CN110693886A

CN110693886A - 防治脑海绵状血管畸形病变的药物

Info

Publication number: CN110693886A
Application number: CN201810746762.4A
Authority: CN
Inventors: 郑祥建
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: CN110693886B

Abstract

本发明涉及防治脑海绵状血管畸形病变的药物。本发明揭示了可以通过抑制CCM的分子通路、进而抑制脑海绵状畸形病灶的发生和生长的药物，即Ponatinib，也包括其类似物或衍生物。

Description

防治脑海绵状血管畸形病变的药物

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及防治脑海绵状血管畸形病变的药物。

背景技术

海绵状血管畸形病变(CCM)是颅内常见的血管性病变，常被认为出血率高，容易引起临床症状。患者常表现为癫痫、出血等局灶性神经功能障碍。较多的患者因癫痫就诊，其临床表现依据位置不同而具有特异性。海绵状血管畸形的发病无性别差异，平均年龄30～40岁。随着神经影像学的发展，尤其是高场强MRI的临床应用，使得越来越大的患者被准确地诊断出，早期诊断可提高其治疗效果。

目前脑海绵状血管畸形病变在临床上一般采用手术的方法进行治疗，需要进行开颅手术切除，至今尚没有药物治疗方法。而手术治疗使患者短期残疾评分恶化，增加症状性脑出血和新的局灶性神经功能缺损出现的风险。

目前已经了解到，三个基因位点(CCM1，CCM2，和CCM3)和海绵状血管畸形关系密切。但是，尽管如此，本领域仍然没有针对这一发现，找到适合于治疗该疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供防治脑海绵状血管畸形病变的药物。

在本发明的第一方面，提供式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变的组合物；

在一个优选例中，，所述的化合物通过调节CCM-MEKK3-KLF分子通路发挥作用。

在另一优选例中，所述的化合物通过抑制MEKK-KLF信号发挥调节作用；较佳地，其抑制MEKK3激酶活性，从而抑制MEKK-KLF信号。

在另一优选例中，所述的化合物通过抑制Rho下游激酶Rho Kinases而预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变。

在另一优选例中，所述的化合物还用于使脑海绵状血管畸形病变的大脑内皮细胞的功能障碍结构变得正常化。

在另一优选例中，所述的化合物还用于抑制KLF、eNOS，ADAMTS1/4基因的表达水平；或所述的化合物还用于降低ERK5和p-ERK5的蛋白水平。

在另一优选例中，所述的组合物中，还包括：Rho Kinase抑制剂(如Fasudil)，细胞链接稳定剂(如cadherin 5blockmir)，抗炎药物(如TLR4信号拮抗剂TAK-242)。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物；例如，所述的药物组合物的剂型包括：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂、注射剂、输液剂、混悬剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，式(I)所示化合物或其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

在另一优选例中，，所述的溶剂合物为水合物。

在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变的方法，所述方法包括：以式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐给予需要预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变的受试者；

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、A-C为计算机模型。在ATP结合带中，Ponatinib以氢键和π-π键(彩色)相互作用与MEKK3激酶结构域结合。如图中所示全长蛋白(A)，带状图(B)和表面图(C)的结合带。

图2显示Ponatinib能够阻断内皮细胞MEKK3导致的下游基因表达上调。A-D为在siRNA敲除CCM1基因的人脐静脉内皮细胞中，Ponatinib处理后MEKK3下游基因表达分析。在人脐静脉内皮细胞中使用Ponatinib可以纠正KLF2(A)，eNOS(B)，ADAMTS1(C)和ADAMTS4(D)的表达升高。

图3显示Ponatinib抑制CCM1基因缺失的疾病模型中CCM损伤形成和进程。A图为实验设计示意图：新生鼠在出生后第一天用4-羟基他莫昔芬诱导产生疾病模型，在出生后第6天给予Ponatinib处理。在小鼠出生后第13天取其脑组织样本并进行显微CT分析。B-G图为CCM1基因缺失疾病状态下给予(E-G)或不给于(B-D)Ponatinib治疗的显微CT结果。H-I图为显微CT定量分析，结果显示对于CCM疾病，相较于对照处理，给予Ponatinib治疗使CCM损伤体积降低了72％(H)，总损伤数量降低了35％(I)。CCM损伤分布分析显示在Ponatinib治疗下可以降低大病灶和中等病灶的数量(I)和总体积(J)，但小病灶的数量和集合体积没有改变。通过T检验显示方差和显著性差异，**表示p<0.001。对照组n＝10，Ponatinib治疗组n＝9。

