CN110664757A - 纳米晶滴眼剂、其制备方法及其应用 - Google Patents

纳米晶滴眼剂、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及滴眼剂领域，且特别涉及一种纳米晶滴眼剂、其制备方法及其应用。其包含双溶性大分子、单溶性大分子以及作用于血管内皮生长因子受体和/或血小板生长因子受体的靶向药物。双溶性大分子和单溶性大分子相互作用包裹靶向药物以形成纳米晶，并维持纳米晶稳定。其能够通过特殊的胞间间隙渗透和/或胞饮方式快速穿过血眼屏障进入玻璃体，并通过被动靶向和附着，达到有效治疗效果，同时，该药物使用方便。

Description

纳米晶滴眼剂、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及滴眼剂领域，具体涉及一种纳米晶滴眼剂、其制备方法及其应用。
背景技术
黄斑变性通常分二类，一类为少年黄斑变性又称先天性黄斑变性，另一类是年龄相关性黄斑变性(AMD)。在AMD等眼科疾病中，视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium，RPE)及脉络膜组织可分泌并调节VEGF、PDGF和PlGF等生长因子及其相应受体促进血管新生，而过量表达则导致血管通透性增加，产生AMD、DME、DR、视网膜静脉阻塞黄斑水肿(RVO)，近视性脉络膜新生血管(mCNV)、病理性近视(PM)、眼表新生血管疾病和新生血管性青光眼(neovascular glaucoma，NVG)等眼科疾病。实验和临床研究证明抑制/调节这些生长因子可以治疗上述与血管新生相关的眼科疾病(张梦泽等，2016，血管新生的分子机制与相关疾病；Gaynes BI,et al:，Expert Opin Drug Saf,2004,3(4):345；Michels S.etal:，Invest Opthalmol Vis Sci,2006,479(1):371)。
现有的眼液滴入方法使大部分药物在结膜的下穹隆中，借助毛细血管、扩散或眨眼等进入角膜前的薄膜层，由此渗入角膜。而眼组织要想获得良好的药物浓度，则药物必须顺利通过血眼屏障，但是角膜上皮细胞、血房水屏障(在睫状体)和血视网膜屏障阻碍了药物的穿透，降低了药物的吸收率，继而降低了药物的治疗效果。
目前治疗湿性黄斑变性的一线药物是血管内皮生长因子(VEGF)受体拮抗剂，如雷珠单抗(Ranibizumab),贝伐单抗(bevacizumab),阿柏西普(Aflibercept)和康柏西普(conbercept)等，都是大分子生物药需要玻璃体注射，但需要长期注射给药。眼球注射有较大风险，玻璃体注射存在潜在的眼组织损伤、视网膜脱离、出血、眼内压升高、眼内炎的风险。这类药物常见副作用有血压升高、血管性死亡或中风(HATAM.et al.,RETINA 2017，37:1320)。为了减少注射次数，一次注射高剂量药物，但足够高药物浓度会影响血液中正常的VEGF水平,尤其是对治疗高危的血管疾病时要认真考虑到抗VEGF药物的总暴露量。一项包含四个临床研究的汇萃分析指出，与手术或激光治疗相比较，两年内每月给DME病人注射阿柏西普或0.5mg雷珠单抗显著增加了死亡、血管性死亡或中风风险(JAMAOphthalmol.2016；134(1):21)。
玻璃体注射给药必须在有资质的医院由训练有素的医务人员执行，治疗和检查方法复杂，治疗成本高，患者经济负担重，病人顺应性差，影响长期治疗效果。这些眼疾者多为老年人，经常做眼球玻璃体注射，不仅加重了患者经济负担，还可能增加眼内炎等不良反应的风险；对于老年患者治疗不方便，并有安全隐患。
全球许多新药研发机构都在努力尝试开发不需要玻璃体注射治疗眼底疾病的新药。在美国开展的鲨烯胺滴眼液(OHR-102，Squalamine Eye Drop)治疗湿性AMD的临床研究，在早期的临床研究表现出一定疗效，但其临床三期没有达到预期目的(RetinalPhysician,Issue:Jan/Feb 2018)。在美国和中国开展的口服一种酪胺酸激酶抑制剂Vorolanib(代号X-82，CM082)治疗湿性AMD的临床研究，早期临床剂量爬坡试验(口服50-300mg/天)观察到X-82可以维持或对参试者的视力有所改善(Jackson等，JAMAOphthalmol.2017；135:761)，但长期服用抗癌药物可能增加病人系统毒副作用风险。阮谭等将替尼类药物制成滴眼液仅用于治疗眼表血管新生相关疾病，如翼状胬肉、在兔眼缝线模型能抑制动物眼表新生血管增长，并未对眼底血管新生相关疾病进行研究。
