CN110632220A - 一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，在烟草样品中加入内标样品后，加入溶剂进行萃取、离心、过滤后获得样品溶液；再将样品溶液采用两维液相色谱质谱联用法进行测定，通过质谱对样品溶液中的蔗糖酯成分和内标样品进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，再确定样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量。本发明进一步提供的一种多维液相色谱质谱联用分析系统及其使用方法。本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，能够有效去除烟草中影响蔗糖酯定量的干扰物质，具有准确度高、重现性好、检测限低的特点，且仪器自动化完成，适应于烟草样品的批量检测。

Description

一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法

技术领域

本发明属于烟草中化学成分分析的技术领域，涉及一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，具体涉及一种采用多维液相色谱质谱联用、中心切割分析烟草中蔗糖酯成分的相对含量的方法。

背景技术

蔗糖酯(SE)是烟草中重要的一类香味前体物质，主要存在于烟叶表面的蜡质层中，烟草中蔗糖酯成分主要包括6种，分别为蔗糖酯SE I、SE II、SE III、SE IV、SE V和SEVI。对于不同类型的烟叶，SE的含量差异较大。其中，香料烟SE含量较高，白肋烟和烤烟样品中含量较低。SE本身无特殊气味，但会燃烧裂解产生多种低级脂肪酸成分，如异丁酸、异戊酸、3-甲基丁酸等，这些成分对卷烟感官品质具有重要作用。SE在香料烟中最为丰富，烤烟中含量较低，而在白肋烟和马里兰烟中含量最低。为更好地获取烟草中SE的含量信息，揭示特色优质烟叶特点，有必要对烟草中蔗糖酯成分的相对含量进行测定。

目前SE的检测方法主要有GC-MS法和LC-MS法。GC-MS法需要衍生化处理，前处理复杂。LC-MS法无需衍生化，但仍需复杂的前处理步骤，如反复液液萃取等。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，用于解决现有技术中缺乏样品前处理简化、抗基质干扰能力强、准确度高、重现性好、检测限低的对烟草中蔗糖酯成分的相对含量进行检测的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，包括以下步骤：

1)在烟草样品中加入内标样品后，加入溶剂进行萃取、离心、过滤后获得样品溶液；

2)将样品溶液采用两维液相色谱质谱联用法(LC-LC-MS)进行测定，通过质谱对样品溶液中的蔗糖酯成分和内标样品进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，再确定样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量。

优选地，所述烟草中蔗糖酯成分为6种，其结构通式为

包括有以下成分：

蔗糖酯SE(I)(即蔗糖酯SE-1，分子式为C₂₈H₄₆O₁₅，分子量为622)，其中，R₁、R₂、R₃、R₄均为氢；

蔗糖酯SE(II)(即蔗糖酯SE-2，分子式为C₂₉H₄₈O₁₅，分子量为636，即在蔗糖酯SE-1上增加1个甲基CH₂的分子量)，其中，R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为甲基、其余为氢；

蔗糖酯SE(III)(即蔗糖酯SE-3，分子式为C₃₀H₅₀O₁₅，分子量为650，即在蔗糖酯SE-1上增加1个乙基CH₂CH₂的分子量)，其中，R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为乙基时其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任二个为甲基时其余为氢；

蔗糖酯SE(IV)(即蔗糖酯SE-4，分子式为C₃₁H₅₂O₁₅，分子量为664，即在蔗糖酯SE-1上增加1个丙基CH₂CH₂CH₂的分子量)，其中，R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为丙基时其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为乙基时除另一个为甲基外其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任三个为甲基时余下一个为氢；

蔗糖酯SE(V)(即蔗糖酯SE-5，分子式为C₃₂H₅₄O₁₅，分子量为678，即在蔗糖酯SE-1上增加1个丁基CH₂CH₂CH₂CH₂的分子量)，其中，R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为丁基时其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为丙基时除另一个为甲基外其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为乙基时除另一个为氢外其余为甲基；R₁、R₂、R₃、R₄中任二个为乙基时其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄均为甲基；

