CN110684716A - 一种细胞添加剂的制备方法及其产品 - Google Patents

一种细胞添加剂的制备方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细胞添加剂的制备方法及其产品，涉及血脂异常相关疾病的体外细胞研究领域，该方法将高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀，充分振荡结合后，经过滤除菌即可得细胞添加剂产品。本发明提出的制备方法能够解决现有油酸或油酸钠配制过程中存在的溶剂毒性、溶解困难、易析出等技术问题，具有油酸或油酸钠浓度精确可控、产品稳定性好、易储存等优点，生产出的细胞添加剂属于即用型产品。

Description

一种细胞添加剂的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及血脂异常相关疾病的体外细胞研究领域，具体涉及一种细胞添加剂的制备方法及其产品。
背景技术
近年来，我国经济的发展促使居民膳食结构由低脂肪向高脂肪模式转变，据《中国居民营养与慢性病状况调查（2015年）》报道，中国成人血脂异常患病率高达39.9-40.8%。血脂异常主要表现为高甘油三酯和游离脂肪酸血症。在体外研究中，为了模拟高甘油三酯和游离脂肪酸血症，通常需要在细胞培养基中添加高浓度的游离脂肪酸。油酸（Oleic acid）是人体内含量最丰富的游离脂肪酸，占血浆游离脂肪酸总量的31%。油酸是一种单不饱和脂肪酸。正常情况下，人体血液中油酸的浓度维持在生理范围内，血脂异常患者血液中油酸浓度显著增高。油酸钠（Sodium oleate）是油酸的钠盐，同等摩尔浓度的油酸钠与油酸对体外培养的细胞产生相同的作用。因此，油酸或油酸钠被认为是体外模拟高甘油三酯和游离脂肪酸血症的理想试剂。
油酸呈液态，易溶于乙醇等有机溶剂中，但不溶于水；油酸钠呈固态，也难溶于水，两者均无法直接用于血脂异常相关疾病的体外研究。目前，市场上尚无即用型油酸或油酸钠细胞添加剂，加上配制方法不当，导致很多从事血脂异常相关疾病研究的科研工作者无法顺利开展体外细胞实验。
目前，有人采用甲醇、乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂，盐酸或硫酸、氢氧化钠溶液等强酸强碱类溶剂溶解油酸或油酸钠，然而，这些溶剂既对细胞具有毒性，也不能有效溶解油酸或油酸钠。此外，有人利用牛血清白蛋白（BSA）可与自由脂肪酸结合的特点，采用高浓度的BSA溶液配制油酸或油酸钠。该方法的优点是溶剂本身对细胞无毒性，但仍存在以下问题：1.对BSA未进行甄选，使用未脱脂的BSA，导致其结合力不足，且油酸或油酸钠的精确浓度不可控；2.未掌握溶解油酸或油酸钠的合适条件，不能充分溶解自由脂肪酸；3.配制的BSA-自由脂肪酸不符合生理情况下的摩尔比例，很快有固体析出，不能有效发挥脂毒性。
发明内容
有鉴于此，本专利的目的在于针对当前本领域的技术空白，提供一种即用型油酸、油酸钠细胞添加剂及其制备方法，该配制方法能够解决现有油酸或油酸钠配制过程中存在的溶剂毒性、溶解困难、易析出等技术问题，具有油酸或油酸钠浓度精确可控、产品稳定性好、使用方便、易储存等优点。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种细胞添加剂的制备方法，其特征在于，将高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀，充分振荡结合后，经过滤除菌即可得细胞添加剂，其中：所述油酸组分溶液的浓度为0.15-36mmol/L，所述BSA组分溶液的浓度为0.025-6 mmol/L。
进一步的，所述高温溶解的油酸组分溶液的配置方法包括如下步骤：将油酸组分倒入缓冲液中并置于70-100℃的温度下加热溶解，待油酸组分完全溶解于缓冲液后，保持70-100℃的高温，得高温溶解的油酸组分溶液。
进一步的，所述将油酸组分倒入缓冲液中并置于70-100℃的温度下加热溶解包括：将油酸组分倒入盛有缓冲液的容器中并置于70-100℃水浴锅中加热溶解，其中：所述缓冲液的PH为7.2-7.5、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种。
进一步的，所述常温溶解的BSA组分溶液的配置方法包括如下步骤：在20-35℃的温度环境下，将BSA组分倒入缓冲液中溶解，待BSA组分完全溶解于缓冲液后，得常温溶解的BSA组分溶液。
进一步的，所述将高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀包括：采用移液器将70-100℃的高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀。
进一步的，所述振荡混匀包括采用涡旋振荡器、磁力搅拌器或翻转振荡器振荡混匀。
进一步的，所述过滤除菌包括如下步骤：在超净台中使用注射器和滤器针对充分振荡结合的细胞添加剂过滤除菌。
进一步的，所述油酸组分包括油酸、和或油酸钠。
进一步的，所述BSA组分包括脱脂BSA、无脂BSA、或低脂BSA中的一种。
本发明的一种细胞添加剂的制备方法具有以下有益效果：
（1）将牛血清白蛋白（BSA）应用于细胞添加剂的配置方法中。制备方法采用0.025-6mmol/L（即质量体积比0.2-40克/100毫升）的BSA组分溶液作为溶剂，既保证了对油酸或油酸钠的充分溶解，也避免了溶剂的直接细胞毒性。解决了现有溶解方法中存在毒性的技术问题，现有方案采用甲醇、乙醇、二甲基亚砜、硫酸、盐酸、氢氧化钠溶液等溶剂既对细胞具有毒性，也不能有效溶解脂肪酸及其钠盐。
（2）采用BSA组分优化BSA-油酸、BSA-油酸钠的结合策略。BSA可以和脂肪酸结合形成脂蛋白，因为未脱脂BSA本身结合了一定量的脂肪酸，不仅导致其与油酸或油酸钠的结合能力下降，而且会导致油酸或油酸钠的真实浓度无法精确定量。该方法中的BSA组分采用脱脂BSA、无脂BSA、或低脂BSA中的一种，既增强了BSA与油酸或油酸钠的结合能力，也保证了对脂毒性的精确定量。
（3）高温溶解油酸组分，有效提升溶解度。该方法中油酸或油酸钠具有在高温（70-100℃）条件下可溶于水、且不变性的特点。该方法利用油酸或油酸钠的这一特点，通过将高温的油酸或油酸钠溶液逐步加入的BSA组分溶液中，成功克服了油酸或油酸钠难溶于水性溶剂的难点，将油酸或油酸钠的浓度提高至36 mmol/L。
一种如上述方法制备的细胞添加剂。
本发明的一种细胞添加剂具有以下有益效果：
