CN110592245A - 一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒 - Google Patents

一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，包括特异性引物对及包含该引物对的试剂盒，其中试剂盒包括试剂一、试剂二和封闭剂；试剂一包含引物FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；试剂二包含Tris‑HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween‑20和甜菜碱，pH 8.8。本发明提供的试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，不仅适合现场灵敏监测检测，以及大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。

Description

一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒。
背景技术
鼠疫(plague)，由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)引起，是一种广泛流行于鼠类和其他野生啮齿动物中的自然疫源性烈性传染病，具有发病急剧、传染性强、传播速度快、病死率高等特点，易酿成流行甚至大流行。根据感染途径的不同，鼠疫主要可分为腺鼠疫、肺鼠疫、败血型鼠疫和肠鼠疫等。在我国，鼠疫自然疫源地的鼠间鼠疫还一直存在，人间鼠疫仅在一些个别地区有少数散发病例。国内外首次报告了从自然感染鼠疫的病死藏系绵羊体内分离出鼠疫耶尔森菌，并有多起关于以染疫藏羊为传染源的人间鼠疫流行的记录。自20世纪90年代以来，我国鼠疫又开始活跃，西北旱獭疫源地的人、动物鼠疫仍连年不断，南方家鼠鼠疫和北方沙鼠鼠疫双双暴发流行，在局部地区的黄鼠鼠疫依然存在，人间病例明显回升，新的疫源县不断增加，疫源地面积迅速扩大，对疫区内人群的生产和生活构成了严重的威胁。我国鼠疫流行除了自然感染发生外，就是人为的感染扩张。
据世界卫生组织报告，2017年8月起非洲马达加斯加共和国暴发鼠疫疫情，2017年8月1日-10月30日，全国报告鼠疫疑似病例1801例，死亡病例127例，病死率(CFR)7％。其中，1111例(62％)为肺鼠疫，261例(15％)为腺鼠疫，1例为败血症型鼠疫，其余428例未分型(尚待进一步分型中)。(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs267/en/)。据世卫组织统计，该国每年均有鼠疫疫情暴发，暴发期一般为每年9月至第二年4月，往年均以腺鼠疫病例为主，但今年鼠疫的流行时间提前，暴发的疫情以最致命的肺鼠疫病例为主，且影响范围既有传统流行地区也有非流行地区，首次暴发于以往的非流行区和人口密集的沿海地区，包括首都安塔那那利佛市(Antananarivo)和港口城市图阿马西那(Toamasina)在内的主要中心城市。鉴于鼠疫的进一步传播的风险增加以及疾病的严重性，疫情继续传播扩散的风险极高，防止鼠疫传入已成为紧迫任务。
因此，提供一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，且能够实现实时快速，方便快捷，特异性强的目的是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测鼠疫耶尔森菌的特点，不仅适合现场监测，以及大人流、快速通关背景下的现场查验检测需求，也适合实验室快速检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
根据鼠疫耶尔森菌F1基因序列中的保守序列(GeneBank号：X61996.1)，设计一种快速检测鼠疫耶尔森菌的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
FP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGAAC-3’；
BP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCCACAATCTCTAGAATCCTTGCCAATC-3’；
IF：5’-GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC-3’。
含有上述的特异性引物对的试剂盒。
进一步的，包括试剂一、试剂二和封闭剂；其中试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；
