CN110606889B - 一种牛骨中胶原蛋白的提取方法 - Google Patents

一种牛骨中胶原蛋白的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及牛骨提取技术领域，具体涉及一种牛骨中胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：S1破碎；S2速冻；S3解冻；S4脱脂脱钙；S5变频电解：将牛骨粉置于氨基酸溶液，在电流密度为15‑25A/cm2的条件下变频电解20‑25min，静置后，加入改性壳聚糖，在30‑40℃的条件下搅拌10‑20min，然后置于转速为4000‑6000r/min的离心机中离心8‑15min，取上清液浓缩3‑5倍，冷冻干燥即得胶原蛋白；采用本发明方法提取牛骨中胶原蛋白，具有提取率高、胶原热稳定性优、透明度高，且还防止了牛骨中氨基酸、多糖等成分被破坏。

Description

一种牛骨中胶原蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及牛骨提取技术领域，具体涉及一种牛骨中胶原蛋白的提取方法。
背景技术
牛骨是牛副产物的一种，占到动物总体重20％～30％，主要由骨质、骨膜和骨髓构成，其中含有丰富的蛋白质、脂肪、软骨素，还含有钙、铁、磷、锌等矿物质及维生素等。
胶原蛋白是以三股螺旋结构聚合而成的纤维状蛋白质，是生物体重要的结构蛋白，具有支撑器官、保护机体的作用，在保健品、生物药品、化妆品及食品行业中都有着广泛的应用。因此，对牛骨胶原的提取及深加工已成为近几年的研究热点。专利号CN201310406154.6公开了一种从牦牛骨中提取复合骨胶原的加工工艺，该专利有效将耗牛骨中的骨胶原提取，但是酸浸和碱中和，易导致蛋白质发生不可逆变性。
目前，国内外常用的胶原蛋白提取方法主要有热水提取法、酸提取法、碱提取和酶提取法，但热水提取法得率较低；酸法水解彻底，色氨酸被完全破坏，丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏；碱性条件下提取胶原，易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏，所得产物等电点pH值较低，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸，如果水解严重，则会产生D、L型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量比L型氨基酸高，则会抑制L－型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突变的作用；酶解法不仅可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率，而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，能够保持其优良的物理和生化特性，故酶解法是目前较理想的方法，但由于动物骨骼结构中的钙主要以羟基磷灰石与胶原形成骨盐沉积在胶原表面，而钙会降低胃蛋白酶活性从而影响胶原蛋白质提取率，同时牛骨中脂含量较高，在酶解过程中会深层难溶的质酸钙沉积在骨表面，影响酶解反应的进行，并影响胶原蛋白的色泽和透明度。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种牛骨中胶原蛋白的提取方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种牛骨中胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过50-80目筛，得牛骨粉；
S2速冻：将牛骨粉在零下10℃至零下30℃的条件下进行冷冻1-3h；
S3解冻：将牛骨粉置于容器中，用含酒石酸的水蒸汽喷淋10-15min；所述含酒石酸的水蒸汽中酒石酸质量分数为30-40％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为500-700mL/s；
S4脱脂脱钙：将牛骨粉按料液比1：(2-5)的质量比置于复合酶液中，在20-35℃、100-200转/min的条件下摇床发酵培养5-10h，再将牛骨粉按料液比1：(1.8-3.6)的质量比置于鼠李糖乳杆菌液中，在相同条件下摇床发酵培养5-10h，过滤，取固形物为牛骨粉；
S5变频电解：将牛骨粉按料液比1：(1.5-2.5)的质量比置于质量分数40-60％的氨基酸溶液，在电流密度为15-25A/cm2的条件下变频电解20-25min，静置后，按添加量为4-7mg/L加入改性壳聚糖，在30-40℃的条件下搅拌10-20min，然后置于转速为4000-6000r/min的离心机中离心8-15min，取上清液浓缩3-5倍，冷冻干燥即得胶原蛋白。
所述复合酶液中酶的总活力为4000-5000U/mL，复合酶由脂肪酶与磷脂酶接种量比为(3-7)：1。
所述复合酶液是将复合酶接种于改性米糠多糖溶液中搅拌10-15min。
所述改性米糠多糖是将米糠多糖加入水中配成质量浓度为8-12％的米糠多糖溶液，在温度为35-45℃、转速为200-500r/min搅拌下向米糠多糖溶液中同时滴加质量分数为15-25％的柠檬酸和质量分数为30-40％的茶多酚溶液，所述柠檬酸的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.8-1.6％，所述茶多酚的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.3-0.7‰，滴加完毕后继续以转速为200-500r/min搅拌反应30-40min。
