CN110638956A - 一种用于抗肿瘤的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种药物组合物，所述药物组合物包括以下重量份的原料：当归10‑15、白芍15‑30、薏苡仁30‑50、茯苓15‑30、玄参10‑15、草河车10‑15、浙贝母10‑15、丹皮10‑15、生牡蛎15‑30、桔梗10‑15、苍术6‑10和炙甘草3‑6。所述药物组合物可以降低TNF‑α和IL‑8的表达；升高E‑cadherin的表达；抑制CD8和CD31‑MVD；促进CD4蛋白的表达。本申请的药物组合物可以治疗肝癌的生长和转移，改善患者的生存质量。

Description

一种用于抗肿瘤的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地涉及一种用于抗肿瘤的药物组合物剂及其应用。
背景技术
肝癌的复发和转移是一个复杂的过程，涉及到肝癌细胞本身的特性、宿主免疫微环境等之间的相互作用，它是一个多基因、多通路联合作用的过程，经历基质降解、细胞黏附、细胞运动及新生血管生成等多个步骤，这个过程不是某一基因或通路被抑制就可以阻断的，它更需要多靶点、多效用、毒副作用小的药物联合。而中药复方包含多种活性成分，可作用于肿瘤转移过程的不同环节。研究表明，扶正抑瘤颗粒通过促进自然杀伤细胞(NK)活性、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌可以诱导HepG2细胞凋亡、调节免疫功能；解毒消癥饮通过抑制细胞周期蛋白D(Cyclin D)、Wnt/β-catenin信号通路可以抑制肿瘤增长、抑制肝癌细胞增殖。由此可见，合理使用中药复方可以成为临床多靶点治疗肿瘤转移和复发的有利手段。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
本申请人在抗肿瘤研究的病例资料及数据统计分析的基础上，结合中药抗肿瘤研究的基础理论及实验室、临床研究成果，以活血化痰、软坚解毒为抗肿瘤治疗的总原则，结合中医辨证论治，以当归、白芍、茯苓、薏苡仁、丹皮、浙贝母、苍术、桔梗、生牡蛎、玄参、草河车、炙甘草为基本药物，根据不同个体的实际情况进行适当加减，可改善患者临床症状，提高患者生存质量，延长患者生存周期。本申请的药物组合物在动物实验上进行实验研究。
目前许多化合物和实验方法都只能单一抑制肿瘤转移和生长的靶点，导致肿瘤很容易复发转移，并且容易给患者带来身体和心理上极大的痛苦，本申请的药物组合物可以多靶点治疗肝癌的生长和转移，也可以通过提高免疫系统来改善患者的生存质量。
复发转移是肝癌患者治疗失败甚至死亡的根本原因，是一个由一系列基因参与调控的多步骤的复杂过程，涉及免疫逃逸、细胞的粘附、基质的降解、细胞的迁移及肿瘤血管生成等多个环节。放化疗给患者带来巨大的痛苦，索拉菲尼药物治疗作为肝癌晚期一线治疗方法，也只能延长晚期肝癌患者近3个月生存期。本申请的药物组合物可以改善肝癌小鼠的生存质量。
目前研究发现，通过尾静脉注射肿瘤细胞可以模拟肿瘤体内转移过程，而经过荧光素酶基因标记的肿瘤细胞可以通过小动物活体成像追踪体内的肿瘤细胞。
本申请的药物组合物可以通过调控CD4+T细胞、CD8+T细胞、钙粘附蛋白E(E-cadherin)、CD31、IL-8、TNF-α来抑制小鼠Hepa1-6肝癌的转移和生长。目前许多化合物只能抑制肿瘤生长或者转移，本申请的药物组合物既可以抑制肝癌生长也可以抑制肝癌转移，并且应用于小动物活体成像方法与尾静脉和皮下两种模型验证了该药物组合物的效果。转染萤火虫荧光素酶基因(firefly luciferase gene)的C57BL/6小鼠肝癌Hepa1-6细胞，经筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，绿色荧光蛋白及荧光素酶基因的小鼠肝癌细胞株Hepa1-6(luc2/GFP)。采用尾静脉注射及右侧腹部皮下注射的方法分别建立尾静脉肝癌转移模型及皮下肿瘤模型，并分别给予本申请的药物组合物(52g/kg、104g/kg)、索拉菲尼(30mg/kg)。造模后进行小动物成像荧光观测，16天后取皮下肿瘤组织，实时荧光定量PCR(q-PCR)法检测E-cadherin、白细胞介素-8(IL-8)、TNF-α的表达；免疫组化(IHC)法检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、血小板-内皮细胞粘附分子标记的微血管密度(CD31-MVD)。
