CN110646538A - 一种基于hplc和spss分析技术的木瓜药材质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法,涉及中药材质量评价方法技术领域。首先采用HPLC方法对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定,包括供试品制备、对照品的制备、色谱条件、线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验步骤。然后通过SPSS分析比较不同产地木瓜药材中齐墩果酸、熊果酸含量以及总含量的差异性,评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性,达到评价不同产地木瓜药材的质量差异的结论。考察了不同产地木瓜药材的质量,以齐墩果酸和熊果酸的含量为指标,进行HPLC含量测定和SPSS软件分析比较不同产地木瓜药材质量,为木瓜药材质量评价提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药材质量评价方法技术领域,特别涉及一种基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法。
背景技术
木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的干燥成熟果实,早在《神农本草经》中记载:“木瓜,生夷陵(今湖北宜昌附近)”;《本草经集注》:“山阴兰亭尤多,今处处有之,而宣城者为佳。”;《本草乘雅半偈》中也有“木瓜处处有之,西雒者最胜,宣城者亦佳,山阴兰亭尤多也。”的记载;《本草纲目》中有“木瓜处处有之,而宣城者为佳”的记载。可见,本草古籍中木瓜的产地为安徽、湖北等地。
现代木瓜的主要产区有安徽、湖北、四川等地,与本草古籍中的记载基本吻合。本发明技术方案选择安徽、湖北、四川三地的木瓜药材进行比较以评价木瓜药材的质量。文献研究显示,不同产地木瓜药材质量的比较中已进行木瓜多糖含量、多种有机酸含量等的研究,而仅针对有效成分齐墩果酸和熊果酸进行的质量比较较少。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法,以齐墩果酸和熊果酸的含量为指标,进行HPLC含量测定和SPSS软件分析比较不同产地木瓜药材质量,为木瓜药材质量评价提供科学依据。
为实现该目的,本发明采用了以下技术方案:
一种基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法,首先采用HPLC方法,对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定,然后进行SPSS分析比较不同产地木瓜药材质量。
作为本发明的优选技术方案,采用HPLC方法对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定的方法步骤为:
①、供试品制备
取不同产地若干批次的干燥木瓜细粉0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声处理20min,放冷,再称定重量,用甲醇补足失去重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
②、对照品的制备
分别称取齐墩果酸、熊果酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含齐墩果酸1.01mg、熊果酸1.43mg的混合对照品母液;精密量取混合对照品母液适量,加甲醇稀释成每1mL含齐墩果酸0.101mg、熊果酸0.143mg的混合对照品溶液;
③、色谱条件
色谱柱:Agilent 5HC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265:35:0.1:0.05)等度洗脱;检测波长:210nm;流速:0.6mL/min;柱温:25℃;进样量:20uL;
利用步骤③色谱条件对不同产地若干批次的木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定。
作为本发明的优选技术方案,采用HPLC方法对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定时还包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验步骤,具体为:
①、线性关系考察
精密吸取混合对照品母液0.2、0.4、0.8、1.5、2.0mL,分别置于10mL容量瓶中,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,按色谱条件进样并计算线性回归方程,评价齐墩果酸、熊果酸在检测浓度范围内与峰面积之间的线性关系;
②、精密度试验
精密吸取混合对照品溶液,连续进样6次,测量齐墩果酸、熊果酸峰面积RSD值,评价精密度;
③、稳定性试验
取同一份供试品溶液,在0、4、12、24、36、48h进样,测量齐墩果酸和熊果酸的峰面积RSD值,评价供试品中的齐墩果酸和熊果酸的稳定性;
④、重复性试验