图4显示Ponatinib抑制CCM2基因缺失的疾病模型中CCM损伤形成和进程。A图为实验设计示意图。B-G图为CCM2基因缺失疾病状态下给予(E-G)或不给于(B-D)Ponatinib治疗的显微CT结果。H-I图为显微CT定量分析，结果显示对于CCM疾病，相较于对照处理，给予Ponatinib治疗使CCM病灶体积降低了85％(H)，总病灶数量降低了36％(I)。I-J为CCM病灶分布分析，显示病灶的减少源自于大病灶数量的减少。通过T检验显示方差和显著性差异，**表示p<0.001。对照组和Ponatinib治疗组均为n＝8。

图5显示在CCM疾病模型中，Ponatinib阻止已形成的CCM病灶的生长。A图为实验设计示意图：新生鼠在出生后第一天用4-羟基他莫昔芬诱导产生疾病模型，在出生后第11天给予Ponatinib治疗。在小鼠出生后第22天取其脑组织样本进行显微CT分析。B-G图为CCM1基因缺失疾病状态下给予(E-G)或不给于(B-D)Ponatinib治疗的显微CT结果。H-J图为显微CT定量分析，结果显示对于CCM疾病，相较于对照处理，给予Ponatinib治疗使CCM病灶体积降低了70％(H)，但总病灶数量没有变化(I)。CCM病灶分布分析显示中等程度和重度程度病灶有所减少，但轻度病灶的数量增加(I)。轻度和中度病灶的叠加体积没有变化，但是重度病灶体积减少(J)。通过T检验显示方差和显著性差异，**表示p<0.001。对照组n＝7，Ponatinib治疗组n＝9。

图6为小鼠视网膜Isolectin染色(红色)。A-C结果显示相较于对照组(A和B)，Ponatinib治疗后的CCM病灶区域变小(C)。

图7CCM疾病小鼠出生后第30天脑组织样本HE染色。CCM1基因缺失导致的CCM疾病，给予Ponatinib治疗的同窝小鼠的脑组织切片图显示病灶大量减少。

图8显示Ponatinib能够阻断CCM疾病模型小鼠中MEKK3导致的下游基因表达上调。A-D为CCM1基因缺失的CCM疾病小鼠中基因表达分析。小鼠出生后第1天诱导基因敲除，第6天用Ponatinib处理，在第13天取脑样本检测，结果显示Ponatinib治疗可以纠正Klf2(A)，Klf4(B)，eNos(C)andId1(D)的表达升高。

图9显示Ponatinib处理可以纠正pMLC2的表达水平。A-C和D-E分别为在siRNA敲除CCM1和CCM2基因的人脐静脉内皮细胞中pMLC2信号变化。与si-CCM1/2(B、D)相比，Ponatinib处理组(C、E)pMLC2信号明显减弱。

图10为小鼠脑微血管的扫描电子显微镜成像，结果显示Ponatinib可以缓解CCM疾病模型中血管超微结构异常。在无CCM病灶(A，D)的微血管中，存在内皮脊，且其沿血流方向排列；在CCM疾病(B，E)状态下，内皮脊扁平化且紊乱；用Ponatinib(C，F)处理的CCM疾病组可使内皮的部分脊结构正常化并沿血流方向排列。

具体实施方式

针对现有技术中尚没有针对脑海绵状畸形的治疗药物的现状，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，确定了可以通过抑制CCM的分子通路、进而抑制脑海绵状畸形病灶的发生和生长的药物，即Ponatinib，也包括其类似物或衍生物。

基于前期发现的CCM-MEKK3-KLF分子通路，本发明人通过计算机模拟，细胞学分析筛选，发现化合物Ponatinib可以抑制MEKK-KLF信号。在CCM动物模型中，早期使用Ponatinib可以抑制CCM病症的发生。而在CCM病灶已经形成的动物模型中，Ponatinib可以抑制CCM生长。超微结构和免疫荧光分析证明Ponatinib通过对Rho下游激酶ROCK和底物pMLC2的抑制而使畸变血管内膜回归正常。详细工作原理和技术数据见附件。因此，本发明通过分子生物学、细胞生物学和临床前动物实验证明Ponatinib能用于治疗人类CCM疾病，可用于经MRI检查后发现CCM病灶的病人或具有家族遗传史并经过基因确诊的病人。

