WO2018174408A1 - 항-dr5 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to apoptosis receptor 5 (DR5) and has a cancer cell death function. Specifically, the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof, and the cancer of the antibody or antigen-binding fragment To prophylactic or therapeutic uses.
  • DR5 apoptosis receptor 5
  • the apoptosis pathway through TNF-related apoptos is inducing l igand (TRAIL or Apo2L), one of its receptors, and the DR5 (death receptors 5) system, which induces cancer cell-selective apoptosis without affecting normal cells, is an important component of cancer drug development. It is considered an important target substance (Ashkenazi et al., Nat Rev Cancer 2: 420, 2002).
  • DcRKDecoy Receptor 1, TRAIL-Receptor 3 which does not transmit apoptosis signal as well as DR4 (Death receptor 4, TRAIL—Receptor 1) and DR5 (Death receptor 5, TRAIL-Receptor 2), which carry apoptosis signals )
  • DcR2 (Decoy Receptor 1, TRAIL-Receptor 4) also has a problem that the specificity for DR5 is low.
  • Recombinant TRAIL is also less stable and has side effects that cause apoptosis in normal cells such as astrocytes, hepatocytes, and keratinocytes (Jo et al., Nature Medi cine 6 , 564—567, 2000). Therefore, the development of anti-DR5 to anti-DR4 antibodies with less side effects and inducing cancer cell selective apoptosis has been actively studied.
  • apoptotic receptor specific antibodies clinical trials have been conducted to evaluate anti-DR5 antibodies and apoptosis activity developed by Genentech Incorporated (USA) and Amgen (USA). Human Genome Scients (USA) has been in Phase II clinical trials using HGS-ETR2, an anti-DR5 antibody, and HGS H ETR1, an anti-DR4 antibody. Currently, development has been discontinued. In addition, the development of anti-DR5 antibodies such as Apomab, Conatumumab, and tigatuzumab has been stopped.
  • apoptosis occurs largely through the extrinsic apoptosis pathway and the intrinsic apoptosis pathway. While most chemotherapeutic agents and radiation treatments cause cancer cell death through the p53-mediated intrinsic cell death pathway, DR5-related cell death is induced through p53—a non-dependent external and intrinsic pathway (Takeda et al., Oncogene, 26, 3745-3757, 2007).
  • TRAIL to antibodies bind to DR5 to form a death-inducing signaling complex (DISC) and activate the apoptosis cas initiating protease caspase-8, caspase—10 via the adapter protein (FADD) Let's do it.
  • Caspase I8 activates subproteases caspase-3 and caspase-7, and induces endogenous apoptosis through mitochondria (Ohtsuka et al., Oncogene, 22, 2034-2044, 2003).
  • the present invention provides an anti-DR5 antibody that specifically binds to death receptor 5 (DR5) and effectively kills various cancer cells and uses thereof.
  • DR5 death receptor 5
  • One example provides an anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the anti-DR5 antibody and / or antigen-binding fragment thereof.
  • Another example provides a method of preventing or treating cancer, comprising administering the anti—DR5 antibody and / or antigen-binding fragment thereof to a subject in need thereof.
  • anti-DR5 antibody and / or antigen-binding fragment thereof for use in the prevention or treatment of cancer, or for use in the manufacture of an anticancer agent.
  • Another example is to encode the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof
  • a polynucleotide molecule, a recombinant vector comprising the polynucleotide, and a recombinant cell comprising the recombinant vector are provided.
  • Another example provides a method of producing an anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising expressing the polynucleotide molecule.
  • An anti-DR5 antibody that specifically binds to death receptor 5 (DR5) and effectively kills various cancer cells, and a composition for preventing or treating cancer, comprising the same.
  • Antibodies provided herein are characterized by being TRAIL non-competitive antibodies that maintain a certain level of antigen binding regardless of TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) concentration. Accordingly, the antibody may be usefully developed as an innovative antibody drug or diagnostic agent having an effect superior to that of an antibody drug developed in the past.
  • TRAIL TNF-related apoptosis inducing ligand
  • Apoptosis receptor 5 (DR5) is TRAIL receptor
  • TRAILR2 tumor necrosis factor receptor superf amy ly member 10B
  • TNFRSF10B tumor necrosis factor receptor superf amy ly member 10B
  • DR5 is a cell surface receptor of the TNF ⁇ receptor superfamily and mediates apoptosis by transmitting apoptosis signals.
  • DR5 is known to interact with Caspase 8, Caspase 10, FADD (Fas-Associated protein ,, with Death Domain), TRAIL: and the like.
  • DR5 may be derived from a mammal, for example human DR5 (e.g., NCBI accession no. UniProt KB / Swiss-Prot: Q6FH58, etc.).
  • polypeptide that specifically recognizes and / or can specifically bind to DR5.
  • the polypeptide may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16.
  • the polypeptide may be one having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 2, 4, and 7 to 16.
  • a protein, polypeptide, or polynucleotide having an amino acid sequence or nucleotide sequence means that the protein, polypeptide, or polynucleotide comprises or consists essentially of the sequence, or Can be used to mean all that is done.
  • These polypeptides can be used as complementarity determining regions (CDRs) of anti—DR5 antibodies.
  • polypeptides and their applicable complementarity determining sites are shown below.
  • VH-CDR1, V H -CDR2, and V H -CDR3 means a heavy chain complementarity determining site
  • V L — CDRl, V L -CDR2, and V L -CDR3 is a light chain complementarity determining site it means
  • a DR5 target pullipeptide molecule comprising one or more selected from the group consisting of the polypeptides.
  • the DR5 target polypeptide molecule is characterized in that it promotes cancer cell death (eg, apoptosis of cancer cells) by non-competitive action with TRAIL, a ligand of DR5.
  • the DR5 target polypeptide molecule may comprise a heavy chain complementarity determining site, a light chain complementarity determining site, or a combination thereof as described above; Or a heavy chain variable region including the heavy chain complementarity determining region, a light chain variable region including the light chain complementarity determining region, or a combination thereof.
  • the DR5 target polypeptide molecule includes, but is not limited to, anti-DR5 Antibodies, antigen-binding fragments of the antibodies, or anti-DR5 antibody analogs (structures having a framework and function similar to antibodies; eg, peptibodies, nanobodies, etc.), or precursors or components (eg, multiple binding antibodies) CDR).
  • epti body + (pept i de + ant i body) is a fusion protein in which all or part of a constant region, such as the peptide and the Fc portion of the antibody is fused, it refers to a protein having a skeleton and function similar to the antibody.
  • a constant region such as the peptide and the Fc portion of the antibody is fused
  • One or more of the peptides described herein above can serve as antigen binding sites (heavy and / or light chain CDRs or variable regions).
  • nanobody 1 also referred to as a single-domain antibody, refers to an antibody fragment comprising a single variable domain of the antibody in monomeric form, similar to a fully structured antibody against a specific antigen.
  • the molecular weight of the nanobody is generally about 12 kDa to about 15 kDa, compared to the general molecular weight (about 150 kDa to about 160 kDa) of a complete antibody (including two, heavy and two light chains). Very small, and in some cases, smaller than Fab fragments or scFv fragments.
  • multiple binding antibodies (including double binding antibodies) recognizes and / or binds two or more different antigens, Means an antibody that recognizes and / or binds different sites of the same antigen, wherein the antigen binding site of one of the multiple binding antibodies is It may be to include the Tide.
  • an anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising one or more selected from the group consisting of the polypeptides as a complementarity determining site.
  • the anti-DR5 antibodies provided herein have the efficacy of DR5 as an agonist (agoni st) and induce cell death by collecting DR5 molecules present individually on the cell surface to generate and transmit apoptosis signals in cells. It plays a role.
  • Polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (V H — CDR2), and polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (V H -CDR3)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is the same as the amino acid sequence of the general formula (1).
  • XI is G or P
  • X2 is S or K.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 3 usable as heavy chain CDR3 of an anti-DR5 antibody or antigen binding fragment thereof is, for example, one or more amino acids selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9 It may have a sequence (highly underlined in the amino acid sequence described below represents an amino acid modified in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7):
  • SEQ ID NO: 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
  • the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof is a complementarity determining region of the light chain.
  • Polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (V L -CDR1), 'polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 polypeptide having an amino acid sequence of (V L CDR2) and SEQ ID NO: 6 (V L -CDR3 )
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is the same as the amino acid sequence of the general formula 2 and formula 3, respectively.
  • X3 is R, L, or K
  • X4 is P, M, or A
  • X5 is S, P, or K
  • X6 is S, A, or D
  • X7 is Y or G
  • X8 is VM, G, or A, .
  • X9 is I, R, or G.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 5 usable as light chain CDR2 of an anti-DR5 antibody or antigen binding fragment thereof is, for example, one or more selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12 It may have an amino acid sequence (highly underlined in the amino acid sequence described below represents an amino acid modified in amino acid sequence of SEQ ID NO: 10):
  • polypeptide of SEQ ID NO: 6 usable as light chain CDR3 of an anti-DR5 antibody or antigen binding fragment thereof is, for example, in the group consisting of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, and SEQ ID NO: 16 It may have one or more amino acid sequences selected (highly underlined in the amino acid sequence described below indicates amino acids modified in amino acid sequence of SEQ ID NO: 13):
  • the anti DR5 antibody or antigen binding fragment thereof in one embodiment, the anti DR5 antibody or antigen binding fragment thereof,
  • a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (V H -CDR1), a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (V H -CDR2), and a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (V H -CDR3 At least one heavy chain complementarity determining site selected from the group consisting of: or a heavy chain variable region comprising the at least one heavy chain complementarity determining site;
  • a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (V L -CDR1), a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (V L — CDR2), and a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (V L ⁇ one or more light chain complementarity determining sites selected from the group consisting of CDR3), or a light chain variable region comprising said one or more light chain complementarity determining sites;
  • the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof is N-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (VH-CDRI), a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (V H -CDR2), and an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:
  • a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (V L ⁇ CDR1), a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10 to 12 (V L — CDR2), and SEQ ID NOs: 13 to SEQ ID NO: 16
  • the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (VH-CDRI), a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (V H — CDR2), and A heavy chain variable region comprising a polypeptide (V H -CDR3) having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 9; And
  • a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (V L -CDR1), a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10 to SEQ ID NO: 12 (V L ⁇ CDR2), and SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 16 It may include a light chain variable region comprising a polypeptide (V L -CDR3) having an amino acid sequence selected from the group consisting of.
  • the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof may include a heavy chain variable region and a light chain variable region combined in Tables 2 and 3 below.
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining region, a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining region, or a combination thereof.
  • the heavy chain variable region may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 37, and the light chain variable region includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 38 to SEQ ID NO: 49 ⁇
  • the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • the anti-DR5 antibody may be an animal derived antibody (eg, a mouse derived antibody), a chimeric antibody (eg, a mouse-human chimeric antibody), or a humanized antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment may be isolated from a living body or non-naturally produced.
  • the antibody or antigen-binding fragment may be produced recombinantly or synthetically.
  • the antibody may be derived (isolated) from any animal, including mammals, birds, etc., including humans.
  • the antibody may be human, mouse, donkey, sheep, rabbit, goat guinea pig, camel, horse, or It may be a chicken antibody.
  • the human antibody is an antibody having an amino acid sequence of human immunoglobulin, and includes an antibody isolated from a human immunoglobulin library or an antibody isolated from an animal transfected against one or more human immunoglobulins and not expressing an endogenous immunoglobulin.
  • the anti-DR5 antibody may be a monoclonal antibody or polyclonal antibody, for example a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to methods well known in the art. For example, it may be manufactured using a phage display technique. Alternatively, anti-DR5 antibodies can be made from monoclonal antibodies from mice.
  • the heavy chain CDRs and light chain CDR sites as defined above, or the sites other than the heavy chain and light chain variable regions are all subtypes of immunoglobulins (eg, IgA, IgD, IgE, IgG ( IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, etc.), eg, from framework regions of immunoglobulins of all the subtypes above, and / or from light chain constant regions and / or heavy chain constant regions. Can be.
  • Complete antibodies are composed of two full length light chains and
  • the constant region of the antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has a gamma ( Y ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) type, subclass Gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4 ), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • variable chain 1 hinges with the variable region domain V H and the three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 comprising an amino acid sequence having a variable region sequence sufficient to confer specificity to the antigen. is construed to include both full-length heavy chains including fragments and fragments thereof.
  • light chain also includes a variable comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is construed as including both the full length light chain and fragments thereof comprising the region domain V L and the constant region domain C L.
  • CDR "means the amino acid sequences of the hypervariable regions of the heavy and light chains of immunoglobulins.
  • the heavy and light chains may each comprise three CDRs (CDRHl, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3). ). remind CDRs can provide key contact residues in which the antibody binds to the antigen or epitope.
  • CDRHl CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3
  • CDRL CDRL3
  • antigen binding fragment refers to a portion of a polypeptide that contains a portion to which an antigen can bind, as a fragment thereof for the entire structure of an immunoglobulin.