发明内容
眼球结构很特殊，分为前段和后段，眼前段即眼表有泪液，眼球前表面有泪膜覆盖，由脂质层、水样层和粘蛋白层组成。角膜上皮层和内皮层均有丰富的类脂物；需要药物既要渗入角膜的水性基质层、继而又要渗透通过油性脂质层，才有可能到达眼底；而能解离的药物难以透过完整的角膜。要做到使药物活性成分(API)同时通过水相和油相这两种极性相反的液态到达玻璃体是非常大的挑战。能将药物以滴眼给药方式输送到眼后段在玻璃体吸收并治疗眼底血管新生相关疾病的尚未见报道。
本发明根据眼球的特殊结构以及药物要通过滴眼途径到达眼底所要克服的障碍，设计开发一种特殊的新型纳米晶滴眼剂，通过严格控制双溶性大分子、单溶性大分子及靶向药物的种类、质量比及制备工艺，使制备得到的滴眼剂由于双溶性大分子的亲水性使其对眼表水相有亲和性，在接触眼表后由于脂溶性比较好的靶向药物对眼前段脂相有亲和力，有利于渗透进入眼底玻璃体病灶部位。通过双溶性大分子和单溶性大分子的协同作用，克服了眼表水层对不溶于水(脂溶性)的药物的排斥，该滴眼剂一但附着在眼表上，药物纳米晶微粒破裂，脂溶性药物在大分子物质的帮助下进入眼表脂质层，就逐步进入眼后段。药物纳米晶颗粒体积小也有利于渗透达到眼后段。选用替尼类激酶抑制剂还考虑到它们是小分子药物，对组织渗透性比生物大分子药物更容易。所选的大分子辅料有较好的生物相容性；对API有助溶作用，也可增加药物微粒在眼组织的渗透性，有利于API进入眼后段。
有鉴于此，本发明选用脂溶性较高的替尼类做为API；选取不止一种性质的辅料，即双溶性大分子和单溶性大分子以期达到和API有较好的相溶性，在介质中做物理分散时，能形成外表亲水的，而核心则以API为主的亲脂的纳米颗粒。使用既溶于水又能溶于有机相的双溶性大分子，加上单溶性大分子做为辅料可使难溶于水的API制备成纳米晶的水溶液。在滴眼时不被泪液排斥，当纳米晶微粒接触到眼表层后其中的API附着到眼表的脂质层，由此经渗透和/或胞饮等方式进入眼底。
本发明的目的之一在于提供一种纳米晶滴眼剂，其能够通过特殊的胞间间隙渗透和/或胞饮方式快速穿过血眼屏障进入玻璃体，并通过被动靶向和附着，达到有效治疗效果，同时，该药物使用方便。
本发明的目的之二在于提供一种纳米晶滴眼剂的制备方法，其方法操作简单、反应条件温和，能够快速制备得到纳米晶滴眼剂。
本发明的目的之三在于提供一种纳米晶滴眼剂的应用，其扩大了该滴眼剂在眼底疾病治疗的使用范围。
为达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种纳米晶滴眼剂，其包含双溶性大分子、单溶性大分子以及作用于血管内皮生长因子受体和/或血小板生长因子受体的靶向药物；
双溶性大分子和单溶性大分子相互作用包裹靶向药物以形成纳米晶，并维持纳米晶稳定。
双溶性大分子指的是同时包含亲水基团和亲脂基团的大分子稳定剂，继而使得双溶性大分子既可以溶解在水中又可以溶解在有机溶剂中。
具体地，双溶性大分子为表面活性剂，更优选为泊洛沙姆、吐温、十二烷基酸钠类化合物、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)和聚乙二醇类化合物中的任意一种或至少两种；
更优选，十二烷基酸钠类化合物为十二烷基磺酸钠和十二烷基硫酸钠；
聚乙二醇类化合物为PEG4000、PEG5000或PEG6000。
双溶性大分子在本发明中不仅仅是与单溶性大分子相互作用包裹，同时起到稳定剂的作用，防止纳米晶滴眼剂沉降或生长，继而保证药物的治疗效果。
而单溶性大分子指的是包含亲水基团或亲脂基团的大分子助悬、助溶剂，继而使得单溶性大分子既可以溶解在水中或者可以溶解在有机溶剂中。
具体地，单溶性大分子为淀粉类化合物、纤维素类化合物或者聚羧酸酯类化合物中的任意一种或者至少两种；
更优选，纤维素类化合物为壳聚糖、透明质酸、甲基纤维素(MC)、羟甲基纤维素(CMC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中的任意一种或至少两种；
淀粉类化合物包括羧甲基淀粉钠、直链淀粉和糊精的任意一种或至少两种；
聚羧酸酯类化合物为PLA、PGA和PLGA中的任意一种或至少两种。
单溶性大分子不仅仅是构成包裹药物的一部分，同时，还起到助悬的作用，继而进一步提升药物的稳定性，同时保证药物的治疗效果。
