CN110714029B - 一种慢病毒载体全封闭生产的方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慢病毒载体全封闭生产的方法及系统，方法包括步骤1：慢病毒载体宿主细胞的培养增殖；步骤2：慢病毒载体宿主细胞的包装，将含有慢病毒载体基因组序列的质粒通过转染试剂转染入慢病毒载体宿主细胞，制得慢病毒载体培养细胞上清液并收集；步骤3：慢病毒载体上清液的纯化，将慢病毒载体上清液依次进行澄清、酶切消化、超滤、层析柱纯化后制得慢病毒载体。系统包括宿主细胞增殖培养装置、慢病毒载体包装装置、慢病毒载体纯化装置，各装置使用一次性无菌耗材，有效避免交叉污染，实现多种产品的共线生产。
Description
技术领域
本发明涉及慢病毒载体生产领域，具体涉及一种慢病毒载体全封闭生产的方法及系统。
背景技术
慢病毒载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体， 属于逆转录病毒科，为RNA病毒，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；
在近年来对于基因治疗以及转基因动物的研究进一步深入，慢病毒载体作为研究之一的载体备受关注，它已被证明在包括癌症基因疗法的多种不同应用中十分有效；
由于慢病毒载体会应用于离体细胞修饰，并将回输至患者体内，因此它的制备过程对环境、人员、设备的无菌控制要求非常高，常规的生产工艺在流程中不同样品对设备、环境、人员容易产生交叉污染，而无法实现产品的多品种共线生产；我们的产品生产特点为批量小，产品质量要求高，多品种的共线生产，因此开发出一套全封闭的生产工艺无论对于产品的本身质量与效果还是整个基因治疗的行业发展都有深刻的影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种慢病毒载体全封闭生产的方法及系统，全程使用一次性无菌耗材，有效避免交叉污染，能实现多种产品的共线生产，所使用的设备不会接触到所使用的物料，样品液、平衡液所流经的管路都是全封闭的，断开和连接采用无菌封管机和无菌接管机，生产过程中能够有效避免污染与交叉污染，降低环境、设备、人员以及其他外界因素对细胞产品造成的影响，提高产品的质量和稳定性，用以解决现有技术导致的缺陷。
为解决上述技术问题本发明提供以下的技术方案：
一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其中，包括以下步骤：
步骤1：慢病毒载体宿主细胞的培养增殖；
步骤2：慢病毒载体宿主细胞的包装，将含有慢病毒载体基因组序列的质粒通过转染试剂转染入慢病毒载体宿主细胞，制得慢病毒载体培养细胞上清液并收集；
步骤3：慢病毒载体上清液的纯化，将慢病毒载体上清液依次进行澄清、酶切消化、超滤、层析柱纯化后制得慢病毒载体。上述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其中，所述步骤1中的所述慢病毒载体宿主细胞需要在多层细胞培养瓶中进行预先封闭培养，预先封闭培养包括在封闭条件下对所述宿主细胞进行复苏、培养、消化、传代。
上述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其中，所述慢病毒载体宿主细胞为293T细胞。
上述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其中，所述转染试剂为氯化钙。
上述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其中，所述步骤3中使用囊式过滤器进行澄清，加入核酸酶进行酶切消化，使用中空纤维柱进行超滤。
一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，其中，包括依次连接设置的宿主细胞增殖培养装置、慢病毒载体包装装置、慢病毒载体纯化装置。
上述的一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，其中，所述宿主细胞增殖培养装置包括第一收集滚瓶以及分别连接于所述第一收集滚瓶的消化液培养输送组件、培养基料液输送组件、宿主细胞培养组件；
所述消化液培养输送组件包括消化液料液袋、消化液输送管路以及连接于所述消化液输送管路上的消化液第一无菌接管机、消化液第一无菌封管机、消化液多层细胞培养瓶、消化液第二无菌接管机、消化液第二无菌封管机，所述消化液输送管路的两端分别与所述消化液料液袋、所述第一收集滚瓶连通；
所述培养基料液输送组件包括培养基料液袋、培养基料液输送管路，所述培养基料液输送管路的两端分别与所述培养基料液袋、所述第一收集滚瓶连通，所述培养基料液输送管路由所述培养基料液袋向所述第一收集滚瓶连通的方向上依次安装有培养基料液无菌封管机、培养基料液无菌接管机；
