CN110646483B - 用于乳制品青霉素g残留检测的纳米免疫传感器及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器及其制备方法，该纳米免疫传感器由工作电极、双层类脂质膜、Ag@Au核‑壳纳米粒子、青霉素G抗体组成，具有制备简单、灵敏度高、检测快速、特异性强、操作简便、能直接检测信号、且具有良好的检测限等优点，克服了现有用于青霉素G检测的生物传感器制备工艺繁琐、设备复杂、且没有足够低的检测限的缺陷，实现了采用无标记免疫电化学方法检测青霉素G的免疫传感器的构建。

Description

用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器及其制法
技术领域
本发明属于化学检测和食品安全技术领域，涉及纳米功能材料与传感器技术，具体涉及乳制品中青霉素G残留检测的纳米免疫传感器及其制备方法。
背景技术
青霉素G(Penicillin G)属于β-内酰胺类抗生素，其问世以来，由于抗菌作用强、疗效高、毒性低，因而得到了广泛应用。畜牧业中上普遍将青霉素G作为奶牛乳房炎防治的常规药物。对乳牛用药不当或未注意给药安全时间等则会造成牛奶中抗生素残留。一般人群长期饮用含有青霉素G残留的牛奶会导致体内某些条件性致病菌产生耐药性，而对青霉素G过敏的人群服用残留有该抗生素的牛奶后会引起过敏反应，对人体健康造成危害。此外，牛奶中残留的青霉素G也对乳制品的品质产生不利影响：在制作酸奶或奶酪的过程中，青霉素G会抑制乳酸菌发酵，造成产量及质量降低。随着社会经济的发展和科学研究的深入，牛奶中抗生素残留引发的食品安全问题日益受到各国食品安全管理部门及国际组织的重视，例如欧盟在508/1999条例中，规定牛奶中青霉素G的最高残留限量(maximum residuelimit，MRL)为4ppb或4×103ng/L，并明文禁止青霉素G残留超出MRL的牛奶上市。因此，开发简便、快速、准确、敏感性高的检测方法，以满足日趋严格的残留限量要求，保障人们饮用牛奶的卫生和安全，是目前亟待解决的问题。
目前，牛奶中青霉素G残留的检测方法主要有微生物检测法、理化检测法以及免疫分析法三类。微生物检测法成本低廉但灵敏度较差。理化检测法具体包括比色法、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等，上述方法普遍具有较高的灵敏度和检出率，但样品前处理复杂、检测时间较长、仪器设备昂贵且需要专门技术人员操作。免疫分析法以酶联免疫吸附测定法(ELISA)应用最为广泛，具有较高的灵敏度和特异性的特点，然而也存在成本较高、检测时间较长的缺点，故不适用于大样本量检测。目前现有用于抗生素检测的生物传感器大多基于酶或离子选择电极采用间接技术方法来检测青霉G，仪器设备和检测步骤复杂，并且没有足够低的检测限。因此，开发出成本低、检测快、灵敏度高、特异性强、操作简便的检测乳制品中青霉素G残留的新方法，是行业领域面临的重要课题。
发明内容
本发明的任务是提供一种基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器。
本发明的另一个任务是提供这种基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器的制备方法。
本发明的又一个任务是提供这种基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器的应用。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器，由工作电极、双层类脂质膜、Ag@Au核-壳纳米粒子、青霉素G抗体组成，双层类脂质膜附着在工作电极的表面构成双层类脂质膜基质，在双层类脂质膜基质的表面沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子，在沉积的Ag@Au核-壳纳米粒子表面修饰有青霉素G抗体。
所述的Ag@Au核-壳纳米粒子是按以下方法制备的金外壳包裹银内核的核-壳结构纳米复合材料：
步骤一：制备Ag胶体溶液：在70℃条件下取0.009～0.09g AgNO3，按0.009g/mL比例加入1～10mL浓度为38.8mmol/L的柠檬酸钠水溶液混匀，随后按1:50体积比加入至100～500mL水中，待溶液变为浅黄色后，冰浴中迅速冷却至25℃，得到Ag胶体溶液；