需要说明的是，本发明实施例中的亲水基体包含但不限于羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基、季铵基、醚键、羟基、羧酸酯等，亲脂基团包含但不限于脂烃基、芳烃基、高级脂肪羟酰基和烷氧羰基。
单溶性大分子和双溶性大分子相互作用不仅仅包裹药物，同时，提升药物的稳定性，防止药物沉降或生长。
进一步地，双溶性大分子与单溶性大分子的质量比为1-5：1，优选为1-2：1。采用上述比例能够保证双溶性大分子和单溶性大分子相互作用对药物进行良好地包裹，同时，有效防止纳米晶沉降或生长，且保证纳米晶能够有效地被吸收。
而本发明采用的药物不仅可以单独作用于血管内皮生长因子受体或者血小板生长因子受体的靶向药物也可以采用同时作用于血管内皮生长因子受体和血小板生长因子受体的靶向药物，继而提升药物的治疗效果，进一步提升眼部疾病的治疗效果，降低副作用。
进一步地，靶向药物为酪氨酸激酶抑制剂类药物；优选，酪氨酸激酶抑制剂类药物为替尼类药物，优选为阿西替尼(Axitinib)、司马沙尼(Semaxanib)、索拉菲尼(sorafenib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)和舒尼替尼(Sunitinib)中的任意一种。采用替尼类药物能够进一步提升纳米晶滴眼剂的治疗效果。本发明实施例仅例举了部分替尼类药物，其他替尼类药物及它们的可作为药物的盐类也可以作为原料药使用。
进一步地，双溶性大分子与靶向药物的质量比为2-12:1，优选为6-10:1；采用上述比例能够保证纳米晶滴眼剂内有适宜的药物浓度，继而保证米晶滴眼剂的治疗效果，同时保证双溶性大分子和单溶性大分子对靶向药物的包裹效果，继而保证药物的吸收率。
进一步地，靶向药物在纳米晶滴眼剂中的浓度为0.04-2mg/mL，若靶向药物浓度含量过高，可能会增加纳米晶滴眼剂的副作用；而若浓度过低则不能产生良好地治疗效果。
进一步地，纳米晶滴眼剂中纳米晶的粒径为200-1000纳米，优选为，300-800纳米，为了保证纳米晶滴眼剂中纳米晶的稳定，需要控制纳米晶的粒径，若粒径过大，则没有纳米药物特殊的渗透作用，降低药效；粒径过小，药物容易聚集，也容易发生沉降，在上述范围内，药物不易聚集发生沉降。粒径指的是平均粒径或者大部分纳米晶的粒径，在纳米晶滴眼剂中可能也存在粒径介于1-3微米范围的亚微米晶。
本发明还提供了一种纳米晶滴眼剂的制备方法，包括以下步骤：
将双溶性大分子、单溶性大分子和靶向药物混合后降低药物粒径以形成稳定被包裹的纳米晶。
具体地，首先，将双溶性大分子和单溶性大分子混合以形成混合溶液，具体地，将双溶性大分子和单溶性大分子分散在水溶液中得到混合溶液，而后将混合溶液与靶向药物混合以形成初悬液；
而后对初悬液进行研磨(或高压均质)，以降低初悬液中物质的粒径，并保证包裹效果，更利于药物通过胞间间隙渗透和/或胞饮方式穿过血眼屏障进入玻璃体，继而提升药物的利用率和治疗效果。
研磨是在0℃～5℃条件下以300-500rpm快速研磨1-3h，研磨采用的容器为氧化锆材质的密封杯子，研磨珠子材料为氧化锆球形珠子，粒径为0.1～0.2mm或0.3～0.4mm左右。
需要说明的是，除了本发明实施例提供地通过研磨降低药物的粒径，还可以采用现有技术中的其他方式降低药物粒径，例如高压均质、机械剪切等。
本发明还提供了一种纳米晶滴眼剂在制备治疗眼部新生血管疾病药物中的应用。
所述眼部新生血管疾病包括眼底新生血管疾病和眼表新生血管疾病；
优选地，所述眼底新生血管疾病包括年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞黄斑水肿(RVO)、中央视网膜静脉阻塞(CRVO)、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)或继发于病理性近视(PM)的脉络膜新生血管(pmCNV)引起的视力下降、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma，NVG)、眼肿瘤、角膜移植、角膜新生血管、眼表新生血管和翼状胬肉中的任意一种。
优选地，所述眼表新生血管疾病包括病毒性角膜炎、物理损伤和/或化学损伤导致角膜新生血管、对翼状胬肉并发的角膜新生血管、角膜移植排斥性角膜新生血管以及角膜干细胞缺乏症中的任意一种。
需要说明的是，本发明实施例提供的纳米晶滴眼剂的应用不限于制备治疗上述眼表新生血管疾病和眼底新生血管疾病，现有技术中的其他眼部新生血管疾病也可采用本发明实施例的纳米晶滴眼剂治疗。