  • it may be one or more selected from the group consisting of scFv, (scFv) 2 , Fab, Fab 'and F (ab') 2 , but is not limited thereto.
  • Fab of the antigen-binding fragment has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and a first constant region of the heavy chain (C H1 ).
  • Fab ′ differs from Fab in that it has a hinge region containing at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'. Recombinant techniques for generating Fv fragments with minimal antibody fragments in which Fv has only heavy chain variable regions and light chain variable regions are well known in the art.
  • Double-chain Fv is non-covalently linked to the heavy chain variable region and the light chain variable region, and the single chain Fv (s ingle—chain FV) is generally linked to the variable region of the heavy chain and the short-chain variable region through a peptide linker. Covalently linked or directly linked at the C-terminus can lead to a dimer-like structure, such as a double chain Fv.
  • the antigen-binding fragment can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain can yield Fab and cleavage with pepsin can yield F (ab ') 2 fragment), It can be produced through genetic recombination technology.
  • proteolytic enzymes e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain can yield Fab and cleavage with pepsin can yield F (ab ') 2 fragment
  • flankinge region is a region included in the heavy chain of an antibody, which exists between the CH1 and CH2 regions, and which functions to provide the flexibility of the antigen binding site in the antibody. Means.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating cancer comprising the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example is the pharmaceutical of the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof Comprising administering an effective amount to a patient in need of prevention and '/ or treatment of cancer, there is provided a preventive and / or therapeutic treatment of cancer.
  • the method of preventing and / or treating cancer may further comprise identifying (eg, diagnosing or screening a subject for treatment) a patient in need of preventing and / or treating cancer prior to the administering step.
  • Anti-DR5 antibodies can be usefully used for the prevention or treatment of cancer.
  • the anti-DR5 antibody provided herein exhibits the function of agonist st of DR5, so that the anti-DR5 antibody exerts its efficacy (ie, anticancer efficacy such as cancer cell death)
  • the cancer cells express DR5.
  • the cancer may be a TRAIL-sensitive cancer or a TRAIL-resistant cancer.
  • the cancer specifically, hematologic cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin myoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, colon cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, fallopian tube carcinoma , Endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, laryngeal cancer, small intestine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, childhood solid Tumors, differentiated lymphoma, bladder cancer, kidney cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, primary central nervous system lymphoma, spinal contraction tumor, brain stem glioma, or pituitary adenoma, and the like.
  • the anti-DR5 antibody or antigen thereof is used in combination with TRAIL. antigen.
  • An enhanced anticancer effect can be obtained compared to the case where only binding fragments are used, and anticancer effects can be obtained for TRAIL-sensitive cancer as well as TRAIL-resistant cancer (see Example 13).
  • the pharmaceutical composition in addition to the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragments thereof, may further comprise TRAIL (TNF— re aed apopto s induc ing l igand).
  • the pharmaceutical composition is an active ingredient
  • the pharmaceutical composition may include (1) the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof and (2) the TRAIL formulated in one formulation, or each formulated in a separate formulation.
  • the method of preventing and / or treating cancer may further comprise administering a pharmaceutically effective amount of TRAIL, in addition to administering an anti—DR5 antibody or antigen binding fragment thereof.
  • the method for preventing and / or treating cancer includes (1) a pharmaceutically effective amount of the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof and (2) a pharmaceutically effective amount of TRAIL, which requires the prevention and / or treatment of cancer. It may include the step of co-administration to the patient.
  • the co-administration may be performed simultaneously by (1) pharmaceutically effective amount of the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof and (2) pharmaceutically effective amount of TRAIL in one formulation, or (1) the anti-DR5 antibody. Or a pharmaceutically effective amount of the antigen-binding fragment thereof and (2) a pharmaceutically effective amount of TRAIL, respectively, formulated in separate formulations and administered sequentially or in any order.
  • the TRAIL (TNF ⁇ related apoptosi s—inducing ligand) is also called CD253 (cluster of differentiation 253) or TNFSF OCtumor necrosis factor (ligand) super family, member 10) and functions as a ligand that induces apoptosis process. It is one of the cytokines that is widely produced and secreted in normal tissue cells.
  • the TRAIL may be of human origin, for example, may be represented by NCBI Accession number NP_001177871.1, ⁇ _003801.1 and the like, but is not limited thereto.
  • Anti-DR5 antibodies or antigen-binding fragments thereof (or in combination with TRAIL) using the apoptosis pathway are described as Carboplatin or Pacl i taxel (Recka et al., Lung Cancer, 82, 441-448,2013), Gemci tabin (Torres et al., Cancer Medicine, 2 (6), 925-932, 2013) can be used in combination with one or more selected from the group consisting of chemotherapeutic agents can further improve the anti-cancer / anti-tumor effect (see Example 15).
  • the use of the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof or a pharmaceutical composition comprising the same as well as the use of surgery, hormonal therapy, drug treatment and / or biological response modulators It can be used in combination with methods.
  • the pharmaceutical composition is a known active ingredient having an anticancer effect with an anti—DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof (or in combination with TRAIL).
  • (Chemotherapy agent) may further contain 1 or more types.
  • the method for preventing and / or treating cancer may include administering at least one known active ingredient (chemotherapeutic agent) having an anticancer effect in addition to an anti—DR5 antibody or an antigen-binding fragment thereof (or a combination with TRAIL). It may include a step.
  • Chemotherapeutic agents that can be used with the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragments thereof include alkylated anticancer agents such as Carboplatin and Paclitaxel; Recka et al., Lung Cancer, 82, 441-448, 2013; Metabolic antagonist-based anticancer agents such as gemcitabine (Gemcitabin; Torres et al., Cancer Medicine, 2 (6), 925—932, 2013); Anthracycline-based anticancer agents such as doxorubicin: HM Amm et al., Mol Cancer Res April, 9; 403, 2011; May be one or more selected from the group consisting of proteasome inhibitor-based anticancer agents such as Bottezo 3 ⁇ 4 (Bortezomib; Shanker A et al., J Natl Cancer Inst, May 7; 100 (9): 649-62, 2008). It is not limited.
  • alkylated anticancer agents such as Carboplatin and Paclitaxe
  • the active ingredient of the anti-DR5 antibody, antigen-binding fragment, etc. is appropriately administered. To this end, it may be included in or administered in the pharmaceutical composition together with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be used in combination with one or more of saline solution, sterile water, Ringer's solution, complete saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, riserol, ethanol, or any of these components.
  • Other conventional additives such as agents, buffers, bacteriostatics, and the like may be further included.
  • diluents may be additionally added to formulate injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • appropriate methods in the art and / or methods disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA can be formulated appropriately for each disease or component.
  • the active ingredient or pharmaceutical composition such as the anti-DR5 antibody, antigen-binding fragment can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration and rectal administration.
  • the protein or peptide is digested so that the oral composition can be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device that allows the active substance to migrate to the target cell. have.
  • the pharmaceutically effective amount of the anti—DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof may be formulated (formulation) method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, interval of administration, route of administration, rate of excretion of the patient. And various factors such as reaction response.
  • the daily dose of the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof may range from 0.01 to 100 mg / kg, specifically 0.01 to 100 mg / kg, more specifically 0.1 to 50 mg / kg, more specifically 0 . It may range from 1 to 20 mg / kg, but is not limited thereto.
  • the daily dosage may be formulated into one formulation in unit dosage form, may be formulated in appropriate quantities or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the pharmaceutical composition is administered in combination with other drugs 1
  • the dosage, method of administration, and other types of drugs may be appropriately prescribed depending on the condition of the patient.
  • compositions may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media or may be formulated in the form of solutions, powders, powders, granules, tablets or capsules, etc. It may further include a topic.
  • the pharmaceutical composition comprising the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises an antibody or antigen-binding fragment
  • it may be formulated into an immune liposome.
  • Liposomes comprising the antibody can be prepared according to methods well known in the art.
  • the immune liposomes can be prepared by reversed phase evaporation as a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and polyethanelenglycol-derivatized phosphatidylethanolamine.
  • Fab 1 fragments of antibodies can be conjugated to liposomes via disulfide-replacement reactions.
  • the anti—DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to DR5
  • detection of DR5 ie, determination of presence and / or level (concentration)
  • / or DR5 related diseases eg, The presence or absence of DR5 (a disease characterized by an increase or decrease in concentration than the normal group) can be used for diagnosis.
  • one embodiment provides a composition for detecting DR5 comprising the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another example includes treating the anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof with a biological sample; And antigen—antibody reaction is provided. At this time, if antigen-antibody reaction is confirmed, DR5 exists in the biological sample. By determining the level of antigen-antibody response, 91 can be determined to determine the level (concentration) of DR5 in the biological sample.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of cells, tissues, body fluids, cultures thereof, and the like obtained from a patient (eg, a mammal such as a human).
  • the normal sample may be selected from the group consisting of cells, tissues, body fluids, cultures thereof, or the like obtained from a patient who does not have a DR5-related disease (eg, a mammal such as a human).
  • Determining whether the antigen-antibody reaction or measuring the antigen-antibody reaction may be performed through various methods known in the art. For example, it can be carried out through conventional enzyme reaction, fluorescence, luminescence and / or radiation detection, specifically, immunochromatography, immunohistochemistry, enzyme-linked immunoadhesion assay (enzyme 1 iked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (Fl oresence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay: LIA), Western blotting (Western blot ting) and the like can be measured by a method selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • enzyme reaction fluorescence, luminescence and / or radiation detection
  • immunochromatography immunohistochemistry
  • enzyme-linked immunoadhesion assay enzyme-linked immunoadhesion assay (enzyme 1 iked immunosorbent assay (ELISA), radioi
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide or a combination thereof, and
  • Recombinant cells comprising the recombinant vector are provided.
  • the recombinant vector comprises a heavy chain complementarity determining site and a light chain complementarity determining site of an anti-DR5 antibody; Heavy chain variable region and light chain variable region; Or heavy chain. And each polynucleotide encoding a light chain may be included in a separate vector or together in one vector.
  • vector means a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • plasmid vectors cosmid vectors and Viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors and adeno-associated virus vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (eg, pSClOl, pGV1106, pACYC177, ColEl, pKT230, ⁇ 290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRl, pHV14).
  • phages for example, ⁇ ⁇ 4 ⁇ , ⁇ -Charon, ⁇ ⁇ and M13, etc.
  • viruses for example, SV40, etc.
  • the polynucleotide encoding the protein complex in the recombinant vector may be operably linked to a promoter.
  • operatively linked means a functional bond between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • Such regulatory sequences may be “operatively 1 inked” to regulate transcription and / or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be a conventional one used to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms in the art.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • the vector used is an expression vector.
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., pL A promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • ribosomes for initiation of translation It is common to include binding sites and transcription / detox termination sequences.
  • replication origins that operate in eukaryotic cells included in the vector include fl replication origin, SV40 replication origin ⁇ pMBl replication origin, adeno replication origin, MV. Replication origin and BBV replication origin, etc. It is not limited to this.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallothionine promoters
  • promoters derived from mammalian viruses eg : adenovirus late promoters, vaccinia virus 7.5K promoters, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and promoter of HSV
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into a suitable host cell.
  • the host cell may be any host cell known in the art as a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector, and as a prokaryotic cell, for example, E.
  • coli Bacillus subtilis
  • Strains of the genus Bacillus such as Bacillus thuringiensis, and enterobacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons, and various Pseudomonas species, and when transforming to eukaryotic cells, hyo S— ( Saccharomyce cerevisiae), insect cells, plant cells and animal cells, for example Sp2 / 0, Chinese hamst er ovary (CHO) l, CHO DG44, PER. C6, l38, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell lines and the like can be used, but are not limited thereto.
  • hyo S— Saccharomyce cerevisiae
  • insect cells plant cells and animal cells
  • plant cells and animal cells for example Sp2 / 0, Chinese hamst er ovary (CHO) l, CHO DG44, PER. C
  • the transport (introduction) of the polynucleotide or the recombinant vector comprising the same into the host cell may be carried out using a transport method well known in the art.
  • a transport method well known in the art.
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used.
  • a micro-injection method, a calm phosphate precipitation method, an electroporation method, Liposome-mediated transfection and gene bombardment, and the like may be used, but is not limited thereto.
  • the method of selecting the transformed host cell The phenotype expressed by the selection marker can be easily carried out according to methods well known in the art.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Another example provides a method of making an anti-DR5 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising expressing the polynucleotide or recombinant vector, such as in an appropriate host cell.
  • the method comprises the steps of culturing a cell comprising the polynucleotide or recombinant vector; And optionally, isolating and / or purifying the antibody produced.
  • the present invention provides an anti-DR5 antibody for therapeutic treatment against DR5, Since the antibody of the present invention is a TRAIL non-competitive antibody that maintains a certain level of antigen binding regardless of TRAIL concentration, it can be usefully developed as an innovative antibody drug or diagnostic agent having superior effects to existing antibody drugs. [Brief Description of Drawings]
  • 1 shows binding and dissociation sensograms for analyzing the binding rate and dissociation rate of antibody DO.