所述宿主细胞培养组件包括宿主细胞输送管路、宿主细胞第一多层细胞培养瓶、宿主细胞第二多层细胞培养瓶，所述宿主细胞输送管路的两端分别与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶、所述第一收集滚瓶连通，所述宿主细胞输送管路上安装有宿主细胞无菌接管机，所述宿主细胞无菌接管机与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶之间的所述宿主细胞输送管路安装有连接于所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶的宿主细胞输送支管，所述宿主细胞输送支管与所述宿主细胞输送管路的连接处连接有宿主细胞无菌封管机。
上述的一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，其中，慢病毒载体包装装置包括第二收集滚瓶、转染试剂料液袋，所述转染试剂料液袋上安装有与所述第二收集滚瓶连通的转染试剂料液输送管路，所述转染试剂料液输送管路由所述转染试剂料液袋向所述第二收集滚瓶方向上依次安装有转染试剂无菌封管机、转染试剂无菌接管机，所述第二收集滚瓶上安装有与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶连通的上清液输送管路，所述上清液输送管路由所述第二收集滚瓶向所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶方向上依次安装有上清液无菌封管机、上清液无菌接管机。
上述的一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，其中，慢病毒载体纯化装置包括慢病毒载体输送管路以及依次安装于所述慢病毒载体输送管路上的病毒上清液料液袋、慢病毒载体第一无菌接管机、慢病毒载体第一无菌封管机、囊式过滤器、慢病毒载体第二无菌接管机、慢病毒载体第二无菌封管机、澄清样品料液袋、中空纤维柱、超滤样品料液袋、慢病毒载体第三无菌接管机、慢病毒载体第三无菌封管机、层析柱、纯化液料液袋，所述病毒上清液料液袋上安装有与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶连通的上清液提取管路，所述上清液提取管路上安装有上清液无菌接管机。
依据上述本发明一种用于慢病毒载体全封闭生产的方法及系统提供的技术方案具有以下技术效果：
全程使用一次性无菌耗材，有效避免交叉污染，能实现多种产品的共线生产，所使用的设备不会接触到所使用的物料，样品液、平衡液所流经的管路都是全封闭的，断开和连接采用无菌封管机和无菌接管机，生产过程中能够有效避免污染与交叉污染，降低环境、设备、人员以及其他外界因素对细胞产品造成的影响，提高产品的质量和稳定性。
附图说明
图1为本发明一种用于慢病毒载体全封闭生产的方法的流程图；
图2为本发明一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统中宿主细胞增殖培养装置的结构示意图；
图3为本发明一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统中慢病毒载体包装装置的结构示意图；
图4为本发明一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统中慢病毒载体纯化装置的结构示意图。
其中，附图标记如下：
第一收集滚瓶101、消化液料液袋102、消化液输送管路103、消化液第一无菌接管机104、消化液多层细胞培养瓶105、消化液第二无菌接管机106、培养基料液袋107、培养基料液输送管路108、培养基料液无菌接管机109、宿主细胞输送管路110、宿主细胞第一多层细胞培养瓶111、宿主细胞第二多层细胞培养瓶112、宿主细胞无菌接管机113、宿主细胞输送支管114、消化液第一无菌封管机115、消化液第二无菌封管机116、培养基料液无菌封管机117、宿主细胞无菌封管机118、第二收集滚瓶201、转染试剂料液袋202、转染试剂料液输送管路203、转染试剂无菌接管机204、上清液输送管路205、上清液无菌接管机206、转染试剂无菌封管机207、上清液无菌封管机208、慢病毒载体输送管路301、病毒上清液料液袋302、慢病毒载体第一无菌接管机303、囊式过滤器304、慢病毒载体第二无菌接管机305、澄清样品料液袋306、中空纤维柱307、超滤样品料液袋308、慢病毒载体第三无菌接管机309、层析柱310、纯化液料液袋311、澄清管路312、慢病毒载体第一无菌封管机313、慢病毒载体第二无菌封管机314、慢病毒载体第三无菌封管机315。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明的一较佳实施例是提供一种慢病毒载体全封闭生产的方法及系统，目的是全程使用一次性无菌耗材，有效避免交叉污染，能实现多种产品的共线生产，所使用的设备不会接触到所使用的物料，样品液、平衡液所流经的管路都是全封闭的，断开和连接采用无菌封管机和无菌接管机，生产过程中能够有效避免污染与交叉污染，降低环境、设备、人员以及其他外界因素对细胞产品造成的影响，提高产品的质量和稳定性。