所述鼠李糖乳杆菌液是将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在30-35℃条件下活化1-4h后，得悬浮液；将悬浮液在45-55℃下热胁迫处理10-25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为(1.7-3.7)×107cfu/mL。
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨6-8g，枯草芽孢杆菌提取物2-4g，葡萄糖22-27g，乙酸钠1-3g，柠檬酸二铵3-4g，吐温801-2mL，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，MnSO4·4H2O0.03-0.04g，K2HPO42-4g，琼脂粉12-16g，水1100-1300mL。
所述枯草芽孢杆菌提取物的制备方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌菌丝体与温度为75-84℃的热水按1：(2-5)的质量比混合搅拌20-25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至25-35℃，并将pH值调节到6.5-7.0，然后按加酶量0.03-0.07‰的量加入蛋白酶和按加酶量0.05-0.08‰的量加入纤维素酶，进行水解反应8-12h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至75-85℃，灭活0.5-2h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物。
所述氨基酸为异亮氨酸与丝氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸中任一种按1：(0.2-0.5)的质量比组成。
所述变频电解中阳极选用铁，阴极选用石墨。
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖和氧化铁在温度为40-50℃条件下搅拌10-20min，得改性壳聚糖。
有益效果：
采用本发明方法提取牛骨中胶原蛋白，具有提取率高、胶原热稳定性优、透明度高，且还防止了牛骨中氨基酸、多糖等成分被破坏。
本发明先将研磨后的牛骨粉进行速冻，防止了机械活化后活性成分损失，再结合解冻，尤其采用含有酒石酸的水蒸汽进行处理，不仅利用水溶解可溶钙，还利用热能和酒石酸的作用，使得酒石酸深层透入骨骼中，分解晶体组织，释放出可溶性物质、骨钙等有益元素，进而使得渗透的酒石酸能够与矿物质鳌合，形成游离态。
本发明利用复合酶处理，使得油脂分解，同时加入多糖成分，不仅能够激发酶活力，还能够完整保留溶出物，加入茶多酚成分，能够增强溶出物抗氧化性能，抑制美拉德反应；本发明利用鼠李糖乳杆菌作用，实现了脱脂脱钙同步，将大量不溶性钙转化成乳酸钙、氨基酸钙等游离形式的钙元素，削弱了葡萄糖等成分对提钙的不良影响；利用和枯草芽孢杆菌提取物活化鼠李糖乳杆菌，不仅增强了其活性，还可以提高骨粉中营养成分的解离与溶出，提高了钙、镁等矿物质含量，有效抑制美拉德反应。
本发明利用氨基酸配合变频电解，提高了胶原蛋白的溶出率，保证了其完整的纤维网状结构，胶原蛋白结构分布相对均匀，且热稳定性强，易分离，利用壳聚糖进行分离，效率高、安全无毒，还有效防止了胶原蛋白被氧化。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种牛骨中胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过50目筛，得牛骨粉；
S2速冻：将牛骨粉在零下10℃的条件下进行冷冻1-3h；
S3解冻：将牛骨粉置于容器中，用含酒石酸的水蒸汽喷淋10min；所述含酒石酸的水蒸汽中酒石酸质量分数为30％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为500mL/s；
S4脱脂脱钙：将牛骨粉按料液比1：2的质量比置于复合酶液中，在20℃、100转/min的条件下摇床发酵培养5h，再将牛骨粉按料液比1：1.8的质量比置于鼠李糖乳杆菌液中，在相同条件下摇床发酵培养5h，过滤，取固形物为牛骨粉；
S5变频电解：将牛骨粉按料液比1：1.5的质量比置于质量分数40％的氨基酸溶液，在电流密度为15A/cm2的条件下变频电解20min，静置后，按添加量为4mg/L加入改性壳聚糖，在30℃的条件下搅拌10min，然后置于转速为4000r/min的离心机中离心8min，取上清液浓缩3倍，冷冻干燥即得胶原蛋白；
所述复合酶液中酶的总活力为4000U/mL，复合酶由脂肪酶与磷脂酶接种量比为3：1；
所述复合酶液是将复合酶接种于改性米糠多糖溶液中搅拌10min；
所述改性米糠多糖是将米糠多糖加入水中配成质量浓度为8％的米糠多糖溶液，在温度为35℃、转速为200r/min搅拌下向米糠多糖溶液中同时滴加质量分数为15％的柠檬酸和质量分数为30％的茶多酚溶液，所述柠檬酸的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.8％，所述茶多酚的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.3‰，滴加完毕后继续以转速为200r/min搅拌反应30min；