  • 2A to 2F are graphs of the results of experiments comparing the binding strengths of the antibodies DO and DA1 to DA35 to DR5 with the control AP.
  • 3A and 3B show the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of exemplary antibodies according to the present invention.
  • 4A to 4H are graphs showing the results of size exclusion chromatography (SE) analysis of exemplary antibodies according to the present invention.
  • 7a and 7b is a result showing the tumor growth inhibitory effect of the antibody according to the invention in a xenograft animal model.
  • 8a and 8b are experimental results showing that the antibody according to the present invention binds to DR5 in a non-competitive TRAIL.
  • 9A and 9B show apoptosis induction experiment showing that the antibody according to the present invention has a synergistic effect when used in combination with TRAIL.
  • 10a to 10c are results of measuring Caspase activity showing that the antibody according to the present invention induces apoptosis with apoptos i s.
  • an animal immune antibody library was constructed.
  • the library was prepared by amplifying antibody genes by PCR using primer combinations of antibody genes after obtaining mRNA from immune and immune cells of animals immunized with antigen and cloning them into phage display vectors.
  • three white-legged chickens were subcutaneously mixed with human DR5 (R & D systems, USA) five times at three week intervals, with complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant (Sigma, USA). Injection. After obtaining the sera of immunized animals, the cells were diluted with PBSB (phosphate buffer solution containing 3% bovine serum albumin) at a concentration of 1: 100, 1: 500, 1: 2500, and 1: 12500, The binding of human DR5 was confirmed by enzyme immunoassay. The ELISA plate was coated with human DR5 (R & D systems, USA) lug / ml overnight at 4 ° C, and the diluted serum was added and reacted for 2 hours.
  • PBSB phosphate buffer solution containing 3% bovine serum albumin
  • PCR amplification was performed to amplify the V H and V L domains of the heavy and light chain variable regions of the chicken antibody. PCR banong by the cDNA prepared in Example 1 as the template, the heavy chain variable region.
  • the primer combinations of Table 4 designed to fit the light chain variable region and the scFv (single chain Fv) region connecting the same were used.
  • V H and V L each 0.5ul cDNA library, 30 pmole forward primer, 30 pmole reverse primers, 10x PCR buffer, 200 uM dNTPs and Taq 0.5ul after combining the DNA polymerase according to standard common end 50 ul, 94 ° C After reacting for 5 minutes at, the reaction was repeated for 30 cycles for 15 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 56 ° C and 90 seconds at 72 ° C.
  • PCR amplified antibody DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and the amplified DNA was separated according to their respective sizes, and purified using a gel extraction kit (Gel extraction kit, Qiagen, USA).
  • scFv DNA In order to obtain scFv DNA, .50 pm of purified V H, 50 L of DNA was used as a template, and 30 pmole forward primer, 30 pmole reverse primer, 10x PCR buffer, 200 uM dNTPs and 0.5 ul Taq DNA polymerase were mixed. After the ul was adjusted, the reaction was performed at 94; C for 5 minutes, and the reaction was repeated for 20 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 56 ° C, and 2 minutes at 72 ° C. The DNA amplified by the PCR was electrophoresed on a 1% agarose gel to separate each amplified DNA according to size, and purified using a gel extraction kit (Gel extraction kit, Qiagen, USA).
  • the scFv and phagemid vector pComb3X (the Scripps Research Institute, Calif., USA) prepared above were digested with restriction enzyme Sfil (Roche, USA). PCR fragments encoding 10 ⁇ g of scFv, 360 units Sfil (Roche, USA), 20ul IOX buffer were added and the final volume was 200ul and reacted overnight at 50 ° C. In addition, insert the pComb3X vector 20ug, 120 units Sfil buffer and 20ul IOx The final volume was 200ul be a banung overnight at 50 ° C. Each section cut with the restriction enzyme was electrophoresed on agarose gel and then purified using a gel extraction kit (Qiagen, USA).
  • Antibodies that bind to human DR5 were selected from the library having the heavy and light chains randomized in the form of scFV obtained in Example 2 using DR5 supported on a solid.
  • scFv-type antibody obtained in Example 2 was fused with phage coat protein PIII to the phage surface.
  • the antibody library DNA that was made to be expressed was transformed with E. coli ER2738 (New Engl and Biol ab) by electroporation, and cultured at 37 ° C., followed by VCSM13 helper phage (Stratagene, USA), followed by 46 ug / ml carbenicillin.
  • 7.0 ug / ml kanamycin were added and cultured overnight in SB medium (30 g / L tryptone, 20 g / L yeast extract and 10 g / L MOPS, pH 7.0).
  • the culture solution containing E. coli and phage obtained above was centrifuged to remove precipitated E. coli. After only the supernatant was recovered, 40 mg / ml polyethylene glycol 8000 and 30 mg / ml NaCl were added and centrifuged to collect phage precipitated by PEG and resuspended in PBS.
  • Human DR5 conjugated to magnetic beads and phages were reacted for 2 hours at room temperature to bind phages having affinity for DR5, washed with PBS containing 0.5% Tween 20, 0.1M glycine (pH 2.2) Eluted with solution and neutralized with 2M Tris solution. The eluted phages were infected with Escherichia coli ER2738 for the next round panning and incubated overnight. The process was repeated four times, followed by panning. High bonding strength through repeated panning steps . Phage accumulated.
  • ER2738 having a clone showing a positive signal to human DR5 was cultured overnight in SB medium and centrifuged to obtain E. coli. Plasmid DNA was obtained using a DNA mini-prep kit (Jinol, Korea). The sequences were analyzed using sequencing primers as shown in Table 5 below for sequencing.
  • a high affinity and activity moclon DO (chimeric ant i body) was selected and the framework of the antibody was converted into a human antibody framework (Ni shi). bor i et al., Molecular Immunology, 43 (2006)).
  • new phage libraries were prepared by randomizing the sequences of the CDRs of the heavy and light chain regions to improve affinity.
  • the phage library obtained in the same manner as in Example 2 was reacted with 10 ug of human DR5 immobilized on magnetic beads at room temperature for 2 hours, and then 0. Washed five times with PBS containing 5% Tween 20.
  • deimmunized variants were also prepared in which amino acid predicted to show high immunity in human immune cells in the framework sequence of the variable region of the moclone. Mutant clones of the moclone that have undergone humanization or de-immunization as described above were named "DA1 to DA35 1 '.
  • VH-FWl, VH-FW2 and VH-FW3 represent a framework of heavy chain variable region
  • Immunoglobulin (IgG) proteins were produced for affinity measurement and activity analysis of the antibodies obtained above.
  • the fragments of the variable and constant regions of the heavy and light chains from pComb3x containing scFv were obtained by PCR under the same conditions as in Example 2 using the primer combinations of Table 10 below.
  • variable region Var i ab le Regi on, V H to VL
  • constant region Const ant Reg i on, C H to Ck
  • PCR HC and IX primer combinations shown in Table 10 below.
  • pcDNATM3 Mammals using 3-T0P0®TA Cloning Kit and P 0pt i TMVEC-T0P0®TA Cloning Kit (I nvi t rogen, USA) Transferred to cell expression plasmid.
  • Each vector (pcDNATM3.3-T0P0 ® vector and pOptiTM VEC-T0P0® vector) lul and sections were added to a complete solution containing 200 mM NaCl and 10 mM .MgCl 2 and reacted for 5 minutes at room temperature. .
  • Thermal striatum was added to DH 5a Escherichia coli competent cell, transformed to obtain colonies, and then cultured in large quantities to obtain plasmids. After transfection of HEK293F cells (Invitrogen, USA) using the plasmid prepared above, the antibody obtained by culturing for 7 days was purified using a Protein A column (GE, USA).
  • the culture was loaded on a column to bind the antibody (IgG) in the culture with Protein A and eluted with 20 mM sodium citrate buffer (pH 3.0). SDS-PAGE of light and heavy chains confirmed molecular weight and high purity consistent with the theoretical calculations of light and heavy chains.
  • CM5, GE carboxymethylated textan biosensor chip
  • Bond speeds and dissociation rates are expressed in a combination and dissociation sensogram, and a simple one-to-one language pairing model (BIAcore X100 evaluation software, Version 2.0).
  • the equilibrium dissociation constant (KD) is obtained by dividing the dissociation rate constant (Kd) by the binding rate constant (Ka).
  • Kd dissociation rate constant
  • Ka binding rate constant
  • the measured values of the antibody DO and DA1 to DA35 of the present invention for DR5 are shown in Table 11 below (name of the antibody is denoted by the name of the clone from which the antibody is derived), and a representative sensogram of DO is shown in FIG. 1.
  • the binding capacity of the antibody of the present invention to human DR5 was confirmed using enzyme immunoassay.
  • Human DR5 protein at a concentration of 10 ng / ml was dispensed at 150 ul per well into 96 well immune plates (Nunc, USA) and adsorbed for 1 hour at room temperature. After washing three times with a buffer solution, 150 ⁇ L per well of a constant concentration (0.1 ⁇ 2000ng / ml) of the antibody diluted sequentially . . The treatment was allowed to react for 1 to 2 hours at silver phase.
  • the size of the antibody according to the invention was analyzed using SDS-PAGE. NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, USA) was used. Manufactured above Treatment of anti-DR5 antibodies (DO, DAI, DA4, DA16, DA 18, DA20, DA23, DA26, and DA29) with DTTC lnvi trogen (USA) to remove disulfide bonds under reduced and non-reduced conditions without DTT. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed respectively to confirm the presence of the light and heavy chains of the whole antibody. The obtained results are shown in FIGS.
  • the mouse blood half-life was evaluated.
  • Antibodies were administered at l-10 mg / kg through the veins of nude mice and orbital venous blood collection was performed from 5 minutes to 14 days after injection, based on the start of administration. Blood collection was performed using heparin-treated capillaries. Plasma (Pl asma) obtained by centrifugation from the collected blood was diluted to a certain concentration and used as a sample for ELISA. Human DR5 100ul diluted at a concentration of 10 ng / ml was placed in a 96-well immune plate (Nunc, USA) for 12 hours in the intestine. Adsorption for 14 hours.
  • the biological activity of the prepared antibodies was determined using an in vitro cell death assay.
  • Human colon cancer cell line Colo205 ATCC, USA
  • human pancreatic cancer cell line Miapaca-2 ATCC, USA
  • human lung cancer cell line H2122 ATCC, USA
  • Each tumor cell was suspended at a concentration of ⁇ * ⁇ ( ⁇ 5 cells / ml) and dispensed at a volume of 50 ul per well in a 96 well cell culture plate and incubated for 16 to 24 hours in a constant temperature wet incubator.
  • ⁇ * ⁇ ⁇ 5 cells / ml
  • Antibodies were treated alone (Ab alone) or in combination with crosslinked antibodies (anti-human FcKSerotec, USA). After incubation for 48 hours, lOul of lizazurin solution (Invitrogen, USA) was added per well and reacted in a constant temperature wet incubator for 1 to 2 hours. After reaction, fluorescence emitted at 590 nm was read using a spectrophotometer (Molecular Device).
  • Relative cell viability per well calculated as a percentage of fluorescence value (treated RFU) of the experimental material treated group relative to the relative fluorescence value of the culture medium treated group (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) (Cell viability (%) treated RFU / Untreated RFU) x 100) was digitized and the results are shown in FIGS. For comparison, the same test was performed on the control antibody AP.
  • the prepared antibodies showed excellent cell killing activity in all three human cancer cell lines tested.
  • Anti-tumor activity was evaluated by administering antibodies to nude mice transplanted with human cancer cell lines. Anti-DR5. Human lung cancer cell line H2122 (ATCC, USA) and human pancreatic cancer cell line Miapaca-2 (ATCC, USA) were used. Two to five million tumor cells were implanted into the lateral subcutaneous of 6-8 week old female BALB / c nude mice (Orientbio) and the tumor volume was measured using calipers. When the average volume of the tumor reached 100 to 300 mm 3 , the groups were separated and the prepared antibodies (control antibody AP and D0 antibodies) were administered according to the separated groups.
  • Antibody administration was intraperitoneally injected three times a weekly intervals (after 7 days and 14 days after the start of administration) at a dose of 0.05-2 mg / kg for 28-50 days from the day of group separation. Tumor volume was measured twice weekly from 28 to 50 days after the start of administration. Negative controls were administered buffer solution (PBS).
  • the cell killing activity when the antibody produced above and the TRAIL protein were treated in combination was analyzed.
  • Human colon cancer cell line Colo205 (ATCC, USA) and human pancreatic cancer cell line Miapaca-2 (ATCC, USA) were used.
  • Tumor cells suspended in 1 * 1CT5 eel ls / ml were dispensed in a 96-well cell culture plate at 50 ul per well, and then cultured in a constant temperature wet incubator for 16 to 24 hours.