如图1所示，一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其中，包括以下步骤：
步骤1：慢病毒载体宿主细胞的培养增殖；
步骤2：慢病毒载体宿主细胞的包装，将含有慢病毒载体基因组序列的质粒通过转染试剂转染入慢病毒载体宿主细胞，制得慢病毒载体培养细胞上清液并收集；
步骤3：慢病毒载体上清液的纯化，将慢病毒载体上清液依次进行澄清、酶切消化、超滤、层析柱纯化后制得慢病毒载体。本实施例提供的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，采用的步骤1中的慢病毒载体宿主细胞需要在多层细胞培养瓶中进行预先封闭培养，预先封闭培养包括在封闭条件下对宿主细胞进行复苏、培养、消化、传代。
本实施例提供的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，采用的慢病毒载体宿主细胞为293T细胞。
本实施例提供的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，采用的转染试剂为氯化钙。
本实施例提供的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，采用的步骤3中使用囊式过滤器304进行澄清，加入核酸酶进行酶切消化，使用中空纤维柱307进行超滤。
根据本实施例提供的一种慢病毒载体全封闭生产的方法进行慢病毒载体全封闭生产的具体过程如下：
首先进行慢病毒载体宿主细胞293T细胞的培养与增殖，在全封闭的多层细胞培养瓶中对细胞进行复苏、培养、消化、传代的过程后获得培养上清；
对获得的培养上清进行包装，将含有慢病毒载体基因组序列的质粒通过转染试剂转染入宿主细胞，制得慢病毒载体包装细胞上清；
慢病毒载体上清液的纯化，收集慢病毒上清液于储液袋中通过澄清管路312与囊式过滤器304进行澄清，去除细胞碎片，加入核酸酶进行酶切消化获得的病毒澄清液，再使用中空纤维柱307进行超滤，获得的浓缩病毒液，将病毒液导入层析柱310中进行纯化获得慢病毒载体，其中层析柱310为Capto core700层析柱。
本发明一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，其中，包括依次连接设置的宿主细胞增殖培养装置、慢病毒载体包装装置、慢病毒载体纯化装置。
如图2所示，本实施例提供的一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，采用的宿主细胞增殖培养装置包括第一收集滚瓶101以及分别连接于第一收集滚瓶101的消化液培养输送组件、培养基料液输送组件、宿主细胞培养组件；
消化液培养输送组件包括消化液料液袋102、消化液输送管路103以及连接于消化液输送管路103上的消化液第一无菌接管机104、消化液第一无菌封管机115、消化液多层细胞培养瓶105、消化液第二无菌接管机106、消化液第二无菌封管机116，消化液输送管路103的两端分别与消化液料液袋102、第一收集滚瓶101连通；
培养基料液输送组件包括培养基料液袋107、培养基料液输送管路108，培养基料液输送管路108的两端分别与培养基料液袋107、第一收集滚瓶101连通，培养基料液输送管路108由培养基料液袋107向第一收集滚瓶连通101的方向上依次安装有培养基料液无菌封管机117、培养基料液无菌接管机109；
宿主细胞培养组件包括宿主细胞输送管路110、宿主细胞第一多层细胞培养瓶111、宿主细胞第二多层细胞培养瓶112，宿主细胞输送管路110的两端分别与宿主细胞第一多层细胞培养瓶111、第一收集滚瓶101连通，宿主细胞输送管路110上安装有宿主细胞无菌接管机113，宿主细胞无菌接管机113与宿主细胞第一多层细胞培养瓶111之间的宿主细胞输送管路110安装有连接于宿主细胞第二多层细胞培养瓶112的宿主细胞输送支管114，宿主细胞输送支管114与宿主细胞输送管路110的连接处连接有宿主细胞无菌封管机118；
在具体使用时，需要使用宿主细胞增殖培养装置进行宿主细胞的培养，具体操作过程如下：
