CN110713530B - 钠通道阻断剂μ-TRTX-Ca1a作为镇痛药物的应用 - Google Patents

钠通道阻断剂μ-TRTX-Ca1a作为镇痛药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及白线霜足蛛毒素μ‑TRTX‑Ca1a的氨基酸序列和基因序列以及应用，属于生物医学领域。μ‑TRTX‑Ca1a含有38个氨基酸残基，其中六个半胱氨酸形成三对二硫键，分子量为4289.31 Da。白线霜足蛛毒素μ‑TRTX‑Ca1a能优先抑制钠离子通道亚型Nav1.7。白线霜足蛛毒素μ‑TRTX‑Ca1a能够明显的减轻小鼠福尔马林模型、醋酸扭体模型以及热板模型导致的疼痛，μ‑TRTX‑Ca1a能做为一种治疗疼痛的药物。

Description

钠通道阻断剂μ-TRTX-Ca1a作为镇痛药物的应用
技术领域
本发明涉及白线霜足蛛多肽毒素μ-TRTX-Ca1a的发现和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
电压门控离子通道是参与细胞电信号传导的跨膜蛋白，是神经、肌肉、腺体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，它们能产生和传导电信号，其活动与细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等特异性功能密切相关。在所有哺乳动物钠通道亚型中，Nav1.7，Nav1.8和Nav1.9主要分布在外周神经系统，参与疼痛信号的传导，而Nav1.7是目前缓解慢性疼痛最有前景的目标之一。Nav1.7通道功能获得性突变会导致神经病理性疼痛，包括红斑性肢痛症、阵发性剧痛症、以及小纤维神经痛；相反，Nav1.7的功能缺失性突变会导致非功能性通道蛋白的表达，进而导致先天性无痛症。在药理学上抑制Nav1.7活性的化合物有可能治疗慢性疼痛，因此靶向Nav1.7通道的专一性抑制剂有望发展为新型的镇痛药物。
蜘蛛毒液是一种高度复杂的混合物，主要含有蛋白质、多肽以及一些小分子物质。目前已经证实了这些多肽成分多为神经毒素，可特异性识别离子通道蛋白、膜受体及转运蛋白。因此蜘蛛毒液中的成分具有广泛的应用前途，如开发成为镇痛药物、治疗自身免疫疾病药物等。
发明内容
本发明提供一种白线霜足蛛多肽毒素μ-TRTX-Ca1a的基因、氨基酸序列及其作为镇痛药物的应用。
本发明提供的白线霜足蛛多肽毒素μ-TRTX-Ca1a，是从白线霜足蛛粗毒中通过反向高效液相色谱分离纯化得到的，其氨基酸序列为IFECSISCEIEKEGNGKKCKPKKCKGGWKCKFNICVKV，该多肽包括38个氨基酸残基，分子量为4289.31Da，等电点为9.20，分子内含有三对二硫键，排列方式为C1-C3、C2-C5和C4-C6。
白线霜足蛛多肽毒素μ-TRTX-Ca1a的基因克隆包括：白线霜足蛛毒腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选白线霜足蛛钠离子通道抑制剂多肽基因。基因测序结果表明编码白线霜足蛛钠离子通道阻断剂的基因由261个核苷酸组成，自5’端至3’端基因序列包括了信号肽、前体肽和成熟肽。
atgaaggtgacattgattgccattctgacatgcgctgcattgttagttcttcacacaacagcagca 66
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本发明的白线霜足蛛多肽毒素μ-TRTX-Ca1a，对电压门控钠通道Nav1.7有非常显著的抑制作用，是一种钠通道抑制剂。同时，小鼠的镇痛模型表明该多肽具有良好的镇痛效果。
附图说明
图1：多肽毒素μ-TRTX-Ca1a的分离纯化。A：白线霜足蛛粗毒C18反相HPLC分离纯化，其中星号所示为目的峰。B：目的多肽进一步采用反相HPLC分离。C：目的分子的质谱鉴定图。
图2：μ-TRTX-Ca1a的基因序列和氨基酸序列。其中黑色阴影部分为成熟肽。
图3：μ-TRTX-Ca1a对电压门控钠通道Nav1.2-Nav1.9的活性。A：1μMμ-TRTX-Ca1a抑制Nav1.2电流63.7％。B：1μMμ-TRTX-Ca1a抑制Nav1.3电流23.1％。C：1μMμ-TRTX-Ca1a抑制Nav1.4电流11.2％。D：10μMμ-TRTX-Ca1a对Nav1.5电流无作用。E：1μMμ-TRTX-Ca1a抑制Nav1.6电流68.1％。F：1μMμ-TRTX-Ca1a抑制Nav1.7电流86.5％。G：10μMμ-TRTX-Ca1a对Nav1.8电流无作用。H：10μMμ-TRTX-Ca1a对Nav1.9电流无作用。I：μ-TRTX-Ca1a对钠离子不同亚型作用的浓效曲线。
图4：μ-TRTX-Ca1a对Nav1.7的动力学作用。A：μ-TRTX-Ca1a不改变Nav1.7的电流电压关系曲线。B：μ-TRTX-Ca1a不改变Nav1.7的稳态激活曲线。C：μ-TRTX-Ca1a不改变Nav1.7的稳态失活曲线。D：μ-TRTX-Ca1a不改变Nav1.7的稳态失活曲线。
图5：μ-TRTX-Ca1a对不同疼痛模型的镇痛效果。A：100μg/kg,200μg/kg以及500μg/kg的μ-TRTX-Ca1a明显减少福尔马林导致的炎性疼痛。B：100μg/kg,200μg/kg以及500μg/kg的μ-TRTX-Ca1a明显减少醋酸导致的疼痛。C：100μg/kg,200μg/kg以及500μg/kg的μ-TRTX-Ca1a明显降低热导致的疼痛。
具体实施方式
1、μ-TRTX-Ca1a的分离纯化
μ-TRTX-Ca1a的分离纯化分为两个步骤：(1)制备型反相HPLC高效液相色谱：将300mg冻干的蜘蛛毒液溶于ddH2O，配制成5mg/ml。上样于反相高效色谱C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，乙腈浓度变化范围为10％-55％，洗脱梯度为1％/min，洗脱速度为3ml/min，检测波长为280/215nm，收集目标组分冻干。(2)分析型反相HPLC高效液相色谱进一步分离纯化：将冻干的目标组分用ddH2O，配制成0.5mg/ml。上样于反相高效色谱C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，乙腈浓度变化范围为20％-40％，洗脱梯度为0.5％/min，洗脱速度为1ml/min。检测波长为280/215nm，收集目的峰。如图1所示，白线霜足蛛粗毒经反相HPLC分离，其中星号所示为目的峰，