  • Antibodies diluted to sequential concentrations (0.1 to 10,000 ng / ml) and TRAIL proteins at a constant concentration (0.5, 1, 10 ng / mi) were treated in 96-well plates.
  • Caspase activity was measured to elucidate the cell death mechanism of the prepared antibody.
  • Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3 / 7 Assay kit (Promega, USA) was used to measure the activity of Caspase-3 / 7.
  • Human colon cancer cell line Co 1 o205 (ATCC USA), human pancreatic cancer cell line Miapaca-2 (ATCC, USA), and human lung cancer cell line H2122 (ATCC, USA) were used for the test.
  • Each tumor cell suspended at 1 * 10 ⁇ 5 eel ls / ml was dispensed into a 96 well cell culture plate at 50 ul per well, and the tablets were incubated for 16 to 24 hours in a wet incubator.
  • FIG. 10A Cold 205 result
  • FIG. 10B H2122 result
  • FIG. 10C Miapaca-2 result
  • the aforementioned antibody AP was treated in the same manner.

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Abstract

세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 암세포 사멸 기능을 갖는 항체와 관련된 것으로, 구체적으로 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편, 및 상기 항체 또는 항원결합단편의 암의 예방 또는 치료 용도가 제공된다. 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편은 DR5에 대한 친화도 및 안정성 및 암세포 사멸 효과가 개선된 것을 특징으로 한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항ᅳ DR5 항체 및 그의 용도 【기술분야】
세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 암세포 사멸 기능을 갖는 항체와 관련된 것으로, 구체적으로， 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편， 및 상기 항체 또는 항원결합단편의 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
【배경 기술】
정상세포에는 영향 없이 암세포 선택적인 세포사멸을 유도하는 TNF- rel ated apoptos i s inducing l igand (TRAIL 또는 Apo2L)와 이의 수용체 중 하나인 DR5 (death receptors 5) 시스템을 통한 세포사멸 경로는 암 치료제 개발의 중요한 표적 물질로 여겨지고 있다 (Ashkenazi 등， Nat Rev Cancer 2： 420 , 2002) .
현재 DR5를 표적으로 하는 암세포 치료제로서 재조합 TRAIL과 세포사멸 수용체 특이적인 항체가 개발되고 있다.
TRAIL의 경우, 세포 사멸 신호를 전달하는 DR4 (Death receptor 4， TRAIL— Receptor 1) , DR5 (Death receptor 5 , TRAIL-Receptor 2)뿐만 아니라 세포 사멸 신호를 전달하지 못하는 DcRKDecoy Receptor 1， TRAIL-Receptor 3) , DcR2(Decoy Receptor 1 , TRAIL-Receptor 4)에도 모두 결합하여 DR5에 대한 특이성이 낮다는 문제가 있다. 또한 재조합 TRAIL은 안정성이 떨어지고 정상세포인 성상세포 (astrocytes ) , 간세포 (hepatocytes) , 각질세포 (kerat inocytes) 등에도 세포 사멸을 유발하는 부작용이 있다 (Jo 등, Nature Medi cine 6， 564—567 , 2000) . 따라서 최근 부작용이 적으며 암 세포 선택적인 세포사멸을 유도하는 항 -DR5 내지 항 DR4 항체 개발이 활발하게 연구되고 있다.
세포사멸 수용체 특이적인 항체와 관련하여， 현재까지 제넨텍 (Genentech Incorporated , 미국)과 암젠 (Amgen , 미국)에서 개발한 항 -DR5 항체와 세포 사멸 활성을 평가하기 위한 임상이 진행된 바 있다. 휴먼제놈사이언스 (Human Genome Sc i ences , 미국)는 항 -DR5 항체인 HGS- ETR2와 항 DR4 항체인 HGSᅳ ETR1을 이용하여 임상 2상을 진행한 바 있으나, 현재 개발이 중단된 상태이며, 이 외에도 Apomab, Conatumumab, tigatuzumab 등의 항 -DR5 항체들의 경우에도 개발이 중단되었다.
세포 사멸 (cell apoptosis)은 크게 외부적 세포 사멸 경로 (extrinsic apoptosis pathway)와 내재적 세포 사멸 경로 ( intrinsic apoptosis pathway)를 통해 발생한다. 대부분의 화학요법약제와 방사선 치료가 p53을 매개하는 내재적 세포 사멸 경로를 통하여 암 세포 사멸을 일으키는 반면 DR5 관련된 세포 사멸은 p53—비 의존적 외부적 경로와 내재적 경로를 통해 유도된다 (Takeda 등, Oncogene, 26， 3745-3757, 2007) . 외부적 세포 사멸 경로에서 TRAIL 내지 항체는 DR5에 결합하여 신호 전달 복합체 (DISC: Death-Inducing Signaling Complex)를 형성하고 Adaptor 단백질 (FADD)을 통해 apoptosisᅳ initiating protease 인 caspase-8, caspase—10을 활성화 시킨다. Caspase一 8는 하위 protease인 caspase-3, caspase-7 등을 활성화시키는 동시에 미토콘드리아를 통한 내재적 세포사멸을 함께 유도한다 (Ohtsuka 등, Oncogene , 22, 2034-2044, 2003).
. TRAIL의 암 치료 용도 개발의 표적으로서의 중요성이 커져가고 있는 상황에서, 보다 효과적이고 강력한 TRAIL 관련 표적 물질의 개발이 요구되고 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 다양한 암세포를 효과적으로 사멸시키는 항 -DR5 항체 및 그 용도를 제공하고자 한다.
일 예는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
다른 예는 상기 항 -DR5 항체 및 /또는 이의 항원결합단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항— DR5 항체 및 /또는 이의 항원결합단편을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항— DR5 항체 및 /또는 이의 항원결합단편의， 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도 또는 항암제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 백터， 및 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는 단계를 포함하는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편의 제조 방법을 제공한다.
【과제의 해결방법】
세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 다양한 암세포를 효과적으로 사멸시키는 항 -DR5 항체， 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 제공되는 항체는 TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) 농도와 상관없이 일정 수준의 항원 결합력을 유지하는 TRAIL 비경쟁적 항체인 것을 특징으로 한다. 따라서 , 상기 항체는 기존에 개발된 항체 약물보다 우수한 효과를 지닌 혁신적인 항체 신약 또는 진단제로서 유용하게 개발될 수 있다.
세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)는, TRAIL receptor
2 (TRAILR2) 또는 tumor necrosis factor receptor superf ami ly member 10B (TNFRSF10B)라고도 칭해지며, TRAIL 에 결합하는. TNF一 수용체 superfamily 의 세포표면 수용체이고 세포자멸사 (apoptosis) 신호를 전달하여 세포자멸사를 매개한다. DR5는 Caspase 8， Caspase 10, FADD (Fas-Associated protein,, with Death Domain) , TRAIL：등과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. DR5는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 예컨대 인간의 DR5 (e.g. , NCBI accession no. UniProtKB/Swiss-Prot： Q6FH58 등)일 수 있다.
일 예는 DR5를 특이적으로 인식하거나 및 /또는 여기에 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드를 제공한다ᅳ 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1， 2, 4, 및 7 내지 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 단백질， 폴리펩타이드, 또는 플리뉴클레오타이드가 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다 함은 단백질, 폴리펩타이드， 또는 폴리뉴클레오타이드가 상기 서열을 포함하거나， 상기 서열을 필수적으로 포함하여 이루어지거나, 상기 서열로 이루어진 것을 모두 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 폴리펩타이드는 항— DR5 항체의 상보성결정부위 (complementarity determining region, CDR)로서 사용 가능하다.
상기 폴리펩타이드 및 이들의 적용 가능한 상보성결정부위를 아래의
Figure imgf000006_0001
(상기 표 1에서, VH-CDR1 , VH-CDR2 , 및 VH-CDR3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, VL— CDRl, VL-CDR2, 및 VL-CDR3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다)
다른 예에서， 상기 폴리펩타이드들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 DR5 표적 풀리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 DR5 표적 폴리펩타이드 분자는 DR5의 리간드인 TRAIL과 비경쟁적으로 작용하여 암세포 사멸 (예컨대 암세포의 apoptosis)을 증진시키는 것을 특징으로 한다.
상기 DR5 표적 폴리펩타이드 분자는 앞서 설명한 항— DR5 항체의 중쇄 상보성결정부위， 경쇄 상보성결정부위， 또는 이들의 조합; 또는 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 DR5 표적 폴리펩타이드 분자는， 이에 한정되지 않지만, 항 -DR5 항체， 상기 항체의 항원결합단편， 또는 항 -DR5 항체 유사체 (항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 구조체; 예컨대， 펩티바디, 나노바디, 등) , 또는 다중 결합 항체 등의 전구체 또는 구성 부분 (예컨대， CDR)으로서 역할을 할 수 있다.
용어 "펩티바디 (pept i de + ant i body) "는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 항체와 유사한 골격과 기능올 갖는 단백질을 의미한다. 여기서 앞서 설명한 1종 이상의 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및 /또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용할 수 있다.
용어 "나노바디'1는 단일-도메인 항체 (s ingle-domain ant ibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며， 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체 (두 개와 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며 , 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.. 용어 "다중 결합 항체" (이중 결합 항체를 포함하는 의미임)는 2개 또는 그 이상의 상이한 항원을 인식 및 /또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및 /또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로， 상기 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 앞서 설명한 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 폴리펩타이드들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 상보성결정부위로서 포함하는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편이 제공된다. 본 명세서에서 제공되는 항 -DR5 항체는 DR5의 작용제 (agoni st )로서의 효능을 갖는 것으로, 세포표면에 개별적으로 존재하는 DR5 분자를 집합시켜 세포내에서 세포사멸 신호를 생성 및 전달시킴으로써 세포 사멸을 유도하는 역할을 한다.
상기 항— DR5 힝 - 또는 이의 항원결합단편은, 중쇄의 상보성결정부위로서，
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1) ,
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH— CDR2) , 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 하기 일반식 1의 아미노산 서열과 같다.
[일반식 1] (서열번호 3)
D—A-G-S-X1-C— G-X2-G— G-W-T-G-A-C- I -D-T
XI은 G 또는 P이고,
X2는 S 또는 K임 .
일 구체예에서, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR3로 사용 가능한 서열번호 3의 폴리펩타이드는， 예컨대， 서열번호 7 서열번호 8， 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄 그은 부분은 서열번호 7의 아미노산 서열에서 변형된 아미노산을 나타낸다) :
서열번호 7 : DAGSGCGSGGWTGACIDT
서열번호 8 : DAGSPCGSGGWTGACIDT
서열번호 9 : DAGSPCGKGGWTGACIDT
다른 예에서, 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄의 상보성결정부위로세
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1) , ' 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL— CDR2) 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 5와 서열번호 6의 아미노산 서열은 각각 하기 일반식 2 및 일반식 3의 아미노산 서열과 같다.
[일반식 2] (서열번호 5)
N-N-N-N-X3-X4-X5
X3는 R, L , 또는 K이고,
X4는 P , M , 또는 A이고,
X5는 S , P , 또는 K임；
[일반식 3] (서열번호 6)
G-S-R-D-S-X6-X7-X8-G-X9
X6는 S , A, 또는 D이고,
X7는 Y 또는 G이고
X8는 V M, G, 또는 A이고, . X9는 I , R , 또는 G임 .
일 구체예에서, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR2로 사용 가능한 서열번호 5의 폴리펩타이드는, 예컨대， 서열번호 10， 서열번호 11 , 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄 그은 부분은 서열번호 10의 아미노산 서열에서 변형된 아미노산을 나타낸다)：
서열번호 10 : NNNNRPS
서열번호 11 : NNNNLMP
서열번호 12 : NNNNKAK
일 구체예에서, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR3으로 사용 가능한 서열번호 6의 폴리펩타이드는, 예컨대， 서열번호 13， 서열번호 14， 서열번호 15 , 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄 그은 부분은 서열번호 13의 아미노산 서열에서 변형된 아미노산을 나타낸다) :
서열번호 13 GSRDSSYVGI
서열번호 14 GSRDSAGMGA
서열번호 15 GSRDSDGGGR
서열번호 16 GSRDSSGAGG
일 구체예에서， 항 DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1) , 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2) , 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 4 의 아마노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1) , 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL— CDR2) , 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리뎁타이드 (VLᅳ CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 , 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은，
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDRI) , 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2) , 및 서열번호 Ί 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위， 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VLᅳ CDR1) , 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL— CDR2) , 및 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL— CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDRI) , 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH— CDR2) , 및 서열번호 7 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1) , 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VLᅳ CDR2) , 및 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
일구현예에서， 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 2 및 3에 조합된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
[표 2】
중쇄의 상보성 결정 부위 서열
Figure imgf000010_0001
번호 번호 번호
1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 8 DAGSPCGSGGWTGACIDT
1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 9 DAGSPCGKGGWTGACIDT
【표 3】
경쇄의 상보성 결정 부위 서열
Figure imgf000011_0001
다른 구체예에서， 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역， 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역， 또는 이들의 조합이 제공된다. 예컨대 , 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 17 내지 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며 , 경쇄 가변 영역은 서열번호 38 내지 서열번호 49로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다ᅳ
따라서 , 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 17 내지 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역;
서열번호 38 내지 서열번호 49로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역; 또는
이들의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 -DR5 항체는 동물 유래 항체 (예컨대, 마우스 유래 항체)， 키메릭 항체 (예컨대, 마우스 -인간 키메릭 항체)， 또는 인간화 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합단편은 생체로부터 분리된 것 또는 비자연적으로 생산 (non-natural ly occurr ing)된 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합단편은 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다. 다른 예에서， 상기 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래 (분리)한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀， 양, 토끼， 염소 기니피그, 낙타， 말， 또는 닭의 항체일 수 있다. 여기서 인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서， 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체를 포함한다.
