CN110656182A - 用于鸽子基因分型的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于鸽子基因分型的组合物、引物组、试剂盒、基因分型的方法及其应用。所述组合物包括STR基因座集和CHD基因，所述STR基因座集包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。同时本发明还提供了一种试剂盒用于鸽子的基因分型，以及个体识别和亲缘鉴定。

Description

用于鸽子基因分型的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于鸽子基因分型的组合物、引物组、试剂盒以及基因分型方法、鸽子个体识别和亲缘鉴定的方法及其应用。
背景技术
鸽子(Columba livia)在人类发展的历史中扮演着重要的角色，埃及出土的象形文字发现鸽子的驯化最早可追溯到1万年前。借助于地球磁场，鸽子有很好的导航能力，能够帮助人们快速地传递及时信息。现如今随着网络通信技术的发展，人们有了更好更快的安全传输工具，鸽子被用来传递信息的作用也逐渐弱化，然而鸽子赛事活动却日渐盛行。人们通过比赛成绩筛选出具有优秀耐力、归巢能力等的鸽子，并进行进一步的育种选育，从而使某一些特定的鸽子具有极高的商业价值。参加比赛的每只鸽子都颁发有足环证或血统证(相当于人的身份证)用于个体识别，以规避在比赛和拍卖等商业活动中的作弊现象。然而足环的脱落和证件的造假，使得不公平、不公正的事件在赛鸽活动中时有发生，让现有的足环证和血统证不是用于个体识别足够好的工具。
人类基因组STR(短串联重复序列)是目前普遍应用的遗传标记，是以少数几个碱基为核心单位，串联重复形成的DNA遗传标记。其长度在几十到几百bp之间。这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，因此STR分型是现今国内外法医个体识别和亲子鉴定最主要的技术。
然而针对鸽子的STR分型手段还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种用于鸽子基因分型的组合物以及试剂盒，以及对鸽子进行基因分型的方法。通过本发明提供的组合物以及试剂盒可以实现鸽子的基因分型，从而可以用于鸽子的个体识别和亲缘鉴定。
本发明是基于发明人的如下发现获得的：
基因组STR片段一直是生物特征个体识别的有效工具，被广泛运用于亲子鉴定等多个领域和人、犬、猫、牛、马等多个物种。鸽子STR位点用于生物特征识别，最早可追溯到2000年7个STR位点的由奥地利科学家们的首次提出，它们分别是CliμD17、CliμT17、CliμD、CliμD19、CliμD32、CliμT13、CliμD01，其中有仅有2个位点是三核苷酸重复，而剩余5个位点为双核苷酸重复。发明人发现：双核苷酸重复的STR在多重PCR扩增的时候会产生片段比较大的影子带(stutter)，即在DNA复制过程中发生碱基错配，导致一个或几个重复单位的缺失或插入，因此这种双核苷酸重复的STR位点并不是遗传学标记鉴定的较好的位点。中国台湾科学家于2007年提出了全新的7个STR位点用于鸽子生物特征个体识别，分别是PG1，PG2，PG3，PG4，PG5，PG6和PG7，但是非父排除率(CPE,combined probability of exclusion)仅为0.9325。2017年，荷兰科学家提出了共计16个STR位点的新方案用于鸽子生物特征个体识别，这个16个STR位点分别是PIGN15，PIGN10，PIGN57，PIGN26，CliμD16，CliμD19，PIGN12，CliμD17，CliμT17，PIGN04，CliμD01，CliμD11，CliμD35，CliμT02，CliμT13，CliμT43。
对于已发现的多个位点，是利用全部的位点的集合，还是选择其中的某些个位点，或者某几个位点，来实现方便快速，而且能够准确的用作鸽子的基因分型，需要经过创造性的分析。本发明的发明人通过研究，发现了一种能够利用尽量少的STR位点，配合上CHD基因，来获得全面的STR分型结果以及性别鉴定结果，用于鸽子的个体识别和亲缘鉴定。
为此，本发明的发明人通过研究发现：CliμT43与PG2、CliμT17与PG3均是同一位点的不同名称。而CliμD01、CliμT13、PG7由二碱基或三碱基重复而出现了严重的stutter干扰峰，因此最后筛选出19个STR位点：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02，PG1、PG2、PG4、PG5、PG6，同时配合上CHD基因，共20个位点。由这20个位点组合，用于鸽子的亲缘鉴定和个体识别。并在此基础上，研究出了相应的试剂盒，用于在市场上提供鸽子个体识别的检测服务。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种组合物，包括：STR基因座集和CHD基因，所述STR基因座集包括PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。其中CHD基因作为性别区分位点，用于鸟类的性别鉴定。位点详细信息见表1。利用STR基因座集中的STR基因座，可以方便快速的用作鸽子的基因分型，同时配合上CHD基因，用作鸽子的性别鉴定，以实现鸽子个体识别、亲缘鉴定以及DNA档案数据库的建立等，在法医学和商业领域发挥重要的价值。需要说明的是，scaffold指的是将测序得到的若干片段进行重叠拼接后形成contigs(重叠群)，然后确定contigs之间的排列关系，这些contigs按照顺序排列形成scaffold。序列名称(sequence ID)指的是对应的STR位点所在的鸽子基因组上的序列编号。根据scaffold序号以及序列名称，利用ensemble数据库中的鸽子基因组，即可获得相应且唯一的STR位点信息。重复单元是指STR位点(短串联重复序列)的核心重复基础单元，每个个体在同一个STR位点的重复单元的重复次数不同，导致不同个体的相同STR位点显示出不同的片段大小，从而来达到区分个体间的基因差异。
表1位点统计
名称 重复单元 scaffold序号 序列名称 片段大小
CliμD11 CA scaffold232 NW_004973497.1 70-109
PG4 TCCA scaffold34 NW_004973262.1 126-166
PG1 TATC scaffold119 NW_004973275.1 191-222
