CN110655566A - 可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体内容涉及可溶性Tim‑3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用。可溶性Tim‑3重组蛋白用于制备具有调控单核细胞功能的药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用，所述可溶性Tim‑3重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。另外，本发明还提供了可溶性Tim‑3重组蛋白的突变型蛋白，及其突变型蛋白和突变型蛋白的制备和应用。所述突变型重组蛋白是通过定向进化技术筛选获得，具有调控单核细胞功能或增强机体免疫应答功能，并结合宿主密码子优化方式，提高其表达效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体内容涉及可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用。
技术背景
生物技术药物主要包括蛋白质、多肽和核酸分子，几乎覆盖了包括癌症、自身免疫性疾病以及传染病等的上百种疾病。应用蛋白质工程技术制造的重组蛋白类产品在人们的生产、生活、医疗中发挥着不可或缺的作用。重组蛋白质药物是目前最主要的一类生物技术药物，与小分子化学药物相比，具有疗效好、副作用小和生物功能明确等一系列优点。
肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。发病急骤，病死率高，危害极大。它是全球公认的危及患者生命的、极具挑战性的临床危重症，目前尚缺乏特效药物和手段。目前认为肝移植是治疗本病的最有效手段，但由于供肝短缺及治疗费用高昂，其临床运用受到极大限制。固有免疫细胞单核细胞过度活化在肝衰竭发病机制中起到重要作用。细胞表面的Tim-3(T cellimmunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3)在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等均有表达，单核细胞膜上Tim-3分子脱落产生的可溶性Tim-3(soluble Tim-3,sTim-3)，与败血症患者的IL-12和TNF-α表达成负相关，课题组前期体外研究发现，sTim-3可使LPS刺激的原代人单核细胞TNF-α表达水平下降，表明sTim-3具有抑制单核细胞活化作用。
目前，每年肝癌患者占到全世界新发现恶性肿瘤病人的4％，肝癌已成为国内肿瘤死亡病因的第二位，有极高的发病率和致死率。现以形成以手术切除为主的治疗方式，然而手术治疗预后差，易复发。研究表明，长期的免疫力低下也是癌症产生的重要原因之一，提高机体的免疫水平是肿瘤治疗的关键手段。因此寻找具有提高免疫力水平作用的抗癌药物是非常必要的。肿瘤免疫治疗是许多治疗方法的总称，有免疫检查点(check point)疗法、细胞因子疗法、肿瘤疫苗和细胞治疗。肿瘤免疫检查点分子的研究主要集中在Tim-3、CTLA-4、PD1三个分子上，这些分子抑制微环境中免疫细胞活性，肿瘤免疫检查点抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的最主要方面，通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能消除肿瘤。Tim-3分子的发现是源于寻找区分Thl细胞和Th2细胞的表面标志物。最近研究发现，通过使用半定量RT-PCR方法，测定荷瘤小鼠不同时间段的可溶性Tim-3和CTLA-4等指标的表达水平，同时测定肿瘤生长。结果发现，肿瘤生长与CTLA-4表达成正相关，与可溶性Tim-3负相关，提示可溶性Tim-3可能具有抑制肿瘤生长作用，目前未有研究报道可溶性Tim-3在肝癌中的作用。最近对HIV疫苗的细胞介导免疫应答的研究表明，可溶性PD1和可溶性Tim-3增强腺病毒载体SIV疫苗(rAd5-SIV)对小鼠T细胞增殖能力，产生更多的抗原特异IFN-γ(+)CD4(+)和CD8(+)T细胞。提示sTim-3可能具有免疫佐剂作用，增强机体的T细胞免疫应答。
发明内容
本发明提供了一种新型的可溶性Tim-3重组蛋白的应用及其纯化方法。
