CN110637032A - 抗dr5抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与死亡受体5(DR5)特异性结合并具有杀伤癌细胞功能的抗体。更具体地,提供了抗DR5抗体或其抗原结合片段以及该抗体或该抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。本发明的特征在于抗DR5抗体或其抗原结合片段在对DR5的亲和性、稳定性和杀伤癌细胞的作用方面有所改善。
Description
技术领域
本公开涉及与死亡受体5(DR5)特异性结合并具有杀伤癌细胞功能的抗体,更具体地,涉及抗DR5抗体或其抗原结合片段以及该抗体或该抗原结合片段在预防或治疗癌症中的用途。
背景技术
通过TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL或Apo2L)和作为其受体之一的死亡受体5(DR5)的细胞凋亡途径诱导癌细胞选择性凋亡而不影响正常细胞,并且该途径被认为是癌症治疗剂的开发的重要靶标(Ashkenazi等人,Nat Rev Cancer 2:420,2002)。
目前,靶向DR5的重组TRAIL和死亡受体特异性抗体被开发为对抗癌细胞的治疗剂。
至于TRAIL,其问题在于对DR5的选择性低,这是因为配体不仅与转导细胞凋亡信号的DR4(死亡受体4,TRAIL-受体1)和DR5(死亡受体5,TRAIL-受体2)结合,还与不能转导凋亡信号的DcR1(诱饵受体1,TRAIL-受体3)和DcR2(诱饵受体1,TRAIL-受体4)结合。此外,重组TRAIL的稳定性差,并且具有诱导包括星形细胞、肝细胞、角质形成细胞等正常细胞的细胞凋亡的不良作用(Jo等人,自然医学6,564-567,2000)。因此,对于开发诱导癌细胞选择性凋亡并几乎没有不良作用的抗DR5和抗DR4抗体进行了积极研究。
关于死亡受体特异性抗体,已进行临床试验以评估由Genentech Incorporated(U.S.A.)和Amgen(U.S.A.)开发的抗DR5抗体的细胞毒活性。人类基因组科学(美国)进行了抗DR5抗体HGS-ETR2和抗DR4抗体HGS-ETR1的II期临床试验,但已停止开发。此外,如Apomab、西他土珠单抗(Conatumumab、替加珠单抗(tigatuzumab)等的抗-DR5抗体的开发被终止。
细胞凋亡主要通过两种主要机制发生,即外在细胞凋亡途径和内在细胞凋亡途径。大多数化学治疗剂和放射疗法通过p53介导的内在细胞凋亡来诱导癌细胞死亡,而DR5介导的细胞凋亡是通过非p53依赖性外在细胞凋亡途径和内在细胞凋亡途径来诱导的(Takeda等,Oncogene,26,3745-3757,2007)。在外在细胞凋亡途径中,TRAIL或抗体与DR5结合形成死亡诱导信号传导复合物(DISC),该复合物通过衔接蛋白(FADD)激活凋亡起始蛋白酶半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10。然后,半胱天冬酶-8激活下游蛋白酶半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7,同时通过线粒体诱导内在细胞凋亡(Ohtsuka等,原癌基因,22,2034至44年,2003年)。
随着TRAIL作为癌症治疗靶标的重要性日益增加,需要开发更有效和强力的TRAIL靶向药物。
发明内容
技术问题
本公开旨在提供与死亡受体5(DR5)特异性结合以有效杀伤各种癌细胞的抗DR5抗体及其用途。
一方面提供了抗DR5抗体或其抗原结合片段。
另一方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物,该组合物包含抗DR5抗体和/或抗原结合片段。
另一方面提供了预防或治疗癌症的方法,该方法包括将抗DR5抗体和/或抗原结合片段施用于有需要的受试者的步骤。
另一方面提供了抗DR5抗体和/或抗原结合片段在预防或治疗癌症或制备抗癌剂中的用途。
另一方面提供了编码抗DR5抗体或抗原结合片段的多核苷酸分子、携带该多核苷酸的重组载体和含有该重组载体的重组细胞。
另一方面提供了制备抗DR5抗体或其抗原结合片段的方法,该方法包括表达多核苷酸分子的步骤。
技术方案
本公开提供了一种与死亡受体5(DR5)特异性结合以有效诱导各种癌细胞死亡的抗DR5抗体,以及包含该抗体以预防或治疗癌症的药物组合物。
本文提供的抗体是TRAIL非竞争性抗体,其不论TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)的浓度如何都保持恒定水平的抗原结合活性。因此,与先前开发的抗体药物相比,该抗体可以有效地开发成显示优异功效的创新型新抗体药物或诊断剂。
死亡受体5(DR5),也称为TRAIL受体2(TRAILR2)或肿瘤坏死因子受体超家族成员10B(TNFRSF10B),是TNF受体超家族的细胞表面受体,死亡受体5通过转导凋亡信号结合TRAIL并介导细胞凋亡。DR5显示与半胱天冬酶8、半胱天冬酶10、FADD(具有死亡域的Fas相关蛋白)和TRAIL相互作用。DR5可以源自哺乳动物,并且可以是例如人DR5(例如,NCBI登录号UniProtKB/Swiss-Prot:Q6FH58)。
一方面提供了特异性识别和/或结合DR5的多肽。多肽可以是选自由SEQ ID NO:1至16的氨基酸序列组成的组中的一种。更具体地,该多肽可以具有选自由SEQ ID NO:1、2、4和7至16组成的组中的一种的氨基酸序列。
如本文所用,表述“具有氨基酸序列或核苷酸序列的蛋白质、多肽或多核苷酸”旨在涵盖蛋白质、多肽或多核苷酸包括所述序列、基本上由所述序列或由所述序列组成的所有情况。
所述多肽可以用作抗DR5抗体的互补决定区(CDR)。
所述多肽及其适用的互补决定区总结于下表1中:
表1
(在表1中,VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3表示重链互补决定区,VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3表示轻链互补决定区)
另一方面提供了靶向DR5的多肽分子,所述多肽分子包含选自由上述多肽组成的组中的至少一种。靶向DR5的多肽分子具有在不与DR5配体TRAIL竞争的情况下用于引发癌细胞死亡(例如,癌细胞凋亡)的特征。
靶向DR5的多肽分子可包含上述的抗DR5抗体重链互补决定区或轻链互补决定区、或其组合;或包含重链互补决定区的重链可变区、包含轻链互补决定区的轻链可变区、或其组合。
靶向DR5的多肽分子可以用作(但不限于)抗DR5抗体、抗体的抗原结合片段或抗DR5抗体类似物(具有与抗体相似的支架和功能的结构,例如肽体、纳米抗体等),或用作多特异性抗体的前体或组件(例如CDR)。
如本文所用,术语“肽体”是指在构架和功能方面模拟抗体的融合蛋白(肽+抗体),其中肽与抗体的部分或完整恒定区(例如Fc)融合。在本文中,如上所述的一种或多种肽可以充当抗原结合片段(重链和/或轻链CDR或可变区)。
如本文所用,术语“纳米抗体”,也称为单域抗体,是指具有抗体的单体单可变域并显示类似于全长抗体的对某些抗原的选择性的抗体片段。纳米抗体的分子量通常为约12kDa至约15kDa,远小于全长抗体(包括两个重链和两个轻链)的分子量(约150kDa至约160kDa),并且在一些情况下甚至比Fab或scFv片段的分子量还小。
如本文所用,术语“多特异性抗体”(包括双特异性抗体)是指识别和/或结合两种或更多种不同抗原,或识别和/或结合相同抗原的不同位点的抗体,多特异性抗体的抗原结合位点之一可以包括上述多肽。
一方面提供了抗DR5抗体或其抗原结合片段,所述抗DR5抗体包含选自由上述多肽组成的组中的至少一种多肽作为互补决定区。本文提供的具有DR5激动剂功效的抗DR5抗体用于聚集在细胞表面上分开存在的DR5分子,以在细胞内产生和转导凋亡信号,从而诱导细胞死亡。
抗DR5抗体或其抗原结合片段可包含选自由以下组成的组中的至少一种作为重链互补决定区:
具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1),
具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2),和
具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)。
SEQ ID NO:3的氨基酸序列与以下通式1的氨基酸序列相同:
[通式1](SEQ ID NO:3)