PG2 ATGG scaffold154 NW_004973316.1 265-308
CliμT02 CATC scaffold1018 NW_004974238.1 82-108
CliμD17 GT scaffold235 NW_004973200.1 108-128
CliμD35 GT scaffold367 NW_004973536.1 165-187
CliμT17 GATC scaffold454 NW_004973619.1 200-249
CliμD16 GT scaffold624 NW_004973775.1 278-350
PIGN04 TAGA scaffold31 NW_004973192.1 385-430
CliμD32 CA scaffold34 NW_004973262.1 136-154
PIGN57 TAGA scaffold822 NW_004973978.1 155-187
CHD scaffold162 NW_004973325.1 265-295
PIGN26 ATTCT scaffold503 NW_004973678.1 366-467
PG5 TTTG scaffold155 NW_004973354.1 94-123
PG6 AAAC scaffold34 NW_004973262.1 138-166
CliμD19 GT scaffold1361 NW_004974495.1 185-205
PIGN12 (TC)n(TC)n(TA)n scaffold114 NW_004973337.1 234-364
PIGN15 GATA scaffold123 NW_004973333.1 120-155
PIGN10 (TC)n(TA)n scaffold16 NW_004973198.1 285-340
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种引物组，所述引物组适于特异性扩增下列位点：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6和CHD基因。通过特异性扩增STR基因座集以及CHD基因，能够快速方便用作鸽子的基因分型以及性别鉴定等，实现鸽子的个体识别。
根据本发明的实施例，以上引物组可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述引物组包括下列引物：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40。在进行多重PCR反应的时候，引物序列的选择应该非常小心。因为引物的不恰当选择可能会产生不期望的结果，例如扩增缺乏、在预期的靶基因座之外的一个或多个位点扩增、形成引物二聚体、不同的基因座的引物间发生非期望的相互作用等等。本发明提供的引物组可以同时实现STR基因座集中所有基因座以及CHD基因的共扩增。本发明所提供的引物序列，针对20个位点在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。每条引物退火温度都在60℃左右、不产生引物二聚体或者非特异性扩增产物，其最终扩增产物的长度在70-450bp之间。经过测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。由此可以一次方便快捷用作鸽子的基因分型和鉴定。
在本发明的一些实施例中，所述引物组中包含多种可检测标记。通过多种可检测标记，可以实现对于扩增产物的快速分类，并结合扩增片段的大小确定是哪一个位点，用作鸽子的基因分型。
在本发明的一些实施例中，所述引物组包含第一引物组，第二引物组，第三引物组，第四引物组和第五引物组，各引物组之间的引物带有不同的可区分的可检测标记；其中所述第一引物组包括用于扩增CliμD11、PG4、PG1和PG2的引物；所述第二引物组包括用于扩增CliμT02、CliμD17、CliμD35、CliμT17、CliμD16和PIGN04的引物；所述第三引物组包括用于扩增CliμD32、PIGN57、CHD和PIGN26的引物；所述第四引物组包括用于扩增PG5、PG6、CliμD19和PIGN12的引物；所述第五引物组包括用于扩增PIGN15和PIGN10的引物。将引物组分为不同的组别，即第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组和第五引物组，每一引物组中的引物带有可检测标记，且各引物组中引物所带有的可检测标记均不相同。以此，根据荧光标记实现分组。然后结合每组引物组中引物所用扩增得到的产物的片段大小，确定具体是哪一个位点，从而实现基因的分型。
在本发明的一些实施例中，所述可检测标记包括荧光标记。例如可以是FAM(6’-羧基荧光素)蓝色荧光标记、HEX(六氯-6-甲基荧光素)绿色荧光标记、TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)黄色荧光标记、ROX(羧基-X-罗丹明)红色荧光标记和Cy5(Indodicarbocyanine)紫色荧光标记。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒能够特异性区分下列位点：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6和CHD基因。本发明旨在提供一种能同时分析鸽子基因组19个STR位点和1个CHD性别基因的试剂盒。该试剂盒包含13个低突变率STR位点及7个高突变率STR位点，因此在维持低突变率的前提下增加了对鸽子个体的识别率。该试剂盒对于位点的选择，稳定性好，扩增效率高，灵敏度强，能广泛适用于法医和商业的鸽子个体识别、亲缘鉴定及DNA档案数据库建立等。