因此，本发明提供了一种如结构式(I)所示母核结构的化合物；

本发明还包括上述式(I)化合物的异构体、衍生物、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)化合物(Ponatinib)具有相同或基本相同的功能。

所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。

化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。

合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。

本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的式(I)所示的化合物、或其异构体、衍生物、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(I)化合物、异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

在本发明中，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.01-30％的式(I)所示的化合物或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐。较佳的，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.03-20％的式(I)所示的化合物或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐。应理解，根据配制或储存的需要(例如制备稀释制剂、儿童制剂或浓缩制剂)，所述药物组合物中所述化合物的含量还可以低于或高于上述所限定的范围。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的。比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、或悬浮液。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本发明的化合物或其药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。

当用于治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变时，药物组合物以口服方式给药是优选的。各种适用于配制口服剂型的药学载体均可应用于本发明中。

式(I)化合物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明的式(I)化合物还可以与其它治疗药物或治疗方式联合应用，包括但不限于：与Rho激酶抑制剂(如Fasudil)组合使用治疗CCM疾病；与细胞链接稳定剂(如Cadherin5blockmir)组合使用治疗CCM疾病；与抗炎药物(如TAK-242)组合使用治疗CCM疾病；等等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

实验设计

本实验为特异性验证Ponatinib可以通过抑制MEKK3-KLF-Adamats信号通路有效预防CCM畸变形成和扩张。本次实验使用的经FDA批准的激酶抑制剂文库，来筛选能在CCM1基因敲低的内皮细胞中抑制KLF2/4的基因表达水平的抑制剂。细胞生物学实验发现Ponatinib是最有效的候选药物。本发明人运用了内皮细胞特异CCM1/2敲除(Ccm1^iECKO或Ccm2^iECKO)的小鼠CCM疾病模型进行药物实验。小鼠分为对照组和Ponatinib组，采取双盲方式从n>4窝小鼠中选择每组n>6只小鼠进行分组。CCM的病灶用Micro-CT扫描技术来检测。Ponatinib的治疗作用分别用CCM病灶的数量、大小及体积的减少量这三个方面进行评估。基因表达的改变通过实时定量PCR技术衡量，并通过扫描电镜分析观察畸变内皮细胞的恢复。

小鼠模型

Cdh5-CreERT2PAC转基因小鼠(iECre)，Ccm1^fl/fl和Ccm2^fl/fl小鼠参见已发表的文章(Nature 2010PMID:20445537,Dev Cell 2015PMID:25625206)。

动物模型中CCM病灶诱导和Ponatinib治疗

Ccm1^iECKO和Ccm2^iECKO实验小鼠通过Cdh5-CreERT2；Ccm1^fl/fl或Cdh5-CreERT2；Ccm2^fl/fl与Ccm1^fl/fl或Ccm2^fl/fl交配得到。为了得到CCM基因缺失的小鼠模型，新生鼠(对照组和Ponatinib治疗组)在出生后第一天灌胃50uL的4-羟基他莫昔芬(0.5mg/ml，H7904，Sigma-Aldrich)诱导产生疾病模型，Ponatinib(Selleck，浓度为10mg/kg，溶于25mM柠檬酸盐缓冲溶液，pH 2.75)在出生后第6或11天给予小鼠灌胃处理，对照组小鼠在出生后第6或11天灌胃给予空白载体(25mM柠檬酸盐缓冲溶液，pH 2.75)。

Ponatinib处理和培养的内皮细胞基因表达分析

在人脐静脉内皮细胞中经siRNA介导的基因敲除：人脐静脉内皮细胞在六孔板中培养，待细胞密度达到80％的时候使用siPortamine(ThermoFisher)试剂转染10nM siRNA。

转染24h后的细胞给予Ponatinib或空白载体处理，转染后48h收细胞提取RNA和蛋白样品。在本实验中使用的敲除CCM1，CCM2，MEKK2，MEKK3和ABL1基因的siRNA都从ThermoFisher订购。