可溶性Tim-3重组蛋白用于制备具有调控单核细胞功能的药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用，所述可溶性Tim-3重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1(所述可溶性Tim-3重组蛋白包含或不包含组氨酸标签序列如HHHHHH；如果包含组氨酸标签序列时如HHHHHH，在标签序列前加上连接肽如(G)nS，n＝1到4，优选的n为4)。
所述调控单核细胞功能的药物可用于抑制炎症患者如肝衰竭患者的单核细胞过度活化；增强肿瘤免疫应答的功能的药物可用于增强癌症患者如肝癌患者的免疫应答，避免宿主免疫逃逸。
可溶性Tim-3重组蛋白的浓度优选为80ng/ml。
可溶性Tim-3重组蛋白的纯化方法，包括如下步骤：将含有重组人可溶性Tim-3的真核CHO细胞、原核大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统细胞培养液通过微滤澄清、超滤浓缩换液后，再经过阴阳离子层析柱、分子筛层析、疏水层析柱和/或亲和层析柱，获得足够纯度(SDS-PAGE测定纯度>96％)重组蛋白；所述可溶性Tim-3重组蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
另外，本发明还提供了可溶性Tim-3重组蛋白的突变型蛋白，及其突变型蛋白和突变型蛋白的制备和应用。所述突变型重组蛋白是通过定向进化技术筛选获得，具有调控单核细胞功能或增强机体免疫应答功能，并结合宿主密码子优化方式，提高其表达效率。
一种可溶性Tim-3重组突变型蛋白，突变型蛋白在人Tim-3(NP_116171.3)胞外结构域氨基酸(SEQ ID NO:1)对应的基因序列基础上，通过定向进化技术筛选得到突变基因，其突变位点不涉及物种间的保守序列，发生在非保守序列位置，进而表达的蛋白。
进一步的，所述可溶性Tim-3重组突变型蛋白包含或不包含组氨酸标签序列如HHHHHH；如果包含组氨酸标签序列时如HHHHHH，在标签序列前加上连接肽如(G)nS，n＝1-4，优选的n为4。
更进一步的，所述氨基酸序列对应的基因序列可根据宿主如原核和真核等密码子的特点进行优化。
优选的，所述可溶性Tim-3重组突变型蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2-7之一。
可溶性Tim-3重组突变型蛋白的制备方法，采用PCR试剂盒进行突变扩增筛选得到基因序列，该突变型蛋白可保留不同种属来源的保守氨基酸序列；在人Tim-3(NP_116171.3)胞外结构域氨基酸(SEQ ID NO:1)对应的基因序列基础上，通过定向进化技术筛选得到突变基因，进而氨基酸表达成可溶性Tim-3重组突变型蛋白，优选氨基酸序列为：SEQID NO:2-7的突变型蛋白。
所述氨基酸表达指预构建的重组蛋白质基因表达载体于真核表达系统、原核表达系统及昆虫杆状病毒表达系统表达，提取生产长效重组药物。
可溶性Tim-3突变型蛋白在制备具有调控单核细胞功能药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用。优选的，可溶性Tim-3突变型蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2-7的突变型蛋白。
药物通过调控单核细胞功能或增强肿瘤免疫应答功能来实现，所述调控单核细胞功能药物可用于抑制炎症患者如肝衰竭患者的单核细胞过度活化，增强肿瘤免疫应答的功能可用于增强癌症患者如肝癌患者的免疫应答，避免宿主免疫逃逸。
本发明把可溶性Tim-3重组蛋白基因序列构建到原核、真核和昆虫杆状病毒表达载体，经宿主表达的重组蛋白采用离子交换层析、亲和层析和疏水层析等多种纯化方法相结合，纯化出可溶性Tim-3重组蛋白。
为了得到更强生物学功能的突变型重组蛋白，通过定向进化技术对该重组蛋白进行大量突变筛选，通过使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，目的基因构建到真核表达载体、原核表达载体或昆虫杆状表达载体，然后把突变型重组表达载体转化到真核、原核或昆虫宿主进行表达。
为了得到更高表达效率的突变型重组表达质粒，通过宿主密码子优化技术进行密码子优化。具体根据宿主真核、原核或昆虫密码子特点，采用重组PCR技术进行定点突变，得到密码子优化了的目的序列，再把这段目的序列经过酶切克隆到相应宿主表达载体上，然后把突变型重组表达载体转化到真核、原核或昆虫宿主进行表达。