步骤二：25℃条件下，将步骤一中制得的Ag胶体溶液1～25mL和1mL 38.8
mmol/L的柠檬酸钠水溶液加入至30mL水中，搅拌混匀；
步骤三：在搅拌的同时缓慢将1.2mL浓度为10mmol/L氯金酸(HAuCl4)水溶液和0.1～1mL的100mmol/L抗坏血酸水溶液加入到步骤二所得溶液中，剧烈搅拌至溶液变为酒红色，得到的酒红色溶液即为Ag@Au核-壳结构纳米复合材料，4℃条件下保存。
所述的工作电极可以是玻碳电极。
本发明提供的基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：采用种子胶体法(seed colloid technique)制备Ag@Au核-壳纳米粒子；
步骤B：以双层类脂质膜修饰工作电极，使双层类脂质膜沉积到工作电极的表面形成双层类脂质膜基质，再在双层类脂质膜基质的表面修饰沉积Ag@Au核-壳纳米粒子，得到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极，然后将青霉素G抗体(anti-penicillin G)修饰到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极上。
上述步骤A所述的采用种子胶体法(seed colloid technique)制备Ag@Au核-壳纳米粒子的具体方法是：
步骤(a)：制备Ag胶体溶液：在70℃条件下取0.009～0.09g AgNO3，按0.009g/mL比例加入1～10mL浓度为38.8mmol/L的柠檬酸钠水溶液混匀，随后按1:50体积比加入至100～500mL水中，待溶液变为浅黄色后，冰浴中迅速冷却至25℃，得到Ag胶体溶液；
步骤(b)：25℃条件下，将步骤(a)中制得的Ag胶体溶液1～25mL和1mL 38.8mmol/L的柠檬酸钠水溶液加入至30mL水中，搅拌混匀；
步骤(c)：在搅拌的同时缓慢将1.2mL浓度为10mmol/L氯金酸(HAuCl4)水溶液和0.1～1mL的100mmol/L抗坏血酸水溶液加入到步骤(b)所得溶液中，剧烈搅拌至溶液变为酒红色；得到的酒红色溶液即为Ag@Au核-壳结构纳米复合材料，4℃条件下保存。
上述步骤(b)中Ag胶体溶液加入的体积为12mL；上述步骤(c)中加入的抗坏血酸水溶液加入的体积为0.4mL。
步骤B所述的以双层类脂质膜修饰工作电极，使双层类脂质膜沉积到工作电极的表面形成双层类脂质膜基质，再在双层类脂质膜基质的表面修饰沉积Ag@Au核-壳纳米粒子，得到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极，然后将青霉素G抗体(anti-penicillin G)修饰到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极上的具体方法包括以下步骤：
步骤(1)以玻碳电极为工作电极，在电极上撒氧化铝(Al2O3)抛光粉并滴加少量超纯水，使用麂皮对电极进行机械打磨，然后用超纯水超声水浴清洗电极表面，清洗时间以及次数通常可以为每次5min，重复3次，再依次使用无水乙醇、1：1硝酸溶液和超纯水超声清洗，清洗时间通常可以为5min，最后晾干，晾干通常在常温25℃下进行；
步骤(2)将4g卵磷脂和1g胆固醇以4:1的质量比混匀，按照0.05g/mL比例加入溶解于100mL正癸烷中，搅拌至溶解，制成双层类脂质膜成膜液，4℃冷藏备用；
步骤(3)将10μL成双层类脂质膜成膜液滴加于步骤(1)中得到的电极上，25℃条件下保持15min；
步骤(4)将步骤(3)电极浸入PBS溶液中15min，随后浸入到Ag@Au核-壳纳米粒子溶液中，给予1.5V电压20min，使纳米粒子电沉积在电极表面；所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
步骤(5)将步骤(4)中得到的电极浸入浓度为4.7mg/mL的青霉素G抗体溶液中，4℃条件下保持12h；
步骤(6)将步骤(5)中得到的电极用PBS清洗，在4℃冰箱中保存晾干后，即制得基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器。所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
上述步骤(1)中所述的在电极上撒氧化铝(Al2O3)抛光粉并滴加少量超纯水，使用麂皮对电极进行打磨的具体方法是：依次采用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉滴加少量超纯水，使用麂皮对电极进行打磨。
