CN110638852A - 源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂及其制备方法 - Google Patents

源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂及其制备方法，属于纯天然植物抗氧化剂技术领域，本发明抗氧化剂至少包含酚类、黄酮和钾离子；其中，酚类至少包含3‑烯丙基‑6‑甲氧基苯酚。该抗氧化剂的抗氧化活性和稳定性佳，在延缓衰老，防治自由基引起的疾病和辅助治疗炎症性疾病等方面具有积极作用。本发明抗氧化剂的制备方法包括如下步骤：于萃取溶液中放入甜叶菊原料，进行萃取，萃取液混合浓缩，发酵得抗氧化剂。该制备方法能高效杀酵母菌等其他杂菌，留下可耐高温的乳酸菌孢子和枯草芽孢杆菌孢子，将萃取液中大分子物质充分分解，实现极强的抗氧化活性。

Description

源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂及其制备方法
技术领域
本发明属于纯天然植物抗氧化剂技术领域，具体涉及源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂及其制备方法。
背景技术
氧化与抗氧化，衰老和抗衰老是人们研究的热点。氧化应激反应是人类身体衰老和健康问题的最大敌人之一，人体内外多种因素诱导产生的过量自由基，可以引发氧化胁迫反应，不仅导致细胞结构损伤和功能缺失，促使机体衰老，而且会加剧阿尔茨海默病、心血管疾病、恶性肿瘤等相关疾病的发展。细胞在正常的代谢过程中受到高能福射、高压氧、药物、香烟烟雾和光化学空气污染物等作用，都会刺激产生活性氧自由基。机体有多种抗氧化防御系统，抗氧化剂主要是通过终止自由基链反应而清除自由基保护机体的。而寻找适当的外源性抗氧化剂，积极清除体内自由基，对治疗疾病和保护人体健康很有益处。由于合成抗氧化剂具有潜在的身体危害，而植物中存在众多消除活性氧自由基的抗氧化成分可抑制氧化过程和化学致癌的发生。目前从植物中提取分离得到的天然抗氧化剂种类繁多，其化学成分类型包括多酚类、类胡萝卜素、迷迭香等，其中，酚类成分的抗氧化活性在纷繁复杂的天然产物中得到了广泛的肯定和认可。因此从植物中寻找高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂成为目前抗氧化剂发展的一个必然趋势。
甜叶菊(Stevia rebaudiana)属菊科，种名为甜菊，又名甜叶菊、甜草，巴西称糖草，巴拉圭称甜草、甜茶，是目前已知甜度较高的糖料植物之一。甜叶菊原产南美巴拉圭东部，是一种高甜度、低热量、无毒、无副作用的天然草本植物，长期以来由其叶所提取的甜菊糖苷一直作为天然甜味剂被广泛利用，其甜度为蔗糖的300倍，热能仅为其1/90，食用安全，是备受推崇的天然糖源。甜叶菊性味甘、平，不仅富含甜菊糖苷，还含有甾醇类、黄酮类化合物、生物碱、水溶性叶绿素、叶黄素、邻羟基肉桂酸、中性水溶性低聚糖、游离糖、氨基酸、脂类、挥发油和微量元素，这些成分使甜叶菊叶片的提取物具有抗氧化、抗自由基、抗过敏、抗菌、抗炎、镇痛和保肝等多种生物活性。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种抗氧化活性和稳定性佳的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，至少包含酚类、黄酮和钾离子，其中，酚类至少包含3-烯丙基-6-甲氧基苯酚。
根据本发明一实施方式，抗氧化剂中酚类含量为0.46～126.82mg/g、黄酮含量为0.08～1.56mg/g、钾离子含量为0.77～37.24mg/g。
根据本发明一实施方式，抗氧化剂中3-烯丙基-6-甲氧基苯酚的含量为0.073～4.17mg/g。
根据本发明一实施方式，抗氧化剂还含有粗多糖。
根据本发明一实施方式，粗多糖浓度为5～4650ppm。
根据本发明一实施方式，抗氧化剂的浓度≥Brix5。
根据本发明一实施方式，抗氧化剂还含有3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯、2,4,6-三甲基吡啶。