在人脐静脉内皮细胞中当siRNA敲除CCM1基因后，细胞给予Ponatinib(0.2-2μM)处理，24h后使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen 74004)提取总RNA。cDNA反转使用SuperScript^TM VILO cDNA Synthesis Kit and Master Mix(Thermo Fisher)。实时荧光定量PCR反应设三个平行样本，统计的数据至少来自三次独立重复。实时荧光定量PCR使用PowerUp SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Fisher)，以下是用来检测基因表达变化的人源引物序列：

GAPDH-正向：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(SEQ ID NO:1)；

GAPDH-反向：5’-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’(SEQ ID NO:2)；

KLF2-正向：5’-CTACACCAAGAGTTCGCATCTG-3’(SEQ ID NO:3)；

KLF2-反向：5’-CCGTGTGCTTTCGGTAGTG-3’(SEQ ID NO:4)；

KLF4-正向：5’-GGCGGGCTGATGGGCAAGTT-3’(SEQ ID NO:5)；

KLF4-反向：5’-TGCCGTCAGGGCTGCCTTTG-3’(SEQ ID NO:6)；

eNOS-正向：5’-GGGTCCTGTGTATGGATGAGT-3’(SEQ ID NO:7)；

eNOS-反向：5’-ATGCTGTTGAAGCGGATCTTA-3’(SEQ ID NO:8)；

AQP1-正向：5’-TCATGTACATCATCGCCCAGT-3’(SEQ ID NO:9)；

AQP1-反向：5’-GGTAGTAGCCAGCACGCATAG-3’(SEQ ID NO:10)；

ADAMTS1-正向：5’-GTAGGACAGCCCACAGGAACT-3’(SEQ ID NO:11)；

ADAMTS1-反向：5’-GTAGGACAGCCCACAGGAACT-3’(SEQ ID NO:12)；

ADAMTS4-正向：5’-AACATGCTCCATGACAACTCC-3’(SEQ ID NO:13)；

ADAMTS4-反向：5’-AATGGAGCCTCTGGTTTGTCT-3’(SEQ ID NO:14)；

ADAMTS9-正向：5’-CCGATCGTGAGCAGTGTAAC-3’(SEQ ID NO:15)；

ADAMTS9-反向：5’-TTGTTTATGCCCTCGACCAC-3’(SEQ ID NO:16)；

CCM1-正向：5’-AATGGCAGAGAAGCATGAGCAGTG-3’(SEQ ID NO:17)；

CCM1-反向：5’-ATTTCAGCATGTCCTCCTCCAGCA-3’(SEQ ID NO:18)；

MEKK2-正向：5’-AGAATCCTTCAGTTCCCCAGA-3’(SEQ ID NO:19)；

MEKK2-反向：5’-TACTACGATCCAGCAGTTCCA-3’(SEQ ID NO:20)；

MEKK3-正向：5’-AGATGTGGAGCACAAGGTGAC-3’(SEQ ID NO:21)；

MEKK3-反向：5’-ATTTATATCCCCTGCGGACTG-3’(SEQ ID NO:22)；

ABL1-正向：5’-GTTCCATCTCCCACTTGTCGT-3’(SEQ ID NO:23)；

ABL1-反向：5’-TGAGATACGAAGGGAGGGTGT-3’(SEQ ID NO:24)。

小脑内皮细胞的分离和基因表达分析

小脑组织经过酶消化得到小脑内皮细胞，然后使用抗CD31共轭磁珠(MACS MS系统，Miltenyi Biotec)进行磁力激活细胞分选。分选出的小脑内皮细胞用RNeasy微量试剂盒(Qiagen 74004)提取总RNA。实时荧光定量PCR反应设三个平行样本，统计的数据至少来自三次独立重复，以下是用来检测基因表达变化的小鼠引物序列：

