CN102512181A - 一种微创血糖检测微针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微创血糖检测微针，包括：依次连接的针柄、针身及针尖，在微针的针身及针尖表面修饰氨基、醛基、羟基和羧基中的一种后，可覆盖上有由pH响应分子修饰的金属纳米材料层，将微针插入由水溶性高分子和水不溶性高分子组成溶液中，可在金属纳米材料层上包覆有多孔的高分子材料层，之后再将微针插入葡萄糖氧化酶溶液中，可使水溶性高分子溶解并在高分子层中产生多个小孔，并在多孔的高分子材料层表面或孔中吸附有葡萄糖氧化酶，所述的金属纳米材料粒径为20-1000nm。利用检测微针对于不同浓度的葡萄糖有不同强度的拉曼信号，可以达到体内和体外微创检测葡萄糖的目的。

Description

一种微创血糖检测微针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微创血糖检测技术领域，更具体地，具有增强拉曼信号的微创血糖的检测微针及其制备方法。

背景技术

糖尿病(I型和II型)已成为一种重要的危及健康的疾病，且趋向于年轻化。用于诊断、监护与治疗糖尿病的费用逐年上升。糖尿病患者因体内血糖水平的大幅波动引起多种并发症，包括肾脏疾病、心脏疾病、失明、神经损伤以及坏疽。针对不同类型的糖尿病，目前的治疗方法主要是通过频繁的监测血糖水平，结合适当的饮食、药物服用和胰岛素注射。大部分患者用指尖采血的装置获得少许血样检测血糖水平，而后用间接的电化学监测法监测由葡糖。利用这种频繁采集血样虽然痛苦且不便，但是如多数患者不能及时、频繁地监测他们的血糖水平会患上各种并发症的危险，因此更快速、更便捷、能减轻痛处并且频繁使用的检测血糖水平的技术方法将惠及个人、医疗事业乃至全社会。

正因为这个问题的重要性，很多研究组致力于研究微创、生物相容性好、定量精确的血糖检测技术。作为一项颇有前景的技术，中红外吸收对温度、pH值、和水的竞争性吸收极为敏感。目前的中红外吸收研究利用了一个留置的探针来降低复杂因素的影响。在激光偏振测定中发展处另一中方法，即利用手性分子(如葡萄糖)使偏振光在穿过眼睛的房水时发生旋转。这项技术可以在体检测浓度低达20mg/mL(～1.0mM)的葡萄糖。然而房水的其他组成成分，(如抗坏血酸盐、白蛋白)的旋光性和角膜的双折射作用，使这种方法极难实现。葡萄糖的间接检测也可以通过荧光或其它光学技术实现。但被分析物相似的生物分子可能干扰这种需要多步处理的方法，从而产生假阳性结果。

在中医中通过将针灸针插入人体来进行治疗的方法已使用了几千年，它的主要特点是治疗过程中的微创性，所以针灸针是一种出入人体验生活的理想的微创的工具.针灸针将用作载体荷载具有增强拉曼和荧光信号的纳米材料形成出入人体的检测微针.当微针进入体内或组织时，组织液会扩散到金纳米壳之间的间隙内，当微针被拔出时，可以将组织液中的待测分子携带出来.体外的表面增强拉曼光谱检测可避免拉曼信号在组织中的衰减，同时根据检测微针刺入的深度可以得到一定深度的皮下组织的增强拉曼信号.

本发明中，我们制备了一种新颖的SERS活性微针。4-巯基苯甲酸分子是一种pH响应的分子，在不同的pH环境中其羟基解离程度不同，而且不同的解离状态也体现在拉曼光谱中SERS₁₄₃₀/SERS₁₅₉₀的比值上，我们将其功能化到SERS活性微针上，能够制备出一种生物组织层面的PH探针，实现生物体组织PH分布的微创探测。同时我们再将葡萄糖氧化酶功能化到微针表面，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖为葡萄糖酸，葡萄糖酸改变SERS活性微针所在的微环境的pH值，改变的pH值可以通过SERS活性微针上的4-巯基苯甲酸的SERS光谱的SERS₁₄₃₀/SERS₁₅₉₀的比值读出，从而可以实现检测人体血糖浓度的目的。从而将其开发成具有商业用途的血糖检测仪。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种微创血糖检测探针及其制备方法，具有用于体内或体外葡萄糖检测的特点。