该细胞添加剂属于即用型产品，广泛适用于血脂异常相关疾病的体外细胞研究，例如2型糖尿病、肥胖症、脂肪肝等体外细胞研究，该细胞添加剂具有无毒性、无固体析出、浓度精确、易储存等优点，能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
附图说明
图1为本发明的一种细胞添加剂的制备方法的流程示意图；
图2为本发明的细胞添加剂诱导肝脏细胞脂滴形成的第一实验结果图；
图3为本发明的细胞添加剂诱导肝脏细胞脂滴形成的第二实验结果图；
图4为本发明的细胞添加剂诱导肝脏细胞脂滴形成的第三实验结果图；
图5为本发明的细胞添加剂诱导肝脏细胞脂滴形成的第四实验结果图。
具体实施方式
本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例一
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸，BSA组分溶液溶解含有脱脂BSA。
其中，配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：取缓冲液于玻璃离心管中，采用移液器吸取油酸倒入玻璃离心管中，置于70-100℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸完全溶解于缓冲液后，保持70-100℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：在常温情况下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取脱脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至脱脂BSA完全溶解于缓冲液中。
需要说明的是，缓冲液的PH为7.2-7.5、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，缓冲液不能为甲醇、乙醇、二甲基亚砜有机溶剂或酸、碱溶液。本实施例选用磷酸盐缓冲液。本实施例中，常温情况是指20-35℃的温度环境。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸充分与脱脂BSA结合。保持油酸组分溶液于70-100℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器、磁力搅拌器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.025-6mmol/L（即质量体积比0.2-40克/100毫升），油酸组分溶液的浓度为0.15-36mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸0.15-36mmol/L的即用型油酸细胞添加剂。使用含相同浓度的脱脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例二
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸钠，BSA组分溶液溶解含有无脂BSA。
其中，配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：取缓冲液于玻璃离心管中，采用分析天平称取油酸钠，倒入玻璃离心管中，置于70-100℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸钠完全溶解于缓冲液后，保持70-100℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：在常温情况下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取无脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至无脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.2-7.5、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用磷酸盐缓冲液。本实施例中，常温情况是指20-35℃的温度环境。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸钠充分与无脂BSA结合。保持油酸组分溶液于70-100℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.025-6mmol/L（即质量体积比0.2-40克/100毫升），油酸组分溶液的浓度为0.15-36mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸钠0.15-36mmol/L的即用型油酸钠细胞添加剂。使用含相同浓度的无脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例三
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸和油酸钠，BSA组分溶液溶解含有脱脂BSA。
其中，配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：取缓冲液于玻璃离心管中，首先采用移液器吸取油酸倒入玻璃离心管中，再采用分析天平称取油酸钠倒入玻璃离心管中，置于80℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸钠完全溶解于缓冲液后，保持80℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