试剂二包含Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween-20和甜菜碱，pH 8.8；
各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40-60pmol、IF 20-30pmol、dNTP 10-20mM、BsDNA聚合酶8-10U/μL、Tris-HCl 20-30mM、硫酸铵10-20mM、氯化钾10-20mM、硫酸镁8-10mM、Tween-200.1％、甜菜碱0.8-1M。
进一步的，所述试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、Bst DNA聚合酶和指示剂；
所述试剂二包含Tris-HCl，硫酸铵，氯化钾，硫酸镁，Tween-20和甜菜碱，pH 8.8；
各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40pmol、IF 20pmol、dNTP10mM、Bst DNA聚合酶8U/μL、Tris-HCl 20mM，硫酸铵10mM，氯化钾10mM，硫酸镁8mM，Tween-200.1％，甜菜碱0.8M。
进一步的，所述指示剂包括pH指示剂和/或荧光染料；所述pH指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，在最终反应体系中：甲酚红0.08mM，苯酚红0.02mM。
进一步地，所述封闭剂为石蜡。
进一步的，在最终反应体系中，所述荧光染料为1×水溶液的SYBR Green I或EveGreen。
进一步的，所述试剂盒的灵敏度为10-1000拷贝/test；核酸浓度检测限不低于100拷贝/μL。
本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，其中试剂瓶设有检测管、检测管盖、放置槽和覆膜；其中，检测管为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖与检测管相适配，覆盖在检测管的开口端，封闭检测管，其中检测管与检测管盖一体成型；检测管盖内侧设置放置槽，放置槽与检测管盖一体成型；覆膜为PPE薄膜，覆盖在放置槽上。
其中，本发明将试剂一置于检测管盖上的放置槽内，然后利用覆膜对放置槽进行封口，并将试剂二和封闭剂放置到检测管底部，最后盖上检测管盖，完成试剂盒的组装。
其中，气溶胶污染是困扰整个核酸扩增领域的难题，聚合酶螺旋反应扩增效率高，反应剧烈，也不免会产生带有大量扩增生产的核酸，将气溶胶污染封闭剂在反应前加入到反应管中，反应过程中熔化成液体覆盖反应液(包括试剂一和试剂二)，阻止了气溶胶的挥发，并且对扩增反应无影响，反应完成后会再次凝结成固体，永久封闭反应液，杜绝了产物污染。
试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用Chelex裂解液，加热提取待检测样品的核酸；
其中所述Chelex裂解液为5.0g Chelex-100(Bio-rad)和1.0ml TritonX-100溶于100ml TE缓冲液(Tris 10mM,EDTA 1mM)中制成Chelex裂解液；
(2)以步骤(1)所述核酸为模板加入所述试剂盒的所述试剂一中，后与所述试剂二和所述封闭液进行混合；并设置阳性和阴性对照；
(3)在65-67℃的条件下，恒温扩增40-60min，显色法观察判断结果和/或利用荧光实时检测法进行检测。
其中，显色法检测：恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在鼠疫耶尔森菌基因(阳性)，检测管颜色变为红色表示待测样本中不存在鼠疫耶尔森菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色变为红色，则本次检测结果无效，应重新检测。
显色法检测原理为：当DNA聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的DNA双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着PSR反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的pH值降低。将pH指示剂溶液加于25μl上述PSR反应体系中，阳性反应变为黄色，阴性对照溶液为红色。
荧光实时检测方法为：设定吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，此波长和SYBR Green I相同，为绿色荧光；将反应体系置于荧光定量仪中，开始反应。