蔗糖酯SE(VI)(即蔗糖酯SE-6，分子式为C₃₃H₅₆O₁₅，分子量为692，即在蔗糖酯SE-1上增加1个戊基CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂的分子量)，其中，R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为戊基时其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为丁基时除另一个为甲基外其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为丙基时除另一个为乙基外其余为氢；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为丙基时除另一个为氢外其余为甲基；R₁、R₂、R₃、R₄中任二个为乙基时除另一个为氢外其余为甲基；R₁、R₂、R₃、R₄中任一个为乙基时其余为甲基。

优选地，步骤1)中，所述内标样品为单葵酸蔗糖酯(即SOE，分子式为C₂₂H₄₀O₁₂，分子量为496，结构式为：

)。

优选地，步骤1)中，所述烟草样品加入的质量g与内标样品加入的体积mL之比为20：5-15。更优选地，所述烟草加入的质量g与内标样品加入的体积mL之比为2：1。

优选地，步骤1)中，所述溶剂为乙腈。

优选地，步骤1)中，所述烟草样品加入的质量g与溶剂加入的体积mL之比为0.2：4-6。更优选地，所述烟草样品加入的质量g与溶剂加入的体积mL之比为0.2：5。

优选地，步骤1)中，所述超声萃取的时间为10-40min。更优选地，所述超声萃取的时间为20min。

优选地，步骤1)中，所述离心条件为：转速为1000-3000r/min；时间为5-15min。更优选地，所述离心条件为：转速为2000r/min；时间为10min。

优选地，步骤1)中，所述过滤为有机相滤膜过滤的方式。更优选地，所述有机相滤膜的孔径为0.22μm。

优选地，步骤2)中，所述两维液相色谱质谱联用法(LC-LC-MS)进行测定，是通过第一维液相色谱分离出目标组分，目标组分经补液稀释后进入捕集柱捕集，再将捕集柱捕集成分洗脱后由第二维液相色谱进行分离，通过质谱进行定性。

更优选地，所述第一维液相色谱为反相液相色谱(RPLC)，所述第一维液相色谱的测定条件为：

第一分离柱：C₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；进样量：1-10μL；流速：0.1-0.3mL/min；检测波长：205-215nm；流动相A相：含0.05-0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.05-0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱。

进一步优选地，所述第一维液相色谱的测定条件为：

第一分离柱：CAPCELL PAK MGIII C₁₈色谱柱(50mm×2.0mm)；柱温：30℃；进样量：5μL；流速：0.2mL/min；检测波长：210nm；流动相A相：含0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱。

进一步优选地，如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：

0-1min，A相：B相体积比为50：50-50：50；

1-5min，A相：B相体积比为50：50-30：70；

5-13min，A相：B相体积比为30：70-0：100；

13-25min，A相：B相体积比为0：100-0：100；

25-25.1min，A相：B相体积比为0：100-50：50；

25.1-35min，A相：B相体积比为50：50-50：50。

表1

更优选地，所述第一维液相色谱分离出目标组分采用中心切割法，获得蔗糖酯成分。

所述中心切割法为多维色谱中常用的馏分切割转移法，在本发明的二维液相色谱中，即将第一维液相色谱分离出的目标物的色谱峰所对应的洗脱液完整转移至第二维液相色谱，其它洗脱液部分不进第二维液相色谱。

更优选地，所述捕集柱的捕集条件为：

捕集柱：DIONEX Acclaim PolarAdvantageII捕集柱(4.6mm×10mm，5μm)；补偿泵流动相：纯水；柱温：25-35℃，优选为30℃；补偿泵流动相流速范围为0.1-1mL/min。

进一步优选地，所述补偿泵流动相流速设置程序(见表2)：

0-7min，保持0.1mL/min；

7-8min，由0.1mL/min改变为1mL/min；

8-16min，保持1mL/min；

16-16.5min，由1mL/min改变为0.1mL/min。

表2

更优选地，所述第二维液相色谱为反相液相色谱(RPLC)，所述第二维液相色谱的测定条件为：

第二分离柱：C₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；进样量：1-10μL；流速：0.2-0.4mL/min；检测波长：205-215nm；流动相A相：含0.05-1％甲酸的水；流动相B相：含0.05-1％甲酸的乙腈；梯度洗脱。