根据本发明的实施例，以上试剂盒可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括：根据本发明第二方面任一实施例所述的引物组。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括：等位基因分型标准物，所述等位基因分型标准物包括根据本发明第一方面所述组合物中任一个基因座以及CHD基因的纯合子DNA。将每一个基因座的纯合子DNA作为等位基因分型标准物，用来实现对于未知样本的STR基因座的分型。在本文中，所用到的术语“等位基因分型标准物(allelic ladder)”指的是一组长度与各STR基因座所对应等位基因形成的DNA。试剂盒中可以含有不同的等位基因分型标准物，以便应用所述试剂盒区别不同的STR基因座。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用来检测STR基因座集及CHD基因，所述试剂盒用于鸽子的个体识别和亲缘鉴定，所述STR基因座集包括PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种基因分型方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对待测样品内的STR基因座以及CHD基因进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述STR基因座包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6；对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果；
根据本发明的实施例，以上基因分型方法可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，利用多重扩增反应对所述待测样品内的STR基因座集以及CHD基因进行共扩增，得到经扩增的等位基因。
在本发明的一些实施例中，所述待测样品来自于鸽子。
在本发明的一些实施例中，所述待测样品来自鸽子的血液、血斑、骨骼或羽毛。
在本发明的一些实施例中，在进行所述分析之前，还包括对所述经扩增的等位基因进行分离。
在本发明的一些实施例中，通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离。
在本发明的一些实施例中，使用引物组特异性扩增所述STR基因座以及CHD基因，所述引物组为根据本发明第二方面任一实施例所述的引物组。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种基因分型系统，其特征在于，所述系统包括：扩增单元，所述扩增单元用于对待测样品内的STR基因座以及CHD基因进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述STR基因座包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6；等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述等位基因确定单元用于对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果。
根据本发明的实施例，以上基因分型系统可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述扩增单元利用多重扩增反应对所述待测样品内的STR基因座以及CHD基因进行共扩增，得到经扩增的等位基因。
在本发明的一些实施例中，所述待测样品来自于鸽子。
在本发明的一些实施例中，所述待测样品来自鸽子的血液、血斑、骨骼或羽毛。
在本发明的一些实施例中，所述系统还包括分离单元，所述分离单元分别与所述扩增单元和所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述经扩增的等位基因进行分离。
在本发明的一些实施例中，所述分离单元通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离。
在本发明的一些实施例中，所述分离单元使用引物组特异性扩增所述STR基因座以及CHD基因，所述引物组为根据本发明第二方面任一实施例所述的引物组。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种STR基因座集和CHD基因在鸽子个体识别和亲缘鉴定领域中的用途，所述STR基因座集包括PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种用于鸽子个体识别和亲缘鉴定的方法，其特征在于，包括：利用含有鸽子DNA的样品，获得所述DNA的基因分型结果，所述基因分型结果根据本发明第五方面任一实施例所述的方法获得；根据所述基因分型结果，对所述鸽子进行个体识别和亲缘鉴定。
在本发明的第九方面，本发明提供了一种用于鸽子个体识别和亲缘鉴定的设备，包括：
基因分型系统，所述基因分型系统利用含有鸽子DNA的样品，获得所述DNA的基因分型结果，所述基因分型系统为根据本发明第六方面任一项所述的基因分型系统；分析系统，所述分析系统与所述基因分型系统相连，所述分析系统根据所述基因分型结果，对所述鸽子进行个体识别和亲缘鉴定。
本发明所取得的有益效果为：本发明所提供的产品中同时包含19个鸽子STR位点，用于鸽子的基因分型，极大地提高了检测的兼容性和准确性。而且在此基础上，进一步含有CHD性别基因检测位点，可以精准鉴定鸽子性别，对鸽子育种产业提供帮助，从而解决了鸽子从外形和声音得难以判断性别的问题。应用本发明的复合扩增体系和试剂盒，能够快速方便的完成基因分型，而且能够极大地节省了物料和时间成本。
附图说明
图1为根据本发明的实施例提供的STR位点排布示意图。
图2为根据本发明的实施例提供的试剂盒对随机鸽子的基因分型图。
图3a～图3d为对图2所示基因分型图的局部放大图。
图4为根据本发明的实施例提供的基因分型系统示意图。
图5为根据本发明的实施例提供的基因分型系统示意图。
图6为根据本发明的实施例提供的用于鸽子个体识别和亲缘鉴定的设备的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面对本发明中出现的某些术语进行解释和说明，以便能够更好的理解本发明。需要说明的是，这些解释和说明，仅用来帮助对于本发明的理解，而不应看做是对于本发明的限制。
在本文中，正如本领域通常的理解，“DNA”指的是以其各种形式存在的的脱氧核糖核酸，诸如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA以及染色体DNA。“核酸”是指任何形式的DNA或RNA(核糖核酸)。
在本文中，鸽子做本领域的通常理解，指的是鸽属，是鸠鸽科的一个属，俗称鸽子。例如可以是家鸽，或者野生的鸽子等。
在本文中，基因座或者位点指的是基因在染色体上所占的位置，在分子水平上，基因座是指有遗传效应的DNA序列。一个基因座可以是一个基因，一个基因的一部分，或具有某种调控作用的DNA序列。染色体中，编码在相同基因座上的DNA被称为等位基因。