可溶性Tim-3及突变型重组蛋白的表达纯化采用亲和层析、离子交换层析和疏水层析等多种纯化方法相结合，纯化出可溶性Tim-3重组蛋白及突变型重组蛋白。金属螯合亲和层析原理是通过蛋白质表面的一些特殊氨基酸与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签6×His-Tag较为常用，具有配体简单、吸附量大、分离条件温和和通用性强等优点。离子层析既能进行粗纯，有效去除绝大多数带有电荷的宿主蛋白质和核酸，又能做到精细纯化，去除痕量杂蛋白。疏水层析既能富集蛋白又能去除绝大多数色素类物质。
本发明公开一种生物工程技术领域的可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备方法及其在疾病如肝脏疾病(肝衰竭和肝癌)中的应用。可溶性Tim-3重组蛋白是一种胞外分泌、可溶性和分子量小的重组蛋白。该重组蛋白含有或不含有6×His标签的Tim-3胞外结构可溶性区域的衍生蛋白，突变型蛋白通过定向进化技术得到含有进化中的保守结构区，又经宿主密码子优化的氨基酸序列。该类重组蛋白具有调控单核细胞功能或增强肿瘤免疫应答的功能。
附图说明
图1为实施例1对培养基、天然蛋白、变性蛋白和纯化蛋白进行SDS-PAGE鉴定图；
图2为实施例2的可溶性Tim-3对单核细胞TNF-α分泌的剂量依赖效应图；
图3为实施例2可溶性Tim-3对单核细胞HMGB1分泌的抑制作用图；
图4为实施例3慢加急性肝衰竭患者单核细胞的mTim-3和sTim-3表达水平图；
图5为实施例3的sTim-3改善D-GalN/LPS急性肝衰竭小鼠肝脏组织学图；
图6为突变型和未突变sTim-3对单核细胞TNF-α分泌的效应图。
图7包含有组氨酸和连接肽的氨基酸序列。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围，还包括各具体实施方式间的任意组合，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明应用分子生物学领域使用的常规技术和方法，本领域技术人员可以在本发明所记载的技术方案基础上，采用本领域其它常规方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
实施例1可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型重组蛋白的获得
人Tim-3(NP_116171.3)胞外结构域的氨基酸序列见SEQ ID NO:1。人Tim-3(NP_116171.3)胞外结构域、连接肽(G)nS和6个组氨酸His融合的氨基酸序列(附图7)，n＝1到4，优选为4。列举以SEQ ID NO:1为基础的6条突变蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:2-7。编码含His或不含His氨基酸的核苷酸序列构建到真核表达载体、原核表达载体或昆虫杆状表达载体，然后把重组表达载体转化到真核、原核或昆虫宿主进行表达。
为了得到更强生物学功能的突变型重组蛋白，通过定向进化技术对该重组蛋白进行大量突变筛选，通过使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，目的基因构建到真核表达载体、原核表达载体或昆虫杆状表达载体，然后把突变型重组表达载体转化到真核、原核或昆虫宿主进行表达。
为了得到更高表达效率的突变型重组表达质粒，通过宿主密码子优化技术进行密码子优化。具体根据宿主真核、原核或昆虫密码子特点，采用重组PCR技术进行定点突变，得到密码子优化了的目的序列，再把这段目的序列经过酶切克隆到相应宿主表达载体上，然后把突变型重组表达载体转化到真核、原核或昆虫宿主进行表达。
可溶性Tim-3及突变型重组蛋白的表达纯化
采用亲和层析、离子交换层析和疏水层析等多种纯化方法相结合，纯化出可溶性Tim-3重组蛋白及突变型重组蛋白。金属螯合亲和层析原理是通过蛋白质表面的一些特殊氨基酸与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签6×His-Tag较为常用(图7)，具有配体简单、吸附量大、分离条件温和和通用性强等优点。离子层析既能进行粗纯，有效去除绝大多数带有电荷的宿主蛋白质和核酸，又能做到精细纯化，去除痕量杂蛋白。疏水层析既能富集蛋白又能去除绝大多数色素类物质。
1.构建含有6条突变核苷酸序列(SEQ ID NO:2-7)连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(如图7)的重组表达载体所用引物