항 -DR5 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있으며， 예컨대, 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항ᅳ DR5 항체는 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로블린 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) , IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고， 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및 /또는 경쇄 블변 영역 및 /또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.
완전한 항체 (예컨대, IgG 타입)는 2개의 전장 (fuli length) 경쇄 및
2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며， 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마 (Y), 뮤 ( μ ), 알파 ( α ), 델타 ( δ ) 및 엡실론 ( ε ) 타입을 가지고， 서브클래스로 감마 1(Υ 1), 감마 2(γ2), 감마 3( γ3), 감마 4(Υ4), 알파 1( α1) 및 알파 2( α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파 ( κ ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다.
용어， "중쇄 (heavy chain)'1는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지 (hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한， 용어 "경쇄 (light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어 , "상보성결정부위 (complementarity determining region,
CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRHl, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 , 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편， 본 명세서에 있어서， 용어， "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식' '은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어， "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로， 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. . 예를 들어， scFv, (scFv)2 , Fab , Fab ' 및 F(ab ' )2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab '는 중쇄 CH1 도메인의 C—말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hi nge regi on)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F( ab ' )2 항체는 Fab '의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two— chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(s ingle— chain FV)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이를 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F( ab ' )2 단편을 얻을 수 있다) , 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역 (hinge region) "은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서， CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며 , 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 ( f lexi bi l i ty)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
다른 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및' /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인 (예컨대， 치료 대상의 진단 또는 선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
항 -DR5 항체는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 항 -DR5 항체는 DR5의 작용제 (agoni st )로서의 기능을 나타내므로， 항ᅳ DR5 항체가 효능 (즉， 암세포 사멸 등의 항암 효능)을 층분히 발휘하기 위해서， 적용 대상 암은 해당 암세포가 DR5를 발현하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 상기 암은 TRAIL-민감성 암 또는 TRAIL-저항성 암일 수 있다. 일 예에서， 상기 암은 구체적으로는 혈액암, 폐암, 위암， 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 혹색종, 자궁암 난소암, 직장암, 대장암， 결장암， 유방암， 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내.막 암종, 자궁경부 암종， 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암， 갑상선암, 부갑상선암， 연조직의 육종, 요도암， 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암， 신장 세포 암종， 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종， 척수축 종양， 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나， 이에 한정되지 않는다.
일 예에서， 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 TRAIL과 병용함으로써 .항— DR5 항체 .또는 이의. 항원. 결합 단편만을 사용한 경우와 비교하여 상승된 항암 효과를 얻을 수 있으며， TRAIL—민감성 암뿐 아니라 TRAIL-저항성 암에 대해서도 항암 호과를 얻을 수 있다 (실시예 13 참조) . 따라서, 상기 약학 조성물은, 항ᅳ DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 더하여, TRAIL (TNF— re l ated apoptos i s induc ing l igand)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
즉, 상기 약학 조성물은, 유효성분으로，
( 1) 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 ; 및
(2) TRAIL
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은, ( 1) 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 (2) TRAIL를 하나의 제형으로 제형화하여 포함하거나, 각각 별개의 제형으로 제형화하여 포함하는 것일 수 있다. 또한， 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계에 더하여, TRAIL의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
즉， 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 (1) 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 (2) TRAIL의 약학적 유효량을 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 .환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 병용 투여하는 단계는 (1) 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 (2) TRAIL의 약학적 유효량을 하나의 제형에 포함시켜 동시에 투여하거나 (1) 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 (2) TRAIL의 약학적 유효량을 각각 별개의 제형으로 제형화시켜 동시 또는 순서에 상관없이 순차적으로 투여하여 수행될 수 있다.
상기 TRAIL (TNFᅳ related apoptosi s— inducing ligand)는 CD253( cluster of differentiation 253) 또는 TNFSF OCtumor necrosis factor (ligand) super family, member 10)이라고도 불리며' 세포 사멸 (apoptosis) 과정을 유도하는 리간드로서 기능을 갖는 단백질로서, 정상 조직 세포에서 널리 생산 및 분비되는 사이토카인 중 하나이다. 일 예에서， 상기 TRAIL는 인간 유래의 것일 수 있으며， 예컨대， NCBI Accession number NP_001177871.1 , ΝΡ_003801.1 등으로 표현되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포사멸 경로를 이용하는 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 TRAIL과의 병용)은 Carboplatin 또는 Pacl i taxel (Recka 등， Lung Cancer, 82, 441-448,2013) , Gemci tabin(Torres 등， Cancer Medicine, 2(6), 925-932, 2013) 등의 화학요법약제들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 병용하여 사용됨으로써 항암 /항종양 효과를 보다 향상시킬 수 있다 (실시예 15 참조).
암의 예방 및 /또는 치료를 위하여 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 단독으로 사용하는 것은 물론， 수술, 호르몬 치료, .약물 치료 및 /또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
일 예에서， 상기 약학 조성물은 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 TRAIL과의 조합)과 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분 (화학요법 약제)을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 또한 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 TRAIL과의 조합)에 더하여 항암효과를 갖는 공지의 유효성분 (화학요법 약제)을 1종 이상을 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원결합단편과 함께 사용할 수 있는 화학요법 약제는 카보플라틴 (Carboplatin), 파클리탁셀 (Paclitaxel; Recka 등， Lung Cancer , 82， 441-448, 2013) 등의 알킬화 계열 항암제; 젬시타빈 (Gemcitabin; Torres 등, Cancer Medicine, 2(6)， 925—932， 2013) 등의 대사 길항제 계열 항암제; 독소루비신 (Doxorubicin:; HM Amm 등， Mol Cancer Res April, 9； 403, 2011) 등의 안트라사이클린 계열 항암제; 보테조 ¾ (Bortezomib; Shanker A 등， J Natl Cancer Inst, May 7； 100(9)： 649-62, 2008)등의 프로테아좀 억제제 계열 항암제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항 -DR5 항체, 항원결합단편 등의 유효성분은， 적절한 투여를. 위하여 , 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기 약학 조성물에 포함되거나 투여될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수， 멸균수, 링거액, 완층 식염수， 덱스트로오스 용액， 말토 덱스트린 용액， 리세롤, 에탄올， 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법 및 /또는 Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 적절하게 제제화할 수 있다.
상기 항 -DR5 항체， 항원결합단편 등의 유효성분 또는 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여， 국소 투여, 비내 투여， 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량은 제제화 (제형화) 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태， 음식, 투여 시간， 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0. 001 내지 lOOOiiig/kg , 구체적으로 0.01 내지 100mg/kg , 보다 구체적으로 0. 1 내지 50 mg/kg , 더욱 구체적으로 0 . 1 내지 20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나， 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 다른 약물과 병용 투여 1
5 .가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제, 산제， 분말제, 과립제， 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며， 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히 , 상기 항 -DR5 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테를 및 폴리에탈렌글리콜 -유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab 1 단편은 디설파이드 -교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 한편， 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 DR5에 특이적으로 결합하므로， 이를 이용하여 DR5의 검출 (즉， 존재 여부 및 /또는 수준 (농도) 측정) 및 /또는 DR5 관련 질병 (예컨대, DR5의 존재 여부 또는 농도 변화 (정상군보다 농도 증가 또는 감소의 특징을 갖는 질병) )의 진단에 사용할 수 있다.
따라서 , 일 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 DR5 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는, 생물 시료에 상기 항ᅳ DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원—항체 반웅 여부를 확인하는 단계를 포함하는 DR5 검출 방법을 제공한다. 이 때, 항원 -항체 반응이 확인되면 상기 생물 시료 내에 DR5이 존재하는 것으로 판단할 수 91고, 항원—항체 반응의 정도를 측정하여 생물 시료 내의 DR5의 수준 (농도)를 측정할 수 있다.
상기 생물 시료는 환자 (예컨대， 인간 등의 포유동물)로부터 얻어진 세포, 조직， 체액， 또는 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 정상 시료는 DR5 관련 질병을 앓지 않는 환자 (예컨대 인간 등의 포유동물)로부터 얻어진 세포, 조직， 체액， 또는 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원 -항체 반응 여부를 확인하는 단계 또는 항원ᅳ항체 반응을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반웅, 형광, 발광 및 /또는 방사선 검출을 통하여 수행될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피 ( Immunochromatography) , 면역조직화학염색 ( I睡 unohi stochemi st ry) , 효소결합 면역홉착 분석 (enzyme 1 iked immunosorbent assay : ELISA) , 방사선 면역즉정법 (radi oimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay : EIA) , 형광면역분석 (Fl oresence immunoassay: FIA) , 발광면역'분석 ( luminescence immunoassay : LIA) , 웨스턴블라팅 (Western blot t ing) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서,
앞서 설명한 항 -DR5 항체의 중쇄 상보성 결정 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 상보성 결정 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드， 또는 이들의 조합; 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드， 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조합,
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조합을 포함하는 재조합 백터, 및
상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다.
일 예에서， 상기 재조합 백터는 항ᅳ DR5 항체의 중쇄 상보성 결정 부위 및 경쇄 상보성 결정 부위; 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는 중쇄. 및 경쇄를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드를 별개의 백터에 각각 포함하거나 하나의 백터에 함께 포함하는 것일 수 있다.
용어 "백터 (vector ) "는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 백터, 코즈미드 백터 및 박테리오파아지 백터, 아데노바이러스 백터， 레트로바이러스 백터 및 아데노 -연관 바이러스 백터와 같은 바이러스 백터를 포함한다. 상기 재조합 백터로 사용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면， pSClOl, pGV1106, pACYC177, ColEl, pKT230, ρΜΕ290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRl , pHV14, pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 PUC19 등)， 파지 (예를 들면, λ^4λΒ, λ -Charon, λ Δζΐ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 백터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operatively 1 inked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 /또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 백터는， 전형적으로 클로닝을 위한 백터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 백터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 백터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 사용되는 백터가 발현 백터이고,. 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어， pLA 프로모터 , CMV 프로모터 , trp 프로모터 , lac 프로모터 , tac 프로모터， T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 백터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 fl 복제원점, SV40 복제원점ᅳ pMBl 복제원점, 아데노 복제원점， MV.복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이.러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어,: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터， 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 상기 재조합 세포는 상기 재조합 백터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는， 예를 들어， E. coli , 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며， 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서， 효 S—( Saccharomyce cerevisiae) , 곤충 세포， 식물 세포 및 동물 세포， 예를 들어, Sp2/0 , CHO(Chinese hamst er ovary) l , CHO DG44 , PER . C6 , l38 , BHK , COS-7 , 293 , HepG2 , Huh7 , 3T3 , RIN , MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 백터의 숙주 세포.내로의 운반 (도입)은， 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들에 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl 2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는， 미세 주입법， 칼슴 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀- 매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은. 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어， 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는， 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다. ·
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 백터를, 예컨대 적절한 숙주세포에서, 발현시키는 단계를 포함하는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편의 제조 방법을 제공한다. 일 예에서， 상기 제조 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 백터를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및 임의로, 생산된 항체를 분리 및 /또는 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명은 DR5에 대한 표적 치료용 항 -DR5 항체를 제공하는 것으로， 본 발명의 항체는 TRAIL 농도와 상관없이 일정 수준의 항원 결합을 유지하는 TRAIL 비경쟁적 항체인 바, 기존의 항체 약물보다 우수한 효과를 지닌 혁신적인 항체 신약 또는 진단제로서 유용하게 개발될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 항체 DO 의 결합속도 및 해리속도를 분석한 결합 및 해리 센소그램을 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2f 는 항체 DO 및 DA1 내지 DA35의 DR5에 대한 결합력을 대조군 AP와 비교한 실험 결과 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명에 따른 예시적인 항체의 SDS- 폴리아크릴아미드젤 전기영동 (SDS-PAGE) 분석 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4h는 본 발명에 따른 예시적인 항체의 크기 배제 크로마토그래피 (s i ze exc lus ion chromatography, SEC) 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 항체의 약동학적 지표값을 산출한 결과를 나타낸다ᅳ
도 6a 내지 도 6ι "은 본 발명에 따른 항체가 종양 세포 사멸 활성을 갖는 것을 나타내는 결과이다.