根据本发明一实施方式，抗氧化剂中至少加入10ppm的柠檬酸。
本发明还提供了源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，采用甜叶菊原株和/或杆茎和/或叶中附生菌发酵获得；其中，附生菌包括乳酸菌或枯草芽孢杆菌。
根据本发明一实施方式，制备方法包括如下步骤：
一)于萃取溶液中放入甜叶菊原料，进行萃取；
二)将所述一)步骤后获得的萃取液混合浓缩；
三)在所述二)步骤后获得的浓缩液发酵得抗氧化剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明抗氧化剂具有较强的自由基清除能力，Fe3+还原能力和氧自由基吸收能力且抗氧化稳定性佳，在延缓衰老，防治自由基引起的疾病和辅助治疗炎症性疾病等方面具有积极作用；本发明抗氧化剂的制备方法能够杀死了甜叶菊杆茎中耐热性差的其他杂菌，尤其能高效灭杀酵母菌，留下可耐高温的乳酸菌孢子或枯草芽孢杆菌孢子，在温度、湿度及含氧量条件适当时，复活并繁殖，同时将萃取液中大分子物质充分分解，得到小分子的活性多酚类，实现极强的抗氧化活性。
本发明采用了上述技术方案提供源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂及其制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1是本发明试验例1中甜叶菊原液GC-MS特性图谱；
图2是本发明试验例1中甜叶菊高效液GC-MS特性图谱；
图3是本发明试验例1中甜叶菊过滤未灭菌液GC-MS特性图谱；
图4是本发明试验例1中甜叶菊未过滤未灭菌液GC-MS特性图谱；
图5是本发明试验例1中甜叶菊过滤灭菌液GC-MS特性图谱；
图6是本发明试验例1中杆茎液GC-MS特性图谱；
图7是本发明试验例1中95％杆茎+5％叶液GC-MS特性图谱；
图8是本发明试验例1中杭白菊液GC-MS特性图谱；
图9是本发明试验例1中胎菊液GC-MS特性图谱；
图10是本发明试验例3中抗氧化剂清除DPPH自由基能力的测定结果；
图11是本发明试验例3中抗氧化稳定性的测定结果；
图12是本发明试验例4中I、II、III、IV四组分对DPPH自由基清除能力的比较；
图13是本发明试验例4中组分IV的GC-MS特性图谱；
图14是本发明试验例5中抗氧化剂的氧化指数；
图15是本发明试验例6中空腹血糖值的测量结果。
具体实施方式
下面详细说明本发明的实施例。
本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。
这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。
本发明一实施方式提供了一种源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，至少包含有酚类、黄酮和钾离子，其中，酚类至少包含3-烯丙基-6-甲氧基苯酚。3-烯丙基-6-甲氧基苯酚具有较强的抗氧化活性，且能够和抗氧化活性成分中的邻苯二酚发挥增益作用，进一步提高所得抗氧化剂的抗氧化活性。此外，酚类物质还含有2,4-双(1,1-二甲基乙基)-苯酚、邻苯二酚、麝香草酚、4-氯-2,6-双(1,1-二甲基乙基)-苯酚、4-乙基-苯酚、异丙酚、4-(1-甲基-1-环丁基)苯酚、3-甲基-4-异丙基苯酚、2,5-双(1-甲基丙基)-苯酚中的一种或多种。该纯天然植物抗氧化剂具有较强的自由基清除能力、Fe3+还原能力和氧自由基吸收能力，在延缓衰老、防治自由基引起的疾病和辅助治疗炎症性疾病等方面具有积极作用，其抗氧化活性主要基于酚类，与黄酮以及钾离子等物质的含量也有关，含量越高，且抗氧化稳定性佳。
上述纯天然植物抗氧化剂酚类含量为0.46～126.82mg/g(例如4.60mg/g、10.55mg/g、22.00mg/g、30.47mg/g、38.75mg/g、46.02mg/g、50.00mg/g、70.50mg/g、95.00mg/g、105.23mg/g、120.38mg/g等)、黄酮含量为0.08～1.56mg/g(例如0.10mg/g、0.14mg/g、0.48mg/g、0.63mg/g、0.80mg/g、0.85mg/g、1.00mg/g、1.05mg/g、1.20mg/g、1.43mg/g等)、钾离子含量为0.77～37.24mg/g(例如2.27mg/g、5.15mg/g、12.40mg/g、17.24mg/g、22.71mg/g、23.00mg/g、25.03mg/g、30.00mg/g、33.20mg/g、35.48mg/g等)。