具体地，本申请提供一种药物组合物，包括以下重量份的原料：当归10-15、白芍15-30、薏苡仁30-50、茯苓15-30、玄参10-15、草河车10-15、浙贝母10-15、丹皮10-15、生牡蛎15-30、桔梗10-15、苍术6-10和炙甘草3-6。
在本申请中，所述药物组合物可以由以下重量份的原料组成：当归10-15、白芍15-30、薏苡仁30-50、茯苓15-30、玄参10-15、草河车10-15、浙贝母10-15、丹皮10-15、生牡蛎15-30、桔梗10-15、苍术6-10和炙甘草3-6。
在本申请中，所述药物组合物可以包括以下重量份的原料：当归10、白芍15、薏苡仁30、茯苓30、玄参15、草河车15、浙贝母15、丹皮10、生牡蛎30、桔梗15、苍术10和炙甘草5。
在本申请中，所述药物组合物可以由以下重量份的原料组成：当归10、白芍15、薏苡仁30、茯苓30、玄参15、草河车15、浙贝母15、丹皮10、生牡蛎30、桔梗15、苍术10和炙甘草5。
本申请还提供所述药物组合物在调节CD4+T细胞、CD8+T细胞、E-cadherin、CD31、IL-8和TNF-α中的一种或更多种中的用途。
在本申请中，所述药物组合物可以降低TNF-α和IL-8的表达。
在本申请中，所述药物组合物可以升高E-cadherin的表达。
在本申请中，所述药物组合物可以抑制CD8和CD31-MVD。
在本申请中，所述药物组合物可以促进CD4蛋白的表达。
在本申请中，所述药物组合物可以降低TNF-α和IL-8的表达；升高E-cadherin的表达；抑制CD8和CD31-MVD；促进CD4蛋白的表达。
在本申请中，所述药物组合物可以作为肿瘤抑制剂。
本申请还提供所述药物组合物在制备用于治疗肿瘤的转移和生长的药物中的用途。
在本申请中，所述肿瘤可以为肝癌。
在本申请中，所述药物组合物可以通过调节CD4+T细胞、CD8+T细胞、E-cadherin、CD31、IL-8和TNF-α中的一种或更多种来抑制肝癌的转移和生长。
在本申请中，所述药物组合物可以通过降低TNF-α和IL-8的表达；升高E-cadherin的表达；抑制CD8和CD31-MVD；促进CD4蛋白的表达，来抑制肝癌的转移和生长。
在本申请中，所述药物组合物的施用方式可以为口服或注射，优选地为口服。
在本申请中，所述药物组合物可以为颗粒剂、汤剂或散剂，优选地为颗粒剂。
本申请还提供所述药物组合物的制备方法，所述制备方法包括：
生牡蛎先用水煎煮30min-40min，当归、白芍、薏苡仁、茯苓、玄参、草河车、浙贝母、丹皮、桔梗、苍术和炙甘草粉碎后加入其中，再用水煎煮2次，每次1.5-2h，合并煎液，抽滤，浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，加乙醇使乙醇的体积份数达40％-50％，搅拌，静置过夜。滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.35-1.40(50℃)的清膏，减压干燥后粉碎。
在本申请中，所述制备方法还包括：
取干浸膏粉∶糖粉按照1∶(2-3)的重量比、干浸膏粉∶可溶性糊精按照1∶(1-2)的重量比混匀，以适量60％-65％乙醇为湿润剂制成软材，以手捏成团，轻压即散为佳，过10-20目筛制成湿颗粒，70-80℃干燥后整粒，即得颗粒剂。
本申请中的药材为药材市场上可买到的符合药典标准的中药饮片。
在本申请中，所述药物组合物的施用剂量可以为100g/天-1000g/天，施用剂量以所述药物组合物中的各组分的生药计。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1是Hepa1-6(luc2/GFP)细胞加入D-荧光素钾盐后的荧光强度的图，其中荧光强度会随着细胞量的增多而增大。