도 7a 및 도 7b 는 이종이식 동물모델에서 본 발명에 따른 항체의 종양 성장 억제 효과를 나타내는 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 본 발명에 따른 항체가 TRAIL 비경쟁적으로 DR5에 결합함을 보여주는 실험 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명에 따른 항체가 TRAIL과 병용시 상승효과가 있음을 보여주는 세포 사멸 유도 실험 결과이다.
도 10a 내지 도 10c는 본 발명에 따른 항체가 apoptos i s로 세포사멸을 유도하는 것을 보여주는 Caspase 활성 측정 결과이다.
도 11a 및 도 lib는 항체를 일정 농도의 젬시타빈과 병용 처리시 세포 사멸 활성을 나타내는 결과이다. 【발명을 실시하기 위한 형태】
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게ᅵ 설명하기 위해 제공되는 것이다. 실시예 1.DR5 면역 및 cDNA 라이브러리 제작
DR5에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여， 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 항원을 면역한 동물의 면.역세포로부터 mRNA를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용한 PCR을ᅵ 통해 항체 유전자를 증폭시키고 이를 파아지 디스플레이 백터로 클로닝하여 제작되었다.
구체적으로， 화이트 레그흔 종의 닭 3마리에 인간 DR5 (R&D systems, 미국)를 완전 프로인트 보강제 (complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제 (Sigma, 미국)와 흔합하여 3주 간격으로 5회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, PBSB(3% 우 혈청 알부민을 포함하는 인산완충용액)를 이용하여 1:100, 1:500, 1： 2500 및 1:12500의 농도로 희석하여 보관한 후， 인간 DR5의 결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. ELISA 플레이트에 인간 DR5 (R&D systems, 미국) lug/ml을 4°C에서 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반웅시켰다. PBST(0.1% tween— 20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로불린ᅳ HRP(horse radish peroxidase)(l:3000)를 넣고. 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS(Thermo, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (mi crop late reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청은 DR5와 결합하지 않았으며, 인간 DR5에 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.
마지막 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 조직을 10ml TRI 시약 (Molecular research center, 미국)과 흔합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20ml TRI 시약을 추가한 후 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모—3-클로로프로판(1-1 0^10- 3-chloropropane, BCP) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. 랜덤 핵사머 (random hexamer)를 프라이머로 이용하여 수퍼스크립트 전사 시스템 (Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반응 (65°C에서 5분; 4°C에서 5분; 50°C에서 50분; 85°C에서 5분; 및 4°C)을 수행하였다. 역전사 반웅의 결과물인 cDNA를 포함하는 반웅액 5uKmicroliter)를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다. 실시예 2. 항체 라이브러리 제작
(2-1) 면역 항체 유전자 증폭
닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 VH와 VL 도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반옹은 상기 실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여， 중쇄 가변영역，. 경쇄 가변영역 및 이를 연결한 scFv(single chain Fv) 영역에 맞게 고안된 하기 표 4의 프라이머 조합을 이용하였다. VH 및 VL 각각의 cDNA 라이브러리 0.5ul, 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5ul Taq DNA 폴리머라제를 흔합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94°C에서 5분 반웅시킨 후， 94°C에서 15초， 56°C에서 30초 및 72°C에서 90초간 반응시키는 과정을 30사이클 반복하였다. PCR 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 증폭된 DNA를 각각의 크기에 따라 분리하고， 겔 추출 키트 (Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
scFv DNA를 얻기 위해， .정제된 VH 50ng, VL 50ng DNA를 주형으로 하여 30 pmole 순방향 프라이머， 30 pmole 역방향 프라이머， 10x PCR 버퍼， 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 흔합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후 94;C에서 5분 반응시키고， 94°C에서 30초， 56°C에서 30초 및 72°C에서 2분간 반응시키는 과정을 20사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트 (Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
상기 PCR 반웅에 사용된 프라이머를 아래의 표 4에 정리하였다:
【표 4】
PCR 반응에 사용된 프라이머
Figure imgf000023_0001
o o GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG 54 scFV GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT
ΰ c 55 GGA GG
(2-2) 항체 DNA의 제한효소 절단
상기에서 제조된 scFv와 파지미드 백터인 pComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 Sfil (Roche, 미국)로 절단하였다. scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units Sfil (Roche, 미국), 20ul IOX 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50°C에서 밤샘 반응시켰다. 또한, pComb3X 백터 20ug, 120 units Sfil 및 20ul IOx buffer를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50°C에서 밤샘 반웅시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트 (Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(2-3) 항체 DNA의 라이게이션 및 라이브러리의 제조
scFv 절편을 PComb3X 백터에 삽입하기 위하여， 상기 (2-2)에서 제한효소 Sfil을 이용하여 절단한 scFv를 코딩하는 PCR 절편 700ng 및 pComb3X 1.4ug을 흔합하고, T4 DNA 라이게이즈 ( Invi trogen, 미국)를 첨가하여 16°C에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 흔합물을 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738( New England Biolab, 미국)에 전기 천공법 (electroporation)으로 형질 전환시켜 46ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 5 xlO9 complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다. 실시예 3. 항 -DR5 scFv를 포함하는 파지 클론의 선별
상기 실시예 2에서 수득한 scFV의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 인간 DR5에 결합하는 항체를 고체에 지지된 DR5를 이용하여 선별하였다.
(3-1) DR5에 결합하는 항체 선별
먼저, 마그네틱 비드에 인간 DR5 (R&D systems, 미국) lOug(microgram)을 컨쥬게이션시켰다. 상기 실시예 2에서 수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 파아지 표면에 발현될 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New Engl and Biol ab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37°C에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지 (Stratagene , 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 7.0ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지 (30g/L 트립톤 , 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS , pH 7.0)에서 밤새 배양하였다. 상기에서 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후 , 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재 현탁하였다. 마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 인간 DR5와 파아지를 상온에서 2시간 동안 반웅시킴으로써 DR5 에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후， 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고， 0. 1M 글리신 (pH 2.2)용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝 (panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다ᅳ 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝 (panning)을 진행하였다. 반복적인 패닝 단계를 통해 결합력이 높은 . 파아지를 축적하였다. 4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰 (deep wel l ) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린， 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지 ( 1 : 1000)를 넣고 37°C에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다. 상기에서 수득한 배양액을 원심분리하여 얻어진 배지 상등액 내 파아지와 TRAIL을 미리 결합시킨 후 이를 DR5가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항 -M13 항체를 이용하여 DR5에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.
(3-2) 선별된 항체의 시퀀싱
상기 (3-1)의 선별조건에서 인간 DR5에 양성 시그널을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻는다. DNA 미니 프랩 키트 (진올， 한국)를 이용하여 플라스미.드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다ᅳ 염기서열 결정을 위해 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분^하였다.
【표 5】
PCR 반응에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호 o o o ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC 56
역 H ¾ CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG 57 실시예 4. 항체최적화 - 인간화 및 친화도 개선
동물 면역 항체라이브러리로부터 얻은 항체 클론들 중 친화도와 활성이 우수한 모클론 DO ( chimer i c ant i body)을 선별한 후, 이 항체의 프레임워크를 인간 항체 프레임워크로 변환하는 과정을 진행하였다 (Ni shi bor i et al . , Molecular Immunology, 43 (2006) ) . 또한, 친화도 개선을 위해 중쇄 및 경쇄영역의 CDR의 서열을 랜덤화시켜 새로운 파아지 라이브러리를 제작하였다. 상기 실시예 2와 같은 방법으로 수득한 파아지 라이브러리를 마그네틱 비드에 고정시킨 인간 DR5 10ug과 상온에서 2시간 반응시킨 후 0 . 5% Tween 20을 포함하는 PBS로 5회 세척하였다. 세척 후 결합되어 있는 파아지를 0. 1M 글리신 (pH 2 .2) 용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 2차 패닝 시에는 마그네틱 비드에 인간 DR5 lug를 고정하고 Tween 20을 포함하는 PBS로 10회 세척하고 3차 패닝 시에는 마그네틱 비드에 인간 DR5 O . lug를 고정하고 Tween 20을 포함하는 PBS로 20회 세척하여 선택 압력을 증가시켰다. 위와 같은 인간화 및 친화도 향상 방법 외에, 모클론의 가변영역의 프레임워크 서열에서 인체 면역세포에서 높은 면역성을 보일 것으로 예측되는 아미노산을 치환시킨 탈면역화 변이체들도 제작하였다. 상기와 같이 인간화 또는 탈면역화 과정을 거친 모클론의 변이 클론들을 "DA1 내지 DA351'으로 명명하였다.
상기 D0 및 DA1 내지 DA35 클론으로부터 얻어진 상보성결정부위 및 가변영역의 서열을 아래의 표 6 내지 9에 정리하였다:
【표 6】
중쇄의 상보성 결정 부위 서열
Figure imgf000026_0001
DA7 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA8 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA9 1 GFTFSSFNML 2 GI GKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA 10 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACI DT
DA 11 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA 12 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA13 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA 14 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA 15 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA 16 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA17 1 GFTFSSF丽 L 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA18 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA 19 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA20 1 - GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA21 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGAC IDT
DA22 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 8 DAGSPCGSGGWTGACIDT
DA23 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 9 DAGSPCGKGGWTGACIDT
DA24 1 GFTFSSFNML • 2 GI GKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA25 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA26 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA27 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA28 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA29 1 GFTFSSF醒 L 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA30 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA31 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACI DT
DA32 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA33 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
DA34 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGAC IDT
DA35 1 GFTFSSFNML 2 GI GKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT
【표 7】
경쇄의 상보성 결정 부위 서열
Figure imgf000027_0001
DA5 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA6 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA7 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA8 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA9 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA 10 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA11 4 SGGDSYAGSYYYG 10 . NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA12 4 SGGDSYAGSYYYG 11 NNNLMP 13 GSRDSSYVGI
DA13 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 14 GSRDSAGMGA
DAW 4 SGGDSYAGSYYYG 12 NNNNKAK 13 GSRDSSYVGI
DA 15 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 15 GSRDSDGGGR
DA16 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 16 GSRDSSGAGG
DA 17 4 SGGDSYAGSYYYG 12 NNNNKAK 13 GSRDSSYVGI
DA 18 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 15 GSRDSDGGGR
DA 19 4 SGGDSYAGSYYYG 11 NNNNLMP 13 GSRDSSYVGI
ΌΑ20 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 14 GSRDSAGMGA
DA21 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 16 GSRDSSGAGG
DA22 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA23 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA24 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA25 4 SGGDSYAGSYYYG 1.0 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA26 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA27 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA28 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA29 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA30 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA31 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA32 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA33 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA34 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
DA35 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI
【표 8】
중쇄 가변영역 서열
Figure imgf000028_0001
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DAI GLVQPGGSL PGKGL YTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA2 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA3 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 19
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG ffVRQA GIGKSD RFTISRDDS NT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA4 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 20
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG . WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA5 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 21
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA6 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 22
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCAR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA7 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 23
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA8 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA9 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG LYLQ删 SLRAED SGGWTGA 24
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 10 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 25
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA11 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQ删 SLRAED SGGWTGA 26
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCAR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 12 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 13 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 14 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGG TGA 27
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 15 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 16 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 17 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 18 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA 19 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA20 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG
GFTFS WGQGTL
DA21 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSPCG
GFTFS WGQGTL
DA22 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 28
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSPCG
GFTFS WGQGTL
DA23- GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED KGGWTGA 29
SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA24 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VRLQLNNLRAED SGGWTGA 17
SFNML VIVSS SLVC GS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA25 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VYLQ陋 SLRAED SGGWTGA 30
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA26 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 30
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA27 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VRLQLNNLRAED SGG TGA 17
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA28 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQLNNLRAED SGGWTGA 31
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA29 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQLNNLRAED SGGWTGA 31
SFNML VIVSS SLVCKGS .EWVA SAVKG TGTYYCVK _ CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA30 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 32
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA. SAVKG TGTYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA31 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQMNSLRAED SGGWTGA 33
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA32 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VRLQLNNLRAED SGGWTGA 34
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA33 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQLNNLRAED SGGWTGA 35
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA34 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 36
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT
AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG
GFTFS WGHGTE
DA35 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG . ARLQ删 SLRAED SGGWTGA 37
SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT
(상기 표 8에서, VH-FWl , VH-FW2 및 VH-FW3는 중쇄 가변영역의 프레임워크를 나타낸다)
【표 9】
경쇄 가변영역 서열
Figure imgf000031_0001
VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA2 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 40
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA3 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA4 SLSASVGDR YAGSY G ςKAPKT TDFTLTISSLQP 39
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA5 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA6 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA7 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSGSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA8 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 41
PS SYVGI KVEIK VTITC . YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA9 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 40
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA 10 SLSASVGDR YAGSY TDFTLTISSLQP 40
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA11 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 40
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNL GSRDS FGQGT
DA 12 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 42
MP SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA 13 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 43
PS AGMGA KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP NNNNK GVPSRFSGSRSG GSRDS FGQGT
DAM ' 44 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT AK , TDFTLTISSLQP SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA15 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 45
PS DGGGR KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA 16 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT. TDFTLTISSLQP 46
PS SGAGG KVEIK VTITC YYG σ LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNK GSRDS FGQGT
DA 17 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 44
AK SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA 18 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 45
PS DGGGR KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNL GSRDS FGQGT
DA 19 SLSASVGDR GKAPKT TDFTLTISSLQP 42
MP SYVGI KVEIK VTITC LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA20 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 43
PS AGMGA KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA21 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 46
PS SGAGG KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA22 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 47
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGQGT
DA23 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 47
PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA24 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA25 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 38
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEAVYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NN刚 R GSRDS FGAGT
DA26 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NNNNR NIPSRFSGSTSG GSRDS FGAGT
DA27 49 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV PS STATLTITGVQA SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQ A NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA28 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 38
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEAVYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA29 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA30 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA31 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA32 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 38
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEAVYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA33 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA34 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC
LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG
NNNNR GSRDS FGAGT
DA35 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49
PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC
(상기 표 9에서， VL-FWl , VL-FW2 및 VL-FW3는 경쇄 가변영역의 프레임워크를 나타낸다) 실시예 5 . 항체의 생산
상기에서 수득한 항체의 친화도 측정 및 활성 분석을 위하여 면역글로불린 ( IgG) 단백질을 생산하였다. scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 10의 프라이머 조합을 이용해서 실시예 2와 같은 조건의 PCR을 통해 수득하였다.