所述鼠李糖乳杆菌液是将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在30℃条件下活化1h后，得悬浮液；将悬浮液在45℃下热胁迫处理10-25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为1.7×107cfu/mL；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨6g，枯草芽孢杆菌提取物2g，葡萄糖22g，乙酸钠1g，柠檬酸二铵3g，吐温801mL，MgSO4·7H2O0.1g，MnSO4·4H2O0.03g，K2HPO42g，琼脂粉12g，水1100mL；
所述枯草芽孢杆菌提取物的制备方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌菌丝体与温度为75-84℃的热水按1：2的质量比混合搅拌20min；
(2)将步骤(1)所得物降温至25℃，并将pH值调节到6.5，然后按加酶量0.03‰的量加入蛋白酶和按加酶量0.05‰的量加入纤维素酶，进行水解反应8h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至75℃，灭活0.5h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述氨基酸为异亮氨酸与精氨酸按1：0.2的质量比组成；
所述变频电解中阳极选用铁，阴极选用石墨；
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖和氧化铁在温度为40℃条件下搅拌10min，得改性壳聚糖。
实施例2
一种牛骨中胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过80目筛，得牛骨粉；
S2速冻：将牛骨粉在零下30℃的条件下进行冷冻1-3h；
S3解冻：将牛骨粉置于容器中，用含酒石酸的水蒸汽喷淋15min；所述含酒石酸的水蒸汽中酒石酸质量分数为40％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为700mL/s；
S4脱脂脱钙：将牛骨粉按料液比1：5的质量比置于复合酶液中，在35℃、200转/min的条件下摇床发酵培养10h，再将牛骨粉按料液比1：3.6的质量比置于鼠李糖乳杆菌液中，在相同条件下摇床发酵培养10h，过滤，取固形物为牛骨粉；
S5变频电解：将牛骨粉按料液比1：2.5的质量比置于质量分数60％的氨基酸溶液，在电流密度为25A/cm2的条件下变频电解25min，静置后，按添加量为7mg/L加入改性壳聚糖，在40℃的条件下搅拌20min，然后置于转速为6000r/min的离心机中离心15min，取上清液浓缩3-5倍，冷冻干燥即得胶原蛋白；
所述复合酶液中酶的总活力为5000U/mL，复合酶由脂肪酶与磷脂酶接种量比为7：1；
所述复合酶液是将复合酶接种于改性米糠多糖溶液中搅拌15min；
所述改性米糠多糖是将米糠多糖加入水中配成质量浓度为12％的米糠多糖溶液，在温度为45℃、转速为500r/min搅拌下向米糠多糖溶液中同时滴加质量分数为25％的柠檬酸和质量分数为40％的茶多酚溶液，所述柠檬酸的滴加量为米糠多糖溶液重量的1.6％，所述茶多酚的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.7‰，滴加完毕后继续以转速为500r/min搅拌反应40min；
所述鼠李糖乳杆菌液是将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在35℃条件下活化4h后，得悬浮液；将悬浮液在55℃下热胁迫处理25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为3.7×107cfu/mL；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨8g，枯草芽孢杆菌提取物4g，葡萄糖27g，乙酸钠3g，柠檬酸二铵4g，吐温802mL，MgSO4·7H2O0.3g，MnSO4·4H2O0.04g，K2HPO44g，琼脂粉16g，水1300mL；
所述枯草芽孢杆菌提取物的制备方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌菌丝体与温度为84℃的热水按1：5的质量比混合搅拌25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至35℃，并将pH值调节到7.0，然后按加酶量0.07‰的量加入蛋白酶和按加酶量0.08‰的量加入纤维素酶，进行水解反应12h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至85℃，灭活2h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述氨基酸为异亮氨酸与蛋氨酸按1：0.5的质量比组成；
所述变频电解中阳极选用铁，阴极选用石墨；
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖和氧化铁在温度为50℃条件下搅拌20min，得改性壳聚糖。
实施例3
一种牛骨中胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过60目筛，得牛骨粉；