于本发明一实施方式中，抗氧化剂中3-烯丙基-6-甲氧基苯酚的含量为0.073～4.17mg/g，例如0.12mg/g、0.57mg/g、0.73mg/g、1.02mg/g、1.64mg/g、1.86mg/g、2.32mg/g、3.07mg/g、3.75mg/g、3.98mg/g等。
于本发明一实施方式中，纯天然植物抗氧化剂还含有粗多糖。上述粗多糖ppm浓度为5～4650ppm，例如228ppm、534.2ppm、840ppm、1148ppm、1683.4ppm、2280ppm、2295.5ppm、2300ppm、2875ppm、3000ppm、3260ppm、4500ppm等。甜菊多糖有六个异构体，粗糖包含了任何一种甜菊多糖，且甜菊多糖几乎没有抗氧化活性，但是只要当此粗多糖含量达到5ppm以上时，会与此抗氧化剂中的抗氧化活性物质酚类、黄酮和钾离子发挥共同协作作用，可对二型糖尿病显示出抑制作用。
于本发明一实施方式中，纯天然植物抗氧化剂的浓度≥Brix5。上述抗氧化剂还具有降血糖的功效，更优选地，纯天然植物抗氧化剂的浓度Brix为5～8时，有降血糖的效果，但是不很明显，有中药味；纯天然植物抗氧化剂的浓度Brix为8～12时，有降血糖的效果，人的个体差明显，总体效果有，中药味稍浓；纯天然植物抗氧化剂的浓度Brix为12～16时，降血糖的效果明显，中药味浓；纯天然植物抗氧化剂的浓度Brix为17～23时，降血糖的效果很明显，中药味很浓；一般每天饮用20～40mL，3个月血糖能从10.8或更高恢复到7左右(有个体差异)，效果明显，效果优于二甲双胍且无任何副作用。
于本发明一实施方式中，上述氧化剂中还含有3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、苯乙醛、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯、2,4,6三甲基吡啶。上述7种挥发性特征物质中3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯属于香气成分，3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯的用途尚不明确，2,4,6三甲吡啶为色谱用溶剂成分。
本发明一实施方式进一步提供了上述源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，采用甜叶菊原株或杆茎及叶中附生菌发酵获得；附生菌包括乳酸菌或枯草芽孢杆菌。甜叶菊杆茎中附生许多微生物，耐高温的乳酸菌孢子和枯草芽孢杆菌孢子可将萃取液中大分子物质充分分解，得到小分子的活性多酚类，提高所得抗氧化剂的抗氧化活性和稳定性。
于本发明一实施方式中，抗氧化剂的制备方法包括如下步骤：
一)于萃取溶液中放入甜叶菊原料，进行萃取；
二)将一)步骤后获得的萃取液混合浓缩；
三)在二)步骤后获得的浓缩液发酵；及
四)将三)步骤后获得的发酵液提纯，浓缩，即得纯天然植物抗氧化剂原液。
于本发明一实施方式中，甜叶菊原料为粉状或颗粒状或截断杆状或原枝状。
于本发明一实施方式中，甜叶菊原料中含有0～100wt％的甜叶菊杆茎和0～50wt％的甜叶菊叶，例如80wt％的甜叶菊杆茎和20wt％的甜叶菊叶，95wt％的甜叶菊杆茎和5wt％的甜叶菊叶，99.5wt％的甜叶菊杆茎和0.05wt％的甜叶菊叶，100wt％的甜叶菊杆茎等。
于本发明一实施方式中，一)步骤萃取采取热水超声萃取，萃取工艺条件为：料液比为1:6～30(例如1:7，1:8.5，1:15，1:20.6，1:28等)，水浴提取温度为90℃以上(例如91℃，95.5℃，97℃，98.5℃等)，水浴提取时间为100～160min(例如110min，125min，135.5min，150min等)，超声辅助提取时间为15-25min(例如16min，18min，20.5min，24min等)，超声频率为15kHz～60kHz(例如18kHz，35.5kHz，58kHz等)、超声强度为80-200W(例如85W，120W，185W等)；甜叶菊废弃物中富含具有强抗氧化能力的生物活性物质，且超声辅助能提高抗氧化活性物质的萃取率，在此条件下所得提取液对DPPH的清除率达90％以上，且抗氧化稳定性佳。
