CN110632147B - 一种高效的乳酸传感器的传感电极的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器的技术领域，更具体地，本发明提供了一种高效的乳酸传感器的传感电极及其制备方法。本发明第一方面提供一种高效的乳酸传感器的传感电极的制备方法，包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；其中，电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器的技术领域，更具体地，本发明提供了一种高效的乳酸传感器的传感电极及其制备方法。
背景技术
乳酸是一种人体代谢过程中的重要中间产物，当人体大量运动时细胞进行无氧酵解产生。若无法及时将其代谢，将会导致乳酸酸中毒，出现低血压、神志模糊、嗜睡、木僵及昏迷等症状，甚至于永久损伤。乳酸可作为反映组织缺氧一个较为敏感、可靠的指标，并有估价病人的预后的作用，有一定的实用价值。
目前检测乳酸常使用四唑盐显色法、对羟基联苯比色法、直接酶检测法等，这些方法处理样品繁琐、检测试剂昂贵、检测精度不够、测试结果受多种因素影响较大导致检测无法满足实时性、准确性的要求。因此，开发一种可以高效、快速、准确的人体乳酸检测手段是十分必要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种高效的乳酸传感器的传感电极的制备方法，包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；其中，电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于水中，超声，反应，离心，干燥。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声，干燥；
B.将氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于水中，浇注于步骤A所得材料表面，干燥；
C.取LOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，静置干燥。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，石墨烯量子点的粒径<10nm，氧化石墨烯的片径<500nm。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，处理液包括硝酸溶液、无水乙醇以及水。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，LOX蛋白酶的制备包括以下步骤：
(1)对绿色气球菌进行全基因提取，利用设计引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
(2)利用一步克隆方法对步骤(1)所得目的基因与出发载体连接构建表达载体；
(3)用宿主菌构建含有LOX基因的基因工程菌，高效表达乳酸氧化酶基因；
(4)采用镍离子柱对重组表达的乳酸氧化酶纯化后，利用浓缩管浓缩获得LOX蛋白酶。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，出发载体为pET-28a(+)，表达载体为pET-LOX。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，宿主菌为E.coli BL21。
本发明第二方面提供一种根据所述传感电极的制备方法制备得到的乳酸传感器的传感电极。
本发明的第三方面提供一种含有所述传感电极的乳酸传感器。
与现有技术相比，本发明提供的基于特定乳酸传感器的传感电极的制备方法，采用特定LOX蛋白酶固定在氧化石墨烯修饰后的电极表面。采用本方法制备的传感电极及含有该电极的传感器线性检测上限较高，响应时间较短，灵敏度、特异性较高，弥补了乳酸无法直接检测以及检测准确率低的缺陷，也为后续开发乳酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。
附图说明
图1：测试方法1对应的实施例1制备的传感电极的乳酸电流—时间响应曲线；
图2：测试方法2对应的实施例1制备的传感电极的乳酸电流—时间响应曲线；
图3：实施例1制备的传感电极的乳酸浓度—电流响应曲线；
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种高效的乳酸传感器的传感电极的制备方法，包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；其中，电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程。
在一种实施方式中，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于水中，超声，反应，离心，干燥。
优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，超声1～5h；然后将所得溶液在150～200℃下反应10～20h；再将反应所得溶液于6000～10000rpm下离心3～9h；再将其于真空烘箱中45～75℃下干燥10～20h。
更优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，超声2h；然后将所得溶液在180℃下反应14h；再将反应所得溶液于8000rpm下离心6h；再将其于真空烘箱中60℃下干燥14h。
在一种实施方式中，氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中所得溶液的浓度为0.8～2mg/mL；优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中所得溶液的浓度为1～1.5mg/mL；更优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中所得溶液的浓度为1.3mg/mL。