각 가변영역 (Var i ab l e Regi on , VH 내지 VL)과 불변영역 (Const ant Reg i on , CH 내지 Ck)을 하기 표 10의 HC 및 IX 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고, pcDNATM3 . 3-T0P0®TA 클로닝 키트 및 P0pt i TMVEC-T0P0®TA 클로닝 키트 ( I nvi t rogen , 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 백터 (pcDNATM3.3-T0P0® 백터와 pOptiTM VEC-T0P0® 백터) lul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM .MgCl2이 포함된 완층액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반웅시켰다. DH 5a 대장균 competent cell에 열층격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다. 상기에서 제조된 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포 (Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후， 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체 (IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하였다. SDS—PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.
【표 10】
Figure imgf000035_0001
실시예 ,6. 인간 DR5에 대한 항체의 결합 친화도 분석
친화도를 측정하기 위해 인간 DR5 각각을 카르복시메틸화 텍스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 커플링하였다. 결합 및 해리 속도 측정을 위해 IgG 단백질을 5nM, 2.5ηΜ, 1.25ηΜ, 0.625ηΜ,
0.313ηΜ 및 0.156ηΜ로 2배 연속 희석하여 주입하였다.
결합속도 및 해리속도는 결합 및 해리 센소그램 (sensogram)으로 표시되고, 단순 일대일 랭뮈어 결합 모델 (BIAcore X100 평가 소프트웨어， 버전 2.0)을 사용하여 계산하였다. 평형해리 상수 (KD)는 해리 속도 상수 (Kd)를 결합 속도 상수 (Ka)로 나눈 값으로서， 실제 값을 계산한 결과 nM 이하로 높은 수준의 KD 값을 확인하였다. DR5에 대한 본 발명의 항체 DO 및 DA1 내지 DA35의 측정값을 하기 표 11에 나타냈으며 (항체명을 항체가 유래한 클론명으로 표기함)， 대표적으로 DO의 센소그램을 도 1에 나타내었다.
【표 111
Figure imgf000036_0001
DA27 Human DR5 1.17 X 10^06 2.24 Χ1(Γ-6 1.92 XIC 一 12
DA28 Human DR5 1.16 ΧΚΓ06 4.52 X10"-6 3.89 ΧΚΓ— 12
DA29 Human DR5 1.21 ΧΚΓ06 8.47 ΧΚΓ—5 6.98 Χ1(Γ-11
DA30 Human DR5 1.03 Χ10Λ06 7.97 Χ Γ-5 7.74 XICT— 11
DA31 Human DR5 1.24 X 10^06 8.79 ΧΚΓ-5 7.06 ΧΚΓ-11
DA32 Human DR5 1.14 ΧΚΓ06 8.59 Xl(r-5 7.51 ΧΚΓ-11
DA33 Human DR5 1.24 Χ1(Γ06 9.77 ΧΚΓ-5 7.88 XlC —ll
DA34 Human DR5 1.00 ΧΚΓ06 9.50 Χ1(Γ-5 9.42 Χ1(Γ-11
DA35 Human DR5 1.13 Χ10Λ06 9.12 ΧΚΓ-05 8.01 ΧΚΓ-11 실시예 7. 인간 DR5에 대한 항체의 결합력 분석
본 발명의 항체의 인간 DR5에 대한 결합력을 효소면역측정법을 이용하여 확인하였다. 10ng/ml 농도의 인간 DR5 단백질을 96웰 면역 플레이트 (Nunc, 미국)에 웰 당 150ul씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 흡착시켰다. 완충 용액으로 3회 세척한 후， 순차적으로 희석한 일정 농도 (0.1~2000ng/ml)의 항체를 웰 당 150uL씩.. 처리하고 상은에서 1시간 내지 2시간 동안 반응시켰다. 완충 용액으로 세척 후， HRP( horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 항 -인간 면역글로불린 Fc에 대한 항체 (Serotec, 미국)를 1:20, 000으로 희석하여 웰 당 150 uL씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 세척 후 ΤΜΒ(3,3'，5,5'- Tetramethylbenzidine; Sigma, 미국) 용액을 웰 당 lOOuL씩 넣,고 3분 내지 10분 정도 발색시켰다. 반웅이 일정 수준이 도달하면 1N 황산 (¾S04)용액으로 반응을 종결시켰다. 분광 광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 450 围에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 2a 내지 도 2f에 나타내었다. 본 시험에서 특허 PCT—US2006— 03577 (W02006— 083971)에 명시된 항ᅳ DR5 항체 서열을 이용하여 합성한 항체 AP를 대조 항체로 이용하였다. 도 2a 내지 도 2f에서 확인되는 바와 같이， 항체 D0 및 DA1 내지 DA35는 대조 항체 AP 대비 항원 결합력이 높게 관찰되었다. 실시예 8. 물리화학적 특성 분석
[8-1] 항체 크기 확인
본 발명에 따른 항체의 크기를 SDS-PAGE 를 이용하여 분석하였다. NuPAGE 4-12% Bis—Tris 젤 (Invitrogen, 미국)을 이용하였다. 상기 제조된 항 DR5 항체 (DO , DAI , DA4, DA16 , DA 18 , DA20 , DA23 , DA26 , 및 DA29)에 DTTC lnvi trogen, 미국)를 처리하여 이황화 결합을 제거한 환원 조건과 DTT를 처리하지 않은 비 환원 조건에서 각각 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행하여 전체 항체의 경쇄와 중쇄의 존재를 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 각각 도 3a (비환원 조건하에서의 결과) 및 도 3b (환원 조건 하에서의 결과)에 나타내었다. 도 3a에서 보여지는 바와 같이, 비환원 조건 (Non— Reduced condi t ion)에서 분석한 검체는 98kDa 사이즈 마커와 188kDa 사이즈 마커 사이 위치에서 항체 전체 크기에 해당되는 밴드의 존재가 확인되었다 . 또한 , 도 3b에서 보여지는 바와 같이 , 환원 조건 (Reduced Condi t ion)의 검체는 49 kDa 사이즈 마커와 28 kDa 사이즈 마커 부근에서 각각 항체의 중쇄와 경쇄에 해당하는 2개의 밴드가 확인 되었다. 이와 같이 SDS—폴리아크릴아미드젤 전기영동 분석을 통해 전체 항체와 항체의 중쇄 및 경쇄에 해당되는 밴드를 확인하였다. [8-2] 항체 순도 확인
TSKgel G3000SWxl 컬럼 (Tosoh, 일본)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (si ze exclusion chromatography, SEC)로 항체의 순도 및 응집체 (불순물의 한 종류로 soluble aggregate를 지칭함)를 분석하여， 그 결과를 도 4a (대조항체 AP) , 도 4b (DO) , 도 4c (DAI) , 도 4d (DA4) , 도 4e (DA15) , 도 4f (DA23) , 도 4g (DA26) , 및 도 4h (DA29)에 각각 나타내었다. lOOmM 인산 완층액 (pH 6.6)을 이동상으로 하여 등용매 용리 방법으로 분리하고 흡광도 280nm에서 분석하였을 때, 단량체의 피크 면적이 전체 피크면적의 94% 이상을 차지하였으며， 응집체 피크의 비율은 6% 미만으로, 대체적으로 94% 이상의 높은 순도를 나타내었다 실시예 9. 항체의 약동력학 (Pharmacokinet ics)
상기 제조된 항체의 생체 내 동태를 알아보기 위해 마우스 혈중 반감기를 평가하였다. 항체를 누드 마우스의 정맥을 통해 l~10mg/kg로 투여하고 투여 시작 시점을 기준으로 주사 후 5분에서 14일까지 안와 정맥 채혈을 수행하였다. 채혈은 해파린이 처리된 모세관을 사용하여 수행하였다. 채취한 혈액에서 원심 분리하여 획득된 혈장 (Pl asma)을 일정 농도로 희석하여 ELISA용 샘플로 사용하였다. 10ng/ml의 농도로 희석한 인간 DR5 lOOul를 96웰 면역 플레이트 (Nunc , 미국)에 넣고， 넁장에서 12시간 내지 14시간 동안 흡착시켰다. 0.1% Tween20이 포함된 완층용액으로 3회 세척한 후， 우 혈청 알부민 (Sigma, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반웅시켰다. 완충용액으로 3회 세척하고 희석된 각 마우스 혈장 시료와 순차적 희석된 표준 물질을 처리한 다음 2시간 내지 3시간 동안 상온에서 결합시켰다. 완충용액으로 3회 세척하고 HRP가 부착된 항 -인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체 (Bethyl, 미국)를 1:20000으로 희석하여 웰당 100 uL씩 넣고 상온에서 1시간 결합시켰다. 3희 세척한 후, TMB(Sigma, 미국) 용액을 각 웰당 100 uL씩 넣고 반응시켰다. 반웅이 일정한 수준에 도달하면 0.2N. 황산용액을 이용하여 반웅을 종결한 후, 분광 광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 Optical Density(OD) 값을 기반으로 각 혈장 시료내 항체의 농도를 계산하였고 원놀린 (Winnonlin ver . 6.2.0.495)을 이용하여 약동학적 지표값을 산출하여 그 결과를 도 5 및 하기의 표 12에 나타내었다.
【표 12】
Figure imgf000039_0001
및■ DA23) 모두 시험에 사용된 마우스에서 6.68일 내지 8.37일의 혈중 반감기를 나타내었다. 실시예 10· 항체의 종양 세포 사멸 활성 확인
상기 제조된 항체의 생물학적 활성을 시험관 내 세포 사멸 분석법을 이용하여 결정하였다. 상기 시험에는 인간 대장암 세포주 Colo205 (ATCC, 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국)， 인간 폐암 세포주 H2122(ATCC, 미국)를 이용하였다.
각각의 종양 세포를 ι*ΐ(Γ5 cells/ml 농도가 되도록 현탁하여 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50ul의 부피로 분주하고 정온 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 일정한 농도 (0.06~66,0(X)pM)의 항체를 단독으로 처리 (Ab alone)하거나 가교결합 항체 (항—인간 FcKSerotec, 미국)와 흔합하여 처리 (Ab linked)하였다. 48시간 동안 배양한 후에 웰 당 lOul의 리자주린 용액 (Invitrogen, 미국)을 넣고 1시간 내지 2시간 동안 정온 습식 배양기에서 반응시켰다. 반웅 후, 분광 광도계 (Molecular Device)를 사용하여 590 nm에서 방출되는 형광을 판독하였다. 배양 배지 처리군의 상대적 형광 값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광 값 (treated RFU)의 백분율로 계산되는 웰 당 상대적 세포 생존율 (Cell viability (%) = treated RFU/ Untreated RFU x 100)을 수치화하여, 그 결과를 도 6a 내지 도 6ιᅳ에 나타내었다. 비교를 위하여, 대조 항체 AP에 대하여 상기와 동일한 시험을 수행하였다.
도 6a 내지 도 6r에서 나타낸 바와 같이， 상기 제작된 항체들은 시험된 3 종의 인간 암 세포주에서 모두에서 우수한 세포 사멸 활성을 나타내었다. 실시예 11. 이종이식 동물모델에서 항 종양 활성 평가
인간 암 세포주를 이식한 누드 마우스에 항체를 투여하여 항 종양 활성을 평가하였다. 항 -DR5 . 인간 암 세포주로는 인간 폐암 세포주 H2122(ATCC, 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국)를 이용하였다. 종양 세포 2~5백만개를 6~8주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스 (오리엔트바이오)의 측면 피하에 이식하고 캘리퍼스를 사용하여 종양의 부피를 측정하였다. 종양의 평균 부피가 100 내지 300 誦 3에 도달했을 때 군을 분리한 후 분리된 군에 따라 상기 제작된 항체 (대조 항체 AP 및 D0 항체)를 투여하였다. 항체 투여는 군 분리 당일부터 28일 내지 50일 동안 0.05~2mg/kg의 용량으로 주 1희 간격으로 총 3회 (투여 개시 당일, 7일 및 14일 후) 복강 내 주사하였으며，. 투여 개시 후 28일 내지 50일까지 주 2회 종양의 부피를 측정하였다. 음성 대조군은 완충 용액 (PBS)를 투여하였다.