S2速冻：将牛骨粉在零下20℃的条件下进行冷冻1-3h；
S3解冻：将牛骨粉置于容器中，用含酒石酸的水蒸汽喷淋12min；所述含酒石酸的水蒸汽中酒石酸质量分数为35％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为600mL/s；
S4脱脂脱钙：将牛骨粉按料液比1：3的质量比置于复合酶液中，在25℃、150转/min的条件下摇床发酵培养7h，再将牛骨粉按料液比1：2的质量比置于鼠李糖乳杆菌液中，在相同条件下摇床发酵培养6h，过滤，取固形物为牛骨粉；
S5变频电解：将牛骨粉按料液比1：2的质量比置于质量分数50％的氨基酸溶液，在电流密度为20A/cm2的条件下变频电解22min，静置后，按添加量为5mg/L加入改性壳聚糖，在35℃的条件下搅拌15min，然后置于转速为5000r/min的离心机中离心12min，取上清液浓缩4倍，冷冻干燥即得胶原蛋白；
所述复合酶液中酶的总活力为4500U/mL，复合酶由脂肪酶与磷脂酶接种量比为5：1；
所述复合酶液是将复合酶接种于改性米糠多糖溶液中搅拌13min；
所述改性米糠多糖是将米糠多糖加入水中配成质量浓度为10％的米糠多糖溶液，在温度为10℃、转速为350r/min搅拌下向米糠多糖溶液中同时滴加质量分数为20％的柠檬酸和质量分数为35％的茶多酚溶液，所述柠檬酸的滴加量为米糠多糖溶液重量的1.2％，所述茶多酚的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.5‰，滴加完毕后继续以转速为350r/min搅拌反应35min；
所述鼠李糖乳杆菌液是将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在32℃条件下活化3h后，得悬浮液；将悬浮液在50℃下热胁迫处理18min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为2.7×107cfu/mL；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨7g，枯草芽孢杆菌提取物3g，葡萄糖25g，乙酸钠2g，柠檬酸二铵3.5g，吐温801.5mL，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·4H2O0.03g，K2HPO43g，琼脂粉14g，水1200mL；
所述枯草芽孢杆菌提取物的制备方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌菌丝体与温度为80℃的热水按1：4的质量比混合搅拌22min；
(2)将步骤(1)所得物降温至30℃，并将pH值调节到6.8，然后按加酶量0.05‰的量加入蛋白酶和按加酶量0.07‰的量加入纤维素酶，进行水解反应10h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至80℃，灭活1.5h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述氨基酸为异亮氨酸与丝氨酸按1：0.4的质量比组成；
所述变频电解中阳极选用铁，阴极选用石墨；
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖和氧化铁在温度为45℃条件下搅拌15min，得改性壳聚糖。
对比例1
与实施例3的区别在于：将变频电解替换成超声波，工作条件为：功率100W，频率45kHz。
对比例2
与实施例3的区别在于：改性米糠多糖中未使用茶多酚。
对比例3
与实施例3的区别在于：将复合酶液中改性米糠多糖溶液替换成水。
对比例4
与实施例3的区别在于：解冻用水蒸汽未含有酒石酸。
试验例1
实施例与对比例中胶原蛋白得率按如下公式计算：胶原蛋白得率/％＝冻干胶原蛋白粗品质量/提取用原料骨质量×100％，结果如下：
表1不同提取方法的胶原蛋白得率(单位：％)
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
得率 47.1 46.3 48.5 34.9 28.8 31.7 37.6
试验例1
将实施例与对比例中胶原蛋白粗品进行氨基酸组成与含量分析，具体是：取50mg胶原蛋白粗品，加入10mL 6mol/L HCl溶液，110℃水解24h；酸水解后过滤，将滤液定容至50mL；取1mL氮吹至干，再向其中加入5mL 0.02mol/L HCl溶液复溶，振荡混匀，用0.20μm的滤膜过滤，用氨基酸自动检测仪进行测定；
结果如下：实施例与对比例中均检测出天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸，其中各组甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量如下：
表2不同提取方法中甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量(单位：mg/g)
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
甘氨酸 346.1 345.8 348.3 302.7 313.6 327.4 315.7
脯氨酸 173.4 171.9 175.1 137.9 156.5 168.2 154.3
羟脯氨酸 176.8 175.9 177.1 148.5 153.7 162.9 155.8
