CN110651716A - 一种莼菜细胞工程苗快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种莼菜胚性愈伤组织诱导及细胞工程苗快繁方法。本发明选取莼菜幼芽或种子，经消毒后接种到愈伤组织诱导培养基；待愈伤组织诱导出来后，筛选其中的胚性愈伤组织进行继代培养；待胚性愈伤组织数量足够时，将其转接至分化培养基以诱导芽的再生；将再生芽切下并转接至生根培养基；将完整小苗取出，经炼苗后形成可供应用的健康细胞工程苗。与现有技术中莼菜的组培快繁方法相比，本发明有效解决了莼菜在组织培养条件下通过胚性愈伤组织再生问题，实现了莼菜高效稳定的组培体系，为加快莼菜优质种苗工厂化生产提供技术支撑，为其工厂化生产提供了一条有效途径。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种莼菜胚性愈伤组织诱导及细胞工程苗快繁方法。
背景技术
莼菜(学名Brasenia schreberi J.F.Gmel.)为睡莲科莼属水生植物，是国家I级重点保护野生植物(国务院1999年8月4日批准)，也是我国历史上一种著名的水生蔬菜，位列太湖流域“水八仙”之首。其可食幼芽和嫩叶被厚厚的胶质包裹，鲜美滑嫩，独具特色。并因该胶质成份富含酸性多糖、蛋白质、多种维生素和矿物质等营养成分，具有清热祛痰、解毒、消肿、抗炎和提高免疫力等功效，莼菜被广泛认同为一种药食两用的重要水生植物资源。
目前中国莼菜产业在其原产地江苏苏州和浙江杭州已濒临消失，取而代之的是湖北利川和重庆石柱等中部山区。野生莼菜可同时通过越冬芽及地下茎进行无性繁殖或通过种子进行有性繁殖，但以前者为主。莼菜人工栽培都以越冬芽及地下茎进行移栽。近年来中国莼菜优质种源稀缺，不仅自然环境中很难收集到足够繁殖体，且已收集的繁殖体多带菌严重，导致湖北、重庆等产区莼菜种源退化明显，农民急需优质健康莼菜种苗进行更新换代。
现有莼菜种苗人工繁殖方法包括水生藻安生物科技(武汉)有限公司申请的专利技术一种莼菜丛生芽的诱导方法(授权公告号CN106900550B)和西南大学申请的一种莼菜的组织培养方法(授权公告号CN106577272B)。两者均以莼菜外植体茎段为基础，直接利用激素进行再生芽的诱导。该方法可以得到无菌优质种苗，但繁殖效率仍比较低。
发明内容
本发明需要解决的问题是针对现有技术中存在的不足，提供一种莼菜胚性愈伤组织的诱导及基于该胚性愈伤组织的细胞工程苗快速繁殖方法，以显著提高莼菜优质细胞工程苗的扩繁速率，为其工厂化生产提供技术支持。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明所述莼菜细胞工程苗快繁方法由莼菜胚性愈伤组织诱导和基于莼菜胚性愈伤组织的细胞工程苗快繁方法构成。
1莼菜胚性愈伤组织诱导由以下步骤构成：
1)选取莼菜生命力较强的嫩芽或种子，经70％-75％乙醇消毒处理0.5～3min后，以无菌水漂洗干净，再经含有效氯0.5％～1％的NaClO溶液或0.05％～0.5％HgCl2溶液或2％～5％H2O2溶液二次消毒5～40min，再次以无菌水漂洗干净，置于无菌操作台中；
2)将上述步骤1)所得消毒后的材料接种到愈伤组织诱导培养基MD中，使其脱分化为愈伤组织，所述MD培养基配方为1/2～1倍标准用量的市售MS基本成分+15～40g/L蔗糖+0.3～2.0mg/L 2,4-D+5％～10％椰子汁，pH 5.6～5.8；
3)取上述步骤2)所得无菌愈伤组织，经显微镜镜检后选取其中黄色或绿色胚性组织，转入新配MD或MDB培养基中进行交替继代培养，此后每隔20～50d更新一次培养基，以获得足够数量的胚性愈伤组织,其中MD培养基配方同上，MDB培养基配方为原MD基础上再加0.1～1.0mg/L 6-BA；