该峰经过第二次反相HPLC分离产生一个单一的主峰。
毒素分子质量的鉴定均使用美国ABI公司生产AB SCIEX-TOF/TOFTM 5800型质谱仪，采用MALDI-TOF进行检测。用0.1％TFA-50％乙腈-49.9％去离子水混合液制备基质CCA(α-cyano-4-hydroxyc-innamic acid)的饱和液，然后取1μl样品与1μl CCA的饱和液混合，再取0.5μl混合液点样于质谱的样品盘上，室温干燥后检测分子量。用外标法或内标法进行校正。结果如图1C，白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a的分子量为4289.31Da，分子内含有三对二硫键。
2、μ-TRTX-Ca1a氨基酸序列以及基因序列
2.1经质谱鉴定纯度达到99.9％的μ-TRTX-Ca1a采用Edman降解原理，利用全自动氨基酸测序仪测得部分序列，再根据μ-TRTX-Ca1a的基因序列最终确定完整的氨基酸序列。
2.2白线霜足蛛毒腺总RNA的提取：
A.取出白线霜足蛛毒腺组织，放入液氮中保存，取出冻存的毒腺组织500mg，加入10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司)，置于20m1玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
B.加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
C.上清中加入等体积的异丙醇，-20℃放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗3次，晾干，管底沉淀物即为白线霜足蛛毒腺总RNA。
2.3白线霜足蛛毒腺mRNA的纯化：
白线霜足蛛毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的
Figure GDA0003994933480000031
mRNA
Isolation Systems试剂盒。
A.取白线霜足蛛毒腺500μg总RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。
C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.lml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1 DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的白线霜足蛛毒腺mRNA。
D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
2.4白线霜足蛛毒腺cDNA文库构建：采用CLONTECH公司CreatorSMART cDNALibraryConstruction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
1.在0.2ml无菌的离心管加入：1μl白线霜足蛛毒腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μlCDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
2.混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂：2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇(DTT)、1.0μl10mMdNTP混合物、1.0μlPowerScript反转录酶。
3.混合离心管中试剂并离心，在42℃保温1小时。
4.将离心管置于冰上中止第一链的合成。
5.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
1.95℃预热PCR仪。
2.将2μlcDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3.在PCR仪中按以下程序扩增：
95℃20秒钟，22个循环：95℃5秒钟、68℃6分钟。
4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
C.PCR产物用PROMEGA公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
3.重复步骤2。
4.16,000g离心5分钟。
5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
1.挑取单个DH5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50m1 LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2,20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。E.酶切、连接以及连接产物的转化：
1.在微量离心管中加入1μl Takara PUC19载体、4μl白线霜足蛛cDNA双链溶液，全量为5μl。
2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
3.16℃反应2小时。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5.42℃水浴热休克90秒钟后，迅速放入冰上2分钟。
6.加入300μl SOC培养基(不含抗生素)，置于37℃摇床，转速200rpm，复苏45min。
7.菌液涂布于15cm培养皿上(Apr-IPTG/x-gal LB固体培养基)，37℃过夜。
8.每个LB平皿用5m1 LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×106个单独克隆。
