物作为有效成分的组合物在制备使皮肤保湿并预防、改善或治疗干皮病及由干皮病引发的疾病的药物中的应用，其特征在于，
将所述组合物涂敷于个体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
上述复合提取物中的垂盆草、仙人镜及绫缨的重量比为0.8～1.2∶0.3～0.6∶0.3～0.6。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
由上述干皮病引发的疾病为皮肤瘙痒症、干性湿疹或痘疮。
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