Gapdh-正向：5’-GTCCCGTAGACAAAATGGTGA-3’(SEQ ID NO:25)；

Gadph-反向：5’-TTTGATGTTAGTGGGGTCTCG-3’(SEQ ID NO:26)；

Klf2-正向：5’-CGCCTCGGGTTCATTTC-3’(SEQ ID NO:27)；

Klf2-反向：5’-AGCCTATCTTGCCGTCCTTT-3’(SEQ ID NO:28)；

Klf4-正向：5’-GTGCCCCGACTAACCGTTG-3’(SEQ ID NO:29)；

Klf4-反向：5’-GTCGTTGAACTCCTCGGTCT-3’(SEQ ID NO:30)；

eNos-正向：5’-CCTGTGCATGGATGAGTATGA-3’(SEQ ID NO:31)；

eNos-反向：5’-TGAGCAGGAGACACTGTTGAA-3’(SEQ ID NO:32)；

Id1-正向：5’-ATCCTGCAGCATGTAATCGAC-3’(SEQ ID NO:33)；

Id1-反向：5’-GAGTCCATCTGGTCCCTCAGT-3’(SEQ ID NO:34)。

组织学

组织样本在4％甲醛固定过夜并嵌入石蜡。使用标准步骤对5um切片进行苏木精和伊红染色，后在光镜下观察。

视网膜分离与血管染色

小鼠处死后，摘取眼球，分离视网膜，对于视网膜染色，在4℃环境下将视网膜固定在含有1％牛血清白蛋白，0.3％Triton X-100的磷酸盐缓冲溶液中封闭过夜。视网膜用PBLEC缓冲液(1％Triton X-100，1mM氯化钙，1mM氯化镁和0.1mM氯化锰的PBS溶液，pH＝6.8)缓冲，后在4℃下用1:25Daylight 594共轭异凝集素B4(IB4)(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)在PBLEC缓冲液中染色视网膜血管。清洗IB4，将染色后的视网膜用4％PFA固定5分钟，并再次用PBS洗涤。使用共聚焦SP5显微镜(LeicaMicrosystems，Germany)拍摄视网膜血管的图像。

Micro-CT扫描和分析

解剖取得模型小鼠的小脑，用4％PFA固定过夜，然后用Lugol’s溶液染色3天。处理好的样品用用Xradia MicroXCT-400成像系统以50kv x 10w，540projection x 2s的扫描参数进行扫描，取得系列反射图像。图像数据运用Avizo软件进行标记和重构，获得3维和定量数据。

计算机模型

使用Prime(Schrodinger，LLC)，基于丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶PAK1(PDB ID:4ZLO)的晶体结构为模板建立Mekk3和MEKK2的同源模型。蛋白最小化然后由Prime展示。Ponatinib是由Glide(Schrodinger，LLC)按XP精度分别制备的和建立在模型中。PyMOL报道了三维结合配体蛋白。二维配体-蛋白质交互图由Maestro(Schrodinger，LLC)提供。

通过扫描电镜分析脑微血管结构

小鼠灌流10ml扫描电镜固定剂(2.5％电镜级戊二醛，2％甲醛，2mmol/L氯化钙，2％蔗糖和0.1M甲次砷酸盐缓冲液，pH 7.4)。解剖后脑并将其固定在扫描电镜固定剂中过夜。如前所述本发明人进一步制备了扫描电镜样本。在JEOL Neoscope上脑组织样本经5000倍放大进行了脑血管造影检查。

免疫荧光

细胞用4％多聚甲醛37℃固定10min，然后1％tritonX-100处理10min，PBS清洗，3％BSA封闭1h，pMLC(CST 1：50)4℃过夜孵育，二抗Anti-rabbit IgG 594(CST)室温孵育1h，封片，用共聚焦LSM800(Axio-Imager_LSM-800，蔡司，德国)拍摄图片。

数据分析

本研究中所有的统计分析均采用GraphPad Prism统计软件中的t检验和单向方差分析，均已平均值着±标准差示意。在P≤0.05认为有统计显著性。

实施例1、Ponatinib直接抑制MEKK3激酶活性

本发明人基于晶体结构进行了复合蛋白建模，并利用纯化的MEKK3及其相互作用底物及其激酶底物MEK5进行了体外激酶分析。Ponatinib是一种II型激酶抑制剂，在DFG-out构象中与激酶结合。基于之前解决的Ponatinib-FGFR4复合物、Ponatinib-Abl复合物的晶体结构和结构求解的DFG-out激酶PAK1与MEKK3激酶结构域具有高同源性，计算机建模揭示了在ATP结合带中，Ponatinib以氢键和π-π键(彩色)相互作用与MEKK3激酶结构域结合(图1，A、B、C)。