将消化液料液袋102内的消化液导入消化液多层细胞培养瓶105进行消化，消化后的细胞培养液导入第一收集滚瓶101中，并将培养基料液袋107中的培养基导入第一收集滚瓶101中，细胞培养液与培养基在第一收集滚瓶101中充分混合均匀制成分别导入宿主细胞第一多层细胞培养瓶111与宿主细胞第二多层细胞培养瓶112中的培养上清，随后加入含有慢病毒载体基因组序列的质粒与转染试剂进行培养、扩增，整个过程均是在封闭的条件下进行，消化液第一无菌接管机104、消化液第二无菌接管机106、培养基料液无菌接管机109、宿主细胞无菌接管机113分别与消化液第一无菌封管机115、消化液第二无菌封管机116、培养基料液无菌封管机117、宿主细胞无菌封管机118的配合用于进行消化液输送管路103、培养基料液输送管路108、宿主细胞输送管路110的封闭。
如图3所示，本实施例提供的一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，采用的慢病毒载体包装装置包括第二收集滚瓶201、转染试剂料液袋202，转染试剂料液袋202上安装有与第二收集滚瓶201连通的转染试剂料液输送管路203，转染试剂料液输送管路203由转染试剂料液袋202向第二收集滚瓶201方向上依次安装有转染试剂无菌封管机207、转染试剂无菌接管机204，第二收集滚瓶201上安装有与宿主细胞第一多层细胞培养瓶111或宿主细胞第二多层细胞培养瓶112连通的上清液输送管路205，上清液输送管路205由第二收集滚瓶201向宿主细胞第一多层细胞培养瓶111或宿主细胞第二多层细胞培养瓶112方向上依次安装有上清液无菌封管机208、上清液无菌接管机207；
在具体使用时，使用慢病毒载体包装装置对产生的细胞上清液进行提取与转染试剂的加入，具体操作步骤如下：
任选宿主细胞第一多层细胞培养瓶111与宿主细胞第二多层细胞培养瓶112其中一个，提取其中的细胞上清液导入第二收集滚瓶201中，将转染试剂料液袋202中的转染试剂导入第二收集滚瓶201中，细胞上清液与转染试剂在第二收集滚瓶201中充分混合均匀后再导回至宿主细胞第一多层细胞培养瓶111或宿主细胞第二多层细胞培养瓶112中进行培养，整个过程均是在封闭的条件下进行，转染试剂无菌接管机204、上清液无菌接管机206分别与转染试剂无菌封管机207、上清液无菌封管机208配合用于进行转染试剂料液输送管路203、上清液输送管路205的封闭。
如图4所示，本实施例提供的一种用于慢病毒载体全封闭生产的系统，采用的慢病毒载体纯化装置包括慢病毒载体输送管路301以及依次安装于慢病毒载体输送管路301上的病毒上清液料液袋302、慢病毒载体第一无菌接管机303、慢病毒载体第一无菌封管机、囊式过滤器304、慢病毒载体第二无菌接管机305、慢病毒载体第二无菌封管机、澄清样品料液袋306、中空纤维柱307、超滤样品料液袋308、慢病毒载体第三无菌接管机309、慢病毒载体第三无菌封管机、层析柱310、纯化液料液袋311，病毒上清液料液袋302上安装有与宿主细胞第一多层细胞培养瓶111或宿主细胞第二多层细胞培养瓶112连通的上清液提取管路，上清液提取管路上安装有上清液无菌接管机206，囊式过滤器进液口的一端设有与慢病毒载体输送管路连通的澄清管路；
在具体使用时，需要使用慢病毒载体纯化装置进行慢病毒载体的提纯，具体操作过程如下：
提取转染后的病毒上清先存储至病毒上清液料液袋302中，将病毒上清液料液袋302中的病毒上清导入囊式过滤器304前先经过澄清管路312进行澄清，进入囊式过滤器304后进行细胞碎片的去除，并加入核酸酶进行酶切消化，获得病毒澄清液并导入澄清样品料液袋306中，将澄清样品料液袋306中的病毒澄清液导入中空纤维柱307中进行超滤获得存储至超滤样品料液袋308中的病毒液，将病毒液导入层析柱310中进行层析后存储至纯化液料液袋311，得到慢病毒载体液，整个过程均是在封闭的条件下进行，慢病毒载体第一无菌接管机303、慢病毒载体第二无菌接管机305、慢病毒载体第三无菌接管机309分别与慢病毒载体第一无菌封管机313、慢病毒载体第二无菌封管机314、慢病毒载体第三无菌封管机315配合用于进行慢病毒载体输送管路301的封闭。
综上，本发明的一种慢病毒载体全封闭生产的方法及系统，全程使用一次性无菌耗材，有效避免交叉污染，能实现多种产品的共线生产，所使用的设备不会接触到所使用的物料，样品液、平衡液所流经的管路都是全封闭的，断开和连接采用无菌封管机和无菌接管机，生产过程中能够有效避免污染与交叉污染，降低环境、设备、人员以及其他外界因素对细胞产品造成的影响，提高产品的质量和稳定性。
以上对发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改做出若干简单推演、变形或替换，这并不影响发明的实质内容。
Claims (5)
1.一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其特征在于，所述慢病毒载体由慢病毒载体全封闭生产的系统实现全封闭生产，所述慢病毒载体全封闭生产的系统，包括依次连接设置的宿主细胞增殖培养装置、慢病毒载体包装装置、慢病毒载体纯化装置，