D-A-G-S-X1-C-G-X2-G-G-W-T-G-A-C-I-D-T
其中,
X1是G或P,和
X2是S或K。
在一种实施方式中,可用作抗DR5抗体或其抗原结合片段的重链CDR3的SEQ IDNO:3的多肽可具有选自由例如SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列组成的组中的至少一种(在以下氨基酸序列中,粗体和下划线字母表示从SEQ ID NO:7的氨基酸序列修饰的氨基酸残基):
SEQ ID NO:7:DAGSGCGSGGWTGACIDT
SEQ ID NO:8:DAGSPCGSGGWTGACIDT
SEQ ID NO:9:DAGSPCGKGGWTGACIDT
在另一种实施方式中,抗DR5抗体或其抗原结合片段可包含选自由以下组成的组中的至少一种作为轻链互补决定区:
具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1),
具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2),和
具有SEQ ID NO:6多肽的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列分别与以下通式2和3的氨基酸序列相同。
[通式2](SEQ ID NO:5)
N-N-N-N-X3-X4-X5
其中,
X3是R、L或K,
X4是P、M或A,和
X5是S、P或K;
[通式3](SEQ ID NO:6)
G-S-R-D-S-X6-X7-X8-G-X9
其中,
X6是S、A或D,
X7是Y或G,
X8是V、M、G或A,和
X9是I、A、R或G。
在一种实施方式中,可以作为抗DR5抗体的轻链CDR2或其抗原结合片段获得的SEQID NO:5的多肽可以具有选自由SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列组成的组中的至少一种(在以下氨基酸序列中,粗体和下划线字母表示从SEQ ID NO:10的氨基酸序列修饰的氨基酸残基):
SEQ ID NO:10:NNNNRPS
SEQ ID NO:11:NNNNLMP
SEQ ID NO:12:NNNNKAK
在一种实施方式中,可以作为抗DR5抗体的轻链CDR3或其抗原结合片段获得的SEQID NO:6的多肽可以具有选自由SEQ ID NO:13、14、15和16的氨基酸序列组成的组中的至少一种(在以下氨基酸序列中,粗体和下划线字母表示从SEQ ID NO:13的氨基酸序列修饰的氨基酸残基):
SEQ ID NO:13:GSRDSSYVGI
SEQ ID NO:14:GSRDSAGMGA
SEQ ID NO:15:GSRDSDGGGR
SEQ ID NO:16:GSRDSSGAGG
在一种实施方式中,抗DR5抗体或其抗原结合片段可包含:
至少一个重链互补决定区,其选自由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)组成的组;或包含上述至少一个重链互补决定区的重链可变区;
至少一个轻链互补决定区,其选自由具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)组成的组;或包含上述至少一个轻链互补决定区的轻链可变区;
上述重链互补决定区和轻链互补决定区的组合;或
上述重链可变区和轻链可变区的组合。
更具体地,抗DR5抗体或其抗原结合片段可包含:
至少一个重链互补决定区,其选自由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有选自由SEQ ID NO:7至SEQID NO:9组成的组中的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)组成的组;或包含上述至少一个重链互补决定区的重链可变区;
至少一个轻链互补决定区,其选自由具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有选自由SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12组成的组中的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有选自由SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:16组成的组中的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)组成的组;或包含上述至少一个轻链互补决定区的轻链可变区;
上述重链互补决定区和轻链互补决定区的组合;或
上述重链可变区和轻链可变区的组合。
在一种实施方式中,抗DR5抗体或抗原结合片段可包含:
重链可变区,其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有选自由SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9组成的组中的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3);和
轻链可变区,其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有选自由SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12组成的组中的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有选自由SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:16组成的组中的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
在一种实施方式中,抗DR5抗体或其抗原结合片段可包含下表2和3中给出的重链可变区和轻链可变区的组合。
表2
重链互补决定区(CDR)的序列
表3
轻链CDR的序列
另一方面提供了包含重链互补决定区的重链可变区、包含轻链互补决定区的轻链可变区或其组合。例如,重链可变区可包含选自由SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:37组成的组中的氨基酸序列,轻链可变区可包含选自由SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:49组成的组的氨基酸序列。
因此,抗DR5抗体或其抗原结合片段可包含:
重链可变区,具有选自由SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:37组成的组中的氨基酸序列;
轻链可变区,具有选自由SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:49组成的组中的氨基酸序列;或
其组合。
在一种实施方式中,抗DR5抗体可以是动物来源的抗体(例如小鼠来源的抗体)、嵌合抗体(例如小鼠-人嵌合抗体)或人源化抗体。抗体或抗原结合片段可以是从活体分离的或非天然存在的。抗体或抗原结合片段可以是重组的或合成的。
在另一种实施方式中,抗体可以来源(分离)自任何动物,例如哺乳类动物(包括人)、鸟类等。例如,抗体可以是人抗体、小鼠抗体、驴抗体、绵羊抗体、兔抗体、山羊抗体、豚鼠抗体、骆驼抗体、马抗体或鸡抗体。本文中,人抗体是具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体,并且包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或从已经转基因至少一种人免疫球蛋白并且不包含内源免疫球蛋白的动物中分离的抗体。
抗DR5抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体,并且可以是例如单克隆抗体。可以使用本领域公知的方法制备单克隆抗体,例如,使用噬菌体展示技术。可供选择地,可以以小鼠来源的单克隆抗体的形式构建抗DR5抗体。
除了如上定义的重链CDR和轻链CDR部分或重链可变区和轻链可变区之外,抗DR5抗体或其抗原结合片段可以来源于免疫球蛋白的任何亚型(例如IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等),例如,来源于构架部分和/或轻链恒定区和/或重链恒定区。