实施例2、Ponatinib在CCM基因缺失细胞模型中抑制MEKK3信号通路活性

在内皮细胞中CCM基因的缺失会引起MEKK3信号上调。为了论证Ponatinib能否通过抑制异常的MEKK3活性而纠正CCM病变，本发明人构建了siRNA敲除CCM1(siRNA)基因的人脐静脉内皮细胞系统，并给予不同剂量的Ponatinib处理。得到的结果显示，CCM1基因缺失增加了MEKK3下游靶基因的表达水平。在对照siRNA处理的细胞中，Ponatinib没有影响KLF2，eNOS，ADAMTS1的表达；而与对照组相比，高剂量的Ponatinib使ADAMTS4表达水平下降(图2A～D)。更重要的是，在人脐静脉内皮细胞中Ponatinib处理组能够减少这些基因的高表达，使其与对照组达到相同表达水平(图2A～D)。在蛋白水平，蛋白免疫印迹实验表明Ponatinib可以抑制CCM基因缺失引起的KLF、eNOS，ADAMTS1/4等基因的表达的上升。同时Ponatinib也降低ERK5和p-ERK5的蛋白水平。

这些结果表明，在内皮细胞中，Ponatinib通过阻断过度激活的MEKK3介导的下游信号通路成为MEKK3信号传导的有效抑制剂。

实施例3、Ponatinib抑制CCM1基因缺失的疾病模型中CCM畸变形成和扩张

体外实验已经证实Ponatinib可以纠正CCM1缺失的内皮细胞的异常信号改变。为了证实Ponatinib是否可以减轻CCM1基因缺失的动物模型CCM病变，本发明人对特异性诱导敲除内皮细胞CCM1基因的动物模型(Cdh5-CreERT2；Ccm1fl/fl，标注为Ccm1^iECKO小鼠)灌胃给予Ponatinib(10mg/kg)处理(图3A)。新生鼠在出生后第一天用4-羟基他莫昔芬(4-HT)诱导产生CCM1缺失疾病模型，在出生后第6天开始有微小的CCM病灶出现，到第13天，通过Micro-CT的方式可见Ccm1^iECKO小鼠有多处血管畸形(图3B-D)。

当本发明人在新生Ccm1^iECKO小鼠出生后第6天给予10mg/kg剂量的Ponatinib，可以显著减少后脑CCM病变的数量(图3E-G)。结果显示，相较于对照处理，给予Ponatinib治疗使CCM病变体积降低了72％(图3H)，总病灶数量降低了35％(图3I)。本发明人进一步根据观察到的病灶大小对其进行病灶数量的分类，与对照组相比，Ponatinib处理组的中度(体积10⁶-10⁷μm³)和重度病灶(体积>10⁷μm³)体积显著下降。更有趣的是，在两组中轻度的病灶(<10⁶μm³)的总体积没有差异(图3I)。在用Ponatinib治疗的Ccm1^iECKO小鼠中观察到的总病灶体积的减少是由于大病灶体积的显著降低(图3J)。

在CCM1-CCM2-CCM3蛋白复合体中，CCM2蛋白直接与MEKK3相互作用，CCM2基因的缺失导致内皮细胞MEKK3信号通路表达上调从而造成血管畸形。与Ccm1^iECKO小鼠结果相似，给予特异性敲除内皮细胞CCM2基因的小鼠10mg/kg剂量的Ponatinib使CCM病9变体积降低了85％，总病变数量降低了36％(图4A-I)。值得强调的是，在Ccm2^iECKO小鼠中，Ponatinib减少了病灶数量，同时也使病灶体积降低(图4I，J)。因此，CCM疾病总病灶的减少提示Ponatinib治疗在起始阶段限制了病变发生。另外，CCM病灶体积的显著减少表明Ponatinib在限制CCM病灶生长方面非常有效。

综上所述，这些数据表明，Ponatinib能够有效抑制血管畸形。

实施例4、Ponatinib预防晚期CCM病变的进展

在新生鼠CCM模型中，CCM病灶在出生后第6天前后出现，然后快速生长，到出生后第11天已经形成许多较成熟的病灶。此后，病灶将继续生长，但速度相对较慢。小鼠中这一病灶的生长模式和以核磁共振扫描的方式检测到人类CCM病灶的生长相似。本发明人的实验数据显示，在病变生长时，使用Ponatinib治疗，使内皮特异性CCM敲除小鼠中形成的病变数量减少，表明Ponatinib可以有效防止病变的发生和生长(图3，4)。为了确定Ponatinib是否可以减少病变的生长或挽救已经形成的病变，本发明人给出生后第11天的Ccm1^iECKO小鼠注射了10mg/kg剂量Ponatinib，并分析了出生后22天的CCM病变(图5A)。与对照组的Ccm1^iECKO小鼠相比，Ponatinib治疗显著降低了CCM病灶(图5B-G，图7)。Micro-CT成像数据的定量分析表明，Ponatinib治疗可以使病灶体积减少>70％(图5H)。但是，Ponatinib处理对CCM病灶的总数没有影响，因此，Ponatinib显著地减少了中重度病变的出现(图5I-J)。说明Ponatinib能有效地抑制CCM病灶生长。