进一步优选地，所述第二维液相色谱的测定条件为：

第二分离柱：Agilent ZORBAX 300SB C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，3.5μm)；柱温：30℃；进样量：5μL；流速：0.3mL/min；检测波长：210nm；流动相A相：含0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.1％甲酸的乙腈；梯度洗脱。

进一步优选地，如表3所示，所述梯度洗脱的具体程序为：

0-15min，A相：B相体积比为95：5-95：5；

15-20min，A相：B相体积比为95：5-50：50；

20-30min，A相：B相体积比为50：50-35：65；

30-30.1min，A相：B相体积比为35：65-5：95；

30.1-39min，A相：B相体积比为5：95-5：95；

39-39.1min，A相：B相体积比为5：95-95：5；

39.1-40min，A相：B相体积比为95：5-95：5。

表3

更优选地，所述质谱的测定条件为：

质谱：ABI 5500三重四级杆质谱仪；电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应检测(MRM)模式；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；离子对的驻留监测时间(dwell time)：20ms；气帘气压力：20Psi；碰撞气：Medium；碰撞池出口电压(CXP)：13V；质谱扫描时间：18-30min；MRM的测定参数见表4。

表4

优选地，步骤2)中，所述标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，包括以下步骤：

A)将一系列不同体积的内标样品加入溶剂稀释后定容，配制成一系列不同浓度的内标溶液，分别进行LC-LC-MS分析，获得内标溶液中内标样品的色谱峰面积与相应内标样品的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到内标样品的标准工作曲线的回归方程；

B)将样品溶液进行LC-LC-MS分析，将获得的样品溶液中内标样品的色谱峰面积代入步骤A)中内标样品的标准工作曲线的回归方程，并根据内标溶液中内标样品的已知浓度，计算得到样品溶液中内标样品的含量。

更优选地，步骤A)或B)中，所述标准工作曲线中，以内标样品的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应内标样品的浓度为横坐标(X轴)。

优选地，步骤2)中，所述样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量，是根据LC-LC-MS分析获得的样品溶液中蔗糖酯成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的内标样品的标准工作曲线中，计算得到样品溶液中蔗糖酯成分的相对含量。

本发明第二方面提供一种多维液相色谱质谱联用分析系统，包括第一维液相色谱、补偿泵、连通接口、捕集柱、切换阀、第二维液相色谱、质谱，所述第一维液相色谱包括有一维泵、一维色谱柱，所述第二维液相色谱包括有二维泵、二维色谱柱；所述一维泵与一维色谱柱相连，所述二维色谱柱的出样端经管线与质谱相连，所述连通接口经管线分别与一维色谱柱的出样端、补偿泵、切换阀相连，所述切换阀还经管线分别与二维泵、二维色谱柱的进样端、捕集柱的进样端及出样端相连。

优选地，所述连通接口为三通接口，所述连通接口设有第1接口、第2接口、第3接口，所述第1接口经管线与一维色谱柱的出样端相连，所述第2接口经管线与补偿泵相连，所述第3接口经管线与切换阀相连。

优选地，所述切换阀为二位六通阀，所述切换阀设有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口经管线与捕集柱的进样端相连，所述第2接口经管线与二维泵相连，所述第3接口经管线与二维色谱柱的进样端相连，所述第4接口经管线与捕集柱的出样端相连，所述第5接口为废液口，所述第6接口经管线与连通接口相连。

优选地，所述一维泵、二维泵为常规使用的液相色谱仪的专用泵。所述一维泵、二维泵为四元泵。

所述多维液相色谱质谱联用分析系统中的第一维液相色谱、补偿泵、连通接口、捕集柱、切换阀、第二维液相色谱、质谱要相匹配。所述匹配是指上述各部件经连通后作为一个整体使用时，能够有效运行。