全长抗体(例如IgG型)具有两条全长轻链和两条全长重链的结构,其中每条轻链经二硫键与相应的重链连接。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区,重链恒定区为γ、μ、α、δ和ε类型,并且具有亚类γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2。轻链恒定区是κ或λ型。
如本文所用,术语“重链”旨在涵盖全长重链及其片段,全长重链包含包括足以提供对抗原特异性的氨基酸序列在内的可变区VH、三个恒定区CH1、CH2和CH3以及铰链。术语“轻链”旨在涵盖全长轻链及其片段,全长轻链包含包括足以提供对抗原特异性的氨基酸序列在内的可变区VL、以及恒定区CL。
术语“互补决定区(CDR)”是指在免疫球蛋白的重链或轻链的超可变区中发现的氨基酸序列。重链和轻链可分别包括三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3;以及CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR可以提供在抗体与抗原或表位的结合中起重要作用的接触残基。如本文所用,术语“特异性结合”和“特异性识别”具有与本领域普通技术人员已知的相同的一般含义,并且表明抗体和抗原彼此特异性相互作用以导致免疫反应。
本文使用的术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白的包括作为抗原结合位点的一部分多肽的片段。抗原结合片段可以是scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab′或F(ab′)2,但不限于此。
在抗原结合片段中,包含轻链可变区和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区CH1的Fab具有一个抗原结合位点。
Fab′与Fab的不同之处在于Fab′包括在CH1的C末端具有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
F(ab′)2抗体通过桥接Fab′铰链区中的半胱氨酸残基的二硫键而形成。Fv是仅由重链可变区和轻链可变区组成的最小抗体片段。产生Fv片段的重组技术在本领域中是众所周知的。
双链Fv包括通过非共价键彼此连接的重链可变区和轻链区。单链Fv通常包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区和轻链可变区经肽接头通过共价键彼此连接或在C末端连接以具有如双链Fv的二聚体结构。
抗原结合片段可以使用蛋白酶来获得(例如,可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割完整抗体来获得Fab,以及可以通过用胃蛋白酶切割获得F(ab′)2片段),或者可以通过使用基因重组技术来制备。
如本文所用,术语“铰链区”是指抗体重链内CH1和CH2域之间的区域,其功能是为抗原结合位点提供灵活性。
另一方面提供了药物组合物,其包含抗DR5抗体或其抗原结合片段作为预防和/或治疗癌症的有效成分。
另一方面提供了预防和/或治疗癌症的方法,该方法包括将药学有效量的抗DR5抗体或其抗原结合片段施用于有需要的受试者的步骤。用于预防和/或治疗癌症的方法可以进一步包括在施用步骤之前鉴定需要预防和/或治疗癌症的患者(例如,诊断或选择待治疗的受试者)的步骤。
抗DR5抗体可有效地用于预防或治疗癌症。因为,如上所述,本文提供的抗DR5抗体用作DR5激动剂,可能有利的是,癌细胞表达DR5使得当应用于其的时候抗DR5抗体发挥足够的功效(例如,抗癌功效,例如癌细胞死亡)。此外,癌症可以是TRAIL敏感性癌症或TRAIL抗性癌症。在一种实施方式中,癌症的具体实例包括血癌、肺癌、胃癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、乳腺癌、子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、喉癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、幼年期实体瘤、分化淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、和垂体腺瘤,但不限于此。
在一种实施方式中,与单独使用抗DR5抗体或其抗原结合片段相比,抗DR5抗体或其抗原结合片段与TRAIL组合使用产生协同效应,并引发对TRAIL抗性癌症以及TRAIL敏感性癌症的抗癌作用(参见实施例13)。
因此,除了抗DR5抗体或其抗原结合片段之外,药物组合物可以包含TRAIL(TNF相关的细胞凋亡诱导配体)。
也就是说,药物组合物可包含以下作为有效成分:
(1)抗DR5抗体或其抗原结合片段;和
(2)TRAIL。
药物组合物可在一种合并制剂中或在分开的制剂中包含(1)抗DR5抗体或其抗原结合片段和(2)TRAIL。
另外,除了施用抗DR5抗体或其抗原结合片段的步骤之外,用于预防和/或治疗癌症的方法还可以包括施用药学有效量的TRAIL的步骤。
也就是说,用于预防和/或治疗癌症的方法可包括将(1)药学有效量的抗DR5抗体或其抗原结合片段和(2)药学有效量的TRAIL组合施用于需要预防和/或治疗癌症的患者的步骤。
组合施用的步骤可以通过同时施用配制成一种剂型的(1)药学有效量的抗DR5抗体或其抗原结合片段和(2)药学有效量的TRAIL来进行,或同时或不考虑顺序地依次施用配制成分开的剂型的(1)药学有效量的抗DR5抗体或其抗原结合片段和(2)药学有效量的TRAIL来进行。
TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体),也称为CD253(分化簇253)或TNFSF10(肿瘤坏死因子(配体)超家族,成员10),是一种用作诱导细胞死亡(细胞凋亡)过程的配体的蛋白质。TRAIL是由正常组织细胞广泛产生和分泌的细胞因子。在一种实施方式中,TRAIL可以是人来源的并且可以由例如NCBI登录号NP_001177871.1、NP_003801.1等表示,但不限于此。
利用细胞凋亡途径的抗DR5抗体或其抗原结合片段(或与TRAIL组合)可以与至少一种化学治疗剂(例如卡铂或紫杉醇(Recka等人,Lung Cancer,82,441-448,2013)、吉西他滨(Torres等人,Cancer Medicine,2(6),925-932,2013)等)组合使用,从而增强抗癌/抗肿瘤作用(参见实施例15)。
为了对癌症发挥预防和/或治疗作用,抗DR5抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物可以单独给药或与手术、激素疗法、药物疗法和/或生物反应调节剂组合给药。
在一种实施方式中,除了抗DR5抗体或其抗原结合片段(或与TRAIL组合)之外,药物组合物可包含至少一种熟知的具有抗癌作用的有效成分(化疗药物)。此外,用于预防和/或治疗癌症的方法可以包括除了抗DR5抗体或其抗原结合片段(或与TRAIL结合使用)之外,还给药至少一种熟知的具有抗癌作用的有效成分(化疗药物)的步骤。
可与抗DR5抗体或其抗原结合片段一起使用的化疗药物可以是选自由以下组成的组中的至少一种:烷基化抗癌剂,例如卡铂、紫杉醇(Recka等人,Lung Cancer,82,441-448,2013)等;基于代谢拮抗剂的抗癌剂,例如吉西他滨(Torres等人,Cancer Medicine,2(6),925-932,2013)等;基于蒽环类的抗癌剂,例如多柔比星(HM Amm等人,Mol Cancer ResApril,9;403,2011)等;基于蛋白酶体抑制剂的抗癌剂,例如硼替佐米(ShankerA等人,JNatl Cancer Inst,May 7;100(9):649-62,2008)等,但不限于此。
为了适当施用有效成分例如抗DR5抗体、抗原结合剂等,至少一种药学上可接受的载体可以被包含在药物组合物中,或者可以与有效成分一起施用。药学上可接受的载体的实例可包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其一种或多种组分的混合物。如果需要,可以进一步添加其他常规添加剂,例如抗氧化剂、缓冲剂或抑菌剂。此外,通过添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂,可以将药物组合物配制成可注射剂型,例如水溶液、悬浮液或乳液,或配制成丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。此外,可以根据疾病或组分,使用与本领域相关的方法或在雷明顿药学科学(Remington′s Pharmaceutical Science)(最新版),Mack出版公司,Easton PA中公开的方法适当地配制药物组合物。