图2是本申请实施例1的药物组合物对小鼠肝癌转移的影响，A：C57BL/6小鼠的生物发光成像，荧光强度第一天时各组无差别，随着时间变化，模型组荧光强度逐渐高于给药组，第35天时荧光强度显示，阳性药索拉菲尼30mg/kg治疗组的抑瘤率约为56.7％，与模型对照组相比呈明显降低(P＜0.05)，本申请实施例1的药物组合物低、高剂量治疗组的抑瘤率分别为42.6％、50.0％，呈现出明显的剂量-效应关系，图2A右侧的颜色由蓝-黄-红转变(从下到上)对应的荧光数值逐渐变大；B：C57BL/6小鼠中Hepa1-6(luc2/GFP)肿瘤细胞的动态生物发光总通量；C：本申请实施例1的药物组合物对肝癌转移小鼠体重的影响，n＝8，与模型组相比，**P＜0.01，**P＜0.001。
图3是本申请实施例1的药物组合物对小鼠肝癌生物发光信号的影响，荧光强度第一天时各组无差别，随着时间变化，模型组荧光强度逐渐高于给药组，第16天时荧光强度显示，本申请实施例1的药物组合物低、高剂量治疗组的抑瘤率分别为23.4％、41.9％，呈现出明显的剂量-效应关系，图3右侧的颜色由蓝-黄-红转变(从下到上)对应的荧光数值逐渐变大。
图4是本申请实施例1的药物组合物对小鼠Hepa1-6(luc2/GFP)肿瘤细胞生长的影响，A：16天后皮下肿瘤；B：本申请实施例1的的药物组合物明显降低小鼠的瘤重；C：小鼠的平均体重变化，n＝8，与模型组相比**P＜0.01，***P＜0.001。
图5是本申请实施例1的药物组合物对各组小鼠肝癌组织CD4+T、CD8+T、CD31表达的影响(IHC，×200)。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
仪器和试剂
当归、白芍、薏苡仁、茯苓、玄参、草河车、浙贝母、丹皮、生牡蛎、桔梗、苍术和炙甘草均为解放军总医院第五医学中心中药房提供的颗粒剂；索拉菲尼(货号：284461-73-0，Sigma公司)；D-Luciferin Potassium Salt/D-荧光素钾盐(部件号：122799，PerkinElmer公司)；RPMI-1640培养基(Sigma公司)；胎牛血清(fatal bovine serum，FBS，Gibco公司)；磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS，北京中科迈晨科技有限公司)；CD31兔单克隆抗体(货号：ab28364，1∶50)、CD4兔单克隆抗体(货号：ab183685，1∶200)、CD8兔单克隆抗体(货号：ab203035，1∶200)均购自Abcam公司；小动物活体成像仪IVIS Spectrum(PerkinElmer公司)；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂TRIzol Reagent(货号：15596-026，Invirtrogen公司)；逆转录试剂盒(货号：A5001，北京照生莱博商贸有限公司)；非冻型组织RNA保存液(货号：SR0020，Solarbio公司)；10％中性福尔马林固定液(货号：G2161，Solarbio公司)；合成引物购自Thermo Fisher Scientific公司。
实施例1本申请药物组合物的制备
生牡蛎30g先用水200ml煎煮30min，当归10g、白芍15g、薏苡仁30g、茯苓30g、玄参15g、草河车15g、浙贝母15g、丹皮10g、桔梗15g、苍术10g和炙甘草5g粉碎后加入其中，用水煎煮2次，每次用水200ml，煎煮1.5h，合并煎液，抽滤，旋转蒸发浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，加乙醇使乙醇的体积份数达50％，搅拌，静置过夜。过滤，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.35-1.40(50℃)的清膏，减压干燥后粉碎。取干浸膏粉∶糖粉按照1∶2.5的重量比、干浸膏粉∶可溶性糊精按照1∶1.5的重量比混匀，以适量60％乙醇为湿润剂制成软材，以手捏成团，轻压即散为佳，过10目筛制成湿颗粒，76-78℃干燥后整粒，即得颗粒剂。
实施例2
2.1检测Hepa1-6(luc2/GFP)细胞的稳定性
细胞的培养：将冻存于液氮的Hepa1-6细胞37℃水浴锅中快速复苏，加入1640培养液(含10％FBS和1％双抗(青霉素加链霉素))中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