于本发明一实施方式中，热水超声萃取分阶段实施：
第一阶段的料液比1:12～16，沸腾后保持微沸90min；第二阶段的料液比1:10，沸腾后保持微沸45min；第三阶段的料液比1:6～8，沸腾后保持微沸20min，该阶段利用超声辅助提取，其中超声强度为53kHz前后。热水超声萃取分阶段实施能够提高提取速率和提取率。
于本发明一实施方式中，一)步骤萃取还可采取醇萃取、热水加压萃取。其中，醇萃取用萃取溶剂为体积分数为30-80％乙醇，超声功率300-550W、超声时间10-60min；热水加压萃取时，加压可以提高萃取率，一般加压可考虑1.25大气压，萃取温度选择105℃，采取热水加压萃取工艺可减少一次萃取次数。
于本发明一实施方式中，二)步骤浓缩为加热敞口浓缩或加热抽真空浓缩，浓缩到Brix 20以上，即水溶特性固形物含量为20％以上。
于本发明一实施方式中，三)步骤发酵菌种源于甜叶菊杆茎中自然附带的乳酸菌有效孢子，热水超声萃取杀死了耐热性差的其他杂菌，留下可耐高温的乳酸菌孢子，在温度、湿度及含氧量条件适当时，复活并繁殖，同时将萃取液中大分子物质充分分解，得到小分子的活性多酚类，实现极强的抗氧化活性。其中发酵条件控制：避光，控氧，忌讳酵母菌存在；原则上为低温无氧发酵以乳酸菌发酵为主线，忌讳酵母菌存在。
于本发明一实施方式中，三)步骤发酵时间为6～12月，时间越长，有效成分含量越高；Brix越高，抗氧化效果越好。
于本发明一实施方式中，三)步骤发酵条件控制为：避光，忌讳酵母菌存在；为了进一步提高抗氧化剂的抗氧化效果，发酵为低温无氧发酵，以乳酸菌发酵为主线，忌讳酵母菌存在。
于本发明一实施方式中，四)步骤提纯采用M500透析分子膜进行一晚搅拌透析，膜外液浓缩后即可获取分子量小于500M的萃取液，无机钾盐，领苯二酚等小分子物质都聚于其中，膜内液浓缩后得到的是分子量大于500M的混合物，其中包含有大分子多糖，多酚类，色素，叶绿素等多种大分子物质。也具有比较强的抗氧化活性。一般情况下无需分离。因为混合萃取液的抗氧化活性高于任何一种分离后抗氧化活性物质的活性。此外，提纯还可以采用反相柱分离法和离子树脂层析法。
下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
实施例1：
源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：按料液比为1:30于水中放入甜叶菊粉状原料，甜叶菊粉状原料中含有100wt％的甜叶菊杆茎，进行萃取，其中水浴提取温度为98℃以上，水浴提取时间为160min，超声辅助提取时间为25min，超声强度为60kHz；将获得的萃取液混合加热抽真空浓缩，浓缩到Brix 22，发酵12月得抗氧化剂原液。
实施例2：
源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：按料液比为1:16于水中放入甜叶菊粉状原料，甜叶菊粉状原料中含有80wt％的甜叶菊杆茎和20wt％的甜叶菊叶，进行萃取，其中水浴提取温度为95℃以上，水浴提取时间为107min，超声辅助提取时间为20min，超声强度为53kHz，将获得的萃取液混合加热抽真空浓缩，浓缩到Brix 25，发酵9月得抗氧化剂原液。
实施例3：
源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：按料液比为1:16于水中放入甜叶菊粉状原料，甜叶菊粉状原料中含有95wt％的甜叶菊杆茎和5wt％的甜叶菊叶，进行萃取，其中水浴提取温度为95℃以上，水浴提取时间为107min，超声辅助提取时间为20min，超声强度为53kHz；将获得的萃取液混合加热抽真空浓缩，浓缩到Brix 25，发酵9月得抗氧化剂原液。
实施例4：