动物玻璃体吸收实验证明本发明的药物有效剂量能通过血眼屏障到达眼底玻璃体，在多数情况下滴眼后30-60分钟在动物玻璃体的浓度即达到最大吸收。
动物药效实验采用了经典的动物眼激光光凝血管新生(CNV)模型，实验结果证明了本发明的药物能有效抑制动物眼底血管新生。
本发明的有益效果在于：本发明的纳米晶滴眼剂通过采用靶向药物作用于VEGFR和/或PDGFR，保证其对眼部新生血管疾病的治疗效果，通过双溶性大分子和单溶性大分子相互作用，可以包裹药物，防止药物聚集，保证药物的稳定性；同时通过特殊的胞间间隙渗透和/或胞饮等方式穿过血眼屏障进入玻璃体，继而提升药物的利用率，并通过被动靶向和附着，提升药物的治疗效果。另外，本发明的纳米晶滴眼剂对眼表水相有亲和性，在接触眼表后又对脂相有亲和力，有利于渗透进入眼底玻璃体病灶部位。药物纳米晶颗粒小也有利于渗透达到眼后段。选用替尼类激酶抑制剂还考虑到它们是小分子药物，对组织渗透性比生物大分子药物更容易。所选的大分子辅料有较好的生物相容性；对API有助溶作用，也可增加药物微粒在眼组织的渗透性，有利于API进入眼后段。最后，药物利用率提升，使用的药物量相对减少，降低药物的系统毒副作用。进一步地将药物制成滴眼剂，降低治疗成本，给药方便，扩大其应用范围。
本发明药物的新型滴眼剂解决药物由不能用滴眼的方式输送到眼后段的技术瓶颈，可避免玻璃体注射的风险，提高了病人治疗的顺应性，提高治疗效果，降低了治疗成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1的纳米晶滴眼剂的药物的SEM表征图。
图2为实施例2的纳米晶滴眼剂的药物的SEM表征图。
图3为实施例3的纳米晶滴眼剂的药物的SEM表征图。
图4为实施例4的纳米晶滴眼剂的药物的SEM表征图。
图5为激光诱导的小鼠眼CNV模型药效试验的动物眼睛荧光造影图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种纳米晶滴眼剂，其包含双溶性大分子、单溶性大分子以及同时作用于血管内皮生长因子受体和血小板生长因子受体的靶向药物；
双溶性大分子和单溶性大分子相互作用包裹靶向药物。其中，双溶性大分子为泊洛沙姆188，单溶性大分子为HPC EF，靶向药物为阿西替尼，泊洛沙姆188和HPC EF的质量比5:1，泊洛沙姆188和阿西替尼的质量比为10:1。
本实施例还提供一种纳米晶滴眼剂的制备方法：
将0.5g泊洛沙姆188和0.1g HPC EF分散在50ml的纯化水中，得到混合溶液；
将50mg阿西替尼分散在上述混合溶液中，得到药物浓度为1mg/mL的初悬液；
而后将上述初悬液转入星行式球磨机，在0℃条件下以350rpm快速研磨2h；其中研磨容器为100ml氧化锆材质的密封杯子，研磨珠子材料为氧化锆球形珠子，粒径为0.3～0.4mm左右；经滤膜减压过滤得到的最终产品为阿西替尼药物纳米混悬液。
实施例2-10
实施例2-10提供的纳米晶滴眼剂中药物的结构与实施例1提供的纳米晶滴眼剂的药物结构相同，区别在于采用的具体化合物不同。
实施例2-10提供的纳米晶滴眼剂的制备方法与实施例1提供的纳米晶滴眼剂的制备方法操作基本一致，区别在于操作条件不同。
实施例2
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为泊洛沙姆188，单溶性大分子为HPC EF，靶向药物为阿西替尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为5:1，泊洛沙姆188和阿西替尼的质量比为5:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为0℃，转速为350rpm，研磨时间为2小时。
实施例3
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为吐温80，单溶性大分子为HPC EF，靶向药物为阿西替尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为5:1，吐温80和阿西替尼的质量比为10:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为3℃，转速为350rpm，研磨时间为1.5小时。
实施例4