本发明将医用针灸针作为检测微针的制备主体，利用检测探针针身覆盖的金属纳米材料表面具有pH响应的分子的增强拉曼信号的变化测定葡萄糖水平，发明一种可用于体外和体内的微创的葡萄糖检测方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明所述的一种微创血糖检测微针，包括：依次连接的针柄、针身及针尖，在针身及针尖的表面上覆盖有由pH响应分子修饰的金属纳米材料层，在金属纳米材料层上包覆有多孔的高分子材料层，在多孔的高分子材料层表面或孔中吸附有葡萄糖氧化酶，所述的金属纳米材料粒径为20-1000nm。

本发明所述的血糖检测微针制备方法：

步骤1)在微针的针身和针尖表面至少修饰氨基、醛基、羧基和羟基中的一种基团；

步骤2)将经步骤1处理的微针的针身和针尖插入浓度为10⁸-10¹⁸个粒子/升的金属纳米粒子悬浮液中静置12-48小时后，取出微针即可；

步骤3)将步骤2处理后的针身和针尖插入高分子混合物溶液中静置1-60秒后取出，其中，所述的高分子混合物溶液中的高分子混合物质量与溶液体积比为0.1-10％，高分子混合物分为水不溶解高分子和水溶解高分子，水不溶解高分子和水溶解高分子的摩尔比为1∶0.1-1∶2，所述的水不溶解高分子为聚苯乙烯、聚乳酸、聚氨酯或聚乙烯丙纶中的一种或多种的混合，水溶解高分子为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，最后用水洗去水溶解高分子；

步骤4)将步骤3处理后的针身和针尖插入pH响应的分子溶液中，浸泡30分钟以上，取出后洗去未吸附的pH响应的分子；

步骤5)将步骤4处理后的针身和针尖插入葡萄糖氧化酶溶液中，37℃两小时或4℃过夜，取出后洗去未吸附的葡萄糖氧化酶分子，即得检测微针。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明与现有商业化的检测技术相比，不需要取血，而且是微创的；本发明不仅可以检测外周血的血糖浓度，而且还可以微创检测生物体软组织的组织液中的葡萄糖浓度。有研究表明生物酶固定在纳米材料表面有利于保持酶的活性，也就是说本发明的产品有利于长时间保存。

(2)本发明与同类光学分析技术相比，可以实现血糖的在体检测，且对生物体的伤害小。

(3)本发明的血糖检测微针是基于针灸针制备的，也就是说，在针灸保健或治疗时，就可以进行血糖的检测。

附图说明

图1是一种具有增强拉曼和荧光信号的检测微针结构示意图。

图2是一种具有增强拉曼和荧光信号的检测微针光学增强层结构示意图。

图3是检测微针表面吸附了金属纳米材料的电镜图，。

图4是检测微针表面的金属纳米材料层外包被的多孔高分子材料层的电镜图。

图5是葡萄糖响应的检测微针的微观示意图(21：针灸针；22：金属壳层；23：介电核体；24：pH响应的分子；25：高分子层；26：孔隙；27：葡萄糖氧化酶)。

图6是pH响应的检测微针在不同pH溶液中SERS₁₁₄₃/SERS₁₁₈₀的比值图。

图7是葡萄糖响应的检测微针在不同葡萄糖溶液中SERS₁₁₄₃/SERS₁₁₈₀的比值图。

图8是用微创血糖微针检测大白兔组织中葡萄糖浓度所得的拉曼光谱图。

具体实施方式

本发明所述的一种微创血糖检测微针，包括：依次连接的针柄、针身及针尖，在针身及针尖的表面上覆盖有由pH响应分子修饰的金属纳米材料层，在金属纳米材料层上包覆有多孔的高分子材料层，在多孔的高分子材料层表面或孔中吸附有葡萄糖氧化酶，所述的金属纳米材料粒径为20-1000nm。