源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：按料液比为1:16于水中放入甜叶菊粉状原料，甜叶菊粉状原料中含有99.5wt％的甜叶菊杆茎和0.05wt％的甜叶菊叶，进行萃取，其中水浴提取温度为95℃以上，水浴提取时间为107min，超声辅助提取时间为20min，超声强度为53kHz；将获得的萃取液混合加热抽真空浓缩，浓缩到Brix 25，发酵9月得抗氧化剂原液。
试验例1：
抗氧剂中物质检测
采用基于气质联用仪GC-MS进行分析，其中，GC-MS分析条件为：
萃取：选用65μmDVB/CAR/PDSSPME萃取头，样品瓶为20ml顶空瓶，在70℃恒温水浴锅中吸附40min后立即插入气相色谱进样口中，解析5min后，拔出。
气相色谱-质谱联用条件：进样口温度250℃，柱温40℃，保持3min,再以3℃/min程序升温到100℃，再以5℃/min升到230℃，保持5min。
色谱柱及气体载体如下：色谱柱：弹性毛细管柱DB-5MS,柱长30m,内径0.25mm,液膜厚度1μm；充填物苯基亚芳基聚合物实质上等同于(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷；非极性；极低的色谱柱流失特性，是理想的GC/MS色谱柱；对活性化合物有优异的惰性；提高了信噪比，具有更高的灵敏度和质谱图完整性；键合交联；可用溶剂冲洗。载气He，流速1.2mL/min。
不同甜菊液和甜叶菊原料的特性峰图谱如图1-7所示，甜菊液部分活性物质含有量如表1所示，其中原液为实施例3获得的甜叶菊抗氧化剂原液；高效液为抗氧化剂原液的精制样品(固形物含量在18％以上)；过滤未灭菌为抗氧化剂原液的精制过程中过滤未灭菌样品；未过滤未灭菌样品为抗氧化剂原液的精制过程中未过滤未灭菌样品；过滤灭菌样品为抗氧化剂原液的精制过程中过滤、灭菌样品；杆茎为甜叶菊杆茎原料粉；杆茎+叶为甜叶菊杆茎95％+叶5％混合原料粉。由图1-7和表1可知，与甜叶菊原料相比，抗氧化剂原液、高效液、过滤未灭菌样品、过滤灭菌样品、未过滤未灭菌样品、过滤灭菌仅有的成分为3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯和2,4,6三甲基吡啶，上述7种挥发性特征物质中3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯属于香气成分，3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯的用途尚不明确，2,4,6三甲吡啶为色谱用溶剂成分。这说明本发明抗氧化剂的制备方法将萃取液中大分子物质充分分解，使所得抗氧化剂产生新的成分物质，3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚和1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯的存在不仅能够赋予抗氧化剂新的风味，而且能够改善抗氧化剂的抗氧化性能，尤其是3-烯丙基-6-甲氧基苯酚的存在，能够和抗氧护活性成分中的邻苯二酚发挥增益作用，提高所得抗氧化剂的抗氧化活性；本发明抗氧化剂的制备方法使所得抗氧化剂在后续不同精制过程的所得的产物挥发性物质的特征峰形状基本不变，进而说明本发明抗氧化剂后续无论是过滤或者灭菌以及浓缩，3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯和2,4,6三甲基吡啶均存在。
不同种菊科植物液特性峰图谱如图1和8-9所示，可以看出不同种菊科植物液的挥发性物质的特征峰形状完全不同，甜菊液、杭白菊液和胎菊液中都有的成分为苯乙醇和苯甲醇，甜菊仅有的成分为3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯和2,4,6三甲基吡啶，这说明菊科植物品种不同，所制发酵液的也成分不同，发酵液的活性也存在不同之处。
表1甜菊液部分活性物质含有量(ng/g)
Figure BDA0002203143830000091
Figure BDA0002203143830000101
Figure BDA0002203143830000111
Figure BDA0002203143830000141