如下：
SEQ ID NO:2连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(M1)
9181P-TIM3-F：AGTTTAAACGGATCTCTAGCgaattcGCCGCCACCATGTTCTCCCACCTGCC
9181P-TIM3-R：TCGAGGTCGGGGGATCCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGGGAGCCTC
9181P-L140R-F1：GCCAAGGTGACCCCCGCCCCCACCAGACAAAGAGATTTCACAGCCGCC
9181P-L140R-R1：GGCGGCTGTGAAATCTCTTTGTCTGGTGGGGGCGGGGGTCACCTTGGC
SEQ ID NO:3连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(M2)
9181P-TIM3-F：AGTTTAAACGGATCTCTAGCgaattcGCCGCCACCATGTTCTCCCACCTGCC
9181P-TIM3-R：TCGAGGTCGGGGGATCCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGGGAGCCTC
9181P-L140R-F1：GCCAAGGTGACCCCCGCCCCCACCAGACAAAGAGATTTCACAGCCGCC
9181P-L140R-R1：GGCGGCTGTGAAATCTCTTTGTCTGGTGGGGGCGGGGGTCACCTTGGC
SEQ ID NO:4连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(M3)
9181P-TIM3-F：AGTTTAAACGGATCTCTAGCgaattcGCCGCCACCATGTTCTCCCACCTGCC
9181P-TIM3-R：TCGAGGTCGGGGGATCCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGGGAGCCTC
9181P-L140R-F1：GCCAAGGTGACCCCCGCCCCCACCAGACAAAGAGATTTCACAGCCGCC
9181P-L140R-R1：GGCGGCTGTGAAATCTCTTTGTCTGGTGGGGGCGGGGGTCACCTTGGC
SEQ ID NO:5连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(M4)
9181P-TIM3-F：AGTTTAAACGGATCTCTAGCgaattcGCCGCCACCATGTTCTCCCACCTGCC
9181P-TIM3-R：TCGAGGTCGGGGGATCCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGGGAGCCTC
9181P-L140R-F1：GCCAAGGTGACCCCCGCCCCCACCAGACAAAGAGATTTCACAGCCGCC
9181P-L140R-R1：GGCGGCTGTGAAATCTCTTTGTCTGGTGGGGGCGGGGGTCACCTTGGC
SEQ ID NO:6连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(M5)
9181P-TIM3-F：AGTTTAAACGGATCTCTAGCgaattcGCCGCCACCATGTTCTCCCACCTGCC
9181P-TIM3-R：TCGAGGTCGGGGGATCCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGGGAGCCTC
9181P-L140R-F1：GCCAAGGTGACCCCCGCCCCCACCAGACAAAGAGATTTCACAGCCGCC
9181P-L140R-R1：GGCGGCTGTGAAATCTCTTTGTCTGGTGGGGGCGGGGGTCACCTTGGC
SEQ ID NO:7连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列(M6)
9181P-TIM3-F：AGTTTAAACGGATCTCTAGCgaattcGCCGCCACCATGTTCTCCCACCTGCC