平行称取6份同一批样品,制备6份供试品溶液,并按色谱条件进样,测定峰面积并计算齐墩果酸和熊果酸的含量RSD值,评价方法的重复性;
⑤、加样回收率试验
取已知含量的木瓜样品粉末6份各0.50g,分别精密加入齐墩果酸和熊果酸对照品适量,按色谱条件进样,并以个峰面积计算RSD,并计算平均回收率。
作为本发明的优选技术方案,通过SPSS分析比较不同产地木瓜药材中齐墩果酸、熊果酸含量以及总含量的差异性,评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性,最后达到评价不同产地木瓜药材的质量差异的结论。
作为本发明的进一步优选技术方案,分析比较不同产地木瓜药材中齐墩果酸、熊果酸含量以及总含量的差异性的步骤为:采用SPSS软件进行多独立样本的非参数检验,将测定的不同产地木瓜药材中齐墩果酸含量、熊果酸含量及其总含量作为检验变量,产地作为分组变量,评价不同产地间齐墩果酸、熊果酸含量、齐墩果酸与熊果酸总含量的差异性。
分析评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性的步骤为:采用SPSS软件对不同产地木瓜药材中齐墩果酸/熊果酸比值和产地进行相关性分析,评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性。
评价不同产地木瓜药材的质量差异的结论的步骤为:分别以木瓜药材中齐墩果酸与熊果酸总含量不低于0.5%、0.6%、0.7%为标准,采用SPSS软件统计不同产地木瓜药材合格率,评价不同产地木瓜药材的质量差异。
本发明的基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法,考察了不同产地木瓜药材的质量,以齐墩果酸和熊果酸的含量为指标,进行HPLC含量测定和SPSS软件分析比较不同产地木瓜药材质量,为木瓜药材质量评价提供科学依据。
附图说明
图1为对照品HPLC色谱图。
图2为木瓜S13号供试品HPLC色谱图。
图3为各产地木瓜中齐墩果酸/熊果酸比值折线图。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施例进一步详细说明本发明的基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法。
一种基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法,首先采用HPLC方法,对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定,然后进行SPSS分析比较不同产地木瓜药材质量。具体步骤如下:
1、仪器与试药
美国Agilent1260高效液相色谱仪(DAD检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置和自动进样器);BP211D电子天平(SartoriusBP211D);超声波清洗器(KQ-300VDE,昆山市超声仪器有限公司);水浴锅(HH-S,巩义市英峪予华仪器厂)。
甲醇为色谱纯;对照品:齐墩果酸(批号:110709-201206)、熊果酸(批号:110742-200314),中国食品药品检定研究院;其余试剂均为分析纯。
38批不同产地木瓜药材(见表1),经鉴定为皱皮木瓜Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai。
表1 38批木瓜药材产地分布
2、实验方法
2.1、供试品制备
取干燥木瓜细粉0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声处理20min,放冷,再称定重量,用甲醇补足失去重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2、对照品的制备
分别称取齐墩果酸、熊果酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含齐墩果酸1.01mg、熊果酸1.43mg的混合对照品母液;精密量取混合对照品母液适量,加甲醇稀释成每1mL含齐墩果酸0.101mg、熊果酸0.143mg的混合对照品溶液。
2.3、色谱条件
色谱柱:Agilent 5HC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265:35:0.1:0.05)等度洗脱;检测波长:210nm;流速:0.6mL/min;柱温:25℃;进样量:20uL。
图1为对照品HPLC色谱图(1齐墩果酸;2熊果酸),图2为木瓜S13号供试品HPLC色谱图(1齐墩果酸;2熊果酸)。通过图1和2可以看出,供试品色谱中齐墩果酸和熊果酸峰的保留时间与对照品的保留时间一致,理论塔板数按齐墩果酸峰计不低于5000,分离度大于1.5。
2.4、线性关系考察