确定筛选浓度：将生长至指数生长期的细胞消化，以2×105个/ml的细胞密度接种于6孔板，待细胞密度达到60％-70％(细胞占培养皿的体积与培养皿总体积的比值)时，分为空白对照组、1μg/ml嘌呤霉素组、2μg/ml嘌呤霉素组、4μg/ml嘌呤霉素组，培养72小时，确定筛选浓度。
将冻存在液氮的Hepa1-6(1uc2/GFP)细胞复苏，培养细胞密度达到50％-60％时，以2μg/ml的嘌呤霉素筛选，再培养72小时，收集经过筛选的细胞进行扩增，取一定数量的细胞铺于96孔板，每孔加入D-荧光素钾盐0.3mg，用小动物活体成像仪检测发光强度。
2.2动物模型验证本申请实施例1的药物组合物效果
Hepa1-6(luc2/GFP)的尾静脉体内转移模型的建立：将稳定筛选后的Hepa1-6(luc2/GFP)细胞重悬于PBS中(密度为1×107个/ml)，每只雌性C57BL/6小鼠提前腹部脱毛处理，尾静脉注入200μl，在3h之内异氟烷麻醉，腹腔注射D-荧光素钾盐15mg/ml，200μl/只，进行活体成像检测造模是否成功(尾静脉注射肺部出现荧光)，将造模成功的小鼠随机分为对照组(0.6ml生理盐水灌胃)、模型组(0.6ml生理盐水灌胃)、本申请实施例1的药物组合物低剂量组[52g/(kg.d)灌胃，等同于2倍临床口服剂量]、本申请实施例1的药物组合物高剂量组[104g/(kg.d)灌胃，等同于4倍临床口服剂量]、索拉菲尼组[30mg/(kg.d)灌胃]，每组8只，造模成功后当天开始给药，每7天进行成像拍照，称重，持续给药35天，观察肿瘤转移情况。
Hepa1-6(luc2/GFP)的皮下肿瘤模型的建立：选取雄性C57BL/6小鼠进行皮下成瘤实验，将Hepa1-6(luc2/GFP)细胞用PBS重悬(密度为4×107个/ml)，将细胞接种至雄性小鼠右侧腹部皮下，200μl/只，留针1min，进行成像观察造模是否成功，将造模成功的小鼠随机分为对照组、模型组、本申请实施例1的药物组合物低剂量组、本申请实施例1的药物组合物高剂量组，每组6只，待第4天成像观测肿瘤稳定后，第5天开始给药，每4天称重，小动物成像拍照，第16天实验结束，颈部脱臼处死动物，取出瘤快，并称质量，拍照，每个瘤块取100mg于RNA保存液中，剩余的存于10％中性福尔马林固定液中。抑瘤率＝(给药组-模型组)/模型组×100％。
q-PCR法检测肿瘤组织中E-cadherin、IL-8、TNF-αmRNA的相对表达：严格按照Trizol试剂说明书进行总RNA提取，然后将总RNA逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR扩增。反应在10ul体系中进行，反应体系：1μl cDNA产物，1μl qPCR引物，3μl无核酸酶水及5ulSYBR Green Master(2×)。GAPDH为内参基因，检测E-cadherin、IL-8、TNF-αmRNA的相对表达，采用特异性引物序列如表1，qPCR反应检测各组Ct值(Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，以2-ΔΔCT法计算组织中E-cadherin、IL-8、TNF-αmRNA的相对表达量。
表1引物序列
基因 引物(5′-3′) 长度/(bp)
GAPDH 上游：TGGCCTTCCGTGTTCCTAC
下游：GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA 178
PD-1 上游：TAGTGGGTATCCCTGTATTGCTG
下游：CTTCTCTCGTCCCTGGAAGTC 176
IL-8 上游：TCGAGACCATTTACTGCAACAG
下游：CATTGCCGGTGGAAATTCCTT 164
TNF-α 上游：CCTGTAGCCCACGTCGTAG
下游：GGGAGTAGACAAGGTACAACCC 148
免疫组化法检测肿瘤组织中相关蛋白的表达：固定的组织常规脱水后石蜡包埋，石蜡切片常规脱蜡、水化、抗原修复，相应的单克隆抗体免疫组织化学染色，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，用中性树胶封片。运用Image-Pro Plus 6.0软件，CD31-MVD、CD4+T、CD8+T的判定取5个高倍视野(×400)计数阳性细胞数，并求平均值。