在一种实施方式中，石墨烯量子点的粒径<10nm，氧化石墨烯的片径<500nm；优选地，石墨烯量子点的粒径3～9nm，氧化石墨烯的片径100～400nm；更优选地，石墨烯量子点的粒径5nm，氧化石墨烯的片径250nm。
在一种实施方式中，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：(0.5～1.5)；优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：1。
在一种实施方式中，玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声，干燥；
B.将氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于水中，浇注于步骤A所得材料表面，干燥；
C.取LOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，静置干燥。
优选地，玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声1～5h，于氮气条件下干燥；
B.将石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于超纯水中，超声1～5h，然后取10～30μL浇注于步骤A所得材料表面，室温下干燥；
C.取2～10μLLOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，在2～6℃静置干燥1.5～3.5h。
更优选地，玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声3h，于氮气条件下干燥；
B.将石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于超纯水中，超声3h，然后取25μL浇注于步骤A所得材料表面，室温下干燥；
C.取5μLLOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，在4℃静置干燥2.5h。
在一种实施方式中，处理液包括硝酸溶液、无水乙醇以及水；优选地，硝酸溶液、无水乙醇以及水的体积比为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；更优选地，硝酸溶液、无水乙醇以及水的体积比为1：1：1。
在一种实施方式中，硝酸溶液的浓度为40～60％(v/v)；优选地，硝酸溶液的浓度为50％(v/v)。
在一种实施方式中，玻碳电极的直径为1～3mm，优选地，玻碳电极的直径为2mm。
在一种实施方式中，氧化铝的直径为0.02～0.5μm；优选地，氧化铝的直径为0.25μm。
在一种实施方式中，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于水中的浓度为0.5～1.5mg/mL；优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于水中的浓度为0.8～1.2mg/mL；更优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于水中的浓度为1.0mg/mL。
在一种实施方式中，LOX蛋白酶的制备包括以下步骤：
(1)对绿色气球菌进行全基因提取，利用设计引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
(2)利用一步克隆方法对步骤(1)所得目的基因与出发载体连接构建表达载体；
(3)用宿主菌构建含有LOX基因的基因工程菌，高效表达乳酸氧化酶基因；
(4)采用镍离子柱对重组表达的乳酸氧化酶纯化后，利用浓缩管浓缩获得LOX蛋白酶。
优选地，LOX蛋白酶的制备包括以下步骤：
(1)对绿色气球菌进行全基因提取，设计一对引物5’-GCGCGGCAGCCATATGATGAATAACAATGACATT-3’、5’-GGTGGTGGTGCTCGAGCTAGTATTCATAACCG-3’对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
(2)利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体连接构建表达载体；
(3)用宿主菌构建含有LOX基因的基因工程菌，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中,37℃培养3-4h,再加入50mM乳糖溶液25ul,20℃培养24h。表达出乳酸氧化酶基因；
(4)采用镍离子柱对重组表达的乳酸氧化酶纯化后，浓缩获得LOX蛋白酶。
在一种实施方式中，出发载体为pET-28a(+)，表达载体为pET-LOX。
在一种实施方式中，宿主菌为E.coli BL21，记为DE3,。
在一种实施方式中，基因工程菌为E.coli BL21，记为DE3-pET-LOX。
本发明对一步克隆试剂盒的购买厂家不做特别限制，一种实施方式中，一步克隆试剂盒购自sigma公司。
在实验制备过程中可以发现当利用特定的氧化石墨烯与石墨烯量子点可以提高对氧化电流的相应程度，可能由于利用氧化石墨烯与石墨烯量子点粒径不同，交错充分，从而实现在玻碳电极表面的细致、均匀的铺展，提高对电流的相应敏感度；此外，在进行响应时间测试过程中，发现本发明提供的特定乳酸氧化酶有利于缩短响应时间，提高所得传感器的检测效率。
本发明第二方面提供一种根据所述传感电极的制备方法制备得到的乳酸传感器的传感电极。
本发明的第三方面提供一种含有所述传感电极的乳酸传感器。
实施例1
本发明的实施例1提供一种高效的乳酸传感器的传感电极，其制备方法包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；