有效成分如抗DR5抗体、抗原结合片段等,或药物组合物可以口服或肠胃外给药。对于肠胃外给药,可以进行静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药和直肠内给药。由于口服给药导致蛋白质或肽的消化,因此可以涂覆或配制用于口服给药的组合物中的活性成分以防止胃中的消化。另外,可以使用能够将活性成分递送至靶细胞的任选的装置来施用组合物。
根据诸如制备(配制)方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、病理状况和饮食、施用时间、施用间隔、施用途径、排泄速度和反应敏感性等因素,可以以各种量规定抗DR5抗体或其抗原结合片段的药物有效量。例如,抗DR5抗体或其抗原结合片段的日剂量可以为0.001至1000mg/kg,特别是0.01至100mg/kg,更特别是0.1至50mg/kg,甚至更特别是0.1至20mg/kg,但不限于此。每日剂量可以配制成单位剂型的单一制剂或配制成适当分开的制剂,或者可以制成被包含在多剂量容器中。药物组合物可以与其他药物组合施用,并且可以根据患者的状态对剂量、施用方法和其他药物的种类作出适当的规定。
药物组合物可以配制成油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆、乳液、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式,并且还可以包括用于配制的分散剂或稳定剂。
特别地,包含抗DR5抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以配制成免疫脂质体,因为它含有抗体或抗原结合片段。含有抗体的脂质体可以使用本领域广泛已知的任何方法制备。免疫脂质体可以是包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物,并且可以通过反相蒸发法制备。例如,抗体的Fab′片段可以通过二硫化物交换反应与脂质体缀合。
同时,由于抗DR5抗体或其抗原结合片段与DR5特异性结合,抗体或片段可用于检测DR5(即存在和/或水平(浓度))和/或诊断DR5相关疾病(即DR5的存在或水平变化(相对于正常状态显示出水平增加或减少的疾病))。
因此,一种实施方式设想了包含抗DR5抗体或其抗原结合片段的DR5检测组合物。另一方面提供DR5检测方法,包括以下步骤:用抗DR5抗体或其抗原结合片段处理生物样品;并确定抗原-抗体反应的存在。如果鉴定出抗原-抗体反应,则可以确定生物样品含有DR5,并且可以通过测量生物样品中抗原-抗体反应的程度来测量DR5的水平(浓度)。
生物样品可以选自由获得自患者(例如哺乳动物,例如人)的细胞、组织和体液以及其培养物组成的组。正常样品可选自由获得自未患DR5相关疾病的正常受试者(例如哺乳动物,例如人)获得的细胞、组织和体液及其培养物组成的组。
可以使用本领域已知的各种方法进行鉴定抗原-抗体反应的存在的步骤或测量抗原-抗体反应的步骤。举例来说,可以通过普通酶反应、荧光、发光和/或放射性检测来检测抗原-抗体反应,并且特别地可以通过选自由免疫色谱法、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)、蛋白质印迹等方法测量,但不限于此。
另一方面提供了:
编码重链互补决定区的多核苷酸、编码轻链互补决定区的多核苷酸、或其组合;编码重链可变区的多核苷酸、编码轻链可变区的多核苷酸、或其组合;或编码重链的多核苷酸、编码轻链的多核苷酸、或其组合,其中互补决定区、重链可变区和轻链可变区、以及重链和轻链如以上对DR5抗体所描述;
携带多核苷酸或其组合的重组载体;和
含有重组载体的重组细胞。
在一种实施方式中,上述重组载体可以在携带每种多核苷酸的单个载体或分开的载体中包含分别编码以下的多核苷酸:抗DR5抗体中的重链互补决定区和轻链互补决定区;重链可变区和轻链可变区;或重链和轻链。
术语“载体”是指在宿主细胞中表达靶基因的工具,例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体(例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体)。重组载体可以由本领域常用的质粒(例如pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列和pUC19)、噬菌体(例如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)或通过操纵病毒(例如,SV40等)来构建。
在重组载体中,多核苷酸可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”旨在涉及目标核苷酸序列和表达调控序列(例如启动子序列)之间的功能性连接。当“可操作地连接”时,调控元件可以控制目标核苷酸的转录和/或翻译。
重组载体通常可以构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体,可以使用本领域通常可用于在植物、动物或微生物细胞中表达外源蛋白的载体。本领域熟知的各种方法可用于构建重组载体。
为了在宿主(例如原核或真核细胞)中使用,可以相应地构建重组载体。例如,当载体被构建为用于原核宿主的表达载体时,载体通常包括用于转录的强启动子(例如pLκλ启动子、CMV启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。另一方面,用于真核宿主的表达载体包括可在真核细胞中起作用的复制起点,例如f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺病毒复制起点、AAV复制起点和BBV复制起点,但不限于此。此外,表达载体通常包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子)以及作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。
可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞中来制备重组细胞。可以在本公开中使用的本领域已知的任何宿主细胞,只要该宿主细胞允许以稳定方式顺序克隆和表达重组载体。可用于本公开的原核宿主细胞的实例包括大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))以及肠杆菌科菌株(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和各种假单胞菌物种(Pseudomonas species))。可用于转化的真核宿主细胞可包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞和动物细胞,例如Sp2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)K1、CHO DG44、PER.C6、W138、BHK、COS-7,293、HepG2、Huh7、3T3、RIN和MDCK。
可以使用本领域熟知的方法将核酸分子或携带核酸分子的重组载体导入
(转染)到宿主细胞中。当宿主细胞是原核细胞时,可以使用CaCl2或电穿孔方法进行该转染。对于真核宿主细胞,可以使用但不限于显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染或粒子轰击来实现遗传引入。
为了选择转化的宿主细胞,可以根据本领域熟知的方法利用与选择标记物相关联的表型。例如,当选择标记物是赋予对某种抗生素抗性的基因时,宿主细胞可以在抗生素存在下在培养基中生长以选择目标转化体。
另一方面提供了生产抗DR5抗体或其抗原结合片段的方法,该方法包括在相关宿主细胞中表达多核苷酸或重组载体的步骤。在一种实施方式中,生产方法可包括在其中培养含有多核苷酸或重组载体的重组细胞,并任选地从培养基中分离和/或纯化抗体。
有益效果