阳性反应的表现为：在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；
阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。
结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，样本在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(Tm变化范围在1-3℃之内)，此时样本可以判断为阳性。否则为阴性。如果阳性样本发生了阴性反应，或者阴性样本发生了阳性反应，应重新实验。
荧光实时检测方法的原理为：核酸荧光染料可以镶嵌到DNA双链里，在特定激发波长荧光激发下，可以发出荧光，进而被仪器检测到。
进一步的，所述试剂盒的工作体系为25μL工作体系：包括所述试剂一1μL，pH为8.8的所述试剂二12.5μL和DNA模板量11.5μl。
进一步地，试剂一的溶剂为水和/或玻璃化液。
玻璃化液选自二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇(EG)、丙二醇、丙三醇等试剂中任意2种以上的组合；或者选自EFS30玻璃化液、EFS40玻璃化液、EDFS30玻璃化液、EDFS40玻璃化液、EDFSF30玻璃化液或EDFSF40玻璃化液。
EFS30玻璃化液中含有30％v/vEG，70％v/vFS溶液；
EFS40玻璃化液中含有40％v/vEG，60％v/vFS溶液；
EDFS30玻璃化液中含有15％v/vEG，15％v/vDMSO，70％v/vFS溶液；
EDFS40玻璃化液中含有20％v/vEG，20％v/vDMSO，60％v/vFS溶液；
FS溶液：300g/L聚蔗糖添加0.5mol/L蔗糖，经PBS缓冲液溶解成FS溶液。
EDFSF30玻璃化液中含有15％v/vEG，15％v/vDMSO，70％v/vFSF溶液；
EDFSF40玻璃化液中含有20％v/vEG，20％v/vDMSO，60％v/vFSF溶液；
FSF溶液：300g/L聚蔗糖添加0.5mol/L蔗糖，经PBS缓冲液溶解后，加20％胎牛血清后制成FSF溶液。
进一步地，试剂一置于检测管盖上的放置槽内后，晾干或烘干。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，具有如下技术优点：
本发明提供了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测鼠疫耶尔森菌的特点，不仅适合现场监测，以及大人流、快速通关背景下的现场查验检测需求，也适合实验室快速检测。本发明试剂盒部分试剂经玻璃化后可以室温储存运输，不依赖冷链运输和低温保存。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的一元包装诊断试剂瓶的结构示意图；
图2附图为本发明提供的显色法检测敏感性实验结果图；
图3附图为本发明提供的荧光法检测敏感性的扩增曲线；
图4附图为本发明提供的荧光法检测敏感性的溶解曲线；
图5附图为本发明提供的PCR检测敏感性实验结果图；
其中，泳道1为DNAMarker(D2000)；泳道2为模板浓度107拷贝/μl；泳道3为模板浓度106拷贝/μl；泳道4为模板浓度105拷贝/μl；泳道5为模板浓度104拷贝/μl；泳道6为模板浓度103拷贝/μl；泳道7为模板浓度102拷贝/μl；泳道8为模板浓度101拷贝/μl；泳道9为模板浓度100拷贝/μl；泳道10为阴性对照。
图6附图为本发明提供的荧光法检测试剂盒特异性实验结果图；
图7附图为本发明提供的荧光法检测试剂盒特异性实验结果图；
图8附图为本发明提供的显色法检测试剂盒特异性实验结果图；
图9附图为本发明提供的显色法检测试剂盒的重复性效果图；
图10附图为本发明提供的荧光法检测试剂盒的重复性实验效果图；
图11附图为本发明提供的荧光法检测试剂盒的重复性实验效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
引物设计
本实施例中Chelex-100、甜菜碱，Sigma公司；氯化锰、硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、EDTA、硫酸铵，国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl，上海生科生物科技有限公司；TritonX-100，北京美莱博医学科技有限公司；dNTP，Pharmacia公司；NP-40，Fluka公司；2×TapMIX试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，Amresco公司。