电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程；
氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，浓度为1.3mg/mL，超声2h；然后将所得溶液在180℃下反应14h；再将反应所得溶液于8000rpm下离心6h；再将其于真空烘箱中60℃下干燥14h；
石墨烯量子点的粒径5nm，氧化石墨烯的片径250nm，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：1；
玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声3h，于氮气条件下干燥；
B.将石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于超纯水中，其浓度为1.0mg/mL，超声3h，然后取25μL浇注于步骤A所得材料表面，室温下干燥；
C.取5μLLOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，在4℃静置干燥2.5h；
处理液包括50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇以及水，硝酸溶液、无水乙醇以及水的体积比为1：1：1；
玻碳电极的直径为2mm，氧化铝的直径为0.25μm；
所述LOX蛋白酶的制备包括以下步骤：
(1)对绿色气球菌进行全基因提取，设计一对引物5’-GCGCGGCAGCCATATGATGAATAACAATGACATT-3’、5’-GGTGGTGGTGCTCGAGCTAGTATTCATAACCG-3’对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
(2)利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体连接构建表达载体；
(3)用宿主菌构建含有LOX基因的基因工程菌，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中,37℃培养3.5h,再加入50mM乳糖溶液25ul,20℃培养24h。表达出乳酸氧化酶基因；
(4)采用镍离子柱对重组表达的乳酸氧化酶纯化后，浓缩获得LOX蛋白酶；
出发载体为pET-28a(+)，表达载体为pET-LOX；
宿主菌为E.coli BL21(DE3)，基因工程菌为E.coli BL21(DE3-pET-LOX)。
实施例2
本发明的实施例2提供一种高效的乳酸传感器的传感电极，其制备方法包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；
电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程；
氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，浓度为2mg/mL，超声5h；然后将所得溶液在200℃下反应20h；再将反应所得溶液于10000rpm下离心9h；再将其于真空烘箱中75℃下干燥20h；
石墨烯量子点的粒径9nm，氧化石墨烯的片径300nm，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：1.5；
玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声5h，于氮气条件下干燥；
B.将石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于超纯水中，其浓度为1.0mg/mL，超声5h，然后取30μL浇注于步骤A所得材料表面，室温下干燥；
C.取10μLLOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，在6℃静置干燥3.5h；
处理液包括50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇以及水，硝酸溶液、无水乙醇以及水的体积比为1：1.2：1.2；
玻碳电极的直径为3mm，氧化铝的直径为0.5μm；
所述LOX蛋白酶的制备方法同实施例1；
出发载体为pET-28a(+)，表达载体为pET-LOX；
宿主菌为E.coli BL21(DE3)，基因工程菌为E.coli BL21(DE3-pET-LOX)。
实施例3
本发明的实施例3提供一种高效的乳酸传感器的传感电极，其制备方法包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；
电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程；
氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，浓度为0.8mg/mL，超声1h；然后将所得溶液在150℃下反应10h；再将反应所得溶液于6000rpm下离心3h；再将其于真空烘箱中45℃下干燥10h；
石墨烯量子点的粒径3nm，氧化石墨烯的片径150nm，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：0.5；
玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声1h，于氮气条件下干燥；
B.将石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于超纯水中，其浓度为1.0mg/mL，超声1h，然后取10μL浇注于步骤A所得材料表面，室温下干燥；
C.取2μLLOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，在2℃静置干燥1.5h；