本发明第三方面提供一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，包括以下步骤：

a)打开第一维液相色谱，样品溶液在一维泵引入的第一流动相带动下，流入一维色谱柱进行初步分离得到目标组分，目标组分流入连通接口的第1接口，同时，通过补偿泵引入的补偿流动相流入连通接口的第2接口，使目标组分与补偿流动相混合，降低目标组分中的有机相比例；

b)打开切换阀，将步骤a)获得的目标组分经连通接口的第3接口流出后，由切换阀的第6接口进入，经切换阀的第1接口进入捕集柱中进行捕集，捕集目标组分后的废液经切换阀的第4接口，由切换阀的第5接口排出；

c)打开第二维液相色谱，将二维泵引入的第二流动相经切换阀的第2接口流入，经切换阀的第1接口进入捕集柱中将捕集的目标组分洗脱，洗脱液经切换阀的第4接口切换至第3接口流入二维色谱柱进行二次分离；

d)打开质谱，步骤c)中获得的分离液流入质谱进行测定。

如上所述，本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，以二维液相色谱为基础，搭建了2D-LC-MS/MS分析平台，采用2种不同的C18×C18色谱柱用于烟草蔗糖酯的分析，方法采用内标样品的标准曲线法，对烟草中6类蔗糖酯分别进行相对定量分析。具有以下有益效果：

(1)本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，使用2种不同的色谱柱，通过不同流动相、淋洗梯度等，对被分析样品进行二维分离，其峰容量相对一维色谱大大增加，尤其适合对复杂样品的高通量分析。

(2)本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，通过第一维液相色谱分离后中心切割，有效去除烟草中影响蔗糖酯定量的干扰物质，降低基质的干扰。

(3)本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，研究采用两维的反相液相色谱串联并有补液流路，具有系统构建简单、自动化程度高，可调节参数多的优点。

(4)本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，第一维采用甲醇/水体系，第二维采用乙腈/水体系，有效地实现二维流动相的转换和目标物的转移。

(5)本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，针对烟草样品类型多、数量多，检测工作量大的特点，对复杂的前处理步骤进行优化，大大减轻了烟草分析检测人员的负担，且自动化程度高、抗基质干扰能力强，对不同类型的烟草样品检测结果表明，方法适用于不同基质样品、大批量样品的日常检测。

(6)本发明提供的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，具有准确度高、重现性好、检测限低的特点，且仪器自动化完成，适于大批量样品的日常检测。

附图说明

图1显示为本发明中一种多维液相色谱质谱联用分析系统的捕集模式下结构示意图，其中，

11：一维泵

12：一维色谱柱

2：补偿泵

3：连通接口

31：连通接口第1接口

32：连通接口第2接口

33：连通接口第3接口

4：捕集柱

5：切换阀

51：切换阀第1接口

52：切换阀第2接口

53：切换阀第3接口

54：切换阀第4接口

55：切换阀第5接口

56：切换阀第6接口

61：二维泵

62：二维色谱柱

7：质谱

图2显示为本发明中单葵酸蔗糖酯的标准工作曲线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例中使用的试剂及实验用具均为常规使用的试剂及实验用具，均可从市场上购买获得。具体使用试剂和仪器如下：

1、试剂

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸乙酯(色谱纯，德国Merk公司)；单葵酸蔗糖酯(纯度≥98％，加拿大Toronto Research chemicals公司)；青烟叶由上海烟草集团有限责任公司提供。

2、仪器

液相色谱仪，配有自动进样器、四元泵、二元泵、一元泵、柱温箱、六通阀、二极管阵列检测器(美国Agilent公司)；API 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)；电子天平(精度：0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司)；SW12H超声仪(瑞士Sono Swiss公司)；RJ-LDL-50G离心机(中国瑞江分析仪器有限公司)；Milli-Q纯水仪(美国Millpore公司)。

如图1所示，本发明中采用的一种多维液相色谱质谱联用分析系统，包括第一维液相色谱、补偿泵、连通接口、捕集柱、切换阀、第二维液相色谱、质谱，所述第一维液相色谱包括有一维泵、一维色谱柱，所述第二维液相色谱包括有二维泵、二维色谱柱；所述一维泵与一维色谱柱相连，所述二维色谱柱的出样端经管线与质谱相连，所述连通接口经管线分别与一维色谱柱的出样端、补偿泵、切换阀相连，所述切换阀还经管线分别与二维泵、二维色谱柱的进样端、捕集柱的进样端及出样端相连。

在一个优选的实施例中，如图1所示，所述连通接口为三通接口，所述连通接口设有第1接口、第2接口、第3接口，所述第1接口经管线与一维色谱柱的出样端相连，所述第2接口经管线与补偿泵相连，所述第3接口经管线与切换阀相连。