2.5、白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a基因克隆筛选：
扩增引物长度为17个核苷酸其序列为5’-GCGAAAAATGGAAATCT-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3＇。
PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，68℃30秒钟和72℃1分钟，30个循环。
将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，用DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的目的片段连接到pUC19载体中，即得连接产物。将连接产物转化预先制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞。最后，取适量转化产物涂布至含Amp的LB平板上，经37℃培养16h形成的单菌落即为含目的片段的阳性克隆。
挑取单菌落用M13引物检测插入片段的大小。挑选含目的片段的阳性克隆送DNA测序公司测序。
白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a的氨基酸序列和基因序列如图2所示。
3、白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a对电压门控钠通道Nav1.2-Nav1.9活性
细胞转染：
(1)培养Hek293t细胞，当细胞密度达到80-90％时，弃培养液，用PBS漂洗一次，加入2ml无血清培养基(Opti-MEM)。
(2)配制A液：250μL无血清培养基+4ug DNA，轻轻混合均匀，室温静置5分钟。
(3)配制B液：250μL无血清培养基+8μL Lipfectamine 2000，轻轻混合均匀，室温静置5分钟。
(5)将A液与B液轻轻混匀，室温下静置20min。
(6)将DNA-脂质体混匀后，轻轻滴加入细胞中。
(7)4-6小时后，更换含有血清的全培养基。
活性检测：
实验前将细胞外液从冰箱取出恢复室温，更换培养皿内的培养液。更换溶液时动作要轻柔，防止细胞从培养皿底部脱落。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(PC-10，Narishige)上经两步拉制而成，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极入水电阻为1.5～2.5MΩ。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容，转换为全细胞记录模式，给予细胞一短促而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。将细胞钳制为-100mV，细胞稳定4～6min开始记录电流。系统电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5～10MΩ的范围之内，基本维持不变，系统串联电阻(Rseries compensation)补偿80％。
4、白线霜足蛛μ-TRTX-Ca1a的镇痛效果
4.1福尔马林镇痛实验
ICR小鼠(18～22g)，分为五组(n＝8)。白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用肌肉注射方式给药，给药30min后，于小鼠右后足趾注射5％福尔马林溶液20μL，立即开始计时注射福尔马林后小鼠添足时间，每隔5min记录一次总时间，连续记录40min。对照组给予同样体积的无菌生理盐水。观察记录各组小鼠注射福尔马林40min之内的舔足时间。实验数据，采用t检验比较各组的显著性差异。
醋酸扭体法镇痛实验
ICR小鼠(18～22g)，分为五组(n＝8)。白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药，在μ-TRTX-Ca1a注射15min后，采用腹腔注射方式给小鼠注射200μl1％的乙酸，计数小鼠注射乙酸后30min的扭体次数。
热板法镇痛实验
本实验前需将小鼠做实验前筛选，剔除对热不敏感和对热过于敏感的个体，选择能够受热5-30s的个体进行实验，并求出基础疼痛阈值。放置小鼠于55±0.1℃的恒温板上，观察记录小鼠从放入到舔后足所需时间，以此作为疼痛阈值。小鼠随机分为五组(n＝8)。白线霜足蛛毒素μ-TRTX-Ca1a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药,分别在μ-TRTX-Ca1a注射后30min,60min,90min和120min测定小鼠的痛阈。对照组给予同样体积的无菌生理盐水。实验数据，采用t检验比较各组的显著性差异。
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<120> 钠通道阻断剂μ-TRTX-Ca1a作为镇痛药物的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> Cyriopagopus albostriatus
<400> 1
Ile Phe Glu Cys Ser Ile Ser Cys Glu Ile Glu Lys Glu Gly Asn Gly
1 5 10 15
Lys Lys Cys Lys Pro Lys Lys Cys Lys Gly Gly Trp Lys Cys Lys Phe
20 25 30
Asn Ile Cys Val Lys Val
35

Claims (4)

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的多肽的制备方法，选自以下之任一：
(1)利用化学合成方法合成所述多肽；(2)在合适的条件下培养宿主细胞并使其表达所述多肽，而后分离及纯化获得所述多肽。
3.如权利要求1所述多肽在制备镇痛药物中的用途。
4.一种药物组合物，包括有效成分以及药学上可接受的载体，所述有效成分含有如权利要求1所述多肽。
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