상기 얻어진 결과를 도 7a (H2122 이식 마우스 결과) 및 7 b (Miapaca-2 이식 마우스 결과)에 나타내었다. 도 7a 및 도 7b에 제시된 바와 같이, D0 항체가 대조 항체 AP보다 우수한 종양 억제 활성을 나타냄을 확인하였다. 실시예 12. TRAIL 비경쟁적 결합 확인
상기 실시예 3에서 선별된 항체의 항원 결합 특성을 확인하기 위하여 TRAIL을 이용한 경쟁적 효소면역측정법을 진행하였다. ELISA 플레이트에 인간 DR5 (R&D systems, 미국) 0. lug/ml을 4°C에서 코팅한 후, 0.01 nM ~ 1440 nM의 항체 (DO, DA20, DA21, DA21, DA22, 및 0八23)를 0.01~400^의 TRAIL 단백질과 함께 플레이트에 2시간 동안 반웅시켰다. PBST(0.1% 우 혈청 알부민, tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후， HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항 -인간 면역글로블린 Fc을 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS (Thermo, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 반응이 일정 수준에 도달하면 1N 황산 용액으로 반웅을 종결하였다. 분광광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 405 讓에서의 측정된 흡광도를 도 8a 및 도 8b 에 나타내었다. 대조 항체로는 실시예 (7-1)에 명시된 항체 AP를 사용하였다.
도 8a 및 도 8b에서 TRAIL 농도 의존적으로 항원 결합이 감소한 대조 항체 AP와 달리 DO, DA20, DA21, DA21, DA22, 및 DA23 항체들은 TRAIL 농.도와 상관없이 일정 수준의 항원 결합을 유지하는 것으로 보아, TRAIL과 비경쟁적으로 결합함을 알 수 있었다. 실시예 13. 항체의 TRAIL 병용효과 확인
항원 결합 부위에 따른 항체의 특성을 분석하기 위해， 상기 제작된 항체와 TRAIL 단백질을 병용 처리했을 때의 세포 사멸 활성을 분석하였다. 시험에는 인간 대장암 세포주 Colo205 (ATCC, 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2 (ATCC, 미국)을 사용하였다. 1*1CT5 eel ls/ml로 현탁된 종양 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50 ul씩 분주한 뒤， 정온 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 순차적 농도 (0.1~10000 ng/ml)로 희석한 항체와 일정 농도 (0.5， 1, 10 ng/mi)의 TRAIL 단백질을 96웰 플레이트에 조합 처리하였다. 48시간 내지 72시간 동안 정온 습식 배양한 후에 웰 당 lOul의 리자주린 용액 (Invitrogen, 미국)을 넣고 1시간 내지 2시간 동안 반응시켰다. 반웅이 일정 수준에 도달하면 분광 광도계 (Molecular Device)를 사용하여 590 nm에서 방출되는 형광올 판독하였다. 배양 배지 처리군의 상대적 형광 값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광 값 (treated RFU)의 백분율로 계산되는 웰 당 상대적 세포 생존율 (Cell viability (%) = treated RFU/ Untreated RFU x 100)을 수치화하였다.
그 중 대표적인 결과를 도 9a (Colo205 결과) 및 도 9b (Miapaca-2 결과)에 나타내았다. 대조 항체로는 전술한 항체 AP를 사용하였다. 이는 대조 항체 AP가 TRAIL과 유사한 항원 결합 부위를 갖는 것을 제시한 문헌 (Cell Death and Differentiation, 15， 751-761， 2008)을 근거로 한다.
도 9a 및 에 나타난 바와 같이, lOng/tnl 정도의 저농도의 DO 항체 또는 DA23를 일정 농도의 TRAIL과 함께 처리하였을 때， 각 물질을 단독 사용했을 때와 비교하여 세포 사멸 활성이 증가되어 항체와 TRAIL의 병용효과가 관찰되었으나， 대조 항체 AP의 경우， 활성이 증가가 관찰되지 않았다. 실시예 14. 세포 내 caspase 활성 분석
상기 제작된 항체의 세포 사멸 기전을 규명하기 위하여 caspase 활성을 측정하였다. Caspase-3/7의 활성을 측정하기 위하여 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit (Promega, 미국)을 이용하였다. 시험에는 인간 대장암 세포주 Co 1 o205(ATCC 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국) , 및 인간 폐암 세포주 H2122(ATCC, 미국)를 이용하였다. 1*10Λ5 eel ls/ml로 현탁한 각각의 종양 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50ul씩 분주한 뒤, 정은 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다.. 일정한 농도 (0.01~10000ng /ml)의 항체를 단독으로 처리하거나 (Ab alone) 가교결합 항체 (항ᅳ인간 Fc)(Serotec, 미국)와 흔합하여 처리 (Ab linked)한 후 4시간 동안 배양하였다. 웰 당 lOOul의 Apo-ONE® Caspase-3/7 Reagent (Promega, 미국)을 처리하고 3시간 내지 16시간 동안 정온 습식 배양기에서 반응시켰다. 반웅이 일정 수준에 도달했을 때, 분광 광도계 (Molecular Device)를 사용하여 520 画에서 방출되는 형광을 판독하였다. 배양 배지 처리군의 형광 값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광 값 (treated RFU)의 배수 (Fold)로 웰 당 상대적 . Caspase act ivity(Caspase ■ RFU/Untreated RFU)을 수치화하였다.
대표적인 결과를 도 10a (Colo205 결과), 도 10b (H2122 결과)， 및 도 10c(Miapaca-2 결과) 에 나타내었다. 대조 항체로는 전술한 항체 AP을 동일한 방식으로 처리하였다.
도 10a 내지 도 10c에 나타난 바와 같이, 항체 D0 또는 DA29를 암 세포주에 처리하였을 때， Casapse-3/7의 활성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 항체의 세포사멸기전에 apoptosis가 관여되어 있음을 확인할 수 있었다. 실시예 15. 항체 -약물 병용효과
상기 제작된 항체와 젬시타빈을 병용하여 처리하였을 ·때의 효과를 시험관 내 종양 세포 사멸 분석법으로 결정하였다. 본 시험은 췌장암 세포에 젬시타빈과 항 -DR5 항체를 병용 처리했을 때 종양 세포 사멸과 caspase의 활성이 증가됨을 제시한 문헌 (J Gastrointest Surg. 2006 Nov; 10(9) :1291-300)을 근거로 한다.
인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국)와 Panc-1(ATCC, 미국)을 각각 1*1(Γ5 eel ls/ml로 현탁하여 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50ul의 세포 현탁액을 넣고 정온 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 본 발명의 항체 DO를 포함한 항 -DR5 항체를 일정 농도 (3nM~300nM)의 젬시타빈과 함께 암 세포주에 처리한 후， 48시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 웰 당 lOul의 리자주린 용액 (Invitrogen, 미국)을 넣고 1시간 내지 3시간 동안 배양기에서 반웅시켰다. 반웅이 일정 수준에 도달했을 때， 분광 광도계 (Molecular Device) 사용하여 590 nm에서 방출하는 형광을 판독하였다. 배양 배지 처리군의 상대적 형광값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광값 (treated RFU)의 백분율로 계산되는 웰 당 상대적 세포 생존율 (Cell viability (%) - treated RFU/ Untreated RFU x 100)을 수치화하여， 그 대표적인 결과를 도 11a (Miapaca-2 결괴-) 및 도 lib (Panc-1 결과)에 나타내었다. 대조 물질로 전술한 항체 AP도 동일한 방식으로 처리하였다. 도 11a 및 도 lib에 나타난 바와 같이， 항체 D0 또는 DA29를 젬시타빈과 함께 투여하였을 때, 각 물질을 단독 사용했을 때 대비 세포 사멸 활성이 증가 됨을 알 수 있었다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며， 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

.【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타ᄋ 드 (VH-CDR1),
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타ᄋ 드 (VH-CDR2),
서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타 o 드 (VH— CDR3),
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타 0 드 (VL-CDR1),
서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타 0 드 (VL— CDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타ᄋ 드 (VL— CDR3)
를 포함하는， 항 -DR5 (death receptor 5) 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 (Vi厂 CDR3)는 서열번호 7, 서열번호 8: 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 3】
저 U항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 (VL-CDR2)는 서열번호 10， 서열번호 11， 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 (VL— CDR3)는 서열번호 13， 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 항ᅳ DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노사 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 38 내지 서열번호 49로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것인， 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 6】
제 1항에 있어서, 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 DR5를 발현하는 TRAIL(TNF-related apoptosi s- inducing ligand)-민감성 암세포 또는 DR5를 발현하는 TRAIL-저항성 암세포의 세포사멸을 유도하는 활성을 갖는 것인, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 항 -DR5 항체는 단클론 항체인 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 8】
제 1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 -DR5 항체의 scFv , ( scFv)2 , Fab , Fab ' 및 F(ab ' )2로 이루어진 군에서 선택되는 것인， 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 9】
제 1항에 있어서， 상기 항 -DR5 항체는 마우스 유래.항체 마우스 -인간 키메릭 항체, 인간화 항체， 또는 인간 항체인， 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 10】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는， 암의 예방 또는.치료용 약학 조성물.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 암은 혈액암, 폐암, 위암, 간암， 골암， 췌장암， 피부암, 두경부암, 피부 혹색종, 자궁암, 난소암， 직장암, 대장암, 결장암, 유방암， 자궁 육종 나팔관 암종， 자궁내막 암종， 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종， 식도암, 후두암, 소장암， 갑상선암， 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음켱암， 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병， 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양， 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인， 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물. '
【청구항 12]
제 10항에 있어서, 상기 조성물은 TRAIL (TNF— re l ated apoptos i s- i nduc ing l i gand)을 추가로 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 13】
제 12항에 있어서, 상기 조성물은 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 TRAIL를 각각 별개의 제형으로 포함하거나 하나의 제형에 함께 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 14】
제 10항에 있어서, 상기 조성물은 알킬화 항암제， 대시 · 길항성 항암제, 안트라사이클린계 항암제 및 프로테아좀 억제제성 항암제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 항암제를 추가로 포함하는 것인， 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 15】
제 14항에 있어서， 상기 항암제는 카보플라틴 (Carbopl at in) , 파클리탁셀 (Pac l i taxel ) , 젬시타빈 (Gemci tabin)， 독소루비신 (Doxorubi c in) 및 보테조밉 (Bortezonu b) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 16】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 항一 DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
【청구항 17】
제 16항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 백터.
【청구항 18】
제 17항의 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포.
【청구항 19】
제 16항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는 단계를 포함하는, 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 .
【청구항 20】
저 U항의 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물.
【청구항 21】
제 1항의 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 22】
제 21항에 있어서， 상기 암은 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암 췌장암, 피부암， 두경부암, 피부 혹색종， 자궁암, 난소암， 직장암, 대장암 결장암, 유방암, 자궁 육종， 나팔관 암종, 자궁내막 암종， 자궁경부 암종 질 암종， 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암 연조직의 육종, 요도암， 음경암, 전립선암， 만성 또는 급성 백혈병 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종， 제 1 중추신경계 림프종， 척수축 종양， 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
【청구항 23】
제 21항에 있어서， 상기 개체에게 TRAIL (TNF-related apoptosis- inducing ligand)을 투여하는 단계를 추가로 포함하는， 방법.
【청구항 24]
제 21항에 있어서, 상기 개체에게 알킬화 항암제， 대시^ 길항성 항암제， 안트라사이클린계 항암제 및 프로테아좀 억제제성 항암제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법 ·
【청구항 25]
제 24항에 있어서, 상기 항암제는 카보플라틴 (Carboplatin), 파클리탁셀 (PacHtaxel), 젬시타빈 (Gemci tabin)， 독소루비신 (Doxorubicin) 및 보테조빕 (Bortezomib) 으로 이루어친 군에서 선택된 1종 이상인， 방법.
【청구항 26】
제 23항에 있어서， 상기 개체에게 알킬화 항암제， 대시" 길항성 항암제， 안트라사이클린계 항암제 및 프로테아좀 억제제성 항암제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법 .
【청구항 27】
제 26항에 있어서, 상기 항암제는 카보플라틴 (Carboplatin), 파클리탁셀 (Paclitaxel), 잼시타빈 (Gemci tabin)， 독소루비신 (Doxorubicin) 및 보테조밉 (Bortezomib) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 , 방법 .
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