在一个优选的实施例中，如图1所示，所述切换阀为二位六通阀，所述切换阀设有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口经管线与捕集柱的进样端相连，所述第2接口经管线与二维泵相连，所述第3接口经管线与二维色谱柱的进样端相连，所述第4接口经管线与捕集柱的出样端相连，所述第5接口为废液口，所述第6接口经管线与连通接口相连。

如图1所示，本发明提供一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，包括以下步骤：

a)打开第一维液相色谱，样品溶液在一维泵引入的第一流动相带动下，流入一维色谱柱进行初步分离得到目标组分，目标组分流入连通接口的第1接口，同时，通过补偿泵引入的补偿流动相流入连通接口的第2接口，使目标组分与补偿流动相混合，降低目标组分中的有机相比例；

b)打开切换阀，将步骤a)获得的目标组分经连通接口的第3接口流出后，由切换阀的第6接口进入，经切换阀的第1接口进入捕集柱中进行捕集，捕集目标组分后的废液经切换阀的第4接口，由切换阀的第5接口排出；

c)打开第二维液相色谱，将二维泵引入的第二流动相经切换阀的第2接口流入，经切换阀的第1接口进入捕集柱中将捕集的目标组分洗脱，洗脱液经切换阀的第4接口切换至第3接口流入二维色谱柱进行二次分离；

d)打开质谱，步骤c)中获得的分离液流入质谱进行测定。

在一个具体实施例中，对于一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，包括以下的检测过程。

1、样品前处理

取一定量的烟草样品，加入内标样品和乙腈进行超声萃取、离心、过0.22μm的有机相滤膜后获得样品溶液。内标样品为单葵酸蔗糖酯。烟草样品加入的质量g与内标样品加入的体积mL之比为20：5-15。烟草加入的质量g与乙腈加入的体积mL之比为0.2:4-6。超声萃取的时间为10-40min。离心条件为：转速为1000-3000r/min；时间为5-15min。

2、测定

将样品溶液采用两维液相色谱质谱联用法(LC-LC-MS)进行测定，通过质谱对样品溶液中的蔗糖酯成分和内标样品进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，再确定样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量。

其中，两维液相色谱质谱联用法(LC-LC-MS)进行测定，是通过第一维液相色谱分离出目标组分，目标组分经补液稀释后进入捕集柱捕集，再将捕集柱捕集成分洗脱后由第二维液相色谱进行分离，通过质谱进行定性。

具体来说，第一维液相色谱为反相液相色谱(RPLC)，第一维液相色谱的测定条件为：

第一分离柱：C₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；进样量：1-10μL；流速：0.1-0.3mL/min；检测波长：205-215nm；流动相A相：含0.05-0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.05-0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱。

如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：

0-1min，A相：B相体积比为50：50-50：50；

1-5min，A相：B相体积比为50：50-30：70；

5-13min，A相：B相体积比为30：70-0：100；

13-25min，A相：B相体积比为0：100-0：100；

25-25.1min，A相：B相体积比为0：100-50：50；

25.1-35min，A相：B相体积比为50：50-50：50。

捕集柱的捕集条件为：

捕集柱：DIONEX Acclaim PolarAdvantageII捕集柱(4.6mm×10mm，5μm)；补偿泵流动相：纯水；柱温：25-35℃；补偿泵流动相流速范围为0.1-1mL/min。

补偿泵流动相流速设置程序(见表2)：

0-7min，保持0.1mL/min；

7-8min，由0.1mL/min改变为1mL/min；

8-16min，保持1mL/min；

16-16.5min，由1mL/min改变为0.1mL/min。

第二维液相色谱为反相液相色谱(RPLC)，第二维液相色谱的测定条件为：

第二分离柱：C₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；进样量：1-10μL；流速：0.2-0.4mL/min；检测波长：205-215nm；流动相A相：含0.05-1％甲酸的水；流动相B相：含0.05-1％甲酸的乙腈；梯度洗脱。