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为吐温80，单溶性大分子为HPMC E5，靶向药物为阿西替尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为5:1，吐温80和阿西替尼的质量比为10:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为5℃，转速为350rpm，研磨时间为3小时。
实施例5
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为PEG4000、PEG5000和十二烷基磺酸钠的混合物，单溶性大分子为羧甲基淀粉钠，靶向药物为瑞戈非尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为3:1，双溶性大分子和瑞戈非尼的质量比为12:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为2℃，转速为350rpm，研磨时间为2.5小时。
实施例6
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为泊洛沙姆188，单溶性大分子为PLGA，靶向药物为凡德他尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为1:1，泊洛沙姆188和凡德他尼的质量比为5:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为0℃，转速为500rpm，研磨时间为3小时。
实施例7
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为PEG6000和吐温80的混合物，单溶性大分子为羧甲基淀粉钠，靶向药物为瑞戈非尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为3:1，双溶性大分子和瑞戈非尼的质量比为12:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为2℃，转速为350rpm，研磨时间为2.5小时。
实施例8
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为十二烷基硫酸钠，单溶性大分子为壳聚糖，靶向药物为索拉菲尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为4:1，十二烷基硫酸钠和索拉菲尼的质量比为6:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为3℃，转速为450rpm，研磨时间为1.5小时。
实施例9
纳米晶滴眼剂中：双溶性大分子为吐温80，单溶性大分子为透明质酸，靶向药物为舒尼替尼，其中，双溶性大分子和单溶性大分子的质量比为2.5:1，吐温80和舒尼替尼的质量比为8:1。
制备工艺纳米晶滴眼剂时，研磨的温度为3℃，转速为480rpm，研磨时间为2小时。
表征
对实施例1-4制备得到的纳米晶滴眼剂进行SEM检测，检测结果参见图1-4，图1为实施例1的SEM图，由图1可知，实施例1的纳米晶滴眼剂中的纳米晶呈现出薄片状，部分有粘结现象存在，微粒尺寸在100nm到800nm之间。图2为实施例2的SEM图，由图2可知，实施例2的纳米晶滴眼剂中的纳米晶呈现出薄片状，粘结现象不明显，微粒尺寸在100nm到2μm之间，粒径分布较宽。图3为实施例3的SEM图，由图3可知，实施例3的纳米晶滴眼剂中的纳米晶为小块状颗粒，粒径尺寸约在100nm到600nm之间。图4为实施例4的SEM图，由图4可知，实施例4的纳米晶滴眼剂中的纳米晶为小块状颗粒，粒径尺寸约在300nm到800nm之间。
对比例1：按照实施例1提供的制备方法制备纳米晶滴眼剂，区别在于使用的双溶性大分子为仅具有亲水基团的物质——硬脂酸钠，采用该双溶性大分子制备得到的不是纳米晶，而可能是凝胶。
对比例2：按照实施例1提供的制备方法制备纳米晶滴眼剂，区别在于使用的双溶性大分子为仅具有亲脂基团的物质——三硬脂酸甘油酯，采用该双溶性大分子制备得到的不是纳米晶，而可能是微球结构。
对比例3：按照实施例1提供的制备方法制备纳米晶滴眼剂，区别在于使用的单溶性大分子为同时具有亲水基体和亲油基体的物质—卵磷脂，采用该单溶性大分子制备得到的物质不是纳米晶，可能是凝胶、微球或者其他结构。
对比例4：按照实施例1提供的制备方法制备纳米晶滴眼剂，区别在于，先研磨阿西替尼，研磨的条件与实施例1相同，而后将研磨后的阿西替尼与混合溶液混合即可，但此方法得不到纳米晶。