本发明提供的基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器能用于乳制品青霉素G残留的检测。
本发明的目的在于克服现有用于青霉素G检测生物传感器制备工艺繁琐、设备复杂、且没有足够低的检测限的缺陷，提供一种制备简单、灵敏度高、检测快速、特异性强的免疫传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于乳制品中青霉素G残留的快速、灵敏检测。基于此目的，本发明首先制备了一种新型纳米材料Ag@Au核-壳，即金外壳包裹银内核的核-壳结构纳米复合材料，利用该材料的良好的电子传递性能、生物相容性和大的比表面积，修饰组装到电极表面的双层类脂质膜基质，从而促进电子的传递，同时实现传感器电信号放大。随后将青霉素G抗体(anti-penicillin G)修饰于电极上，利用抗体与抗原的特异性定量结合对电子传输能力的影响，使得电流强度相应降低，最终实现了采用无标记免疫电化学方法检测青霉素G的免疫传感器的构建，其具有操作简便、能直接检测信号、且具有良好的检测限等优点。
本发明提供的基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器的应用方法如下：
(1)标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度(0.1～500ng/mL)的青霉素G标准溶液；
(2)工作曲线绘制：以铂丝电极作为辅助电极，饱和甘汞电极电极作为参比电极，与步骤B所修饰好的工作电极组成三电极体系，连接电化学工作站，采用电化学交流阻抗法，通过检测工作电极结合青霉素G前后的交流阻抗值差异(ΔRct)来对青霉素G进行定量检测，ΔRct＝Rct(AP-P)-Rct(AP)，其中Rct(AP-P)是青霉素G与工作电极结合之后的交流阻抗值，而Rct(AP)则是工作电极在空白标样中的交流阻抗值，ΔRct与青霉素G标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，由此绘制ΔRct－C工作曲线；
(3)青霉素G的检测：用待测乳制品样品代替步骤(1)中的青霉素G标准溶液，按照步骤(2)中的方法进行检测，根据交流阻抗值差异值ΔRct和工作曲线，得到待测样品中青霉素G的含量。
优选的技术方案为：电化学交流阻抗法进行检测具体参数为，电位330mV，交流电压10m V，频率范围：10-1～105Hz。
本发明突出的有益效果在于：(1)本发明所述的免疫传感器制备过程简单，实现了对乳制品中青霉素G残留的快速、灵敏、特异性检测，且制作成本低，检测步骤简便易行，可应用于便携式检测，具有较好的市场应用前景。(2)本发明首次将双层类脂质膜作为基质修饰电极表面，具有以下突出的技术优势：一、双层类脂质膜制作过程非常简单，并且通过成膜液成分的配比能够合理地控制膜的组成成分；二、双层类脂质膜因其具有的高阻抗特性，故能够产生极高的电极电流以及非常低的背景噪音，这一特性对于传感器的研究是非常有益的；双层类脂质膜具有生物膜的基本结构形式和类似于生物细胞膜的生物相容性，可增加电极对抗体的固定量，并且能为包括抗体在内的生物成分的嵌入和固定提供一个接近于细胞膜的天然环境，从理论上来说，在双层类脂质膜中如果嵌入不同的抗体，就能用来检测相应的配体抗原。因此，该基质材料的有效制备，具有重要的科学意义和应用价值。(3)本发明首次将Ag@Au核-壳复合结构纳米颗粒应用于电化学生物传感器的制备中。纳米金银是电子的良导体，可促进电子的传递，从而实现在较低电位下的电分析，避免了高电位所产生的噪音和干扰，同时显著提高了信号强度并实现信号的放大，大大提升了免疫传感器的检测灵敏度，实现了免疫传感器在青霉素G残留检测实际工作中的应用。此外，纳米金具有较好的生物相容性，作为外壳可有助于维持抗体性质稳定。该材料的应用，也为相关生物传感器，如酶传感器、光电化学传感器等的研发提供了技术参考，具有广泛的潜在应用价值。
附图说明
图1：传感器制备流程示意图；
图2：传感器检测青霉素G残留的线性范围，
线性方程为：ΔRct＝0.8665×Log[penicillin G]-1.166(R2＝0.998)
图3：传感器重现性考察。