本发明所述的血糖检测微针制备方法：

步骤1)在微针的针身和针尖表面至少修饰氨基、醛基、羧基和羟基中的一种基团得到功能化的微针，所用方法在本领域是已知的。

所述的微针为临床所用各种类型的针灸针。

步骤2)将步骤1的针身和针尖插入浓度为10⁸-10¹⁸个粒子/升的金属纳米粒子悬浮液中静置12-48小时后，取出微针即可；

所述的金属纳米粒子层为球形的纳米粒子层，可以是单一的金属纳米粒子层包括金纳米粒子层、银纳米粒子层、铜纳米粒子层、铂纳米粒子层；可以是球形的复合纳米粒子层，即：所述的球形复合纳米粒子层为金、银、铜和铂的两种或两种以上的金属复合纳米粒子层，包括金银复合纳米粒子层及金、铜和铂复合纳米粒子层；可以是球形的核壳结构的复合纳米粒子层，包括银核金壳复合纳米粒子层、铜核金银复合壳纳米粒子层、铜核金银双层壳纳米粒子层；可以是非金属的SiO₂核金壳、银壳、铜壳、铂壳或复合壳纳米粒子层，所述的复合壳纳米粒子为金、银、铜和铂中的两种或两种以上金属复合的壳纳米粒子。

步骤3)将步骤2处理后的针身和针尖插入高分子溶液中的高分子混合物质量与溶液体积比为0.1-10％的高分子混合物溶液中静置1-60秒后取出，其中高分子混合物分为水不溶解高分子和水溶解高分子，前者与后者的摩尔比为1∶0.1-1∶2，最后用水洗去水溶解高分子；

所述的水不溶解高分子溶液可以是聚苯乙烯溶液；可以是聚乳酸溶液；可以是聚氨酯溶液；可以是聚乙烯丙纶溶液。

所述的水溶解高分子溶液可以是聚乙烯吡咯烷酮；可以是聚乙二醇。

步骤4)将步骤3处理后的针身和针尖插入pH响应的分子溶液中，浸泡30分钟以上，取出后洗去未吸附的pH响应的分子；

所述的pH响应的分子可以是4-巯基苯甲酸；可以是2-巯基吡啶；可以是2-巯基苯硼酸；可以是半胱氨酸。

步骤5)将步骤4处理后的针身和针尖插入葡萄糖氧化酶溶液中，37℃两小时或4℃过夜，取出后洗去未吸附的葡萄糖氧化酶分子，即得微创血糖检测微针；上述制备的微创血糖检测微针可以进行体外或体内的葡萄糖检测。将上述制备的微创血糖检测微针直接插入溶液或施针的部位，滞留一定时间后取出并作拉曼检测，可以检测溶液或施针部位组织液成分的葡萄糖水平。

实施例1：一种金纳米粒子的制备

金纳米颗粒的制备利用硼氢化钠还原氯金酸的方法，制备直径50nm的金纳米颗粒。取3ml 1％的氯金酸溶液加入搅拌的200ml纯水中，再加入1ml 0.2M的碳酸钾溶液。最后快速加入新鲜配制的0.5mg/ml硼氢化钠溶液3ml。溶液由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色。继续搅拌5min，置于4℃冰箱保存备用。

实施例2：一种银纳米粒子的制备

银纳米颗粒的制备利用柠檬酸钠还原硝酸银的方法，制备直径40nm的银纳米颗粒。取3ml 1％的硝酸银溶液加入搅拌的200ml纯水中，再加入5ml 0.1M的柠檬酸钠溶液加热至沸腾，再加热5分钟后自然冷却，溶液有无色逐渐变成亮黄色。到室温后置于4℃冰箱保存备用。