Figure BDA0002203143830000151
Figure BDA0002203143830000161
Figure BDA0002203143830000181
Figure BDA0002203143830000191
Figure BDA0002203143830000201
试验例2：
抗氧化剂基本成分及部分活性物质含有量测定
水分含量测定参考GB 5009.3-2016食品安全国家标准；蛋白质含量测定参考GB5009.5-2016食品安全国家标准；粗脂肪含量测定参考GB 5009.6-2016食品安全国家标准；灰分含量测定参考GB 5009.4-2016食品安全国家标准；碳水化合物测定参考GB 5009.1-2016食品安全国家标准。其中原液为实施例3获得的甜叶菊抗氧化剂原液；高效液为抗氧化剂原液的精制样品(固形物含量在18％以上)；过滤未灭菌为抗氧化剂原液的精制过程中过滤未灭菌样品；未过滤未灭菌样品为抗氧化剂原液的精制过程中未过滤未灭菌样品；过滤灭菌样品为抗氧化剂原液的精制过程中过滤、灭菌样品；杆茎为甜叶菊杆茎原料粉；杆茎+叶为甜叶菊杆茎95％+叶5％混合原料粉。各样品的基本成分及部分活性物质含有量测定如表2和表3所示。
表2甜叶菊基本成分(％，n＝2)
Figure BDA0002203143830000202
Figure BDA0002203143830000211
注：同一行上标不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。
表3甜叶菊制剂抗氧化活性相关及其他指标(n＝3)
Figure BDA0002203143830000212
注：同一行上标不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。
试验例3：
抗氧化剂的抗氧化活性测定：
1.清除DPPH自由基能力的测定
分别取一定体积的实施例3抗氧化剂于试管中，用蒸馏水溶解至3ml，然后加入1ml无水乙醇及1ml 0.2mmol/L的DPPH溶液，充分混匀，室温下放置30min后以40％乙醇溶液(V/V)调零点，在其最大吸收波长518nm下测定其吸光度为B；同时，在不加实施例3抗氧化剂的条件下重复上述步骤作一对照实验，测定其吸光度为A；再在不加DPPH试剂的条件下，为消除实施例3抗氧化剂的颜色干扰，重复上述步骤作一空白实验，记录其吸光度为C。BHT和VE是将其分别溶解在1ml无水乙醇中进行测定。自由基清除率根据下列公式计算：清除率＝(1-(B-C))/A×100。结果如图10所示。由图10可知，实施例3所得抗氧化剂原液以及由该原液获得的高效液、过滤未灭菌、未过滤未灭菌、过滤灭菌的浓度低于0.004％浓度时，抗氧化剂的自由基清除率低于BHT；但是高于0.005％浓度时，比实施例3所得抗氧化剂原液以及由该原液获得的高效液样品、过滤未灭菌样品、未过滤未灭菌样品、过滤灭菌样品的自由基清除率高于BHT；VE是天然、安全、高效的抗氧化剂，目前正广泛应用于我们的日常饮食中，对比比实施例3所得抗氧化剂原液以及由该原液获得的高效液样品、过滤未灭菌样品、未过滤未灭菌样品、过滤灭菌样品与VE的抗氧化活性可知，其抗氧化剂的自由基清除率远远优于VE。
2.抗氧化稳定性的测定
取一定量的实施例3抗氧化剂和VC于烧杯中，将其配成1％的水溶液，另取一定量的BHT和VE于烧杯中，将其配成1％的乙醇水溶液，用保鲜膜密封置于室温(5℃)下贮存。每天取样测定其对DPPH自由基的清除率，方法同清除DPPH自由基能力的测定，结果如图11所示。由图11可知，实施例3所得抗氧化剂原液以及由该原液获得的高效液、过滤未灭菌、未过滤未灭菌、过滤灭菌的自由基清除率较高，且随时间变化较为稳定，抗氧化稳定性较好；而VC虽然也对DPPH自由基有较高的清除率，但其稳定性较差，DPPH自由基清除率曲线随时间波动较大，抗氧化稳定性较差；BHT不仅对DPPH自由基的清除率低于实施例3抗氧化和VC，而且其抗氧化稳定性也较差；天然抗氧化剂VE虽然具有较好的抗氧化稳定性，但其对DPPH自由基的清除率最低。由此可见，实施例3所得抗氧化剂原液以及由该原液获得的高效液、过滤未灭菌、未过滤未灭菌、过滤灭菌不仅有较高的DPPH自由基清除率，而且具有较好的抗氧化稳定性，在今后的食品工业中具有很大的应用价值。