图4：碳玻电极(工作电极)表面结构扫描电镜显微图：(A)为未做处理的碳玻电极表面；(B)为碳玻电极表面附着有双层类脂质膜基质；(C)为碳玻电极表面附着双层类脂质膜基质在并沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子。
具体实施方式
1.Ag@Au核-壳复合结构纳米颗粒的制备：
(1)在70℃条件下将0.018g AgNO3和2mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠水溶液加入至100mL水中，待溶液变为浅黄色后，冰浴迅速冷却溶液，得到Ag胶体溶液，；
(2)25℃条件下，将(1)中制得的Ag胶体溶12mL和1mL 38.8mM的柠檬酸钠水溶液加入至30mL水中，搅拌混匀；
(3)在搅拌的同时缓慢将1.2mL浓度为10mM氯金酸(HAuCl4)水溶液和0.4mL的100mM抗坏血酸水溶液加入到(2)所得溶液中，剧烈搅拌至溶液变为酒红色；
(4)将(3)所得反应产物4℃条件下保存，使用前超声30min分散混匀。
2.免疫传感器的制备：
(1)以玻碳电极为工作电极，在电极上撒氧化铝抛光粉并滴加少量超纯水，使用麂皮以圆形或者“S”形路径对电极进行机械打磨，然后用超纯水超声水浴清洗电极表面，依次使用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉，每次打磨5min，重复3次，最后依次使用无水乙醇、1:1硝酸溶液和超纯水超声清洗5min，25℃条件下晾干；
(2)将4g卵磷脂和1g胆固醇溶解于100mL正癸烷中，制成双层类脂质膜成膜液，4
℃冷藏备用；
(3)将(2)成中所得的双层类脂质膜成膜液10μL滴加于步骤(1)中得到的电极上，25℃条件下保持15min晾干；
(4)将步骤(3)中电极浸入PBS溶液中15min，随后浸入到Ag@Au核-壳纳米粒子溶液中，给予1.5V电压20min，使纳米粒子电沉积在电极表面；
(5)将步骤(4)中得到的电极浸入浓度为4.7mg/mL的青霉素G抗体溶液中，4℃条件下保持12h；
(6)将步骤(5)中得到的电极用PBS清洗，在4℃冰箱中保存晾干后，即制得免疫传感器。
所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
3.本发明所制备的免疫传感器的应用，步骤如下：
(1)标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度(0.1～500ng/mL)的青霉素G标准溶液；
(2)工作曲线绘制：以铂丝电极作为辅助电极，饱和甘汞电极电极作为参比电极，与步骤B所修饰好的工作电极组成三电极体系，连接电化学工作站，采用电化学交流阻抗法，通过检测工作电极结合青霉素G前后的交流阻抗值差异(ΔRct)来对青霉素G进行定量检测，ΔRct＝Rct(AP-P)-Rct(AP)，其中Rct(AP-P)是青霉素G与工作电极结合之后的交流阻抗值，而Rct(AP)则是工作电极在空白标样中的交流阻抗值，ΔRct与青霉素G标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，由此绘制ΔRct－C工作曲线，青霉素G的线性检测范围为：0.1～500ng/mL，检出限为0.08ng/mL远低于欧盟标准4×103ng/L(4ng/mL)限值故能满足实际检测需求；
(3)青霉素G的检测：用待测乳制品样品代替步骤(1)中的青霉素G标准溶液，按照步骤(2)中的方法进行检测，根据交流阻抗值差异值ΔRct和工作曲线，得到待测样品中青霉素G的含量。
所述电化学交流阻抗法进行检测具体参数为，电位330mV，交流电压10m V，频率范围：10-1～105Hz。
4.传感器和HPLC标准方法对牛奶样品的检测结果对比：
牛奶样品的标准检测方法参照国家标准中牛奶中青霉素类药物的检测方法——高效液相色谱(HPLC)法(农业部公告第781-11-2006号)进行检测。免疫传感器检测方法依照步骤3中所述。牛奶样品的检测结果如表1所示，从其中可以看出，本实验所制备的生物传感器的检测值与标准方法的检测值相比基本相近，统计学结果显示二者并无显著差异，而传感器具有更低的检测限(0.08ng/mL)。
表1传感器和HPLC标准方法对牛奶样品的检测结果对比
Figure BDA0001710888740000081
注：a和b样本量n＝6；CV为变异系数(Coefficient of Variance)；P为t检验得出，以P≤0.05为具有统计学差异。
