CN110684721A - 一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法。所述培养基，包括胎牛血清蛋白、胰岛素‑转铁蛋白‑硒添加剂和嘌呤霉素。本发明利用培养基进行胚胎质量的评估方法,依次通过胚胎培养与胚胎条件培养液的收集、解冻胚胎条件培养液、培养子宫内膜基质细胞、添加胚胎条件培养液和蛋白检测，得到具体的细胞分泌蛋白的差异蛋白，从而对胚胎质量进行评估。本发明的评估方法十分的有效和准确，弥补了市面上的空白。

Description

一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，具体的涉及一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法。
背景技术
胚胎条件培养液简称BCM，是一种含有胚胎的培养液。体外受精－胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET)是目前治疗不孕症最好的方法。胚胎现有的评估方法主要根据细胞数目，碎片和均匀度等形态学参数进行胚胎评分，但在实际操作过程中发现，该方法进行胚胎评级时受人为主观因素影响较大，经常存在着评分不一致的现象。而为进一步提高成功率和降低多胎妊娠率，需采用一种更为科学的方法鉴别胚胎质量，以便在保证一定妊娠率的情况下减少移植胚胎的数量和次数。胚胎作为一种有分泌活性的生物体，大量的研究表明，种植前的胚胎能够分泌不同的配体分子，配体分子包括生长因子，细胞因子和激素类分子等。而有相关学者发现了胚胎的分泌活性与其种植潜能可能具有相关性。
但由于BCM中外加蛋白的含量往往显著高于胚胎自身分泌的蛋白数量，目前直接定量检测如质谱法和酶联免疫法等对BCM进行检测也无法检出明确的胚胎源性信号分子或仅能实现部分信源分子的检出。所以检测BCM中的胚胎信号分子难度较大，直接对BCM中胚胎分泌信号分子检测无法取得良好的成果。而子宫内膜基质细胞又称HESC作为胚胎植入重要的接受环境，在自然生理过程中，卵子或精子均不能单独引起子宫内膜的变化，只有在精卵结合并发育成胚胎，才能启动子宫内膜一系列的形态及分子响应，为胚胎种植做准备。这提示胚胎信号可以作为植入发生的起始信号，可能扮演着“导火索”的角色，主要功能并不是直接的效应作用，而是作用于母体子宫内膜，引起生物信号由“点”“线”“面”到“体”的全面响应。而且这种响应可能与BCM对应胚胎的质量及种植潜能密切相关。而现有技术中缺少一种利用BCM进行胚胎的质量评估的方法。
发明内容
本发明为了解决上述背景技术中缺少一种利用BCM进行胚胎的质量评估的方法的技术问题，提供能够有效进行胚胎质量评估的一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种培养基，包括胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素，所述胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素的质量比为1979:20:1。
本发明的有益效果是：上述培养基的营养成份能够很好的用于胚胎条件培养液的培养。胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂采用赛默飞官网订购的41400045型号的Insulin,Transferrin,SeleniumSolution(ITS-G),100X。胎牛血清蛋白采购来自上海信帆生物科技有限公司。上述培养基的制备方法为：取10g的Sigma-Aldrich中国官网上购买的Sigma，D2906-1L型粉末，补充1.5g碳酸氢钠，溶于纯净水后过滤取滤液，然后向滤液中添加1％浓度的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素配置为培养基。添加10％浓度的胎牛血清蛋白及1％浓度的青链霉素配置为完全培养基即所需要的培养基。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述胎牛血清蛋白的浓度为10％g/dl，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的浓度为1％g/dl，所述嘌呤霉素的浓度为500ng/mL。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的浓度能够让得到的培养基效果更好。
本发明还提供一种利用上述所述的培养基进行胚胎质量的评估方法，包括以下步骤：
A、胚胎培养与胚胎条件培养液的收集：取囊胚培养液微滴，取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养得到胚胎，所述胚胎在胚胎培养2天后按照10：(1～2)的体积比添加所述囊胚培养液微滴培养3天，得到胚胎条件培养液并于-70～-80℃下保藏3～10天；
B、解冻子宫内膜基质细胞：将冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于34～40℃下解冻后按照1：(3～5)的体积比加入所述培养基，接着在1000～1200r/min的转速下离心2～4min，弃去上清液后加入1ml所述培养基，重悬培养液得到重悬细胞液；
C、培养子宫内膜基质细胞：将步骤B中的重悬细胞液加入4.5～5.5ml所述培养基，然后将重悬细胞液中内的细胞按照十字混匀法均匀铺开，接着在37℃和5％CO2的培养箱中孕育4～6个小时，再然后弃去培养液且用PBS冲洗后加入4.5～5.5ml所述培养基，再接着放入到37℃和5％CO2的培养箱中孕育2～3天后用胰蛋白酶进行消化，并培养于48孔细胞培养板中，所述48孔细胞培养板中每孔细胞数为5×104个，置于37℃和5％CO2的培养箱中培养至培养板中细胞汇合度达到90％以上，更换为胎牛血清蛋白含量为2％的完全培养液；