精密吸取“2.2项下”的混合对照品母液0.2、0.4、0.8、1.5、2.0mL,分别置于10mL容量瓶中,并用甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件进样并计算线性回归方程为:齐墩果酸y=24521.311x–66.227,r=0.9995(n=5);熊果酸y=10504.635x–33.497,r=0.9995(n=5);结果表明,齐墩果酸、熊果酸在检测浓度范围分别为0.020~0.202mg/mL、0.029~0.286mg/mL内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5、精密度试验
精密吸取“2.2项下”混合对照品溶液,连续进样6次,结果齐墩果酸峰面积RSD=0.96%,熊果酸峰面积RSD=0.91%,均小于2.50%,表明精密度良好。
2.6、稳定性试验
取同一份供试品溶液(S13),在0、4、12、24、36、48h进样,齐墩果酸和熊果酸的峰面积RSD值分别为1.14%和1.04%,均小于2.50%,说明供试品中的齐墩果酸和熊果酸在24小时内稳定。
2.7、重复性试验
平行称取6份同一批样品(S13),制备6份供试品溶液,并按上述色谱条件进样,测定峰面积并计算齐墩果酸和熊果酸的含量,结果齐墩果酸和熊果酸的含量RSD值分别为1.59%和2.16%,均小于3.00%,说明本方法重复性良好。
2.8、加样回收率试验
取已知含量的宣木瓜样品(S13)粉末6份各0.50g,分别精密加入齐墩果酸和熊果酸对照品适量,按上述色谱条件进样,并以个峰面积计算RSD。结果表明:齐墩果酸回收率:101.82%、98.28%、99.09%、100.91%、100.91%、99.27%,平均回收率为100.04%,RSD为1.65%。熊果酸回收率:98.49%、98.00%、100.26%、102.22%、99.03%、98.72%,平均回收率为99.45%,RSD为1.56%。表明结果可靠。
3、结果与讨论
3.1、含量测定结果
安徽、湖北及四川三个产地的木瓜含量测定结果如表2所示,齐墩果酸与熊果酸总含量以下记作“总含量”:
表2各产地木瓜含量测定结果(%,x±s)
产地 | 齐墩果酸含量 | 熊果酸含量 | 总含量 |
安徽产地(n=19) | 0.32±0.08 | 0.34±0.09 | 0.66±0.12 |
湖北产地(n=13) | 0.46±0.04 | 0.08±0.01 | 0.55±0.04 |
四川产地(n=6) | 0.19±0.09 | 0.35±0.19 | 0.54±0.17 |
将表2结果采用SPSS软件进行多独立样本的非参数检验,将齐墩果酸含量、熊果酸含量及其总含量作为检验变量,产地作为分组变量,提示不同产地间齐墩果酸、熊果酸含量、齐墩果酸与熊果酸总含量无显著性差异。从平均值上来看,湖北产地的熊果酸含量相对较低,而四川产地的齐墩果酸含量相对较低。下面将进一步从齐墩果酸/熊果酸含量比值来探究不同产地间的差异。
3.2、各产地木瓜齐墩果酸/熊果酸比值
采用SPSS软件对三个产地的齐墩果酸/熊果酸比值和产地进行相关性分析,P<0.05(P=0.029),显示产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在显著相关性。从图3(各产地齐墩果酸/熊果酸比值折线图)可见,安徽产地和湖北产地木瓜在齐墩果酸/熊果酸的百分含量比值上有很大差异。在此次样品收集过程中发现,湖北产地木瓜现在的繁殖方式主要为无性繁殖嫁接技术,植株生长年限短;而安徽产区木瓜多为种子繁殖方式,植株生长年限较长;四川产地木瓜亦多为种子繁殖方式,熊果酸含量亦较高;因此推测可知熊果酸含量的差异可能跟繁殖方式和植株的生长年限有关。
3.3、各产地木瓜总含量达标率
现行版药典中木瓜项下含量测定齐墩果酸与熊果酸总含量(%)应不低于0.5,在此基础上提高标准,计算各产地合格率,如表3所示。
表3木瓜总含量达标率(%)
样本数(总样本占比) | ≥0.5(n=36) | ≥0.6(n=15) | ≥0.7(n=7) |
安徽产地 | 19(52.78%) | 12(80%) | 6(85.71%) |
湖北产地 | 13(36.11%) | 2(13.33%) | 0 |
四川产地 | 4(11.11%) | 1(6.67%) | 1(14.29%) |
从表3可以见,提高标准后,安徽产区木瓜齐墩果酸与熊果酸总含量达标率明显高于其他两个产区,提示安徽产区木瓜质量较优良。
3.4、安徽产地木瓜质量较好
课题组在2009年对不同产地木瓜中齐墩果酸与熊果酸进行过初步研究,涉及皱皮木瓜及其不同亚型品种、光皮木瓜和榠楂等不同基源的含量比较,存在采样量少和部分品种不是现行药典收载品种等问题。随着中药木瓜的种植栽培技术的发展,皱皮木瓜得到广泛的种植,故本次实验在前期研究基础上,选择基源为贴梗海棠的木瓜以齐墩果酸、熊果酸含量为指标,不局限于宣城、资丘等地,扩大采样范围,加大样本量,对3个主要产地进行质量比较。
含量测定结果发现,在现行药典含量标准基础上不能很明显地对3个产地木瓜进行质量划分。但是,在提高现有总含量标准后,安徽产地木瓜达标率仍能保持在80%以上,明显高于其他两产地,从而提示安徽产地木瓜药材质量更好。
3.5、湖北木瓜的区分
在齐墩果酸与熊果酸含量比值方面,安徽产地木瓜药材中齐墩果酸与熊果酸含量比值≤2,而湖北产地木瓜药材中齐墩果酸与熊果酸含量比值>4,四川产地木瓜药材中齐墩果酸与熊果素含量比值<1(有一批比值高于1是因为其熊果酸含量极低),提示四川产地木瓜质量参差不齐。此次试验利用齐墩果酸/熊果酸含量的比值即可区分出湖北产地木瓜。