9181P-TIM3-R：TCGAGGTCGGGGGATCCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGGGAGCCTC
9181P-M6-F1：AGGATCCAGATCCCTAGAATCATGGCCGCCGAGAAGTTTAACCTGAAGCTGG
9181P-M6-R1：CCAGCTTCAGGTTAAACTTCTCGGCGGCCATGATTCTAGGGATCTGGATCCT
2.构建重组重组表达载体所用的PCR反应体系和程序
10μl PCR反应体系如下：
PCR反应程序：
3.构建重组表达载体，瞬时转染和表达纯化
构建pATX2表达载体，瞬时转染至80ml HEK293细胞，转染后第6天收集1.5ml细胞培养基和细胞。对表达的目的重组蛋白进行纯化，对培养基、天然蛋白、变性蛋白和纯化蛋白进行SDS-PAGE和WB进行鉴定，结果如图1。纯化的重组蛋白M1，M2，M3，M4，M5和M6浓度分别为0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.22mg/ml，0.11mg/ml，0.17mg/ml，进行冻干保存。
实施例2可溶性Tim-3抑制单核细胞活化释放炎症因子
1.可溶性Tim-3对单核细胞的TNF-α细胞因子分泌能力的剂量依赖效应
磁珠分选健康人外周血原代单核细胞，在1μg/ml LPS刺激细胞时，将可溶性Tim-3以10、20、40和80ng/ml浓度同时处理原代单核细胞，1μg/ml LPS刺激24h；1μg/ml LPS先刺激单核细胞30min，再将可溶性Tim-3以10、20、40和80ng/ml浓度干预原代单核细胞，1μg/mlLPS总共刺激24h。收集细胞上清液，并采用ELISA检测其中TNF-α水平，所用的仪器是美国Bio-Rad伯乐酶标仪iMark吸收光标酶标仪，所用试剂是TNF-αELISA试剂盒，具体步骤按照说明书操作。
如图2所示，与LPS组相比，可溶性Tim-3显著抑制LPS刺激单核细胞的细胞因子TNF-α分泌能力，具有显著性差异，而且具有剂量依赖效应。而且可溶性Tim-3与LPS同时干预比LPS先刺激30min的细胞因子TNF-α分泌的抑制效果更好，其中最高剂量80ng/ml可溶性Tim-3的TNF-α抑制效果最好。
2.可溶性Tim-3对单核细胞的HMGB1分泌能力效应
磁珠分选健康人外周血原代单核细胞，在1μg/ml LPS刺激细胞时，将可溶性Tim-3以20ng/ml浓度同时处理原代单核细胞，1μg/ml LPS刺激24h，收集细胞上清液，并采用ELISA检测其中HMGB1水平，所用的仪器是美国Bio-Rad伯乐酶标仪iMark吸收光标酶标仪，所用试剂是HMGB1 ELISA试剂盒，具体步骤按照说明书操作。
如图3所示，与LPS组相比，可溶性Tim-3显著抑制LPS刺激单核细胞的炎症介质HMGB1分泌能力，具有显著性差异。
实施例3可溶性Tim-3对肝衰竭的肝损伤作用
1.慢加急性肝衰竭患者单核细胞的可溶性Tim-3和膜式Tim-3表达水平
收集慢加急性肝衰竭患者(ACLF,n＝8)、慢性乙型肝炎患者(CHB,n＝8)和健康对照(HC,n＝8)外周血。对于外周血样本，用抗人CD14-APC流式抗体和抗人Tim-3-PE流式抗体与血液标本100μl混匀，室温避光孵育15min，加入红细胞裂解液1ml混匀，室温避光孵育10min后，离心，加洗涤液洗涤，重悬后准备上机测定。打开流式分析软件，收集100000个细胞，分析CD14阳性单核细胞的Tim-3阳性百分数。图4的结果表明，慢加急性肝衰竭患者(ACLF,n＝8)、慢性乙型肝炎患者(CHB,n＝8)和健康对照(HC,n＝8)的血浆可溶性Tim-3(sTim-3)水平随疾病进展表达水平显著上升，而单核细胞膜上Tim-3(mTim-3)水平随疾病进展而显著降低。2.可溶性Tim-3对急性肝衰竭小鼠的肝损伤作用
模型组采用D-氨基半乳糖胺(D-GalN)联合内毒素(LPS)诱导小鼠急性肝衰竭模型，可溶性Tim-3治疗组是急性肝衰竭模型在造模后30min，再经尾静脉注射可溶性Tim-3，对照组是小鼠经尾静脉注射生理盐水。所用的C57BL/6小鼠为：雄性，6-8周龄，18-20g。HE染色检测的肝组织学表现，发现sTim-3显著改善肝细胞坏死，对该模型具有保护作用(图5)。
实施例4突变型和未突变sTim-3蛋白对单核细胞TNF-α分泌的抑制效应
实施例的突变型sTim-3蛋白序列是SEQ ID NO:2-7(连接有组氨酸和连接肽的氨基酸序列，M1,M2,M3,M4,M5,M6)。M0和sTim-3都是未突变的sTim-3蛋白序列，其中M0是与突变型sTim-3一起重组表达，sTim-3是商用重组蛋白。