在本文中，所用到的术语“STR位点”或者“STR基因座”或“多个STR位点”或者“STR基因座集”中的STR位点或者STR基因座是指由在某一个染色体处或者给定的靶核酸处，由两个或多个核苷酸重复形成的核苷酸序列。所述STR基因座集指的是包含两个以上的STR基因座或者STR位点的集合。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种复合体系，所述复合体系能够扩增下列STR位点：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6以及CHD基因。由于鸽子是单态鸟，仅从外形、声音等难以判断性别，因此以CHD基因作为性别区分位点，可以用于鸽子的性别分析和鉴定。本发明中所述复合体系，也可以表述为复合系统，指的是能够在同一个环境下，完成这20个位点的同时扩增。应用本发明的复合体系能够在维持低突变率的前提下增加对于鸽子的个体的识别率。而且该复合体系稳定性好，扩增效率高，灵敏度高，且位点的选择是在全球多个国家和地区的鸽子群体研究结果的基础上，特异性选择了由这20个位点组成的一个集合，能广泛适用于法医和商业的鸽子个体识别、亲缘鉴定以及DNA档案数据库的建立等。
在本发明的一种具体实施方式中，所述复合体系可以进一步分为：第一复合体系、第二复合体系、第三复合体系、第四复合体系和第五复合体系，所述第一复合体系用于区分CliμD11、PG4、PG1和PG2；所述第二复合体系用于区分CliμT02、CliμD17、CliμD35、CliμT17、CliμD16和PIGN04；所述第三复合体系用于区分CliμD32、PIGN57、CHD和PIGN26；所述第四复合体系用于区分PG5、PG6、CliμD19和PIGN12；所述第五复合体系用于区分PIGN15和PIGN10。所述第一复合体系、第二复合体系、第三复合体系、第四复合体系和第五复合体系分别带有不同的荧光标记，以实现每种复合体系的区分。例如可以是FAM(6’-羧基荧光素)蓝色荧光标记、HEX(六氯-6-甲基荧光素)绿色荧光标记、TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)黄色荧光标记、ROX(羧基-X-罗丹明)红色荧光标记和Cy5(Indodicarbocyanine)紫色荧光标记。在本发明的一种具体实施方式中，所述第一复合体系中标记有FAM蓝色荧光标记；所述第二复合体系标记有HEX绿色荧光标记；所述第三复合体系标记有TAMRA黄色荧光标记；所述第四复合体系标记有ROX红色荧光标记；所述第五复合体系标记有Cy5紫色荧光标记。每一复合体系中各位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个STR位点不能有重叠，从而在一个总的复合体系中实现所有位点的区分，用于基因分型。
应用本发明的复合体系，能够在单管内一次性扩增多个STR位点和性别鉴定CHD基因，借助于荧光标记手段，可在90分钟内完成PCR扩增、120分钟内得到基因分型图谱，极大地节省了物料和时间成本。
在本发明的另一种具体实施方式中，所述复合体系进一步包括：引物序列SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:40，如表2所示。利用序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40分别来扩增本发明的20个位点，可以实现STR分型和鸽子的亲缘鉴定。而且通过利用所述引物进行复合扩增试验验证，确定没有非特异扩增现象和交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
表2本发明复合体系各STR位点引物信息
Figure BDA0001711908790000091
Figure BDA0001711908790000101
根据本发明的实施例，所述引物根据编号1～40从小到大，两个引物为一对，每一对引物之间的浓度比为：(0.30±0.1)：(0.26±0.1)：(0.14±0.1)：(0.14±0.1)：(0.31±0.1)：(0.15±0.1)：(0.63±0.1)：(0.23±0.1)：(0.37±0.1)：(0.16±0.1)：(0.19±0.1)：(0.12±0.1)：(0.27±0.1)：(0.36±0.1)：(0.22±0.1)：(0.48±0.1)：(0.12±0.1)：(0.14±0.1)：(0.37±0.1)：(0.19±0.1)。由此，可以实现STR基因座集中的所有基因座以及CHD基因的共扩增。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：表1所述的引物序列。除此之外，所述试剂盒还包括PCR缓冲液以及Taq DNA聚合酶。本发明的PCR缓冲液包括：10mM DMSO，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mMMgCl2，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP混合物。dNTP混合物是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的混合物。根据本发明的实施例，所述试剂盒中的引物还可以分为第一引物组，第二引物组，第三引物组，第四引物组和第五引物组，各引物组之间的引物带有不同的可区分的可检测标记，第一引物组包括用于扩增CliμD11、PG4、PG1和PG2的引物；所述第二引物组包括用于扩增CliμT02、CliμD17、CliμD35、CliμT17、CliμD16和PIGN04的引物；所述第三引物组包括用于扩增CliμD32、PIGN57、CHD和PIGN26的引物；所述第四引物组包括用于扩增PG5、PG6、CliμD19和PIGN12的引物；所述第五引物组包括用于扩增PIGN15和PIGN10的引物。其中第一、第二、第三、第四、第五等表述仅仅是为了表示每一引物组带有不同的可检测标记，并不表示将每一引物组分别隔开，进行扩增。所有引物组根据需要，可以在一个复合体系中同时扩增。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种基因分型的方法，包括：对待测样品内的STR基因座集以及CHD基因进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述STR基因座包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6；对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果。