结果：
从图1可以看出，荧光强度会随着细胞量的增多而增大。
从图2可以看出，给药第35天时，荧光强度显示，阳性药索拉菲尼30mg/kg治疗组的抑瘤率约为56.7％，与模型对照组相比呈明显降低(P＜0.05)，本申请实施例1的药物组合物低、高剂量治疗组的抑瘤率分别为42.6％、50.0％，呈现出明显的剂量-效应关系。小鼠的体重各组间并无明显差异，证明各组药物并无毒性。
从图3和图4可以看出，本申请实施例1的药物组合物对Hepa1-6(1uc2/GFP)肝癌细胞形成的皮下肿瘤也有抑制作用，本申请实施例1的药物组合物低、高剂量治疗组的抑瘤率分别为23.4％、41.9％。皮下成瘤后小鼠体重相比对照组增长开始减缓，第16天时模型组的体重相比对照组减少了33.2％，本申请实施例1的药物组合物低、高剂量治疗组的体重减少约26.2％、16.1％。
从表2可以看出，本申请实施例1的药物组合物低、高剂量组E-cadherin-mRNA水平明显高于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而本申请实施例1的药物组合物低、高剂量组IL-8、TNF-α-mRNA水平明显低于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
表2本申请实施例1的药物组合物的低剂量组、高剂量组和模型组对于E-cadherin、IL-8和TNF-α的影响
Figure BDA0002254242030000091
注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
从图5可以看出，相比模型组，本申请实施例1的药物组合物的CD4+T、CD4+T/CD8+T的表达均上升，CD8+T、CD31-MVD的表达下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
表3本申请实施例1的药物组合物的低剂量组、高剂量组和模型组对于CD4+T、CD4+T/CD8+T、CD8+T和CD31-MVD的影响
Figure BDA0002254242030000101
注：与模型组相比，*＜0.05.**＜0.01，***＜0.001
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (9)

1.一种药物组合物，包括以下重量份的原料：当归10-15、白芍15-30、薏苡仁30-50、茯苓15-30、玄参10-15、草河车10-15、浙贝母10-15、丹皮10-15、生牡蛎15-30、桔梗10-15、苍术6-10和炙甘草3-6。
2.权利要求1所述的药物组合物在调节CD4+T细胞、CD8+T细胞、E-cadherin、CD31、IL-8和TNF-α中的任一种或更多种中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述药物组合物降低TNF-α和IL-8的表达；升高E-cadherin的表达；抑制CD8和CD31-MVD；促进CD4蛋白的表达。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述药物组合物作为肿瘤抑制剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述药物组合物在制备用于治疗肿瘤的转移和生长的药物中的用途。
6.根据权利要求4所述的用途，所述肿瘤为肝癌。
7.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述药物组合物的施用方式为口服或注射。
8.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述药物组合物的施用剂量为100g/天-1000g/天。
9.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述药物组合物为颗粒剂、汤剂或散剂。
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