本公开提供了用于靶向治疗表达DR5的疾病的抗DR5抗体。本公开的抗体是TRAIL非竞争性抗体,其不论TRAIL的浓度如何都保持恒定水平的抗原结合亲和力。因此,与先前开发的抗体药物相比,抗体可以有效地开发成显示出优异功效的创新型新抗体药物或诊断剂。
附图说明
图1是描述抗体D0的缔合和解离速率的缔合和解离传感图。
图2a至2f是抗体D0和DA1至DA35与对照抗体AP在对DR5的结合活性方面进行比较的图。
图3a和3b显示了根据本公开的代表性抗体的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果。
图4a至4h是根据本公开的代表性抗体的尺寸排阻色谱图(SEC)。
图5显示了根据本公开的抗体的药代动力学分布图。
图6a至6r证明了根据本公开的抗体在肿瘤细胞中具有细胞毒活性。
图7a和7b显示了根据本公开的抗体在异种移植动物模型中的肿瘤生长抑制的结果。
图8a和8b证明了根据本公开的抗体不与TRAIL竞争结合DR5。
图9a和9b是描绘在诱导细胞死亡的测定中根据本公开的抗体和TRAIL的协同效应的图。
图10a至10c是显示根据本公开的抗体通过细胞凋亡诱导细胞死亡的图。
图11a和11b显示了根据本公开的抗体当与某些浓度的吉西他滨组合使用时的细胞毒活性。
具体实施方式
在下文中,将参考实施例详细描述本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明,对本领域技术人员显而易见的是,本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1.DR5免疫和cDNA文库构建
为了选择与DR5特异性结合的抗体,构建了动物免疫的抗体文库。通过从用抗原免疫的动物的免疫细胞中获得mRNA,使用针对抗体基因的引物组合通过PCR扩增抗体基因,并将抗体基因克隆到噬菌体展示载体中来构建文库。
简而言之,将与完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂(Sigma,U.S.A)混合的人DR5(R&Dsystems,U.S.A)以三周的规律间隔五次皮下注射至三只白色来亨鸡。将来自免疫动物的血清在PBSB(3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水溶液)中以1∶100、1∶500、1∶2500和1∶12500的浓度稀释,然后储存。进行酶联免疫吸附测定以检查血清是否与人DR5结合。将ELISA板用1μg/ml人DR5(R&D systems,U.S.A.)在4℃下包被过夜,然后与稀释的血清反应2小时。将板用PBST(0.1%吐温-20的PBS溶液)洗涤三次,然后与抗鸡免疫球蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)(1∶3000)一起温育1小时。用PBST洗涤三轮后,用ABTS(Thermo,U.S.A.)显色20分钟。在酶标仪上读取405nm处的吸光度。免疫前的血清不与DR5结合。选择产生与人DR5强结合的血清的动物。
最后一次注射后5天,从所选择的鸡中收集骨髓、脾脏和法氏囊。将组织与10mlTRI试剂(Molecular research Center,U.S.A.)混合,并用匀浆器匀浆。添加20ml TRI试剂,然后离心。将由此获得的上清液与3ml的1-溴-3-氯丙烷(BCP)混合并离心以获得上清液。通过添加15ml异丙醇来沉淀总RNA。使用SuperScript转录系统(InVitrogen,U.S.A.)以随机六聚体作为引物进行逆转录(65℃下5分钟;4℃下5分钟;50℃下50分钟;85℃下5分钟;以及4℃下)。将含有所得cDNA的5μl(微升)逆转录反应混合物上样到1%琼脂糖凝胶上并电泳以检测各种长度的cDNA条带。
实施例2.抗体文库的构建
(2-1)免疫抗体基因的扩增
为了扩增鸡抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL,如下进行PCR。对于PCR,用实施例1中制备的cDNA作为模板,并且如下表4所示,使用针对重链可变区、轻链可变区和连接重链可变区和轻链可变区的scFv(单链Fv)设计的引物组合。将VH和VL cDNA文库各0.5μl、30pmol正向引物、30pmol反向引物、10×PCR缓冲液、200μM dNTP和0.5μl TaqDNA聚合酶混合并调节至最终体积为50μl,并进行PCR。在94℃下变性5分钟,接着进行30个循环:94℃下15秒,56℃下30秒,72℃下90秒。通过1%琼脂糖凝胶电泳根据大小分离PCR扩增的抗体DNA,并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen,U.S.A.)纯化。
为获得scFv DNA,将纯化的VH和VL DNA各50ng用作模板,并与30pmol正向引物,30pmol反向引物,10×PCR缓冲液,200μM dNTP和0.5μl TaqDNA聚合酶混合至终体积为50μl。PCR通过以下进行:在94℃下变性5分钟,然后进行20个循环:94℃下30秒,56℃下30秒和72℃下2分钟。在1%琼脂糖凝胶电泳上根据大小分离PCR扩增的DNA,并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen,U.S.A.)纯化。
PCR中使用的引物总结在下表4中。
表4
PCR中使用的引物
(2-2)抗体DNA的限制酶消化
将以上制备的scFV和噬菌粒载体pComb3X(Scripps Research Institute,CA,U.S.A)用限制酶SfiI(Roche,U.S.A)消化。将10μg编码scFv的PCR片段,360单位SfiI(Roche,U.S.A.)和20μl 10×缓冲液的混合物体积调节至最终体积为200μl,并使其在50℃下反应过夜。另外,将20μg pComb3X载体、120单位SfiI和20μl 10×缓冲液的混合物体积调节至200μl,并在50℃下反应过夜。将每种所得消化物在琼脂糖凝胶上电泳,并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen,U.S.A.)纯化。
(2-3)抗体DNA的连接和文库构建
为了将scFv片段插入pComb3X,将在(2-2)中用限制酶SfiI消化的700ng编码scFV的PCR片段和1.4μg pComb3X的混合物在T4 DNA连接酶(Invitrogen,U.S.A.)存在下于16℃下反应过夜。将由此获得的连接混合物通过乙醇沉淀纯化,并通过电穿孔转化到大肠杆菌ER2738(New England Biolab,U.S.A.)中。在46μg/ml羧苄青霉素和70μg/ml卡那霉素存在下培养大肠杆菌,以构建复杂度为5×109的文库。
实施例3.携带抗DR5 scFv的噬菌体克隆的选择
从实施例2中获得的具有scFV形式的随机化重链和轻链的文库中,使用固相固定的DR5选择与人DR5结合的抗体。
(3-1)选择与DR5结合的抗体
首先,将10μg人DR5(R&D systems,U.S.A)与磁珠缀合。通过将实施例2中获得的scFv型抗体与噬菌体外壳蛋白PIII融合以使噬菌体表面上的抗体表达来构建抗体DNA文库。用抗体文库DNA通过电穿孔转化后,将大肠杆菌ER2738(New England Biolab)在37℃下培养,然后在SB培养基(30g/L胰蛋白胨,20g/L酵母提取物和10g/L MOPS,pH7.0)中,在46μg/ml羧苄青霉素和70μg/ml的卡那霉素存在下与VCSM13辅助噬菌体(Stratagene,U.S.A)温育过夜。将得到的含有大肠杆菌和噬菌体的培养肉汤离心以沉淀并除去大肠杆菌。回收上清液并在添加40mg/ml聚乙二醇8000和30mg/ml NaCl后离心。收集PEG沉淀的噬菌体并重悬于PBS中。使噬菌体在室温下与缀合至磁珠的人DR5反应2小时,以捕获对DR5具有亲和力的噬菌体。此后,用0.5%吐温20的PBS溶液洗涤珠子,用0.1M甘氨酸(pH 2.2)洗脱结合的噬菌体,并用2M Tris中和。使洗脱的噬菌体感染大肠杆菌ER2738并培养过夜以进行下一轮淘选。该淘选程序重复四次。重复的淘选轮次导致具有高结合亲和力的噬菌体的积累。将选自第四次淘选的平板的单个克隆与VCSM13辅助噬菌体(1∶1000)在37℃下在100μl/ml羧苄青霉素和70μg/ml卡那霉素存在下在96深孔板中温育过夜以诱导扩增表达抗体的噬菌体。离心所得到的培养肉汤后,将上清液中的噬菌体与TRAIL预结合,然后接种到涂有DR5的ELISA板中。在37℃下温育2小时,然后使用HRP缀合的抗M13抗体进行ELISA以鉴定DR5结合抗体。