稳定性检测
将实施例1-4和对比例1-4的纳米晶滴眼剂在25±5℃和相对湿度为60±10％条件下放置30天，而后检测纳米晶滴眼剂的D90、D50和D10，检测结果参见表1。
其中，检测使用的设备为microtrac S3500，检测条件为：湿法、分散介质水、流速60％、超声功率30w、超声时间120S；检测过程：按上述实验条件设定好实验参数；向湿法进样器中注满水同时开启内循环，同时开始调零；仪器校零通过后，逐滴加入已制备好的纳米晶混悬液，直至浓度到达仪器规定的浓度范围，开启内部超声，超声结束后即开始测试PSD结果。
表1检测结果
Figure BDA0002278025870000121
根据表1可知，本发明实施例提供的纳米晶滴眼剂具有良好地稳定性，药物不易聚集。而由于对比例1-4制备的物质不是纳米晶，在放置过程中，药物聚集快，稳定性差。
将实施例1-4的纳米晶滴眼剂在25±5℃和相对湿度为60±10％条件下放置60天，而后检测纳米晶滴眼剂的含量。采用外标法测定含量，具体检测条件参见表2，具体检测结果参见表3。
表2检测条件
Figure BDA0002278025870000122
Figure BDA0002278025870000131
表3检测结果
Figure BDA0002278025870000132
根据表3可知，本发明实施例提供的纳米晶滴眼剂具有良好地稳定性，药物的有效含量可以得到保证。
动物体内实验
实施例10
药效实验
使用实施例1和4所制备的药物对兔眼表碱烧伤角膜新生血管生成抑制实验。
取10只雄性，2.0-2.5kg，3-4个月龄新西兰兔分成正常对照组(1只动物，2只眼睛)；3个实验组(模型组、实施例1组和实施例4组)，每组3只动物，6只眼睛；用1mol/L NaOH溶液碱烧伤动物眼角建立角膜新生血管模型。造模后第1天(Day2)开始给药(浓度0.1mg/ml)，30ul/眼/次，3次/天；给药后第10天(Day11)，观察兔眼角膜新生血管(NV)的长度及分布钟点位数以计算角膜新生血管面积。采集图像在Photoshop CS进行钟点数校正，角膜新生血管面积采用Image Pro Plus处理；面积公式：S＝C/12×3.1416×[R2-(R-L)2]，C表示在图片中角膜边缘从有NV到无NV生长时点所占的钟点数，R表示在图片中从角膜与巩膜接触的边缘到角膜中心的长度，L表示在图片中从角膜与巩膜接触边缘新生血管的根部到角膜中NV的末端NV长度，每个钟点中取最长的一根血管长度。
试验结果：
Figure BDA0002278025870000141
实验结果表明使用实施例1和4所制备的药物与模型组相比，新生血管数和面积远低于模型组，说明这2个试验药物对新生血管具有显著的抑制作用。
实施例11
动物玻璃体吸收实验
对实施例1-4的纳米晶滴眼剂和对比例1-4的滴眼剂进行动物实验，选用健康雄性成年SD大鼠66只，每两只为一组，共33组，其中一组(4只眼)为空白对照滴生理盐水各40μl，并在滴加样液10分钟后采样。剩余32组，再均以4组为一个系列，共8个系列，每个系列分别滴加实施例1-4和对比例1-4的纳米晶滴眼剂，每只眼睛20μl。每个系列中每组采样时间一次为30分钟、60分钟、120分钟和240分钟。
具体采样是在将动物断颈处死后，迅速采集双眼玻璃体，保存在-80℃。而后进行玻璃体样本匀浆处理，稀释后按标准样品前处理流程处理，用甲醇或乙腈处理(溶解)，得到液质分析(LC/MS/MS)检测目标化合物浓度。LC/MS条件：参考SHIMADUZ No.C126。样品分析处理：采用LC/MS/MS法测定玻璃体中的药物浓度，具体检测条件参见表4，具体检测结果参见表5。而在对比例1-4的玻璃体样品中没有检测到药物。
表4检测条件
Figure BDA0002278025870000151
表5检测结果
Figure BDA0002278025870000152
根据表5可知，本发明实施例制备的纳米晶滴眼剂具有良好吸收，药物能够快速进入眼部，对病变部位进行治疗，而更改本发明实施例的配方或者操作后制备得到的滴眼剂不能快速进入眼内，治疗效果较差。
实施例12
动物药效实验
小鼠眼脉络膜新生血管(CNV)模型药效试验
1)样品准备
高剂量组：基于实施例13(表8实验条件及结果-序号1)条件制备的药物含量1mg/ml样品；
中剂量组：高剂量组做4倍稀释；
低剂量组：中剂量组做4倍稀释。
2)实验动物准备
选用6-8周龄，体重18-25g的C57Bl/6c小鼠40只，雌雄各半，检查双眼无异常的动物进行激光造模。