需要说明的是，上述油酸和油酸钠无比例对应关系，目的是要保证步骤二中充分混合后的油酸组分溶液的浓度为0.15-36mmol/L。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：在常温情况下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取脱脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至脱脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.3、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用磷酸盐缓冲液。本实施例中，常温情况是指20-30℃的温度环境。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸钠充分与脱脂BSA结合。保持油酸组分溶液于80℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.025-6mmol/L，油酸组分溶液的浓度为0.15-36mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸钠0.15-36mmol/L的即用型油酸钠细胞添加剂。使用含相同浓度的脱脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例四
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸和油酸钠，BSA组分溶液溶解含有脱脂BSA。
其中，配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：取缓冲液于玻璃离心管中，首先采用移液器吸取油酸倒入玻璃离心管中，再采用分析天平称取油酸钠倒入玻璃离心管中，置于80℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸钠完全溶解于缓冲液后，保持80℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
需要说明的是，上述油酸和油酸钠无比例对应关系，目的是要保证步骤二中充分混合后的油酸组分溶液的浓度为0.3-33mmol/L。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：在常温情况下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取脱脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至脱脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.3、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用磷酸盐缓冲液。本实施例中，常温情况是指20-30℃的温度环境。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸钠充分与脱脂BSA结合。保持油酸组分溶液于80℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.05-5.5mmol/L，油酸组分溶液的浓度为0.3-33mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸钠0.3-33mmol/L的即用型油酸钠细胞添加剂。使用含相同浓度的脱脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例五
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸和油酸钠，BSA组分溶液溶解含有脱脂BSA。
其中，配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：取缓冲液于玻璃离心管中，首先采用移液器吸取油酸倒入玻璃离心管中，再采用分析天平称取油酸钠倒入玻璃离心管中，置于80℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸钠完全溶解于缓冲液后，保持80℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
需要说明的是，上述油酸和油酸钠无比例对应关系，目的是要保证步骤二中充分混合后的油酸组分溶液的浓度为1.2-28.5mmol/L。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：在常温情况下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取脱脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至脱脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.3、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用磷酸盐缓冲液。本实施例中，常温情况是指20-30℃的温度环境。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸钠充分与脱脂BSA结合。保持油酸组分溶液于80℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.2-4.75mmol/L，油酸组分溶液的浓度为1.2-28.5mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸钠1.2-28.5mmol/L的即用型油酸钠细胞添加剂。使用含相同浓度的脱脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例六
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸钠，BSA组分溶液溶解含有脱脂BSA。
配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：
取缓冲液于玻璃离心管中，采用分析天平称取油酸钠，倒入玻璃离心管中，置于90℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸钠完全溶解于缓冲液后，保持90℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：