根据本发明的实施例，所述待测样品为含有鸽子DNA的样品。根据本发明的实施例，从鸽子羽毛中提取获得所述DNA。例如可以利用Chelex-100法提取获得所述DNA。DNA的含量根据需要，优选在0.1至0.3ng范围之间，含量太低可能导致某些位点检测不出，含量太高会导致非特异性的扩增产物产生。
根据本发明的实施例，利用各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)进行所述扩增。根据本发明的实施例，利用如下条件进行扩增：91℃预变性1分钟；95℃变性3秒钟，58℃退火1分钟，70℃延伸20秒钟，该步骤重复28个循环；60℃继续延伸30分钟；4℃～12℃保存。
根据本发明的实施例，将所述扩增产物与甲酰胺、分子量内标按30：1的比例进行混合变性后，再使用毛细管电泳法分离。最终的荧光标记混合物在激光激发下发出可识别的光信号，能够被遗传分析仪(ABI 3130、3100、3500等)成功接收。接收的荧光信号可以在 IDx、GeneMarker等数据分析软件上，转化、分析得到STR基因分型信息和直观图谱。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种基因分型系统，如图4所示，所述基因分型系统包括：扩增单元和等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述扩增单元对待测样品内的STR基因座以及CHD基因进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述STR基因座包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6。所述等位基因确定单元用于对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果。根据本发明的实施例，所述基因分型系统还可以包括分离单元，如图5所示，所述分离单元分别与所述扩增单元和所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述经扩增的等位基因进行分离。例如，利用所述分离单元通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离。
在本发明的又一方面，本发明提供了一种用于鸽子个体识别和亲缘鉴定的设备，如图6所示，所述设备包括基因分型系统和分析系统，所述分析系统与所述基因分型系统相连。所述基因分型系统利用含有鸽子DNA的样品，获得所述DNA的基因分型结果；所述分析系统根据所述基因分型结果，对所述鸽子进行个体识别和亲缘鉴定。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 STR位点的筛选
本发明通过对PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、CliμT43、CliμD01、CliμT13、PG1、PG2、PG3、PG4、PG5、PG6和PG7共24个STR位点的基因多态性及突变率的研究，以及性别识别CHD基因的序列研究，确定了CliμT43与PG2、CliμT17与PG3均是同一位点的不同名称。同时考虑到CliμD01、CliμT13、PG7由二碱基或三碱基重复而出现了严重的stutter干扰峰，因此我们最后筛选出19个STR位点：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02，PG1、PG2、PG4、PG5、PG6，其中PG1、PG2、PG4、PG5、PG6为5个亚洲鸽群补充位点，及1个性别鉴定位点CHD基因，共20个位点。
实施例2本发明试剂盒对随机鸽子的基因分型图
鸽子羽毛样品为随机挑选，选中羽毛的鸽子足环号为5000382。采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press，1998)鸽子羽毛中的DNA，利用本发明试剂盒对上述DNA样本进行扩增，扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用 IDx软件。本发明所用的试剂和材料诸如甲酰胺、内标等均为本领域技术人员常用的常规材料。
2.1羽毛DNA浓度稀释
Chelex-100法提取羽毛中的DNA，所获得的DNA浓度为13.2ng/μL，将其稀释到0.5ng/μL用于实验。
2.2荧光标记引物混合配制
将20个位点的正、反向引物混合物按照表3配制成引物工作混合物，其中每个位点对应的正向引物和反向引物的浓度相同。用于扩增CliμD11、PG4、PG1和PG2的引物均带有FAM蓝色荧光素；用于扩增CliμT02、CliμD17、CliμD35、CliμT17、CliμD16和PIGN04的引物均带有HEX绿色荧光素；用于扩增CliμD32、PIGN57、CHD和PIGN26的引物均带有TAMRA黄色荧光素；用于扩增PG5、PG6、CliμD19和PIGN12的引物均带有红色荧光素；用于扩增PIGN15和PIGN10的引物均带有Cy5紫色荧光素。利用这些引物所扩增出来的DNA片段大小如图1所示。其中图1中100～500即为DNA片段的大小，单位是bp。其中在利用基因分型软件进行分析时，软件中无法正常显示拉丁文“μ”，所以对于本文中出现的基因座的名称中，如果含有“μ”，则用“m”代替。
表3各引物浓度
Figure BDA0001711908790000121
2.3聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物(引物终浓度见表2)、Taq酶，按照表4配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入模板DNA。
表4复合扩增反应体系
组分 体积(μL)
引物混合物(5×PrimerSets) 5
缓冲液(2.5×PCR MasterMix) 10
热启动Taq酶 0.4(2U)
DNA 0.2ng-5ng
无核酸酶水 补充至25μL
2)按照表4的反应条件设置热循环仪增仪(G1000)，将PCR反应管放入仪器中进行PCR扩增。