试验例2
热收缩温度的测定
采用DSC法测定牦牛骨胶原蛋白的热收缩温度。取约10mg样品于铝制坩埚中，加盖后压片密封，以空铝制坩埚作为参比。25℃保持1min，从25℃升温至100℃，100℃保持1min，升温速率为2℃/min；
结果显示：加热会使得胶原蛋白螺旋结构中的氢键断裂，变性则形成无规则卷曲，并伴随着能量变化，各组热收缩温度如下表：
表3不同提取方法中热收缩温度(单位：℃)
Figure BDA0002221843070000121

Claims (7)

1.一种牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过50-80目筛，得牛骨粉；
S2速冻：将牛骨粉在零下10℃至零下30℃的条件下进行冷冻1-3h；
S3解冻：将牛骨粉置于容器中，用含酒石酸的水蒸汽喷淋10-15min；所述含酒石酸的水蒸汽中酒石酸质量分数为30-40％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为500-700mL/s；
S4脱脂脱钙：将牛骨粉按料液比1：(2-5)的质量比置于复合酶液中，在20-35℃、100-200转/min的条件下摇床发酵培养5-10h，再将牛骨粉按料液比1：(1.8-3.6)的质量比置于鼠李糖乳杆菌液中，在相同条件下摇床发酵培养5-10h，过滤，取固形物为牛骨粉；
S5变频电解：将牛骨粉按料液比1：(1.5-2.5)的质量比置于质量分数40-60％的氨基酸溶液，在电流密度为15-25A/cm2 的条件下变频电解20-25min，静置后，按添加量为4-7mg/L加入改性壳聚糖，在30-40℃的条件下搅拌10-20min，然后置于转速为4000-6000r/min的离心机中离心8-15min，取上清液浓缩3-5倍，冷冻干燥即得胶原蛋白；
所述复合酶液中酶的总活力为4000-5000U/mL，复合酶由脂肪酶与磷脂酶接种量比为(3-7)：1；
所述氨基酸为异亮氨酸与丝氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸中任一种按1：(0.2-0.5)的质量比组成。
2.如权利要求1所述牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述复合酶液是将复合酶接种于改性米糠多糖溶液中搅拌10-15min。
3.如权利要求2所述牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述改性米糠多糖是将米糠多糖加入水中配成质量浓度为8-12％的米糠多糖溶液，在温度为35-45℃、转速为200-500r/min搅拌下向米糠多糖溶液中同时滴加质量分数为15-25％的柠檬酸和质量分数为30-40％的茶多酚溶液，所述柠檬酸的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.8-1.6％，所述茶多酚的滴加量为米糠多糖溶液重量的0.3-0.7‰，滴加完毕后继续以转速为200-500r/min搅拌反应30-40min。
4.如权利要求1所述牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌液是将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在30-35℃条件下活化1-4h后，得悬浮液；将悬浮液在45-55℃下热胁迫处理10-25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为(1.7-3.7)×107 cfu/mL。
5.如权利要求4所述牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨6-8g，枯草芽孢杆菌提取物2-4g，葡萄糖22-27g，乙酸钠1-3g，柠檬酸二铵3-4g，吐温80 1-2mL，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，MnSO4·4H2O0.03-0.04g，K2HPO4 2-4g，琼脂粉12-16g，水1100-1300mL。
6.如权利要求5所述牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌提取物的制备方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌菌丝体与温度为75-84℃的热水按1：(2-5)的质量比混合搅拌20-25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至25-35℃，并将pH值调节到6.5-7.0，然后按加酶量0.03-0.07‰的量加入蛋白酶和按加酶量0.05-0.08‰的量加入纤维素酶，进行水解反应8-12h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至75-85℃，灭活0.5-2h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述枯草芽孢杆菌提取物。
7.如权利要求1所述牛骨中胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖和氧化铁在温度为40-50℃条件下搅拌10-20min，得改性壳聚糖。
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