除了小脑病变的发展，CCM模型小鼠的视网膜也会发生病变，与发生于人类的此类病变相似。在对照组的Ccm1^iECKO小鼠中，血管畸形位于视网膜血管丛的外周。Ponatinib抑制了血管病变在视网膜发生，与它在小脑的抑制作用类似(图6A-C)。

这些数据表明，Ponatinib可以有效地减少已经形成的CCM病变的大小和数量。

实施例5、Ponatinib使CCM缺陷小鼠内皮细胞的异常表达基因正常化

为了确定Ponatinib是否通过对KLF2/4及其下游靶基因的调控来抑制CCM病变的形成和进展，本发明人分离了小鼠的小脑内皮细胞，并通过qPCR分析基因表达。新生鼠在出生后第1天诱导基因缺失，在第6天给予Ponatinib处理，在第13天Ccm1^iECKO幼仔中分离出脑内皮细胞。

qPCR结果显示，与同窝对照组小鼠相比，Klf2、Klf4、eNos和Id1mRNA表达增加。Ponatinib处理对Ccm1^iECKO小鼠足以使大脑内皮细胞中升高的基因表达水平下调至与对照组一致的水平(图8A-D)。

实施例6、Ponatinib处理可以纠正pMLC2的表达升高

在体外培养的小鼠脑内皮细胞和人内皮细胞中发现，缺乏CCM基因导致Rho信号研究的激活。为了确定Ponatinib是否能够逆转CCM缺失引起的Rho信号激活，本发明人在人脐静脉内皮细胞中用siRNA对CCM1或CCM2进行敲除，然后再进行Ponatinib处理。免疫荧光分析显示，与对照组(图9A)相比，si-CCM1(图9B)或si-CCM2(图9D)增加了Rho激酶的下游底物pMLC2水平。但这种pMLC2表达增加在Ponatinib治疗下均可被逆转(图9C，E)。

实施例7、Ponatinib处理使CCM基因缺失小鼠的内皮细胞形态正常化

CCM病变主要病理特征是内皮细胞变平，以及内皮细胞-内皮细胞、内皮细胞-周细胞相互作用被破坏。为了确定Ponatinib是否能将病变的内皮结构改变正常化，本发明人进行了扫描电镜检查，首次将脑微血管内皮内侧与CCM病变区域相比较。在正常内皮细胞中，存在内皮脊且和血液流动的方向一致(图10A、D)。相比之下，病变的内皮细胞扁平且杂乱无序(图10B，E)。Ponatinib治疗可以部分重建内皮脊结构，使内皮细胞排列在血液流动的方向(图10C，F)。

这些结果表明，Ponatinib可以使含有CCM病变的大脑内皮细胞潜在的功能障碍结构改变正常化。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 天津医科大学

<120> 防治脑海绵状血管畸形病变的药物

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Claims

1.式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变的组合物；

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物通过调节CCM-MEKK3-KLF分子通路发挥作用。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的化合物通过抑制MEKK-KLF信号发挥调节作用；较佳地，其抑制MEKK3激酶活性，从而抑制MEKK-KLF信号。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物通过抑制Rho下游激酶RhoKinases而预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物还用于使脑海绵状血管畸形病变的大脑内皮细胞的功能障碍结构变得正常化。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物还用于抑制KLF、eNOS，ADAMTS1/4基因的表达水平；或所述的化合物还用于降低ERK5和p-ERK5的蛋白水平。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物中，还包括：Rho Kinase抑制剂，细胞链接稳定剂，抗炎药物。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，式(I)所示化合物或其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的溶剂合物为水合物。

10.一种预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变的方法，其特征在于，所述方法包括：以式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐给予需要预防、缓解或治疗脑海绵状血管畸形病变或视网膜血管病变的受试者；