表5复合扩增热循环条件
Figure BDA0001711908790000141
3)扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测。电泳结果用
Figure BDA0001711908790000142
IDx软件进行分析，本发明试剂盒对足环号为5000382鸽子的分型结果详见图2。结果显示，PCR复合扩增和DNA分型检测，结果稳定、图谱清晰完整(图2)。图2中两条竖的粗线是为了对图2进行放大，而添加的。对于图2的放大图分别如图3a～图3d所示。其中，如果将图2横向放置来看的话，图3a对应图2左上角两行STR基因座分型结果，图3b对应图2右上角两行STR基因座分型结果，图3c对应图2左下角三行STR基因座分型结果，图3d对应图2右下角三行STR基因座分型结果。从图2和图3a～图3d给出的结果可以看出，19个STR基因座和1个CHD性别基因的扩增产物峰高保持平衡。
实施例3本发明试剂盒对鸽子DNA浓度梯度的基因分型图
实验具体步骤与“实施例2”中相同。
以足环号为5000382的鸽子羽毛DNA为模板(图3)，进行灵敏度检测。所设置的DNA的含量梯度分别是1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625ng/μL、0.03125ng/μL，进行扩增分型，并重复实验3次。
实验发现，当模板DNA含量≥0.0625ng时，所有等位基因峰值均大于500RFU；当模板DNA含量≤0.03125ng时，多个等位基因峰值低于300RFU，分型时出现等位基因丢失的现象。0.03125ng/μL的检测样品在145bp左右的中正常检测峰的峰值变得特别的低；在75bp、155bp、290bp左右的杂峰的峰值相对变高，对正常检测峰形成干扰。
应用本发明，可以检测到0.0325ng以上的DNA，实现鸽子的分型。
实施例4
通过利用19个STR基因座对117只鸽子分型，一共检测到106个等位基因，平均每个位点含有5.9个，每个等位基因频率详细见表6。实验具体步骤与“实施例2”中相同，来获得鸽子群体的STR位点的信息。PG5由于仅有一个等位基因，所以并未计算表6中给出的众多参数值。CHD基因为性别决定基因，也不必对表6中给出的众多参数直接进行计算。其中所测得的杂合度(heterozygosity)是指某群体某一遗传标记所有基因型中杂合子所占到的比例。即为杂合子数与个体总数的比值，杂合度用来反映群体内遗传变异的水平。随机匹配概率(probability of matching，Pm)即为在同一群体中，随机抽取两名个体，基因型一致的概率。多态信息含量，指的是一个后代所获得的某个等位标记来自于它的父亲(或母亲)的同一个等位标记的可能性。经典父权指数，是嫌疑父具备必需基因成为生父的机会(x)，与随机男子具备必需基因成为生父机会(y)的比值。
表6本发明试剂盒对鸽子群体的STR位点统计表
Figure BDA0001711908790000151
如表6所示，这些STR基因座的多态信息含量(PIC，polymorphic informationcontent)平均值为0.60，变化范围在0.35～0.89之间；杂合度(Heterozygotes)平均值为0.55，变化范围在0.26～0.92之间。其中，PIGN26为等位基因数量最多的STR位点，多达14个，同时它也有最高的多态信息含量PIC值0.89和识别率(PD，Power of Discrimination)0.96。在杂合度、排除率(PE,Power of Exclusion)、经典父权指数(PI,Typical PaternityIndex)三项指标中，PG2都是18个STR位点中最高的，分别达到了0.92、0.84和6.50。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大法医科技有限公司
<120> 用于鸽子基因分型的组合物及其应用
<130> PIDC3182645
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaatcccaa agaggattat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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actgtcctat ggctgaagtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cccatctcct tgcctgatgc 20
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<213> 人工序列
<400> 4
actgtcctat ggctgaagtg 20
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<213> 人工序列
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atgtgtgttt gtgcatgaag 20
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<213> 人工序列
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ccttccaacc cacattatt 19
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agttttaatg aaggcacctc t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tcttacacac tctcgacaag 20
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gtttccaccc aaatgagcaa g 21
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gggagcttaa gggattattg 20
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<213> 人工序列