需要指出的是,本发明不仅仅限于以上列举的实施例,凡是能从本发明内容直接导出或启示联想得到的相关技术均应属于本发明涵盖保护的范围。
Claims (7)
1.一种基于HPLC和SPSS分析技术的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:首先采用HPLC方法,对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定,然后进行SPSS分析比较不同产地木瓜药材质量。
2.如权利要求1所述的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:采用HPLC方法对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定的方法步骤为:
①、供试品制备
取不同产地若干批次的干燥木瓜细粉0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声处理20min,放冷,再称定重量,用甲醇补足失去重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
②、对照品的制备
分别称取齐墩果酸、熊果酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含齐墩果酸1.01mg、熊果酸1.43mg的混合对照品母液;精密量取混合对照品母液适量,加甲醇稀释成每1mL含齐墩果酸0.101mg、熊果酸0.143mg的混合对照品溶液;
③、色谱条件
色谱柱:Agilent 5HC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265:35:0.1:0.05)等度洗脱;检测波长:210nm;流速:0.6mL/min;柱温:25℃;进样量:20uL;
利用步骤③色谱条件对不同产地若干批次的木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定。
3.如权利要求2所述的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:采用HPLC方法对不同产地木瓜药材中熊果酸和齐墩果酸进行含量测定时还包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验步骤,具体为:
①、线性关系考察
精密吸取混合对照品母液0.2、0.4、0.8、1.5、2.0mL,分别置于10mL容量瓶中,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,按色谱条件进样并计算线性回归方程,评价齐墩果酸、熊果酸在检测浓度范围内与峰面积之间的线性关系;
②、精密度试验
精密吸取混合对照品溶液,连续进样6次,测量齐墩果酸、熊果酸峰面积RSD值,评价精密度;
③、稳定性试验
取同一份供试品溶液,在0、4、12、24、36、48h进样,测量齐墩果酸和熊果酸的峰面积RSD值,评价供试品中的齐墩果酸和熊果酸的稳定性;
④、重复性试验
平行称取6份同一批样品,制备6份供试品溶液,并按色谱条件进样,测定峰面积并计算齐墩果酸和熊果酸的含量RSD值,评价方法的重复性;
⑤、加样回收率试验
取已知含量的木瓜样品粉末6份各0.50g,分别精密加入齐墩果酸和熊果酸对照品适量,按色谱条件进样,并以个峰面积计算RSD,并计算平均回收率。
4.如权利要求3所述的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:通过SPSS分析比较不同产地木瓜药材中齐墩果酸、熊果酸含量以及总含量的差异性,评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性,最后达到评价不同产地木瓜药材的质量差异的结论。
5.如权利要求4所述的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:分析比较不同产地木瓜药材中齐墩果酸、熊果酸含量以及总含量的差异性的步骤为:采用SPSS软件进行多独立样本的非参数检验,将测定的不同产地木瓜药材中齐墩果酸含量、熊果酸含量及其总含量作为检验变量,产地作为分组变量,评价不同产地间齐墩果酸、熊果酸含量、齐墩果酸与熊果酸总含量的差异性。
6.如权利要求4所述的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:分析评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性的步骤为:采用SPSS软件对不同产地木瓜药材中齐墩果酸/熊果酸比值和产地进行相关性分析,评价产地与齐墩果酸/熊果酸的比值存在的相关性。
7.如权利要求4所述的木瓜药材质量评价方法,其特征在于:评价不同产地木瓜药材的质量差异的结论的步骤为:分别以木瓜药材中齐墩果酸与熊果酸总含量不低于0.5%、0.6%、0.7%为标准,采用SPSS软件统计不同产地木瓜药材合格率,评价不同产地木瓜药材的质量差异。
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