磁珠分选健康人外周血原代单核细胞，在1μg/ml LPS刺激细胞时，将可溶性Tim-3以20ng/ml浓度提前30min处理原代单核细胞，再用1μg/ml LPS刺激24h。收集细胞上清液，并采用ELISA检测其中TNF-α水平，所用的仪器是美国Bio-Rad伯乐酶标仪iMark吸收光标酶标仪，所用试剂是国产TNF-αELISA试剂盒，具体步骤按照说明书操作。
如图6所示，与LPS组相比，突变型sTim-3蛋白(M1，M2,M3和M4)，M0和sTim-3都显著抑制LPS刺激单核细胞的细胞因子TNF-α分泌能力，具有显著性差异，而M5和M6都未显著抑制LPS刺激单核细胞的细胞因子TNF-α分泌能力。重组蛋白(M0，M1，M2，M3，M4，M5，M6)与商业sTim-3相比，抑制TNF-α分泌能力无显著差异。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用
<130> 21-2019-1401
<141> 2019-10-24
<150> 2018112516828
<151> 2019-10-25
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg
<210> 2
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Arg Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
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Claims (10)
1.可溶性Tim-3重组蛋白用于制备具有调控单核细胞功能的药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用，所述可溶性Tim-3重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控单核细胞功能的药物可用于抑制炎症患者的单核细胞过度活化；所述增强肿瘤免疫应答的功能的药物可用于增强癌症患者的免疫应答，避免宿主免疫逃逸。
3.可溶性Tim-3重组蛋白的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：将含有重组人可溶性Tim-3的真核CHO细胞、原核大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统细胞培养液通过微滤澄清、超滤浓缩换液后，再经过阴阳离子层析柱、分子筛层析、疏水层析柱和/或亲和层析柱，获得足够纯度可溶性Tim-3重组蛋白；所述可溶性Tim-3重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
4.一种可溶性Tim-3重组突变型蛋白，其特征在于:该突变型蛋白为：在人Tim-3(NP_116171.3)胞外结构域氨基酸(SEQ ID NO:1)对应的基因序列基础上，通过定向进化技术筛选得到突变基因，其突变位点不涉及物种间的保守序列，发生在非保守序列位置，进而表达的可溶性Tim-3重组突变型蛋白。
5.可溶性Tim-3重组突变型蛋白，其氨基酸序列为：SEQ ID NO:2-7之一。
6.根据权利要求4或5所述的可溶性Tim-3重组突变型蛋白，其特征在于:所述可溶性Tim-3重组突变型蛋白还包含组氨酸标签序列；组氨酸标签序列前加上连接肽。
7.根据权利要求6所述的可溶性Tim-3重组突变型蛋白，其特征在于:所述组氨酸标签序列为HHHHHH，所述连接肽为(G)nS，n＝1-4。
8.权利要求4-7任一所述可溶性Tim-3重组突变型蛋白的制备方法，其特征在于：在人Tim-3(NP_116171.3)胞外结构域氨基酸(SEQ ID NO:1)对应的基因序列基础上，通过定向进化技术筛选得到突变基因，进而氨基酸表达成可溶性Tim-3重组突变型蛋白。
9.权利要求4或5所述的可溶性Tim-3突变型蛋白用于制备具有调控单核细胞功能的药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述调控单核细胞功能的药物可用于抑制炎症患者的单核细胞过度活化；所述增强肿瘤免疫应答的功能的药物可用于增强癌症患者的免疫应答，避免宿主免疫逃逸。
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