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attccttgca tgcctactta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgggtttgg agatgttttg 20
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<213> 人工序列
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ggtttttctg tttcctcacg 20
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gggattctgg gattattttt tc 22
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<213> 人工序列
<400> 21
gagccatttc agtgagtgac a 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtttgcagga gcgtgtagag aagt 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctcttgtatg tccatctgaa c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acccatttac cactctctaa 20
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<213> 人工序列
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gcttccaagg atgagaaact gtg 23
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<213> 人工序列
<400> 26
atggagtcac tatcagatcc ag 22
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<211> 22
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<213> 人工序列
<400> 27
tcactgtatt caccaaagtc tg 22
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<213> 人工序列
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caatgtgggg gcgtctatg 19
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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agtagtgaag caatcagaac agtgc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttccactgaa tgggtctcag 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ctgccagaag gtaaatgaca c 21

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括：STR基因座集和CHD基因，所述STR基因座集包括PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。
2.一种引物组，其特征在于，所述引物组适于特异性扩增下列位点：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6和性别区分位点(CHD)。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，包括下列引物：SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:40；
任选地，所述引物组中包含多种可检测标记；
任选地，所述引物组包含第一引物组，第二引物组，第三引物组，第四引物组和第五引物组，各引物组之间的引物带有不同的可区分的可检测标记；
其中所述第一引物组包括用于扩增CliμD11、PG4、PG1和PG2的引物；
所述第二引物组包括用于扩增CliμT02、CliμD17、CliμD35、CliμT17、CliμD16和PIGN04的引物；
所述第三引物组包括用于扩增CliμD32、PIGN57、CHD和PIGN26的引物；
所述第四引物组包括用于扩增PG5、PG6、CliμD19和PIGN12的引物；
所述第五引物组包括用于扩增PIGN15和PIGN10的引物；
任选地，所述可检测标记包括荧光标记。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒能够特异性区分下列位点：
PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6和性别区分位点(CHD)；
任选地，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的引物组；
任选地，进一步包括等位基因分型标准物，所述等位基因分型标准物包括权利要求1所述组合物中任一个基因座以及CHD基因的纯合子DNA。
5.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用来检测STR基因座集及CHD基因，所述试剂盒用于鸽子的个体识别和亲缘鉴定，所述STR基因座集包括PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。
6.一种基因分型方法，其特征在于，包括：
对待测样品内的STR基因座集以及CHD基因进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述STR基因座包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5、PG6；
对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果；