D、添加胚胎条件培养液：将步骤C中的所述完全培养液弃去，用PBS冲洗1～2次后每个孔均加入179～180μL的所述培养基和18～22μL的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合液，接着静置46～49h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白；
E、蛋白检测：将步骤D中的细胞上清液用采用激光扫描仪InnoScan300扫描信号，得到子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量。
本发明的有益效果：由于不同类型不同丰度信号分子刺激产生不同的细胞学响应，且信号传递过程中存在级联放大效应。即将胚胎条件培养液中未知的、低丰度的、检测困难的信号分子作用于重悬细胞液及子宫内膜基质细胞后，相当于初级信号经过逐级级联放大(Cascadeamplification)，翻译为可知的、高丰度的、容易检测的次级信号。所以胚胎条件培养液可以通过影响子宫内膜基质细胞的分泌活性，从而改变子宫内膜基质细胞的分泌蛋白种类。所以我们可以将含有不同胚胎分泌信号的胚胎条件培养液作为培养基添加剂添加至子宫内膜基质细胞的培养基中刺激子宫内膜基质细胞的发育，然后对子宫内膜基质细胞上清液中的细胞分泌蛋白采用激光扫描仪InnoScan300扫描信号，得到具体的细胞分泌蛋白的差异蛋白，从而对胚胎质量进行评估。本发明的评估方法十分的有效和准确，弥补了市面上的空白。受精卵和冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞均是现有的且来自深圳中山泌尿外科医院。
进一步，所述囊胚培养液微滴的制备方法为在培养皿中滴入25～30μl的培养液，接着在培养液中添加细胞培养油至细胞培养油覆盖所述培养液静置5天得到。
采用上述进一步方案的有益效果是，囊胚培养液微滴上的细胞培养油能够起到隔绝胚胎培养液与外界物理接触，同时气体可通过培养油输送至囊胚培养液。
进一步，取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养的具体步骤为：在静置培养的第一天，受精卵采用受精卵培养基，静置培养的第二天至第三天，受精卵采用卵裂期胚胎培养液，静置培养的第四天至第五天，受精卵采用囊胚培养液。
采用上述进一步方案的有益效果是，能够让受精卵顺利的形成胚胎。
进一步，在步骤A中，所述胚胎在胚胎培养2天后按照10：2的体积比囊胚培养液微滴中培养3天。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的比例能够让最后差异蛋白的检测更加准确从而更好的判断胚胎质量。
进一步，在步骤B中，将子宫内膜基质细胞于37℃下解冻后按照1：4的体积比加入所述培养基，接着在1000r/min的转速下离心3min。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的比例能够让最后差异蛋白的检测更加准确从而更好的判断胚胎质量。
进一步，在步骤C中，将步骤B中的重悬细胞液按照1：4的体积比加入培养基，在37℃和5％CO2的培养箱中孕育6个小时。
采用上述进一步方案的有益效果是，上述条件有利于更好的判断胚胎质量。
附图说明
图1为本发明子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白测试图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1、
一种培养基，包括胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素，所述胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素的质量比为1979:20:1。
可选的，所述胎牛血清蛋白的浓度为10％g/dl，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的浓度为1％g/dl，所述嘌呤霉素的浓度为500ng/mL。
一种利用上述所述的培养基进行胚胎质量的评估方法，包括以下步骤：
A、胚胎培养与胚胎条件培养液的收集：取30μL的优质囊胚的囊胚培养液微滴，取10g受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养得到胚胎，所述胚胎在胚胎培养2天后按照10：1的体积比添加所述囊胚培养液微滴培养3天，得到胚胎条件培养液并于-80℃下保藏3天；
B、解冻子宫内膜基质细胞：将10mg的冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于34℃下解冻后按照1：2的体积比加入所述培养基，接着在1000r/min的转速下离心2min，弃去上清液后加入1ml所述培养基，重悬培养液得到重悬细胞液；
C、培养子宫内膜基质细胞：将步骤B中的重悬细胞液加入4.5～5.5ml的所述培养基，然后将重悬细胞液中内的细胞按照十字混匀法均匀铺开，接着在37℃和5％CO2的培养箱中孕育6个小时，再然后弃去培养液且用PBS冲洗后4.5ml所述培养基，再接着放入到37℃和5％CO2的培养箱中孕育2天后用胰蛋白酶进行消化，并培养于48孔细胞培养板中，48孔细胞培养板中每孔细胞数为5×104个，置于37℃和5％CO2的培养箱中培养至培养板中细胞汇合度达到90％以上，更换为胎牛血清蛋白含量为2％的完全培养液；