其中，激光造模是指小鼠双眼眼底激光诱导构建CNV模型，每只眼激光灼烧数量为3个；激光参数为波长532nm，功率120mW，光斑直径100um，曝光时间100ms。
将激光光凝造模成功的小鼠随机分入下列4组：
表6实验条件
Figure BDA0002278025870000161
3)给药频率和周期
造模后第7天开始滴眼，4次/天，5μL/眼/次，连续给药14天。
眼底照相(FP)观察眼底视网膜形态等、眼底血管荧光造影(FFA)观察脉络膜新生血管渗漏情况。
4)结果
表7实验结果
Figure BDA0002278025870000171
注：光斑渗漏平均分＝[(0级光斑数×0)+(1级光斑数×1)+(2级光斑数×2)+(3级光斑数×3)]÷4种光斑总数(即有效光斑数)。
实验结果表明，给药2周后不同浓度的试验品都减少了实验动物眼光斑渗漏，其中高剂量组改善最大；而对照组(生理盐水)动物眼光斑的改善最小。
实施例13
药物制剂与动物玻璃体吸收关系
球磨法：
1)分别称取双溶性大分子和单溶性大分子投入含50ml纯化水的容器中搅拌，热水浴(50-70℃)加热至完全溶解；
2)称取靶向药物投入到步骤1)所得的溶液中，开启剪切机，在10000rpm左右速度剪切3～5分钟，得到初悬液；
3)将步骤2)获得的初悬液转入球磨机，球磨容器为100ml密封杯，研磨珠为氧化锆球珠，粒径为0.3～0.4mm(或0.1-0.2mm)，在0℃～5℃条件下350rpm研磨2h；将所得物料用布氏漏斗经滤膜减压过滤，得到的产品为混悬液；回收氧化锆珠。
高压均质法：
1)分别称取双溶性大分子和单溶性大分子投入含50ml的纯化水容器中，搅拌加热(水浴50-70℃)加热至完全溶解；
2)称取靶向药物投入到步骤1)得到的含稳定剂的溶液中，得到初悬液；用剪切机在10000-15000rpm速度剪切3-5分钟得到初悬液；
3)将在步骤2)得到的初悬液转移到高压均质机，控制温度在5℃；压力设置为500-600bar，循环一次；调整压力至1200bar左右，循环15-20次；最终调整均质压力在600-800bar左右循环一次，排出，得均质液；
药物在大鼠玻璃体含量检测方法：
选用健康成年SD大鼠，分组，每组4～6只眼，分别滴加所制备的滴眼剂，每只眼睛20μl。在设定的时间点将动物处死后采集双眼玻璃体，保存在-80℃。玻璃体样本匀浆处理，用甲醇或乙腈溶解，过滤得到分析用样品，用液质仪(LC/MS)检测目标化合物浓度，根据在相同分析条件下所获得的API标准曲线计算测试样品中API的含量。
表8实验条件及结果
Figure BDA0002278025870000181
Figure BDA0002278025870000191
注：表中实验都以水为介质，体积50ml。
通过大量的实验研究，最终得到的实验结果如下：
1)所述双溶性大分子和单溶性大分子因所含化学基团、聚合方式和聚合度的不同，其理化性质、脂水分布、对所述靶向药物的稳定作用和生物相容性等都有很大差异。例如选羟丙基纤维素(HPC EF或HF)为单溶性大分子，以吐温为双溶性大分子，在其他条件相同的情况下所配制的滴眼剂在动物玻璃体里的吸收明显优于使用羟丙基甲基纤维素(HPMCE5)制备的滴眼剂；后者可能达不到治疗眼底疾病所需的药物浓度。用泊洛沙姆+HPC HF制备的滴眼剂在动物玻璃体的吸收浓度比使用泊洛沙姆+HPMC E5高1倍；
2)所述双溶性大分子与所述靶向药物的质量比影响纳米晶滴眼剂在动物玻璃体的吸收；
3)所述双溶性大分子或/和单溶性大分子在滴眼剂的最终浓度将影响所述靶向药物的吸收；如双溶性大分子浓度低于0.6mg/ml可明显影响动物玻璃体对药物的吸收；
4)所述纳米晶滴眼剂的制备因选择的靶向药物、双溶性大分子或/和单溶性大分子的种类、质量比、制备工艺等条件的不同都将导致所制备的滴眼剂在玻璃体的吸收。
综上所述，本发明的纳米晶滴眼剂通过采用靶向药物作用于VEGFR和/或PDGFR，保证其对眼部新生血管疾病的治疗效果，通过双溶性大分子和单溶性大分子相互作用，可以包裹药物，防止药物聚集，保证药物的稳定性，同时通过特殊的胞间间隙渗透和/或胞饮方式快速穿过血眼屏障进入玻璃体，继而提升药物的利用率，并通过被动靶向和附着，提升药物的治疗效果。另外，本发明的纳米晶滴眼剂对眼表水相有亲和性，在接触眼表后又对脂相有亲和力，有利于渗透进入眼底玻璃体病灶部位。药物纳米晶颗粒小也有利于渗透达到眼后段。选用替尼类激酶抑制剂还考虑到它们是小分子药物，对组织渗透性比生物大分子药物更容易。所选的大分子辅料有较好的生物相容性；对API有助溶作用，也可增加药物微粒在眼组织的渗透性，有利于API进入眼后段。最后，药物利用率提升，添加的药物量相对减少，降低药物的毒副作用。进一步地将药物制成滴眼剂，降低治疗成本，扩大其应用范围。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种纳米晶滴眼剂，其特征在于，其包含双溶性大分子、单溶性大分子以及作用于血管内皮生长因子受体和/或血小板生长因子受体的靶向药物；