如表3所示，梯度洗脱的具体程序为：

0-15min，A相：B相体积比为95：5-95：5；

15-20min，A相：B相体积比为95：5-50：50；

20-30min，A相：B相体积比为50：50-35：65；

30-30.1min，A相：B相体积比为35：65-5：95；

30.1-39min，A相：B相体积比为5：95-5：95；

39-39.1min，A相：B相体积比为5：95-95：5；

39.1-40min，A相：B相体积比为95：5-95：5。

质谱的测定条件为：

质谱：ABI 5500三重四级杆质谱仪；电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应检测(MRM)模式；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；离子对的驻留监测时间(dwell time)：20ms；气帘气压力：20Psi；碰撞气：Medium；碰撞池出口电压(CXP)：13V；质谱扫描时间：18-30min；MRM的测定参数见表4。

其中，标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，是将一系列不同体积的内标样品加入溶剂稀释后定容，配制成一系列不同浓度的内标溶液，分别进行LC-LC-MS分析，获得内标溶液中内标样品的色谱峰面积与相应内标样品的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到内标样品的标准工作曲线的回归方程。然后将样品溶液进行LC-LC-MS分析，将获得的样品溶液中内标样品的色谱峰面积代入内标样品的标准工作曲线的回归方程，并根据内标溶液中内标样品的已知浓度，计算得到样品溶液中内标样品的含量。所述标准工作曲线中，以内标样品的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应内标样品的浓度为横坐标(X轴)。

其中，样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量，是根据LC-LC-MS分析获得的样品溶液中蔗糖酯成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的内标样品的标准工作曲线中，计算得到样品溶液中蔗糖酯成分的相对含量。

实施例1

1、样品前处理

取0.2g的烟草样品，加入0.1mL内标样品和5mL乙腈进行超声萃取20min，在转速2000r/min的条件下离心10min，过0.22μm的有机相滤膜后获得样品溶液。内标样品为单葵酸蔗糖酯。

2、测定

将样品溶液采用两维液相色谱质谱联用法(LC-LC-MS)进行测定，通过质谱对样品溶液中的蔗糖酯成分和内标样品进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，再确定样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量。

其中，两维液相色谱质谱联用法(LC-LC-MS)进行测定，是通过第一维液相色谱分离出目标组分，目标组分经补液稀释后进入捕集柱捕集，再将捕集柱捕集成分洗脱后由第二维液相色谱进行分离，通过质谱进行定性。

具体来说，第一维液相色谱为反相液相色谱(RPLC)，第一维液相色谱的测定条件为：

第一分离柱：CAPCELL PAK MGIII C₁₈色谱柱(50mm×2.0mm)；柱温：30℃；进样量：5μL；流速：0.2mL/min；检测波长：210nm；流动相A相：含0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱。所述梯度洗脱的具体程序如表1所示。

捕集柱的捕集条件为：

捕集柱：DIONEX Acclaim PolarAdvantageII捕集柱(4.6mm×10mm，5μm)；补偿泵流动相：纯水；柱温：30℃；补偿泵流动相流速范围为0.5mL/min。补偿泵流动相流速设置程序如表2所示。

第二维液相色谱为反相液相色谱(RPLC)，第二维液相色谱的测定条件为：

第二分离柱：Agilent ZORBAX 300SB C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，3.5μm)；柱温：30℃；进样量：5μL；流速：0.3mL/min；检测波长：210nm；流动相A相：含0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.1％甲酸的乙腈；梯度洗脱。所述梯度洗脱的具体程序如表3所示。

质谱的测定条件为：

质谱：ABI 5500三重四级杆质谱仪；电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应检测(MRM)模式；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；离子对的驻留监测时间(dwell time)：20ms；气帘气压力：20Psi；碰撞气：Medium；碰撞池出口电压(CXP)：13V；质谱扫描时间：18-30min；MRM的测定参数见表4。

其中，标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，是将一系列不同体积的单葵酸蔗糖酯加入乙腈稀释后定容，配制成一系列不同浓度的内标溶液，分别进行LC-LC-MS分析，获得内标溶液中内标样品的色谱峰面积与相应内标样品的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到内标样品的标准工作曲线的回归方程。然后将样品溶液进行LC-LC-MS分析，将获得的样品溶液中内标样品的色谱峰面积代入内标样品的标准工作曲线的回归方程，并根据内标溶液中内标样品的已知浓度，计算得到样品溶液中内标样品的含量。