(3-2)所选抗体的测序
在实施例(3-1)的选择条件下显示含有DR5反应性克隆的大肠杆菌ER2738在SB培养基中培养过夜,并通过离心收获。使用DNA min-prep试剂盒(GeneAll,Korea)制备质粒DNA并测序。使用下表5中给出的测序引物进行测序。
表5
PCR中使用的引物
引物 | 序列 | SEQ ID NO |
正向 | ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC | 56 |
反向 | CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG | 57 |
实施例4.抗体优化-人源化和亲和力改善
在从动物免疫抗体文库获得的抗体克隆中,选择具有高亲和力和活性的亲本克隆D0(嵌合抗体)。将抗体构架转换为人抗体构架(Nishibori等人,Molecular Immunology,43(2006))。为了改善亲和力,构建了在重链和轻链区的CDR序列中具有随机突变的新噬菌体文库。以与实施例2相同的方式获得噬菌体文库,在室温下与固定在磁珠上的10μg人DR5反应2小时,并用0.5%吐温20的PBS溶液洗涤5次。此后,用0.1M甘氨酸(pH 2.2)洗脱结合的噬菌体,然后用2M Tris溶液中和。为了增加选择压力,在第二轮淘选中,将1μg人DR5固定在磁珠上并用吐温20的PBS溶液洗涤10次,同时在第三轮淘选中,固定0.1μg人DR5并用吐温20的PBS溶液洗涤20次。除了上述人源化和亲和力改善方法之外,还通过取代预测在免疫细胞中具有高免疫原性的亲本克隆的可变区构架序列中的氨基酸来构建去免疫化变体。如上所述获得的亲本克隆的人源化或去免疫化变体命名为“DA1至DA35”。
获得自D0和DA1至DA35克隆的互补决定区和可变区的序列总结于下表6至9中:
表6
重链CDR的序列
表7
轻链CDR的序列
表8
重链可变区的序列
(在上表8中,VH-FW1、VH-FW2和VH-FW3代表重链可变区的构架)
表9
轻链可变区的序列
(在表9中,VL-FW1、VL-FW2和VL-FW3代表轻链可变区的构架)
实施例5.抗体的产生
生产免疫球蛋白(IgG)蛋白质以用于测定上面获得的抗体的亲和力和活性。从携带scFv核苷酸的pComb3x,使用表10中所示的引物组合和实施例2中使用的条件通过PCR获得重链和轻链的可变区和恒定区片段。
使用表10中的HC和LC引物的组合,通过PCR扩增重链和轻链中可变区(VH至VL)和恒定区(CH至Ck)的基因,并使用pcDNATM3.3-TA克隆试剂盒和pOptiTMVEC-TA克隆试剂盒(Invitrogen,U.S.A.)插入哺乳动物细胞表达质粒中。1μl的各载体(pcDNATM3.3-载体和pOptiTM VEC-载体)和片段添加到含有200mM NaCl和10mM MgCl2的缓冲液中直到最终体积为6μl,并在室温下反应5分钟。通过热休克将载体转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中。将得到的菌落大量培养以获得质粒。将以上制备的质粒转染到HEK293F细胞(Invitrogen,U.S.A.)中,然后培养7天以表达抗体。使用蛋白A柱(GE,U.S.A.)纯化抗体。将细胞培养上清液上样到柱上,使抗体(IgG)与蛋白A结合,然后用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱。通过SDS-PAGE证实抗体具有高纯度和与理论大小一致的轻链和重链分子量。
表10
实施例6.抗体与人DR5的结合亲和力的测定
为了测量亲和力,根据制造商的说明将人DR5偶联至羧化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE)。通过注射2倍连续稀释至5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.313nM和0.156nM的IgG蛋白来评估缔合和解离速率。
在缔合和解离传感图中描述了缔合和解离速率,并使用简单的1∶1Langmuir结合模型(BIAcore X100评估软件,版本2.0)计算。平衡解离常数(KD),即解离常数(Kd)与缔合常数(Ka)之比,被证实为在亚纳摩尔范围内。本公开的D0和DA1至DA35抗体与DR5的结合的测量在下表11中给出(抗体名称作为来自该抗体的克隆的名称给出)。D0的代表性传感图在图1中示出。
表11
实施例7.人DR5的抗体的结合活性的测定
通过酶联免疫吸附测定证实了本公开的抗体对人DR5的结合活性。将浓度为10ng/ml的人DR5蛋白以150μl/孔的体积铺到96孔免疫板(Nunc,U.S.A.)上,并在室温下吸附1小时。将板用缓冲溶液洗涤三次后,将抗体的连续稀释溶液(0.1至2000ng/ml)以150μl/孔加入孔中,并在室温下温育1至2小时。用缓冲溶液再次洗涤板。然后,将抗人免疫球蛋白Fc的HRP(辣根过氧化物酶)-缀合的抗体(Serotec,U.S.A.)稀释1∶20,000,并以每孔150μl的体积铺板,然后在室温下温育1小时。洗涤后,以每孔100μl的量添加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB;Sigma,U.S.A.)溶液,并温育3至10分钟进行显色。当显色达到一定水平时,用1N硫酸(H2SO4)终止反应。使用分光光度计(Molecular Device,U.S.A.)在450nm处读取吸光度,结果示于图2a至2f中。在该测定中,根据PCT/US2006/03577(WO 2006/083971)中公开的抗DR5抗体序列合成抗体AP,并用作对照抗体。如图2a至2f所示,与对照抗体AP相比,观察到抗体D0和DA1至DA35具有更高的抗原结合活性。
实施例8.物理化学性质的分析
[8-1]抗体大小的确认
使用NuPAGE 4至12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen,U.S.A.)通过SDS-PAGE分析根据本公开的抗体的大小。在经DTT(Invitrogen,U.S.A.)处理以去除二硫键后的还原条件下以及不用DTT处理的非还原条件下,对制备的抗DR5抗体(D0、DA1、DA4、DA16、DA18、DA20、DA23、DA26和DA29)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),以鉴定完整抗体的轻链和重链的存在。结果如图3a(非还原条件)和3b(还原条件)所示。如图3a所示,对于在非还原条件下分析的样品,在98kDa大小标记物和188kDa大小标记物之间的位置处检测到条带,其对应于完整抗体的大小。如图3b所示,对于在还原条件下分析的样品,在49kDa大小标记物和28kDa大小标记物的附近检测到两个条带,其分别对应于抗体的重链和轻链。因此,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测对应于整个抗体、重链和轻链的条带。
[8-2]抗体纯度的确认
使用TSKgel G3000SWx1柱(Tosoh,Japan)通过尺寸排阻色谱(SEC)分析抗体纯度和(可溶性)聚集体。结果如图4a(对照抗体AP)、4b(D0)、4c(DA1)、4d(DA4)、4e(DA15)、4f(DA23)、4g(DA26)和4h(DA29)所示。使用100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.6)作为流动相使用等度洗脱操作SEC并在280nm处测量吸光度。通常,观察到超过94%的高纯度,即单体占总峰面积的94%或更多,聚集峰占不到6%。
实施例9.抗体的药代动力学
为了检查上文构建的抗体的体内动力学,在小鼠中评估血液半衰期。将抗体以1至10mg/kg的剂量静脉内注射到裸鼠中。注射后5分钟至14天从眼眶静脉采血。使用肝素化毛细管进行血液采集。将通过离心血液样品获得的血浆以一定比例稀释,并用作ELISA评估的样品。将稀释至10ng/ml浓度的人DR5以100μl/孔接种到96孔免疫板(Nunc,U.S.A.)上并吸附到孔中12至14小时。将板用含有0.1%吐温20的缓冲溶液洗涤三次,并在室温下用含有牛血清白蛋白(Sigma,U.S.A.)的缓冲溶液封闭1小时。用缓冲溶液洗涤三轮后,将板与每种小鼠血浆稀释溶液和标准物质的连续稀释溶液在室温下温育2至3小时。用缓冲溶液洗涤三次后,以每孔100μl的体积添加1∶20000稀释的HRP缀合的抗人免疫球蛋白Fc(Fc-HRP)抗体(Bethyl,U.S.A.),并在室温下温育1小时。洗涤三次后,向每个孔中添加100μl TMB溶液(Sigma,U.S.A.)并使其反应。当显色达到一定水平时,用0.2N硫酸溶液终止反应。使用分光光度计(Molecular Device,U.S.A.)测量在450nm处的吸光度。由光密度(OD)测量来计算每个血浆样品中的抗体浓度,并使用WinNonLin第6.2.0.495版估计药代动力学参数。结果如图5和下表12所示。