所述步骤2)、3)均在无菌培养室中进行，光密度50～120μmol/m2/s,光照周期10～12h/d，室内温度25±5℃。
2.基于莼菜胚性愈伤组织的细胞工程苗快繁方法，由以下步骤构成：
1)将莼菜胚性愈伤组织接入分化培养基CS中，以诱导莼菜丛生芽的分化，所述CS培养基配方为1/2～1倍标准用量的市售MS基本成分+15～40g/L蔗糖+1.0～3.0mg/L 6-BA+0.2～1.0mg/L IBA+5％～10％椰子汁，pH 5.6～5.8；
2)取上述步骤1)中所得新生芽，转入生根培养基CR中，以诱导莼菜根的分化，所述CR培养基配方为1/4～1倍标准用量的市售MS基本成分+15～30g/L的蔗糖+0.2～1.0mg/LNAA+5％～10％椰子汁，pH 5.6～5.8；
3)取上述步骤2)中所得完整幼苗，转入大塑料盆中进行水培炼苗，并按照1/10～1/2浓度加入Hoagland营养液，直至形成株高10cm以上、根系发达的健康细胞工程苗；
所述步骤1)、2)均在无菌培养室中进行，光密度100～200μmol/m2/s,光照周期8～12h/d，室内温度25±5℃；所述步骤3)在普通实验室或玻璃温室中进行，其中普通实验室光密度100～300μmol/m2/s,光照周期8～12h/d，室内温度25±5℃；玻璃温室采用太阳光自然光照，控温25±5℃。
本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明首次成功获得了莼菜胚性愈伤组织，并通过胚性愈伤组织诱导再生获得健康莼菜细胞工程苗。与现有技术相比，本发明改用胚性愈伤组织进行诱导后，单块愈伤组织的平均从芽诱导率为大小相似茎段(茎节)的10倍以上。为农业生产提供了一种莼菜优质细胞工程苗，大大提高了扩繁速率，为加快莼菜优质种苗工厂化生产提供技术支撑，为其工厂化生产提供了一条有效途径
附图说明
图1为莼菜胚性愈伤组织；其中图1-A为绿色胚性愈伤组织；图1-B为黄色胚性愈伤组织；
图2为由胚性愈伤组织诱导出来的莼菜丛生芽；其中图2-A为单块胚性愈伤组织分化所得丛生芽；图2-B为一瓶胚性愈伤组织分化所得丛生芽；
图3为已诱导生根的莼菜完整幼苗；其中图3-A为已生根莼菜培养瓶的侧视照片；图3-B为已生根莼菜培养瓶的底部照片；
图4为已完成炼苗的莼菜优质细胞工程苗；其中图4-A为经温室中炼苗的莼菜健康细胞工程苗；图4-B为经普通实验室炼苗的莼菜健康细胞工程苗。
具体实施方式
实施例1莼菜胚性愈伤组织诱导及细胞工程苗快繁方法，具体步骤如下：
1)取莼菜新生幼嫩春芽，经70％乙醇消毒处理3min后，以无菌水漂洗干净，再经0.1％HgCl2溶液二次消毒30min，再次以无菌水漂洗干净，置于无菌操作台中。
2)将上述步骤1)所得消毒后的材料接种到愈伤组织诱导培养基MD中，使其脱分化为愈伤组织。MD培养基配方为2.2～4.4g/L Sigma公司产MS基本成分+15～30g/L蔗糖+0.3～3.0mg/L 2,4-D+10％椰子汁，pH 5.64。所得诱导效果如表1所示。
表1几种MD培养基愈伤诱导效果比较
由上表可知，1/2和1倍标准含量的MS基本成分、15和30g/L的蔗糖以及5％和10％的椰子汁均适合于莼菜愈伤组织的诱导，两种组合基本营养成分下愈伤组织的生长效果各有优势，低浓度下材料整体增长速度快，但组织比较疏松；高浓度下材料整体增长速度略低，但组织紧密。另外3.0mg/L的2,4-D浓度过高，不利于莼菜愈伤组织的诱导。0.3mg/L的2,4-D可诱导莼菜愈伤组织，但效果较差。鉴于此，本方法确定0.3～2.0mg/L的2,4-D为莼菜愈伤组织诱导的使用范围。