处理液包括50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇以及水，硝酸溶液、无水乙醇以及水的体积比为1：0.8：0.8；
玻碳电极的直径为1mm，氧化铝的直径为0.1μm；
所述LOX蛋白酶的制备方法同实施例1；
出发载体为pET-28a(+)，表达载体为pET-LOX；
宿主菌为E.coli BL21(DE3)，基因工程菌为E.coli BL21(DE3-pET-LOX)。
实施例4
本发明的实施例4提供一种高效的乳酸传感器的传感电极，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，氧化石墨烯与石墨烯量子点含量均为0。
实施例5
本发明的实施例5提供一种高效的乳酸传感器的传感电极，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，LOX蛋白酶为市购，购自sigma公司。
性能评估：
1.以纯水为溶剂分别配置1mol/L的NaCl、KCl、葡萄糖、尿素、乳酸溶液，然后分别将实施例1～4所得电极接入电化学工作站扫描IT图，待基线平稳后，将配置好的乳酸溶液25uL加入反应池中，待其电流响应平稳后将其余溶液依次加入25uL溶液至检测池中，反应50s，观察电流变化。最后再加入25uL乳酸溶液验证响应效果的重复性；读取每种溶液加入后的电流值变化。
实施例1～3所得乳酸氧化酶电极只对乳酸溶液有较为明显的电流响应，证明该乳酸传感器对只对乳酸溶液有响应，有良好的抗干扰性，如图1所示；而实施例4所得电极在实验过程中没有发现明显的氧化峰电流。
2.响应时间测试：A.以纯水为溶剂分别配置1mol/L的乳酸溶液，然后将实施例1所得电极接入电化学工作站扫描IT图，待基线平稳；B.将配置好的乳酸溶液25uL加入反应池中，待其平稳后记录响应时间；C.重复B步骤，计算响应时间平均值；如图2所示，响应时间平均值为6s。证明该乳酸传感器具有响应时间短、快速高效的特点；
利用实施例5所得电极材料重复上述操作，发现所得响应时间平均值为35s，说明含有本发明提供的传感电极的传感器具有响应时间短、快速高效的特点。
3.传感器准确性测试：A.在大肠杆菌发酵液(LB培养基)中加入定量乳酸溶液制备模拟检测液，乳酸浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM；B.将实施例1所得电极接入电化学工作站扫描IT图；C.待基线平稳后，将上述乳酸溶液5uL加入反应池中，待其平稳后记录响应时间；D.重复C步骤，计算响应时间平均值；
计算其理论响应电流,根据响应电流平均值计算相对误差,其相对误差为:模拟检测液在0.1mM时,相对误差为0.3％；模拟检测液在0.2mM时,相对误差为1.4％；模拟检测液在0.3mM时,相对误差为0.7％；模拟检测液在0.4mM时,相对误差为4.5％；证明该乳酸传感器具有准确性高的特点。
4.传感器线性范围测试：A.以纯水为溶剂分别配置1mol/L的乳酸溶液，然后将实施例1所得电极接入电化学工作站扫描IT图，待基线平稳；B.将配置好的乳酸溶液5uL加入反应池中待其平稳；C.重复B步骤数次；D.计算每次响应电流大小,找出响应值相同的最大限,计算其终浓度及线性范围。线性范围为0.1-0.8mM,线性公式为Y＝0.98667X+0.01667,R2＝0.99。
Claims (8)
1.一种高效的乳酸传感器的传感电极的制备方法，其特征在于，包括LOX蛋白酶的制备以及电极材料的制备过程；其中，电极材料的制备过程包括氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备过程以及玻碳电极的处理过程；
石墨烯量子点的粒径<10nm，氧化石墨烯的片径<500nm；
氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，超声1～5h；然后将所得溶液在150～200℃下反应10～20h；再将反应所得溶液于6000～10000rpm下离心3～9h；再将其于真空烘箱中45～75℃下干燥10～20h；
玻碳电极的处理过程包括以下步骤：
A.利用氧化铝抛光处理玻碳电极，得到镜面的玻碳电极，并将其利用处理液进行超声，干燥；
B.将氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料溶于水中，浇注于步骤A所得材料表面，干燥；
C.取LOX蛋白酶滴加于步骤B所得材料表面，静置干燥。
2.根据权利要求1所述传感电极的制备方法，其特征在于，氧化石墨烯与石墨烯量子点复合材料的制备为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于水中，超声，反应，离心，干燥。
3.根据权利要求1所述传感电极的制备方法，其特征在于，处理液包括硝酸溶液、无水乙醇以及水。
4.根据权利要求1～3任一项所述传感电极的制备方法，其特征在于，LOX蛋白酶的制备包括以下步骤：
(1)对绿色气球菌进行全基因提取，利用设计引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
(2)利用克隆方法对步骤(1)所得目的基因与出发载体连接构建表达载体；
(3)用宿主菌构建含有LOX基因的基因工程菌，高效表达乳酸氧化酶基因；
(4)采用镍离子柱对重组表达的乳酸氧化酶纯化后，浓缩获得LOX蛋白酶。
5.根据权利要求4所述传感电极的制备方法，其特征在于，出发载体为pET-28a(+)，表达载体为pET-LOX。
6.根据权利要求4所述传感电极的制备方法，其特征在于，宿主菌为E.coliBL21。
7.一种根据权利要求1～6任一项所述传感电极的制备方法制备得到的乳酸传感器的传感电极。
8.一种含有如权利要求7所述传感电极的乳酸传感器。
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