实施例3：一种金壳二氧化硅核粒子的制备

以直径110纳米的球形二氧化硅粒子为核制备金纳米壳粒子。将5微升3-氨基乙氧基硅烷加到100毫升含1克二氧化硅的醇溶胶中，37℃过夜。然后转移至烘箱内(80℃)固化3小时。离心除去多余的3-氨基乙氧基硅烷即得氨基化的二氧化硅。将氨基化的二氧化硅加入金纳米粒子胶体溶液中搅拌3小时，离心分离出二氧化硅/金纳米复合颗粒。将二氧化硅/金纳米复合颗粒加入0.01％氯金酸溶液中，再加入甲醛或双氧水等还原剂使氯金酸沉积在二氧化硅表面形成金纳米壳。

实施例4：一种银核金壳纳米粒子的制备

调节直径40纳米的银纳米粒子溶胶的消光强度至1.0，取1毫升加入到100毫升0.01％的氯金酸溶液中，再加入甲醛或双氧水等还原剂使氯金酸沉积在银纳米粒子表面形成银核金壳纳米壳粒子。

实施例5：一种微创血糖检测微针的制备

在针灸针的针身表面修饰巯基得功能化的微针(修饰巯基的方法在本领域是已知的)，调节金纳米粒子悬浮液使其浓度为1×10^8-18个/升。再将功能化的微针在金属纳米粒子悬浮液中静置12-48小时后取出。由于微针表面的巯基和金纳米粒子的化学键作用，金纳米粒子会吸附在针灸针表面，形成1-2层结构均一的、有增强拉曼和荧光信号的纳米结构。再将微针的覆盖有金属纳米粒子的部分插入聚苯乙烯溶液中，(高分子质量与溶液体积比为0.1-10％，其中聚苯乙烯与聚乙二醇的摩尔比为1∶(0.1-2))中静置1-60秒后取出，水洗去聚乙二醇；取出室温放置即可。形成的聚苯乙烯层可以在插入和取出针的过程中保护金纳米粒子不被摩擦掉。形成孔隙可以吸附葡萄糖氧化酶并在插入和取出针的过程中保护葡萄糖氧化酶不被摩擦掉。再将针身和针尖插入pH响应的分子4-巯基苯甲酸溶液中，浸泡30分钟以上，取出后洗去未吸附的4-巯基苯甲酸。再将针身和针尖插入葡萄糖氧化酶溶液中，37℃两小时或4℃过夜，取出后洗去未吸附的葡萄糖氧化酶分子，即得检测微针。图3所示为针体表面的金壳二氧化硅核纳米粒子层，图4所示为金属纳米粒子层表面覆盖的内部有孔隙的聚苯乙烯层。参考图5，21表示针身和针尖部分，22表示为纳米粒子的金壳层，23表示为纳米粒子的二氧化硅核，24表示为吸附在金属纳米粒子层表面的pH响应的信号分子，25表示为金属纳米粒子层表面覆盖的内部有孔隙的聚苯乙烯层，26表示为聚苯乙烯层中的孔隙，27表示为葡萄糖氧化酶。

实施例6：微创血糖检测微针的葡萄糖检测标准曲线

用琼脂糖水凝胶模拟生物体的软组织，用系列浓度的葡萄糖溶液(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3和1.5g/L)配制重量体积比为1.5％的琼脂糖水凝胶。将上述制备的微创葡萄糖检测微针插入1.5％的琼脂糖水凝胶中37℃孵育5-30分钟，取出测Raman光谱，计算SERS₁₁₄₃/SERS₁₁₈₀的两个特征Raman峰的比值。绘制不同孵育时间的葡萄糖浓度与SERS₁₁₄₃/SERS₁₁₈₀的两个特征Raman峰的比值的曲线即为葡萄糖检测标准曲线。参考图6、图7，当溶液中葡萄糖浓度不同时，被葡萄糖氧化酶还原后所得的葡萄糖酸的量就不同，溶液的pH也会有所同，图6、图7分别表示了当溶液中pH、葡萄糖浓度不同时SERS₁₁₄₃/SERS₁₁₈₀两个特征峰比值的变化。