3)从上述步骤所得愈伤组织中，选取其中黄绿色无菌胚性组织(如图1-A)，转入新配MD培养基中进行继代培养。40d后转入MDB培养基中再培养40d以进一步扩繁，所用MDB培养基配方为4.4g/L MS基本成分+30g/L蔗糖+1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+10％椰子汁，pH 5.72。
上述愈伤组织诱导和扩繁过程均在无菌培养室中进行，光密度100±20μmol/m2/s,光照周期10h/d，室内温度25±2℃。
4)无菌条件下收获上述扩繁所得莼菜胚性愈伤组织，转接入分化培养基CS中，以诱导莼菜丛生芽的分化。所用CS培养基配方为2.2g/L的MS基本成分+30g/L蔗糖+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+10％椰子汁，pH 5.80。
5)40d后收获上述步骤中所得丛生芽(如图2-A)，于无菌条件下将每个幼芽从组织块上切下并转入生根培养基CR中，以诱导莼菜根的分化。所用CR培养基配方为2.2g/L的MS基本成分+15g/L蔗糖+0.2mg/L NAA+5％椰子汁，pH 5.60。上述莼菜丛生芽和根的分化均在无菌培养室中进行，光密度150±20μmol/m2/s,光照周期12h/d，室内温度25±2℃。
6)30d后收获上述步骤所得已经生根的莼菜完整幼苗(如图3-A)，转入容积为45L的大塑料盆中进行水培炼苗，并按照1/10比例补充Hoagland营养液，直至形成株高10cm以上、根系发达的健康细胞工程苗(如图4-A)。该炼苗过程在玻璃温室中进行，采用自然光照，温室控温25±5℃。
实施例2莼菜胚性愈伤组织诱导及细胞工程苗快繁方法，具体步骤如下：
1)取饱满莼菜种子，经70％乙醇消毒处理3min后，以无菌水漂洗干净，再经含有效氯0.5％的NaClO溶液二次消毒15min，再次以无菌水漂洗干净，置于无菌操作台中。
2)将上述步骤1)所得消毒后的材料接种到愈伤组织诱导培养基MD中，使其脱分化为愈伤组织。所用MD培养基配方为2.2g/L Sigma公司产MS基本成分+30g/L蔗糖+0.5mg/L2,4-D+10％椰子汁，pH 5.68。
3)从上述步骤所得愈伤组织中选取黄色无菌胚性组织(如图1-B)，转入新配MD培养基中进行继代培养。40d后转入MDB培养基中再培养40d以进一步扩繁，所用MDB培养基配方为2.2g/L MS基本成分+30g/L蔗糖+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+10％椰子汁，pH5.60。
上述愈伤组织诱导和扩繁过程均在无菌培养室中进行，光密度100±20μmol/m2/s,光照周期10h/d，室内温度25±2℃。
4)无菌条件下收获上述扩繁所得莼菜胚性愈伤组织，转接入分化培养基CS中，以诱导莼菜丛生芽的分化。所用CS培养基配方为2.2g/L的MS基本成分+15～30g/L蔗糖+2.0mg/L 6-BA+0～0.5mg/L IBA+10％椰子汁，pH 5.80。
为比较本发明之通过胚性愈伤组织诱导丛生芽与现有技术之直接利用茎段诱导丛生芽的效果差异，同时取已消毒的莼菜茎段，切割成单节后接种至相同培养基，单个茎节材料体积与单块愈伤组织相似，并在相同组培室环境中培养。经40d后得两种材料的芽分化效果如表2所示。
表2两种材料在不同CS培养基中的芽分化效果
由上述对比实验可知，相同诱导分化条件下，莼菜胚性愈伤组织平均出芽率为相同大小茎节出芽率的14～29倍。