表12
如图5和表12所示,抗体(D0、DA22和DA23)在所用小鼠中显示出6.68至8.37天的血液半衰期。
实施例10.确认肿瘤细胞中抗体的细胞毒性
使用体外细胞死亡测定来确定制备的抗体的生物活性。对于该测定,使用人结肠直肠癌细胞系Colo205(ATCC,U.S.A.)、人胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC,U.S.A.)和人肺癌细胞系H2122(ATCC,U.S.A.)。
将每个肿瘤细胞系以1×105个细胞/ml的密度悬浮,以每孔50μl铺板到96孔细胞培养板中,并在恒温潮湿室中培养16至24小时。将具有一定浓度(0.06至66,000pM)的抗体(单独的Ab)单独施加或与交联抗体(抗人Fc)(Serotec,U.S.A.)(Ab连接)组合施加,然后温育48小时。向每个孔中添加10μl刃天青溶液(Invitrogen,U.S.A.),并在恒温潮湿室中温育1至2小时。此后,使用分光光度计(Molecular Device)在590nm处读取荧光。细胞存活率计算为测试物质处理组(处理的RFU)的相对荧光单位(RFU)与培养基处理组(未处理的RFU)的相对荧光单位的百分比(细胞存活率(%)=处理的RFU/未处理的RFU)×100)。结果如图6a至6r所示。为了比较,对对照抗体AP进行与上述相同的测定。
如图6a至6r所示,上述构建的抗体在所有三种人癌细胞系中显示出优异的细胞死亡活性。
实施例11.异种移植模型中抗肿瘤活性的评估
通过向已经植入人癌细胞系的裸鼠注射抗体来评估抗肿瘤活性。对于表达人DR5的癌细胞系,使用人肺癌细胞系H2122(ATCC,U.S.A.)和人胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC,U.S.A.)。将2至5百万个肿瘤细胞植入6至8周龄雌性BALB/c裸鼠(OrientBio)的侧皮下部位,然后使用测径器测量肿瘤体积。当肿瘤生长至平均体积为100至300mm3时,将小鼠分组,并将上述构建的抗体(对照抗体AP和抗体D0)注射到指定的组。以0.05至2mg/kg的剂量,每周三次腹膜内注射(分组当天、第7天和第14天)给予抗体。在初次注射后的28天至50天期间,每周两次测量肿瘤体积。注射缓冲溶液(PBS)作为阴性对照。
结果如7a(H2122植入小鼠)和7b(Miapaca-2植入小鼠)所示。如图7a和7b所示,抗体D0显示出优于对照抗体AP的抗肿瘤活性。
实施例12.TRAIL-非竞争性结合
为了检测实施例3中选择的抗体的抗原结合特性,进行TRAIL竞争性酶联免疫吸附测定。在4℃下用0.1μg/ml人DR5(R&D systems,U.S.A.)包被ELISA板。此后,将平板与0.01nM至1440nM抗体(D0、DA20、DA21、DA21、DA22和DA23)以及0.01至400nM TRAIL蛋白一起温育2小时。将板用PBST(0.1%牛血清白蛋白和吐温-20的PBS溶液)洗涤三次后,向每个孔中添加HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗人免疫球蛋白Fc并温育1小时。用PBST洗涤三次后,用ABTS(Thermo,U.S.A.)进行显色20分钟。当显色达到一定水平时,用1N硫酸终止反应。使用分光光度计(Molecular Device,U.S.A.)在405nm处测量吸光度,并示于图8a和8b中。将实施例(7-1)中公开的抗体AP用作对照。
在图8a和8b中,对照抗体AP的抗原结合以TRAIL剂量依赖性方式降低,而抗体D0、DA20、DA21、DA21、DA22和DA23维持一定水平的抗原结合,而与TRAIL浓度无关,暗示本公开的抗体不与TRAIL竞争结合DR5。
实施例13.抗体与TRAIL组合的作用
在与构建的抗体和TRAIL共同处理后的细胞死亡活性方面分析根据表位的抗体性质。在该试验中,使用人结肠直肠癌细胞系Colo205(ATCC,U.S.A.)和人胰腺细胞系Miapaca-2(ATCC,U.S.A.)。将肿瘤细胞以1×105个细胞/ml的浓度悬浮,将悬浮液以50μl/孔接种到96孔培养板中,然后在恒温潮湿箱中培养16至24小时。将抗体的系列稀释溶液(0.1至10000ng/ml)和确定浓度的TRAIL蛋白(0.5、1、10ng/ml)组合施加于96孔板。在恒定温度下在潮湿条件下温育48至72小时后,以每孔10μl的量添加刃天青溶液(Invitrogen,U.S.A.)。当反应在1至2小时后达到一定水平时,使用分光光度计(Molecular Device)在590nm处读取荧光。细胞存活率计算为测试物质处理组(处理的RFU)的相对荧光单位(RFU)与培养基处理组(未处理的RFU)的相对荧光单位的百分比(细胞存活率(%)=处理的RFU)/未经处理的RFU×100)。
代表性的结果如图9a(Colo205)和9b(Miapaca-2)所示。为了比较,基于文献(细胞死亡与分化(Cell Death and Differentiation),15,751-761,2008)中的观察,将上述抗体AP用作对照,该抗体AP具有与TRAIL相似的结合位点。
如图9a和9b所见,与单独的抗体相比,当浓度低至10ng/ml的抗体D0或DA23与TRAIL组合使用时,检测到更高的细胞死亡活性,而对于对照抗体AP则没有观察到活性的这种增加。
实施例14.细胞内半胱天冬酶活性的测定
为了研究构建的抗体的细胞死亡机制,测定构建的抗体的半胱天冬酶活性。使用Apo-均质半胱天冬酶-3/7测定试剂盒(Promega,U.S.A.)测量半胱天冬酶-3/7的活性。在该测定中,使用人结肠直肠癌细胞系Colo205(ATCC,U.S.A.)、人胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC,U.S.A.)和肺癌细胞系H2122(ATCC,U.S.A.)。将浓度为1×105个细胞/ml的每种肿瘤细胞系的悬浮液以每孔50μl的体积铺到96孔细胞培养板中,并在恒温潮湿室中培养16至24小时。用预定浓度(0.01至10000ng/ml)的抗体单独(仅Ab)或与交联抗体(抗人Fc)(Serotec,U.S.A.)(Ab连接的)组合处理细胞,然后培养4小时。随后,在恒温潮湿室中,每孔用100μl Apo-半胱天冬酶-3/7试剂(Promega,U.S.A.)温育细胞3至16小时。当反应达到预定水平时,使用分光光度计(Molecular Device)在520nm处读取荧光。半胱天冬酶活性计算为测试物质处理组(处理的RFU)的相对荧光单位(RFU)相对于培养基处理组(未处理的RFU)的相对荧光单位的倍数增加(半胱天冬酶活性=处理的RFU/未经处理的RFU)。
代表性的结果如图10a(Colo205)、10b(H2122)和10c(Miapaca-2)所示。为了比较,以相同的方式处理抗体AP。
如图10a和10c所示,在癌细胞系中施加抗体D0或DA29,以引起半胱天冬酶-3/7的活性增加,这意味着本公开的抗体的细胞死亡机制涉及凋亡途径。
实施例15.抗体和药物的组合效果
使用体外肿瘤细胞死亡测定评估由用上述构建的抗体和吉西他滨共处理获得的效果。该测定基于文献中的观察结果(J Gastrointest Surg.2006 Nov;10(9):1291-300),其中用吉西他滨和抗DR5抗体共处理胰腺癌细胞导致更大的肿瘤细胞死亡和半胱天冬酶活性。
将人胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC,U.S.A.)和Panc-1(ATCC,U.S.A.)各自以1×105个细胞/ml的密度悬浮。将悬浮液以50μl的量添加到96孔细胞培养板的每个孔中,并在恒温潮湿室中温育16至24小时。用包括D0的本公开的抗DR5抗体与某些浓度(3nM至300nM)的吉西他滨组合处理癌细胞系,并培养48至72小时。每孔添加10μl刃天青溶液(Invitrogen,U.S.A.)后,将细胞进一步温育1至3小时。当反应进行到预定水平时,使用分光光度计(Molecular Device)在590nm处读取荧光。细胞存活率计算为测试物质处理组(处理的RFU)的相对荧光单位(RFU)与培养基处理组(未处理的RFU)的相对荧光单位的百分比(细胞存活率(%)=处理的RFU/未经处理的RFU×100)。结果如图6a至6r所示。代表性的结果如图11a(Miapaca-2)和11b(Panc-1)所示。为了比较,以相同方式处理对照抗体AP。