在文献查阅和基因序列比对基础上，选取鼠疫F1基因序列中的保守序列(GeneBank号：X61996.1)，进行生物信息学分析，确定靶序列。并对此靶序列在美国NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast，所选序列的特异性较好，可以作为PSR引物设计的靶序列。将待扩增的DNA分为4个独立的区域，根据这4个区域分别设计PSR反应所需的引物(内引物FP和BP，加速引物IF或IB)，共设计4套PSR引物扩增靶基因，他们分别是：
YP105-FP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGAAC-3’；SEQ ID NO.1；
YP105-BP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCCACAATCTCTAGAATCCTTGCCAATC-3’；SEQ IDNO.2；
YP105-IF：5’-GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC-3’；SEQ ID NO.3；
YP146-FP：5’-ATCAAAATCTCTAGAATCCTTGCCACTCAGGATGGAAATAACCACC-3’；SEQ IDNO.4；
YP146-BP：5’-ATCAAAATCTCTAGAATCCTTGCCCAAGTTTACCGCCTTTGG-3’；SEQ IDNO.5；
YP146-IB：5’-GGCAGCCAGGATTTCTTTGT-3’；SEQ ID NO.6；
YP165-FP：5’-ACCGTTTACCTTAGGAGAGATATCACAATTCACTACAAAAGTGATTGG-3’；SEQID NO.7；
YP165-BP：5’-ACCGTTTACCTTAGGAGAGATATACAAGTTTACCGCCTTTGG-3’；SEQ IDNO.8；
YP165-IB：5’-CGGGCAGCCAGGATTTCT-3’；SEQ ID NO.9；
YP185-FP：5’-GGATGACGTCGTCTTGGCTAACAATTCACTACAAAAGTGATTGG-3’；SEQ IDNO.10；
YP185-BP：5’-GGATGACGTCGTCTTGGCTACAAGTTTACCGCCTTTGG-3’；SEQ ID NO.11；
YP185-IB：5’-CGGGCAGCCAGGATTTCT-3’；SEQ ID NO.12。
引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。
将上述4套引物利用本发明中的试剂盒对鼠疫耶尔森菌进行扩增，其中本发明中的试剂盒包含试剂一、试剂二和封闭剂；其中试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、Bst DNA聚合酶和指示剂，溶剂为EFS30玻璃化液；
所述试剂二包含Tris-HCl，硫酸铵，氯化钾，硫酸镁，Tween-20和甜菜碱，pH 8.8。
各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40pmol、IF 20pmol、dNTP10mM、Bst DNA聚合酶8U/μL、Tris-HCl 20mM，硫酸铵10mM，氯化钾10mM，硫酸镁8mM，Tween-200.1％，甜菜碱0.8M。
指示剂包括pH指示剂和荧光染料，其中在最终反应体系中：甲酚红工作浓度0.08mM、苯酚红工作浓度0.02mM，EveGreen为1×水溶液。
本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，如图1其中，试剂瓶设有检测管1、检测管盖3、放置槽4和覆膜2；其中，检测管1为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖3与检测管1相适配，覆盖在检测管1的开口端，封闭检测管1，其中检测管1与检测管盖3一体成型；检测管盖3内侧设置放置槽4，放置槽4与检测管盖3一体成型；覆膜2为PPE薄膜，覆盖在放置槽4上。
其中，本发明试剂一1μl置于检测管盖3上的放置槽4内，晾干后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将试剂二12.5μl放置到检测管1底部再加入一滴封闭剂石蜡，最后盖上检测管盖3，完成试剂盒的组装。