试验例4：
抗氧化剂中3-烯丙基-6-甲氧基苯酚的抗氧化活性
准确量取50mL实施例3抗氧化剂于250mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，充分摇匀，静置，待溶液完全分层后，放出下层的生物制剂水溶液，保留上层石油醚，下层生物制剂水溶液用同法再萃取2次，将3次的石油醚萃取液合并，在40℃下减压回收石油醚，得到无色黏稠油状物，为甜叶菊生物发酵制剂抗氧化提取物石油醚部，然后用乙醚继续萃取3次，将3次上层的有机溶剂萃取液合并，在40～50℃下减压回收有机溶剂，得到乙醚提取部。将乙醚部样品真空浓缩，配成40％的乙醚溶液。采用10块制备型硅胶薄层板用点样用毛细管进行带状点样，点样宽度控制在2mm左右，每块板点样8次，点样总量共1mL。实验选用V(甲苯):V(甲酸甲酯):V(甲酸)＝5.5:4.0:0.5为展开剂，在层析缸中展开约50min后，挥干溶剂，观察颜色带和各峰分离情况。后将硅胶薄层板置于紫外分析仪365nm下显色，根据紫外显色定位，刮下可辨认的色带(从上到下共有4条清晰、易刮的色带)，合并Rf值相同的色带于50mL离心管中，加入适量甲醇溶解、离心(2000r/min，20min)、洗脱3次，收集洗脱后的上清液并用甲醇定容至10mL，得到I、II、III、IV四组分，于-18℃下充氮保存。然后测定I、II、III、IV四组分对DPPH自由基清除能力的比较(如图12)。从图中可以看出，分离得到的这4组分均具有一定的DPPH自由基清除能力，其抗自由基活性强弱顺序为IV﹥III﹥I﹥II。因此，选择了自由基清除能力最强的组分IV利用气质联用仪进行结构鉴定。组分IV经GC-MS检测，由化学工作站给出了组分IV的GC-MS特性图谱(如图13)。图中显示IV为一个主要组分色谱峰，其保留时间为29.636min，杂质干扰较小，根据IV组分的保留时间，参考图1-5，可知IV组分为3-烯丙基-6-甲氧基苯酚。此外，测得IV组分的质谱图，然通过计算机检索并与结构库对照，得出该组分为3-烯丙基-6-甲氧基苯酚，相似度为61％。因此近似推断该组分为3-烯丙基-6-甲氧基苯酚，具有较强的抗氧化性。
试验例5：
抗氧化剂中和柠檬酸的抗氧化协同作用分析
准备6个5ml试管，6个试管中均加入0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)1.0ml、50mM亚油酸酒精(99.5％)1.0ml以及蒸馏水0.5ml，设为1-6号，然后将1号试管中加入实施例3抗氧化剂(添加量为40ppm)，设为试验组1；2号试管中加入α型维生素E(添加量为40ppm)，设为试验组2；3号试管中加入柠檬酸(添加量为40ppm)，设为试验组3；3号试管中加入实施例3抗氧化剂和柠檬酸(添加量为40ppm)，设为试验组3；3号试管中加入实施例3抗氧化剂和柠檬酸(添加量为40ppm)，设为试验组3；4号试管中加入实施例3抗氧化剂和α型维生素E(添加量分别为40ppm)，设为试验组4；5号试管中加入实施例3抗氧化剂和柠檬酸(添加量分别20ppm)，设为试验组5；6号试管无添加，为空白对照组。然后加上硅胶盖子密闭，置于70℃的恒温器中遮光放置，经时取样，观察其氧化指数的变化。采用抗氧化指数[100×(A-B)/A]表示抗氧化试样的抗氧化效果。A和B分别为无添加区及添加区的吸光度或PV。结果如图14，可以看出，实施例3抗氧化剂表现出较好的抗氧化性能，该实验结果与试验例1结果一致；同时实施例3抗氧化剂与柠檬酸合用的抗氧化效果优于单独作用，因此判断二者的相互作用表现为协同作用。所以，本发明实施例3抗氧化剂中少量的廉价的安全的柠檬酸的加入，可期待抗氧化效果倍增。
试验例6：
抗氧化剂对二型糖尿病的作用
1.实验动物饲养及模型建立
实验SD大鼠，雄性，SPF级，体重80±5g，在光-暗周期为12h、恒温20～22℃、相对湿度65～70％的环境下适应饲养1周后开始实验，给予标准的饲料和自由饮水。