在20-30℃的温度环境下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取脱脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至脱脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.5、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用磷酸盐缓冲液。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸钠充分与脱脂BSA结合。保持油酸组分溶液于90℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.025-4mmol/L，油酸组分溶液的浓度为0.15-25mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸钠0.15-25mmol/L的即用型油酸钠细胞添加剂。使用含相同浓度的脱脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例七
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸，BSA组分溶液溶解含有无脂BSA。
配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：
取缓冲液于玻璃离心管中，采用分析天平称取油酸，倒入玻璃离心管中，置于80℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸完全溶解于缓冲液后，保持80℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：
在20-25℃的温度环境下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取无脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至无脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.4、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用细胞培养基。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸充分与无脂BSA结合。保持油酸组分溶液于80℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是1-6mmol/L，油酸组分溶液的浓度为6-36mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸6-36mmol/L的即用型油酸细胞添加剂。使用含相同浓度的无脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
实施例八
一种新型细胞添的制备方法，具体步骤如下：
步骤一）
分别配置高温溶解的油酸组分溶液和常温溶解的BSA组分溶液，配置顺序不分先后。其中，油酸组分溶液含有油酸钠，BSA组分溶液溶解含有无脂BSA。
配置高温溶解的油酸组分溶液包括如下具体流程：
取缓冲液于玻璃离心管中，采用移液器吸取油酸倒入玻璃离心管中，置于88℃水浴锅中待其全部溶解，待油酸钠完全溶解于缓冲液后，保持88℃的高温。需要说明的是，采用水浴锅或其他金属浴等加热系统均可以。
配置常温溶解的BSA组分溶液包括如下具体流程：
在25-32℃的温度环境下，取缓冲液于玻璃离心管中，在分析天平上称取无脂BSA，倒入缓冲液中充分溶解，直至无脂BSA完全溶解于缓冲液中。需要说明的是，缓冲液的PH为7.2、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种，本实施例选用生理盐水。
步骤二）
使用移液器迅速将高温溶解的油酸组分溶液转移至BSA组分溶液中，并置于涡旋振荡器振荡混匀，使油酸钠充分与无脂BSA结合。保持油酸组分溶液于88℃水浴锅中、并重复上述步骤，直至油酸组分溶液全部转移至BSA组分溶液中。需要说明的是，涡旋振荡器也可以是翻转振荡器或其他搅拌装置。
需要说明的是，步骤二中两者混合后，需要保证BSA组分溶液的终浓度是0.1-5mmol/L，油酸组分溶液的浓度为1-30mmol/L。
步骤三）
待混合液自然冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得含油酸钠1-30mmol/L的即用型油酸细胞添加剂。使用含相同浓度的无脂BSA的缓冲液作为对照。
配置完成的细胞添加剂能够在2-8℃的环境下保存6-8个月。
基于上述实施例1至8描述的制备方法和细胞添加剂诱导肝脏细胞脂滴形成，验证本专利配制的油酸或油酸钠细胞添加剂对HepG2人肝癌细胞脂滴形成的影响。
如图2、图3、图4和图5所示，油酸或油酸钠细胞添加剂诱导脂肪肝细胞模型。其中，图2至图5为HepG2细胞经油红O染色后的照片，位于细胞浆中的油红O染色阳性、圆形透亮沉积物即为脂滴。图1为空白对照；图2为溶剂对照；图3为500µM油酸钠处理2天；图4为500µM油酸钠处理3天。
实验中，分别给予HepG2人肝癌细胞空白对照（图2）、BSA溶剂对照（图3）、500µM油酸钠（图4-图5）2-3天后，进行油红O染色后，采用显微镜拍照。结果显示，与空白对照相比，单纯BSA对HepG2细胞脂滴形成无影响，500µM油酸钠处理2-3天显著增加了HepG2细胞中脂滴的生成。该研究证明本专利配制的细胞添加剂成功诱导了脂肪肝细胞模型。
本专利提供一种即用型油酸、油酸钠细胞添加剂及其制备方法，该配制方法能够解决现有油酸或油酸钠配制过程中存在的溶剂毒性、溶解困难、易析出等技术问题，具有油酸或油酸钠浓度精确可控、产品稳定性好、使用方便等优点。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种细胞添加剂的制备方法，其特征在于，将高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀，充分振荡结合后，经过滤除菌即可得细胞添加剂，其中：所述油酸组分溶液的浓度为0.15-36mmol/L，所述BSA组分溶液的浓度为0.025-6 mmol/L。
2.根据权利要求1所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述高温溶解的油酸组分溶液的配置方法包括如下步骤：将油酸组分倒入缓冲液中并置于70-100℃的温度下加热溶解，待油酸组分完全溶解于缓冲液后，保持70-100℃的高温，得高温溶解的油酸组分溶液。