具体来说，内标溶液中单葵酸蔗糖酯的浓度分别为25、50、100、250、500、1000ng/mL。以单葵酸蔗糖酯的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应单葵酸蔗糖酯的浓度为横坐标(X轴)。进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表5所示。由表5可知，回归方程在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数R²>0.999，方法具有良好的线性范围。

表5

化合物	线性范围(ng/mL)	回归方程	相关系数(R<sup>2</sup>)
				单葵酸蔗糖酯	0-1000	y＝103.28x+528.77	0.9991

其中，样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量，是根据LC-LC-MS分析获得的样品溶液中蔗糖酯成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的内标样品的标准工作曲线中，计算得到样品溶液中蔗糖酯成分的相对含量。

实施例2

采用蔗糖酯含量较高的香料烟进行方法的重复性考察，进行上述实施例1中步骤1的前处理，并进行上述实施例1中步骤2的LC-LC-MS分析，发现6类不同蔗糖酯和SOE，方法的重复性在10％左右，符合检测的需要，结果见表6。

表6蔗糖酯的方法重复性考察

实施例3

选取不同类型的烟草样品如青烟叶烤烟、烤后烤烟、烤后香料烟，对其进行蔗糖酯含量的测定，进行上述实施例1中步骤1的前处理，并进行上述实施例1中步骤2的LC-LC-MS分析，具体测定结果见表7。由表7可知，与烤后烤烟相比，总体而言香料烟的蔗糖酯的含量较高，尤其是STE III，STE IV，STE V。可能这类物质对香味成分的贡献是较大的。青烟叶烤烟和烤后烤烟相比STE II成分含量较高，其相对含量在总蔗糖酯中的占比也较高。

表7实际样品中蔗糖酯相对含量

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (15)

1.一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，包括以下步骤：

1)在烟草样品中加入内标样品后，加入溶剂进行萃取、离心、过滤后获得样品溶液；

2)将样品溶液采用两维液相色谱质谱联用法进行测定，通过质谱对样品溶液中的蔗糖酯成分和内标样品进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，再确定样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量。

2.根据权利要求1所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述烟草中蔗糖酯成分包括有以下成分：蔗糖酯SE-1、蔗糖酯SE-2、蔗糖酯SE-3、蔗糖酯SE-4、蔗糖酯SE-5、蔗糖酯SE-6。

3.根据权利要求1所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，步骤1)中，包括以下条件中的任一项或多项：

A1)所述内标样品为单葵酸蔗糖酯；

A2)所述烟草样品加入的质量g与内标样品加入的体积mL之比为20：5-15；

A3)所述溶剂为乙腈；

A4)所述烟草样品加入的质量g与溶剂加入的体积mL之比为0.2：4-6；

A5)所述超声萃取的时间为10-40min；

A6)所述离心条件为：转速为1000-3000r/min；时间为5-15min。

4.根据权利要求1所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，步骤2)中，所述两维液相色谱质谱联用法进行测定，是通过第一维液相色谱分离出目标组分，目标组分经补液稀释后进入捕集柱捕集，再将捕集柱捕集成分洗脱后由第二维液相色谱进行分离，通过质谱进行定性。

5.根据权利要求4所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述第一维液相色谱的测定条件为：第一分离柱：C₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；进样量：1-10μL；流速：0.1-0.3mL/min；检测波长：205-215nm；流动相A相：含0.05-0.1％甲酸的水；流动相B相：含0.05-0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱。

6.根据权利要求5所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述第一维液相色谱的梯度洗脱的具体程序为：

0-1min，A相：B相体积比为50：50-50：50；

1-5min，A相：B相体积比为50：50-30：70；

5-13min，A相：B相体积比为30：70-0：100；

13-25min，A相：B相体积比为0：100-0：100；

25-25.1min，A相：B相体积比为0：100-50：50；

25.1-35min，A相：B相体积比为50：50-50：50。

7.根据权利要求4所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述捕集柱的捕集条件为：捕集柱：DIONEX Acclaim PolarAdvantageII捕集柱，4.6mm×10mm，5μm；补偿泵流动相：纯水；柱温：25-35℃；补偿泵流动相流速范围为0.1-1mL/min。