如图11a和11b所示,相对于每种物质单独处理,在用抗体D0或DA29和吉西他滨共处理时检测到凋亡活性增加。
本领域技术人员将理解,前述描述中公开的构思和具体实施方式可以容易地用作修改或设计用于实施本发明相同目的的其他实施方式的基础。本领域技术人员还将理解,这些等同的实施方式不脱离所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。
Claims (27)
1.一种抗死亡受体5(DR5)抗体或其抗原结合片段,所述抗体包含:
具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1),
具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2),
具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3),
具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1),
具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2),和
具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
2.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述多肽(VH-CDR3)具有选自由SEQ ID NO:7、8和9组成的组中的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述多肽(VL-CDR2)具有选自由SEQ ID NO:10、11和12组成的组中的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述多肽(VL-CDR3)具有选自由SEQ ID NO:13、14、15和16组成的组中的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗DR5抗体或其抗原结合片段包含:
重链可变区,具有选自由SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:37组成的组中的氨基酸序列;和
轻链可变区,具有选自由SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:49组成的组中的氨基酸序列的。
6.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗DR5抗体或其抗原结合片段具有诱导表达DR5的TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)敏感性癌细胞或表达DR5的TRAIL抗性癌细胞凋亡的活性。
7.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗DR5抗体是单克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗原结合片段选自由抗DR5抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab′和F(ab′)2组成的组。
9.根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗DR5抗体是小鼠来源的抗体、小鼠-人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
10.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物,所述组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的药物组合物,其中,所述癌症选自由以下组成的组:血癌、肺癌、胃癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、乳腺癌、子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、喉癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、幼年期实体瘤、分化淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、和垂体腺瘤。
12.根据权利要求10所述的药物组合物,还包含TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)。
13.根据权利要求12所述的药物组合物,其中,所述组合物在一种合并制剂或分开的制剂中包含所述抗DR5抗体或其抗原结合片段和TRAIL。
14.根据权利要求10所述的药物组合物,还包含至少一种选自由烷基化抗癌剂、基于代谢拮抗剂的抗癌剂、基于蒽环霉素的抗癌剂;和基于蛋白酶体抑制剂的抗癌剂组成的组的抗癌剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物,其中,所述抗癌剂是选自由卡铂、紫杉醇、吉西他滨、多柔比星和硼替佐米组成的组中的至少一种。
16.一种编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗DR5抗体或抗原结合片段的多核苷酸分子。
17.一种携带权利要求16所述的多核苷酸分子的重组载体。
18.一种含有权利要求17所述的重组载体的重组细胞。
19.一种生产抗DR5抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括表达权利要求16所述的多核苷酸分子的步骤。
20.一种药物组合物,其包含根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段。
21.一种预防或治疗癌症的方法,所述方法包括将根据权利要求1所述的抗DR5抗体或其抗原结合片段施用于有需要的受试者的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,所述癌症选自由以下组成的组:血癌、肺癌、胃癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、乳腺癌、子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、喉癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、幼年期实体瘤、分化淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、和垂体腺瘤。
23.根据权利要求21所述的方法,还包括向所述受试者施用TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)的步骤。
24.根据权利要求21所述的方法,还包括向所述受试者施用至少一种抗癌剂的步骤,所述抗癌剂选自由烷基化抗癌剂、基于代谢拮抗剂的抗癌剂、基于蒽环霉素的抗癌剂和基于蛋白酶体抑制剂的抗癌剂组成的组。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,所述抗癌剂是选自由卡铂、紫杉醇、吉西他滨、多柔比星和硼替佐米组成的组中的至少一种。
26.根据权利要求23所述的方法,还包括向所述受试者施用至少一种抗癌剂的步骤,所述抗癌剂选自由烷基化抗癌剂、基于代谢拮抗剂的抗癌剂、基于蒽环霉素的抗癌剂和基于蛋白酶体抑制剂的抗癌剂组成的组。
27.根据权利要求26所述的方法,其中,所述抗癌剂是选自由卡铂、紫杉醇、吉西他滨、多柔比星和硼替佐米组成的组中的至少一种。
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