3.根据权利要求2所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述将油酸组分倒入缓冲液中并置于70-100℃的温度下加热溶解包括：将油酸组分倒入盛有缓冲液的容器中并置于70-100℃水浴锅中加热溶解，其中：所述缓冲液的PH为7.2-7.5、且包括磷酸盐缓冲液、水、生理盐水、细胞培养基中的一种。
4.根据权利要求1所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述常温溶解的BSA组分溶液的配置方法包括如下步骤：在20-35℃的温度环境下，将BSA组分倒入缓冲液中溶解，待BSA组分完全溶解于缓冲液后，得常温溶解的BSA组分溶液。
5.根据权利要求1所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述将高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀包括：采用移液器将70-100℃的高温溶解的油酸组分溶液加入常温溶解的BSA组分溶液中振荡混匀。
6.根据权利要求5所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述振荡混匀包括采用涡旋振荡器、磁力搅拌器或翻转振荡器振荡混匀。
7.根据权利要求1所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述过滤除菌包括如下步骤：在超净台中使用注射器和滤器针对充分振荡结合的细胞添加剂过滤除菌。
8.根据权利要求1所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述油酸组分包括油酸、和或油酸钠。
9.根据权利要求1所述的细胞添加剂的制备方法，其特征在于，所述BSA组分包括脱脂BSA、无脂BSA、或低脂BSA中的一种。
10.根据权利要求1至9任意一项所述的方法制备的细胞添加剂。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101490243A (zh) * 2006-07-12 2009-07-22 谢菲尔德大学 细胞生长培养基

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101490243A (zh) * 2006-07-12 2009-07-22 谢菲尔德大学 细胞生长培养基

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOEL E. ULLOTH等: "Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells", vol. 85, pages 655 - 668 *
NOUR ALSABEEH等: "Cell culture models of fatty acid overload: Problems and solutions", vol. 1863, no. 2, pages 143 - 151, XP085326687, DOI: 10.1016/j.bbalip.2017.11.006 *
吴丹等: "染料木黄酮对脂肪变HepG2细胞甘油三酯水平和Lipin1表达的影响", 《营养学报》 *
吴丹等: "染料木黄酮对脂肪变HepG2细胞甘油三酯水平和Lipin1表达的影响", 《营养学报》, no. 04, 31 August 2013 (2013-08-31) *
张强等: "灵芝提取物及其含药血清对胰岛β细胞的影响", 《海南医学》 *
张强等: "灵芝提取物及其含药血清对胰岛β细胞的影响", 《海南医学》, no. 09, 10 May 2018 (2018-05-10) *
曹宁等: "乌药叶总黄酮对高脂血症脂肪肝小鼠模型的降脂作用", 《中药新药与临床药理》 *
曹宁等: "乌药叶总黄酮对高脂血症脂肪肝小鼠模型的降脂作用", 《中药新药与临床药理》, no. 02, 25 March 2011 (2011-03-25) *
杨壮群等: "脂质体鱼肝油酸钠对人血管瘤内皮细胞的作用", 《中国口腔颌面外科杂志》 *
杨壮群等: "脂质体鱼肝油酸钠对人血管瘤内皮细胞的作用", 《中国口腔颌面外科杂志》, no. 06, 8 November 2007 (2007-11-08) *
牟波等: "链佐星、细胞因子及游离脂肪酸诱导β-TC3细胞凋亡", 《复旦学报(医学版)》 *
牟波等: "链佐星、细胞因子及游离脂肪酸诱导β-TC3细胞凋亡", 《复旦学报(医学版)》, no. 04, 15 July 2006 (2006-07-15) *
王兴国: "《油料科学原理 第2版》", 31 August 2017, 中国轻工业出版社, pages: 81 *
王冰等: "胰岛素-PI3K/Akt通路在高游离脂肪酸所致的胰岛β细胞分泌功能紊乱中的作用", 《中华临床医师杂志(电子版)》 *
王冰等: "胰岛素-PI3K/Akt通路在高游离脂肪酸所致的胰岛β细胞分泌功能紊乱中的作用", 《中华临床医师杂志(电子版)》, no. 14, 15 July 2012 (2012-07-15) *
王春晖等: "软脂酸对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞的作用及机制", 《世界华人消化杂志》, no. 19, 18 July 2011 (2011-07-18) *
郑萍等: "热应激对体外仔猪肝细胞AMPK活性及脂质代谢产物的影响", 《营养学报》 *
郑萍等: "热应激对体外仔猪肝细胞AMPK活性及脂质代谢产物的影响", 《营养学报》, no. 01, 25 February 2007 (2007-02-25), pages 24 *
顾翼东 等: "化学词典", 上海辞书出版社, pages: 542 *
马欢等: "Mibefradil通过下调FoxO1表达改善HepG2细胞的胰岛素抵抗", 《第三军医大学学报》 *
马欢等: "Mibefradil通过下调FoxO1表达改善HepG2细胞的胰岛素抵抗", 《第三军医大学学报》, no. 20, 31 December 2017 (2017-12-31) *

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