8.根据权利要求7所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述补偿泵流动相流速设置程序为：

0-7min，保持0.1mL/min；

7-8min，由0.1mL/min改变为1mL/min；

8-16min，保持1mL/min；

16-16.5min，由1mL/min改变为0.1mL/min。

9.根据权利要求4所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述第二维液相色谱的测定条件为：第二分离柱：C₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；进样量：1-10μL；流速：0.2-0.4mL/min；检测波长：205-215nm；流动相A相：含0.05-1％甲酸的水；流动相B相：含0.05-1％甲酸的乙腈；梯度洗脱。

10.根据权利要求9所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述第二维液相色谱的梯度洗脱的具体程序为：

0-15min，A相：B相体积比为95：5-95：5；

15-20min，A相：B相体积比为95：5-50：50；

20-30min，A相：B相体积比为50：50-35：65；

30-30.1min，A相：B相体积比为35：65-5：95；

30.1-39min，A相：B相体积比为5：95-5：95；

39-39.1min，A相：B相体积比为5：95-95：5；

39.1-40min，A相：B相体积比为95：5-95：5。

11.根据权利要求4所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，所述质谱的测定条件为：质谱：ABI 5500三重四级杆质谱仪；电离方式：电喷雾离子源ESI，正离子扫描，多反应检测MRM模式；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；离子对的驻留监测时间：20ms；气帘气压力：20Psi；碰撞气：Medium；碰撞池出口电压CXP：13V；质谱扫描时间：18-30min。

12.根据权利要求1所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，步骤2)中，所述标准曲线法对样品溶液中内标样品进行定量，

A)将一系列不同体积的内标样品加入溶剂稀释后定容，配制成一系列不同浓度的内标溶液，分别进行LC-LC-MS分析，获得内标溶液中内标样品的色谱峰面积与相应内标样品的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到内标样品的标准工作曲线的回归方程；

B)将样品溶液进行LC-LC-MS分析，将获得的样品溶液中内标样品的色谱峰面积代入步骤A)中内标样品的标准工作曲线的回归方程，并根据内标溶液中内标样品的已知浓度，计算得到样品溶液中内标样品的含量。

13.根据权利要求1所述的一种多维液相色谱质谱联用分析烟草中蔗糖酯的方法，其特征在于，步骤2)中，所述样品溶液中与定量确定的内标样品结构相似的蔗糖酯成分的相对含量，是根据LC-LC-MS分析获得的样品溶液中蔗糖酯成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的内标样品的标准工作曲线中，计算得到样品溶液中蔗糖酯成分的相对含量。

14.一种多维液相色谱质谱联用分析系统，其特征在于，包括第一维液相色谱、补偿泵(2)、连通接口(3)、捕集柱(4)、切换阀(5)、第二维液相色谱、质谱(7)，所述第一维液相色谱包括有一维泵(11)、一维色谱柱(12)，所述第二维液相色谱包括有二维泵(61)、二维色谱柱(62)；所述一维泵(11)与一维色谱柱(12)相连，所述二维色谱柱(62)的出样端经管线与质谱(7)相连，所述连通接口(3)经管线分别与一维色谱柱(12)的出样端、补偿泵(2)、切换阀(5)相连，所述切换阀(5)还经管线分别与二维泵(61)、二维色谱柱(62)的进样端、捕集柱(4)的进样端及出样端相连。

15.根据权利要求14所述的一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，包括以下步骤：

a)打开第一维液相色谱，样品溶液在一维泵引入的第一流动相带动下，流入一维色谱柱进行初步分离得到目标组分，目标组分流入连通接口的第1接口，同时，通过补偿泵引入的补偿流动相流入连通接口的第2接口，使目标组分与补偿流动相混合，降低目标组分中的有机相比例；

b)打开切换阀，将步骤a)获得的目标组分经连通接口的第3接口流出后，由切换阀的第6接口进入，经切换阀的第1接口进入捕集柱中进行捕集，捕集目标组分后的废液经切换阀的第4接口，由切换阀的第5接口排出；

c)打开第二维液相色谱，将二维泵引入的第二流动相经切换阀的第2接口流入，经切换阀的第1接口进入捕集柱中将捕集的目标组分洗脱，洗脱液经切换阀的第4接口切换至第3接口流入二维色谱柱进行二次分离；

d)打开质谱，步骤c)中获得的分离液流入质谱进行测定。

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