实施例7：微创血糖检测微针在体内检测中的应用

将上述制备的微创血糖检测微针插入禁食但饮水一昼夜的大白兔的软组织(肌肉)中，滞留10分钟，取出测拉曼光谱，计算光谱中解离和不解离的两个特征Raman峰的比值，如图8所示，SERS₁₁₄₃/SERS₁₁₈₀两个特征峰比值约为0.5。在根据相应的葡萄糖检测标准曲线计算待测液中葡萄糖的浓度为0.75±0.12克/升。以商业化的强生稳豪型血糖试纸检测耳缘静脉血，葡萄糖的浓度为0.74±0.14克/升。统计学分析表明两种方法的检测结果具有可比性。

Claims (8)

1.一种微创血糖检测微针，包括：依次连接的针柄(13)、针身(12)及针尖(11)，其特征在于，在针身(12)及针尖(11)的表面上覆盖有由pH响应分子修饰的金属纳米材料层(2)，在金属纳米材料层(2)上包覆有多孔的高分子材料层(3)，在多孔的高分子材料层表面或孔中吸附有葡萄糖氧化酶，所述的金属纳米材料粒径为20-1000nm。

2.根据权利要求1所述的微创血糖检测微针，其特征在于，金属纳米材料层为金纳米粒子层、银纳米粒子层、铜纳米粒子层或铂纳米粒子层。

3.根据权利要求1所述的一种微创的血糖检测微针，其特征在于，金属纳米材料层为球形复合纳米粒子层，所述的球形复合纳米粒子层为金、银、铜和铂的两种或两种以上的金属复合纳米粒子层。

4.根据权利要求1所述的微创血糖检测微针，其特征在于，金属纳米材料层为球形的核壳结构的复合纳米粒子层，所述的球形的核壳结构的复合纳米粒子层包括银核金壳复合纳米粒子层、铜核金银复合壳纳米粒子层、铜核金银双层壳纳米粒子层。

5.根据权利要求1所述的微创血糖检测微针，其特征在于，金属纳米材料层为非金属的SiO₂核金壳、银壳、铜壳、铂壳或复合壳纳米粒子层，所述的复合壳纳米粒子为金、银、铜和铂中的两种或两种以上金属复合的壳纳米粒子。

6.根据权利要求1所述的微创血糖检测微针，其特征在于，多孔的高分子材料层为水不溶解聚苯乙烯层、聚乳酸层、聚氨酯层或聚乙烯丙纶层中的一种或多种的混合。

7.根据权利要求1所述的微创血糖检测微针，其特征在于，pH响应的分子为含有巯基的pH响应的分子，所述的含有巯基的pH响应的分子是4-巯基苯甲酸，2-巯基吡啶，2-巯基苯硼酸或半胱氨酸中的一种。

8.一种权利要求1所述微创血糖检测微针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1)在微针的针身和针尖表面至少修饰氨基、醛基、羧基和羟基中的一种基团；

步骤2)将经步骤1处理的微针的针身和针尖插入浓度为10⁸-10¹⁸个粒子/升的金属纳米粒子悬浮液中静置12-48小时后，取出微针即可；

步骤3)将步骤2处理后的针身和针尖插入高分子混合物溶液中静置1-60秒后取出，其中，所述的高分子混合物溶液中的高分子混合物质量与溶液体积比为0.1-10％，高分子混合物分为水不溶解高分子和水溶解高分子，水不溶解高分子和水溶解高分子的摩尔比为1∶0.1-1∶2，所述的水不溶解高分子为聚苯乙烯、聚乳酸、聚氨酯或聚乙烯丙纶中的一种或多种的混合，水溶解高分子为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，最后用水洗去水溶解高分子；

步骤4)将步骤3处理后的针身和针尖插入pH响应的分子溶液中，浸泡30分钟以上，取出后洗去未吸附的pH响应的分子；

步骤5)将步骤4处理后的针身和针尖插入葡萄糖氧化酶溶液中，37℃两小时或4℃过夜，取出后洗去未吸附的葡萄糖氧化酶分子，即得检测微针。

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