5)收获上述步骤中由胚性愈伤组织诱导所得丛生芽(如图2-B)，于无菌条件下将每个幼芽从组织块上切下并转入生根培养基CR中，以诱导莼菜根的分化。所用CR培养基配方为2.2g/L的MS基本成分+15g/L蔗糖+0.2mg/L NAA+10％椰子汁，pH 5.76。
上述莼菜丛生芽和根的分化均在无菌培养室中进行，光照150±20μmol/m2/s,光照周期12h/d，室内温度25±2℃。
6)30d后收获上述步骤所得已经生根的莼菜完整幼苗(如图3-B)，转入容积为45L的大塑料盆中进行水培炼苗，并按照1/10比例补充Hoagland营养液，直至形成株高10cm以上、根系发达的健康细胞工程苗(如图4-B)。该炼苗过程在普通实验室中进行，维持光照200±50μmol/m2/s,光照周期12h/d，温室控温25±2℃。
Claims (3)
1.一种莼菜细胞工程苗快繁方法，其特征是由莼菜胚性愈伤组织诱导和基于莼菜胚性愈伤组织的细胞工程苗快繁方法构成。
2.根据权利要求1所述莼菜细胞工程苗快繁方法，其特征是莼菜胚性愈伤组织的诱导由以下步骤构成：
1)选取莼菜生命力较强的嫩芽或种子，经70％-75％乙醇消毒处理0.5～3min后，以无菌水漂洗干净，再经含有效氯0.5％～1％的NaClO溶液，或0.05％～0.5％的HgCl2溶液，或2％～5％的H2O2溶液，二次消毒5～40min，再次以无菌水漂洗干净，置于无菌操作台中；
2)将上述步骤1)所得消毒后的材料接种到愈伤组织诱导培养基MD中，使其脱分化为愈伤组织，所述MD培养基配方为1/2～1倍标准用量的市售MS基本成分+15～40g/L蔗糖+0.3～2.0mg/L 2,4-D+5％～10％椰子汁，pH 5.6～5.8；
3)取上述步骤2)所得无菌愈伤组织，经显微镜镜检后选取其中黄色或绿色胚性组织，转入新配MD或MDB培养基中进行交替继代培养，此后每隔20～50d更新一次培养基，以获得足够数量的胚性愈伤组织,其中MD培养基配方同上，MDB培养基配方为原MD基础上再加0.1～1.0mg/L 6-BA；
4)所述步骤2)、3)均在无菌培养室中进行，光密度50～120μmol/m2/s,光照周期10～12h/d，室内温度25±5℃。
3.根据权利要求1所述莼菜细胞工程苗快繁方法，其特征是基于莼菜胚性愈伤组织的细胞工程苗快繁方法，由以下步骤构成：
1)将莼菜胚性愈伤组织接入分化培养基CS中，以诱导莼菜丛生芽的分化，所述CS培养基配方为1/2～1倍标准用量的市售MS基本成分+15～40g/L蔗糖+1.0～3.0mg/L 6-BA+0.2～1.0mg/L IBA+5％～10％椰子汁，pH 5.6～5.8；
2)取上述步骤1)中所得新生芽，转入生根培养基CR中，以诱导莼菜根的分化，所述CR培养基配方为1/4～1倍标准用量的市售MS基本成分+15～30g/L蔗糖+0.2～1.0mg/L NAA+5％～10％椰子汁，pH 5.6～5.8；
3)取上述步骤2)中所得完整幼苗，转入大塑料盆中进行水培炼苗，并按照1/10～1/2浓度加入Hoagland营养液，直至形成株高10cm以上，根系发达的健康细胞工程苗；
4)所述步骤1)、2)均在无菌培养室中进行，光密度100～200μmol/m2/s,光照周期8～12h/d，室内温度25±5℃，所述步骤3)在普通实验室或玻璃温室中进行，其中普通实验室光密度100～300μmol/m2/s,光照周期8～12h/d，室内温度25±5℃，玻璃温室采用太阳光自然光照，控温25±5℃。
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