5.免疫传感器的重现性考察：
传感器的重现性通过在连续的三天之内重复检测同一浓度的青霉素G标准液(100ng/m L)的交流阻抗值(ΔRct)来评估。所得重现性曲线如图3所示，并由此计算出相应的相对标准偏差为1.17％，传感器具有良好的重现性，可满足实际检测工作需求。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器，其特征在于，所述的传感器由工作电极、双层类脂质膜、Ag@Au核-壳纳米粒子和青霉素G抗体组成，所述的双层类脂质膜附着在工作电极的表面构成双层类脂质膜基质，在所述的双层类脂质膜基质的表面沉积有所述的Ag@Au核-壳纳米粒子，在沉积的Ag@Au核-壳纳米粒子表面修饰有所述的青霉素G抗体；所述的Ag@Au核-壳纳米粒子是按以下方法制备的金外壳包裹银内核的核-壳结构纳米复合材料：
步骤一：制备Ag胶体溶液：在70℃条件下将0.018g AgNO3和2mL浓度为38.8mmol/L的柠檬酸钠水溶液加入至100mL水中，待溶液变为浅黄色后，冰浴中迅速冷却至25℃，得到Ag胶体溶液；
步骤二：25℃条件下，将步骤一中制得的Ag胶体溶液1～25mL和1mL 38.8mmol/L的Na(cit)3水溶液加入至30mL水中，搅拌混匀；
步骤三：在搅拌的同时缓慢将1.2mL浓度为10mmol/L氯金酸(HAuCl4)水溶液和0.1～1mL的100mmol/L抗坏血酸水溶液加入到步骤二所得溶液中，剧烈搅拌至溶液变为酒红色，得到的酒红色溶液即为Ag@Au核-壳结构纳米复合材料，4℃条件下保存。
2.根据权利要求1所述的纳米免疫传感器，其特征在于，所述的工作电极为玻碳电极。
3.权利要求1所述的基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：采用种子胶体法制备Ag@Au核-壳纳米粒子；
步骤B：以双层类脂质膜修饰工作电极，使双层类脂质膜沉积到工作电极的表面形成双层类脂质膜基质，再在双层类脂质膜基质的表面修饰沉积Ag@Au核-壳纳米粒子，得到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极，然后将青霉素G抗体(anti-penicillin G)修饰到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极上。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述的以双层类脂质膜修饰工作电极，使双层类脂质膜沉积到工作电极的表面形成双层类脂质膜基质，再在双层类脂质膜基质的表面修饰沉积Ag@Au核-壳纳米粒子，得到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极，然后将青霉素G抗体修饰到沉积有Ag@Au核-壳纳米粒子的电极上的具体方法是：
(1)以玻碳电极为工作电极，在电极上撒氧化铝抛光粉并滴加少量超纯水，使用麂皮对电极进行机械打磨，然后用超纯水超声水浴清洗电极表面，每次5min，重复3次，最后依次使用无水乙醇、1：1硝酸溶液和超纯水超声清洗5min，25℃条件下晾干；
(2)将4g卵磷脂和1g胆固醇溶解于100mL正癸烷中，制成双层类脂质膜成膜液，4℃冷藏备用；
(3)将10μL双层类脂质膜成膜液滴加于步骤(1)中得到的电极上，25℃条件下保持15min；
(4)将步骤(3)电极浸入PBS溶液中15min，随后浸入到Ag@Au核-壳纳米粒子溶液中，给予1.5V电压20min，使纳米粒子电沉积在电极表面；
(5)将步骤(4)中得到的电极浸入浓度为4.7mg/mL的青霉素G抗体溶液中，4℃条件下保持12h；
(6)将步骤(5)中得到的电极用PBS清洗，在4℃冰箱中保存晾干后，即制得基于双层类脂质膜的用于乳制品青霉素G残留检测的纳米免疫传感器。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的在电极上撒氧化铝抛光粉并滴加少量超纯水，使用麂皮对电极进行打磨的具体方法是：依次采用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉滴加少量超纯水，使用麂皮对电极进行打磨。
6.权利要求1或2所述纳米免疫传感器在乳制品青霉素G残留检测中的应用。
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