D、添加胚胎条件培养液：将步骤C中的所述完全培养液弃去，用PBS冲洗2次后每个孔均加入180μL的所述培养基和20μL的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合液，接着静置48h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白；
E、蛋白检测：将步骤D中的细胞上清液用采用激光扫描仪InnoScan300扫描信号，得到子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量。
实施例2、
与实施例1不同是，在步骤A中，取30μL的无囊胚形成的囊胚培养液微滴。
实施例3、
与实施例1不同是，在步骤A中，取30μL的未培养过囊胚的囊胚培养液。
综合实施例1至实施例3，得到了如图1所示的子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白测试图。通过蛋白芯片检测培养优质囊胚的囊胚培养液微滴中IL-6含量，荧光信号值为1843.0；而无囊胚形成的囊胚培养液微滴检测IL-6的荧光信号值为1080.5；未培养过囊胚的囊胚培养液微滴检测IL-6的荧光信号值则为478.4。这表明不同囊胚质量的BCM诱导子宫内膜细胞分泌IL-6含量可作为胚胎质量评定的依据，成为一种新型的无创胚胎质量评定方法。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种培养基，其特征在于，包括胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素，所述胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素的质量比为1979:20:1。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述胎牛血清蛋白的浓度为10％g/dl，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的浓度为1％g/dl，所述嘌呤霉素的浓度为500ng/mL。
3.一种利用权利要求1或2所述的培养基进行胚胎质量的评估方法，其特征在于,包括以下步骤：
A、胚胎培养与胚胎条件培养液的收集：取囊胚培养液微滴，取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养得到胚胎，所述胚胎在胚胎培养2天后按照10：(1～2)的体积比添加所述囊胚培养液微滴培养3天，得到胚胎条件培养液并于-70～-80℃下保藏3～10天；
B、解冻子宫内膜基质细胞：将冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于34～40℃下解冻后按照1：(3～5)的体积比加入所述培养基，接着在1000～1200r/min的转速下离心2～4min，弃去上清液后加入1ml所述培养基，重悬培养液得到重悬细胞液；
C、培养子宫内膜基质细胞：将步骤B中的重悬细胞液加入4.5～5.5ml所述培养基，然后将重悬细胞液中内的细胞按照十字混匀法均匀铺开，接着在37℃和5％CO2的培养箱中孕育4～6个小时，再然后弃去培养液且用PBS冲洗后加入4.5～5.5ml所述培养基，再接着放入到37℃和5％CO2的培养箱中孕育2～3天后用胰蛋白酶进行消化，并培养于48孔细胞培养板中，所述48孔细胞培养板中每孔细胞数为5×104个，置于37℃和5％CO2的培养箱中培养至培养板中细胞汇合度达到90％以上，更换为胎牛血清蛋白含量为2％的完全培养液；
D、添加胚胎条件培养液：将步骤C中的所述完全培养液弃去，用PBS冲洗1～2次后每个孔均加入179～180μL的所述培养基和18～22μL的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合液，接着静置46～49h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白；
E、蛋白检测：将步骤D中的细胞上清液用采用激光扫描仪InnoScan 300扫描信号，得到子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量。
4.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法，其特征在于,所述囊胚培养液微滴的制备方法为在培养皿中滴入25～30μl的培养液，接着在培养液中添加细胞培养油至细胞培养油覆盖所述培养液静置1天得到。
5.根据权利要求5所述的胚胎质量的评估方法，其特征在于,取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养的具体步骤为：在静置培养的第一天，受精卵采用受精卵培养基，静置培养的第二天至第三天，受精卵采用卵裂期胚胎培养液，静置培养的第四天至第五天，受精卵采用囊胚培养液。
6.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法，其特征在于,在步骤A中，所述胚胎在胚胎培养2天后于25～30μl囊胚培养液微滴中培养3天。
7.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法，其特征在于,在步骤B中，将子宫内膜基质细胞于37℃下解冻后按照1：4的体积比加入所述培养基，接着在1000r/min的转速下离心3min，弃去上清液后加入1ml所述培养基得到重悬细胞液。
8.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法，其特征在于,在步骤C中，将步骤B中的重悬细胞液按照1：4的体积比加入培养基，在37℃和5％CO2的培养箱中孕育6个小时。
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