所述宿主细胞增殖培养装置包括第一收集滚瓶以及分别连接于所述第一收集滚瓶的消化液培养输送组件、培养基料液输送组件、宿主细胞培养组件；所述消化液培养输送组件包括消化液料液袋、消化液输送管路以及连接于所述消化液输送管路上的消化液第一无菌接管机、消化液第一无菌封管机、消化液多层细胞培养瓶、消化液第二无菌接管机、消化液第二无菌封管机，所述消化液输送管路的两端分别与所述消化液料液袋、所述第一收集滚瓶连通；所述培养基料液输送组件包括培养基料液袋、培养基料液输送管路，所述培养基料液输送管路的两端分别与所述培养基料液袋、所述第一收集滚瓶连通，所述培养基料液输送管路由所述培养基料液袋向所述第一收集滚瓶连通的方向上依次安装有培养基料液无菌封管机、培养基料液无菌接管机；所述宿主细胞培养组件包括宿主细胞输送管路、宿主细胞第一多层细胞培养瓶、宿主细胞第二多层细胞培养瓶，所述宿主细胞输送管路的两端分别与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶、所述第一收集滚瓶连通，所述宿主细胞输送管路上安装有宿主细胞无菌接管机，所述宿主细胞无菌接管机与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶之间的所述宿主细胞输送管路安装有连接于所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶的宿主细胞输送支管，所述宿主细胞输送支管与所述宿主细胞输送管路的连接处连接有宿主细胞无菌封管机；
所述慢病毒载体包装装置包括第二收集滚瓶、转染试剂料液袋，所述转染试剂料液袋上安装有与所述第二收集滚瓶连通的转染试剂料液输送管路，所述转染试剂料液输送管路由所述转染试剂料液袋向所述第二收集滚瓶方向上依次安装有转染试剂无菌封管机、转染试剂无菌接管机，所述第二收集滚瓶上安装有与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶连通的上清液输送管路，所述上清液输送管路由所述第二收集滚瓶向所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶方向上依次安装有上清液无菌封管机、上清液无菌接管机；
所述慢病毒载体纯化装置包括慢病毒载体输送管路以及依次安装于所述慢病毒载体输送管路上的病毒上清液料液袋、慢病毒载体第一无菌接管机、慢病毒载体第一无菌封管机、囊式过滤器、慢病毒载体第二无菌接管机、慢病毒载体第二无菌封管机、澄清样品料液袋、中空纤维柱、超滤样品料液袋、慢病毒载体第三无菌接管机、慢病毒载体第三无菌封管机、层析柱、纯化液料液袋，所述病毒上清液料液袋上安装有与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶连通的上清液提取管路，所述上清液提取管路上安装有上清液无菌接管机，所述囊式过滤器进液口的一端设有与所述慢病毒载体输送管路连通的澄清管路；
所述慢病毒载体纯化装置包括慢病毒载体输送管路以及依次安装于所述慢病毒载体输送管路上的病毒上清液料液袋、慢病毒载体第一无菌接管机、慢病毒载体第一无菌封管机、囊式过滤器、慢病毒载体第二无菌接管机、慢病毒载体第二无菌封管机、澄清样品料液袋、中空纤维柱、超滤样品料液袋、慢病毒载体第三无菌接管机、慢病毒载体第三无菌封管机、层析柱、纯化液料液袋，所述病毒上清液料液袋上安装有与所述宿主细胞第一多层细胞培养瓶或所述宿主细胞第二多层细胞培养瓶连通的上清液提取管路，所述上清液提取管路上安装有上清液无菌接管机，所述囊式过滤器进液口的一端设有与所述慢病毒载体输送管路连通的澄清管路；
所述慢病毒载体全封闭生产的方法，包括以下步骤：
步骤1：慢病毒载体宿主细胞的培养增殖；步骤2：慢病毒载体宿主细胞的包装，将含有慢病毒载体基因组序列的质粒通过转染试剂转染入慢病毒载体宿主细胞，制得慢病毒载体培养细胞上清液并收集；
步骤3：慢病毒载体上清液的纯化，将慢病毒载体上清液依次进行澄清、酶切消化、超滤、层析柱纯化后制得慢病毒载体。
2.如权利要求1所述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其特征在于，所述步骤1中的慢病毒载体宿主细胞需要在多层细胞培养瓶中进行预先封闭培养，预先封闭培养包括在封闭条件下对所述宿主细胞进行复苏、培养、消化、传代。
3.如权利要求2所述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其特征在于，所述慢病毒载体宿主细胞为293T细胞。
4.如权利要求3所述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其特征在于，所述转染试剂为氯化钙。
5.如权利要求4所述的一种慢病毒载体全封闭生产的方法，其特征在于，所述步骤3中使用囊式过滤器进行澄清，加入核酸酶进行酶切消化，使用中空纤维柱进行超滤。
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