所述双溶性大分子和所述单溶性大分子相互作用包裹所述靶向药物以形成纳米晶，并维持所述纳米晶稳定。
2.根据权利要求1所述的纳米晶滴眼剂，其特征在于，所述靶向药物为酪氨酸激酶抑制剂类药物，
优选，所述酪氨酸激酶抑制剂类药物为替尼类药物及其可成药的盐类；
更优选为阿西替尼、司马沙尼、索拉菲尼、瑞戈非尼、帕唑帕尼、凡德他尼、伊马替尼、尼达尼布和舒尼替尼中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的纳米晶滴眼剂，其特征在于，所述双溶性大分子为同时包含亲水基团和亲脂基团的大分子稳定剂，优选为表面活性剂，更优选为泊洛沙姆、吐温、十二烷基酸钠类化合物、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇类化合物中的任意一种或至少两种；
更优选，所述十二烷基酸钠类化合物为十二烷基磺酸钠和十二烷基硫酸钠；
所述聚乙二醇类化合物为PEG4000、PEG5000或PEG6000。
4.根据权利要求1所述的纳米晶滴眼剂，其特征在于，所述单溶性大分子为包含亲水基团或亲脂基团的大分子助悬剂，优选为淀粉类化合物、纤维素类化合物或者聚羧酸酯类化合物中的任意一种或者至少两种；
更优选，所述纤维素类化合物为壳聚糖、透明质酸、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠中的任意一种或至少两种；
所述淀粉类化合物包括羧甲基淀粉钠、直链淀粉和糊精的任意一种或至少两种；
所述聚羧酸酯类化合物为PLA、PGA和PLGA中的任意一种或至少两种。
5.根据权利要求1所述的纳米晶滴眼剂，其特征在于，所述纳米晶滴眼剂中纳米晶的粒径为200-1000纳米，优选为，300-800纳米；
优选，所述双溶性大分子与所述靶向药物的质量比为2-12:1，优选为6-10:1；
优选，所述双溶性大分子与所述单溶性大分子的质量比为1-5：1，优选为1-2：1。
6.一种权利要求1～5任一项所述的纳米晶滴眼剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将双溶性大分子、单溶性大分子和靶向药物混合后降低药物粒径以形成稳定被包裹的纳米晶。
7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纳米晶滴眼剂是将所述双溶性大分子和单溶性大分子混合以形成混合溶液；
而后所述混合溶液与所述靶向药物混合以形成初悬液；
而后对所述初悬液进行研磨或均质，以形成稳定包裹所述靶向药物的混悬滴眼剂。
8.一种权利要求1～5任一项所述的纳米晶滴眼剂在制备治疗眼部新生血管疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述眼部新生血管相关疾病包括眼底新生血管疾病和眼表新生血管疾病；
优选，所述眼底新生血管相关疾病包括年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞黄斑水肿(RVO)、中央视网膜静脉阻塞(CRVO)、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)或继发于病理性近视(PM)的脉络膜新生血管(pmCNV)引起的视力下降、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma，NVG)、眼肿瘤、角膜移植、角膜新生血管、眼表新生血管和翼状胬肉中的任意一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述眼表新生血管相关疾病包括病毒性角膜炎、物理损伤和/或化学损伤导致角膜新生血管、对翼状胬肉并发的角膜新生血管、角膜移植排斥性角膜新生血管以及角膜干细胞缺乏症中的任意一种。
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