任选地，利用多重扩增反应对所述待测样品内的STR基因座以及CHD基因进行共扩增，得到经扩增的等位基因；
任选地，所述待测样品来自于鸽子；
任选地，所述待测样品来自鸽子的血液、血斑、骨骼或羽毛；
任选地，在进行所述分析之前，还包括对所述经扩增的等位基因进行分离；
任选地，通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离；
任选地，使用引物组特异性扩增所述STR基因座以及CHD基因，所述引物组为权利要求2或3所述的引物组。
7.一种基因分型系统，其特征在于，所述系统包括：
扩增单元，所述扩增单元用于对待测样品内的STR基因座集以及CHD基因进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述STR基因座集包括：PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6；
等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述等位基因确定单元用于对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果；
任选地，所述扩增单元利用多重扩增反应对所述待测样品内的STR基因座集以及CHD基因进行共扩增，得到经扩增的等位基因；
任选地，所述待测样品来自于鸽子；
任选地，所述待测样品来自鸽子的血液、血斑、骨骼或羽毛；
任选地，所述系统还包括分离单元，所述分离单元分别与所述扩增单元和所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述经扩增的等位基因进行分离；
任选地，所述分离单元通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离；
任选地，所述分离单元使用引物组特异性扩增所述STR基因座以及CHD基因，所述引物组为权利要求2或3所述的引物组。
8.STR基因座集和CHD基因在鸽子个体识别和亲缘鉴定领域中的用途，所述STR基因座集包括PIGN15、PIGN10、PIGN57、PIGN26、CliμD16、CliμD32、CliμD19、PIGN12、CliμD17、CliμT17、PIGN04、CliμD11、CliμD35、CliμT02、PG1、PG2、PG4、PG5和PG6。
9.一种用于鸽子个体识别和亲缘鉴定的方法，其特征在于，包括：
利用含有鸽子DNA的样品，获得所述DNA的基因分型结果，所述基因分型结果根据权利要求6所述的方法获得；
根据所述基因分型结果，对所述鸽子进行个体识别和亲缘鉴定。
10.一种用于鸽子个体识别和亲缘鉴定的设备，其特征在于，包括：
基因分型系统，所述基因分型系统利用含有鸽子DNA的样品，获得所述DNA的基因分型结果，所述基因分型系统为权利要求7所述的基因分型系统；
分析系统，所述分析系统与所述基因分型系统相连，所述分析系统根据所述基因分型结果，对所述鸽子进行个体识别和亲缘鉴定。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050112592A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-26 Sinha Sudhir K. Assay for species sources
CN101260439A (zh) * 2008-03-03 2008-09-10 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法
CN101935710A (zh) * 2010-10-14 2011-01-05 江苏省农业科学院 一种鸽性别鉴别方法
CN106701910A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 深圳华大农业与循环经济科技有限公司 一种用于鉴定鸽子性别的引物对、试剂盒及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050112592A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-26 Sinha Sudhir K. Assay for species sources
CN101260439A (zh) * 2008-03-03 2008-09-10 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 PCR-mtDNA检测鸽子源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法
CN101935710A (zh) * 2010-10-14 2011-01-05 江苏省农业科学院 一种鸽性别鉴别方法
CN106701910A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 深圳华大农业与循环经济科技有限公司 一种用于鉴定鸽子性别的引物对、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B TRAXLER 等: "Polymorphic DNA microsatellites in the domestic pigeon, Columba livia var. domestica", 《MOL ECOL》 *
JAMES CHUN-I LEE 等: "Racing pigeon identification using STR and chromo‐helicase DNA binding gene markers", 《NUCLEIC ACIDS》 *
M DE GROOT等: "n evaluation of the International Society for Animal Genetics recommended parentage and identification panel for the domestic pigeon (Columba livia domestica)", 《ANIM GENET》 *
窦雪丽等: "3个Y-STR分型体系的法医学应用比较", 《刑事技术》 *
许明 等: "鸽性染色体CHD1基因序列差异的检测新方法", 《中国家禽》 *

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