二型糖尿病模型大鼠是通过高糖高脂饲料结合链脲佐菌素(STZ)诱导，高糖高脂饲料喂养6周后，禁食12h，一次性左下腹腔注射STZ(30mg/kg，溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4，冰浴，现配现用，5min内用完)。正常组按1mL/kg体重剂量腹腔注射柠檬酸缓冲液(0.1mmol/L，pH4.4)。72h后测定空腹血糖，空腹血糖大于11.1mmol/L的大鼠即为糖尿病模型。
2.分组和给药方法
二型糖尿病大鼠模型建立成功后，将大鼠按血糖及体重随机分为四组：试验组(造模后，用实施例3抗氧剂干预治疗)、模型组、正常对照组1、对照组2(用实施例3抗氧剂干预正常大鼠组)，每组15只。用实施例3抗氧剂干预8周，期间各组大鼠给药方法如下所示：
试验组：高脂饲料，自由饮食饮水，每日灌胃30mL实施例3抗氧剂；
对比组：高脂饲料，自由饮食饮水，每日灌胃30mL实施例3抗氧剂(除去粗多糖)；
模型组：高脂饲料，自由饮食饮水，每日灌胃同等体积的生理盐水；
正常对照组1：普通饲料，自由饮食饮水，每日灌胃同等体积的生理盐水；
对照组2：普通饲料，自由饮食饮水，每日灌胃30mL实施例3抗氧剂。
实验过程中观察各组大鼠的精神、营养、活动、饮食、排泄、体重等一般情况，每两周尾尖采血测定空腹12h后的空腹血糖值，结果分别如图15所示。从图15中可以看出，正常组对照组1及对照组2的空腹血糖实验期间基本保持一个稳定水平，对比组和模型组大鼠始终保持较高血糖水平，试验组大鼠血糖水平随时间变化呈快速下降的趋势。与模型组相比，试验组大鼠的空腹血糖显著下降，到第8周时血糖值降低了32.75％，但仍然显著高于正常对照组(p<0.05)。以上结果表明，本发明得抗氧化剂中粗多糖的存在会与此原液中的抗氧化活性物质酚类、黄酮和钾离子发挥共同协作作用，可对二型糖尿病显示出抑制作用。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：至少包含酚类、黄酮和钾离子；所述的酚类至少包含3-烯丙基-6-甲氧基苯酚。
2.根据权利要求1所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的抗氧化剂中酚类含量为0.46～126.82mg/g、黄酮含量为0.08～1.56mg/g、钾离子含量为0.77～37.24mg/g。
3.根据权利要求1所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的抗氧化剂中3-烯丙基-6-甲氧基苯酚的含量为0.073～4.17mg/g。
4.根据权利要求1所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的抗氧化剂还含有粗多糖。
5.根据权利要求4所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的粗多糖浓度为5～4650ppm。
6.根据权利要求1所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的抗氧化剂的浓度≥Brix5。
7.根据权利要求1所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的抗氧化剂还含有3,7二甲基-1,6辛二烯-3-醇、十四烷酸、乙酸苄酯、乙酸乙酯、1,7,7-三甲基-双环[2,2,1]庚-2-烯、2,4,6-三甲基吡啶。
8.根据权利要求1所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述的抗氧化剂中至少加入10ppm的柠檬酸。
9.权利要求1-8任一项所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂的制备方法，其特征在于：采用甜叶菊原株和/或杆茎和/或叶中附生菌发酵获得；所述附生菌包括乳酸菌或枯草芽孢杆菌。
10.根据权利要求9所述的源于天然甜叶菊的纯天然植物抗氧化剂，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：
一)于萃取溶液中放入甜叶菊原料，进行萃取；
二)将所述一)步骤后获得的萃取液混合浓缩；
三)在所述二)步骤后获得的浓缩液发酵得抗氧化剂。
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