使用时撕去覆膜2，分别取出11.5μl阳性DNA模板，滴加至检测管1上的检测管盖3上，扣上检测管盖3，倒置约10秒，将管盖上的液体用力甩至管底内。并且设置双蒸水阴性对照。将实验组与阴性对照组检测管1置于智能恒温检测仪，点击扩增键，65℃开始加热，2分钟后看到封闭剂融化，拿出检测管1迅速甩动两下，使检测管1中的液体混匀，然后再置于恒温装置，听到提示音反应结束(预设50min)，取出，同时反应过程中切勿开盖。根据反应检测结果，优化出专一鉴别鼠疫耶尔森菌的特异性引物组，YP105引物组最先发生PSR反应的引物，选为最佳引物组。
同时，根据筛选出的最佳引物组，设置温度梯度，65℃时，YP105引物组最先发生PSR反应。
实施例2
敏感性实验
根据实施例1得到的最佳引物组YP105引物组，并将其应用到本发明中的试剂盒；本发明中的试剂盒与实施例1中的试剂盒和检测方法相同，在此不再一一赘述，本实施例以含有鼠疫F1基因的质粒克隆株为检测对象，计算拷贝数进行10倍稀释度稀释，使得最终核酸浓度分别为108拷贝/μl，107拷贝/μl，106拷贝/μl，105拷贝/μl，104拷贝/μl，103拷贝/μl，102拷贝/μl，101拷贝/μl，100拷贝/μl，并以双蒸水作为阴性对照。然后利用本实施例中的试剂盒进行检测，将核酸与试剂一进行混合后，再与试剂二进行混合；分别采用显色法(添加pH指示剂)和荧光法来检测。
结果如图2-4，鼠疫耶尔森菌基因质粒倍比稀释样本有明显的颜色改变，同时，其最低检测浓度为100拷贝/μl。荧光法与显色法实验结果一致，荧光扩增曲线有典型S型扩增曲线。其中阳性样本倍比稀释检测Ct值如表1。
表1阳性样本倍比稀释检测Ct值
同时将10倍梯度稀释的质粒用于PCR反应，检测结果如图5。其中25μlPCR反应体系为：11.5μl模板、各10pmol引物(YP105-FP、YP105-BP)、12.5μl 2×Taq MIX。
扩增循环条件为：94℃预变性5min，之后94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，共40个循环，最后延伸7min。取PCR产物5μl，在1％含EB琼脂糖凝胶电泳上120V电泳35min，在凝胶成像系统下照像检测。PCR最低检测浓度为1000拷贝/μl，本实施例中试剂盒为PCR敏感性的100倍。
实施例3
特异性实验
分别对鼠疫耶尔森菌F1基因阳性质粒样品(YF-P1，YF-P2)、6份人全血DNA样品(H1～H6，鼠疫耶尔森菌阴性)、6份鼠肺脏组织DNA样品(R1-R6，其中R1及R6:褐家鼠；R2～R4：小家鼠；R5：小麝鼩，均为鼠疫耶尔森菌阴性)、金黄色葡萄球菌(Sa)、大肠埃希氏菌(Ec)、雷氏普罗威登斯菌(Pr)、肺炎克雷伯菌肺炎亚种(Kpn)及双蒸水进行扩增。
荧光法试验结果：鼠疫耶尔森菌F1基因阳性质粒样品呈典型S性扩增曲线，溶解曲线Tm值约85℃，其余样品无扩增或无典型S型扩增曲线，无溶解曲线或溶解曲线Tm值未在85℃(图6，图7)。
显色法试验结果：鼠疫耶尔森菌F1基因阳性质粒样品呈阳性，2份人全血基因组DNA(H2、H 5)及1份褐家鼠基因组DNA呈弱阳性，其余均为阴性(图8)
综合两种检测方法，以溶解曲线Tm值作为判断标准，试剂盒方法可特异性扩增出鼠疫耶尔森菌F1基因阳性质粒样品，人全血DNA样品、鼠肺脏组织DNA样品(褐家鼠，小家鼠，小麝鼩)、金黄色葡萄球菌(Sa)、大肠埃希氏菌(Ec)、雷氏普罗威登斯菌(Pr)及肺炎克雷伯菌肺炎亚种(Kpn)均为阴性(表2)。
表2特异性检测结果
实施例4
本实施例分别取鼠疫F1基因质粒，健康体检者血清6份和鼠肝脏研磨液6份，利用实施例2中的试剂盒进行检测。
其中鼠肝脏研磨液的制备方法为：以无菌手续采取肝、脾、肺、心血及有可疑病理改变的淋巴结等组织，加入4-8滴(约100-200μl)Chelex裂解液进行研磨。用采样棉签沾取研磨匀浆液(约50-100μl)，置于含2mLChelex裂解液的试管，标记待检。摇动混匀后，置于恒温扩增检测仪，95℃加热10min，取出凉至室温后，即可作为样本DNA模板。
取鼠疫F1基因质粒的细菌培养液200μL，分别置于含2mLChelex裂解液的试管内，摇动混匀后，置于恒温扩增检测仪，95℃加热10min，取出凉至室温后，即可作为样本DNA模板。
本实施例采用显色法的结果如表3，由表3可知，鼠疫F1基因质粒阳性，其余样本均为阴性。
表3鼠疫耶尔森菌特异性试验结果
实施例5
重复性检测结果
选取鼠疫耶尔森菌F1基因阳性质粒样品1份(104拷贝/μl)，人全血DNA样品1份(鼠疫耶尔森菌阴性)，小家鼠肺脏组织DNA样品1份(鼠疫耶尔森菌阴性)，上述样品分别重复5次试验。利用显色法、荧光法同时进行检测，结果如图9-11。
由图9可知，显色法试验结果为鼠疫耶尔森菌F1基因质粒样品5次检测结果均为阳性；人全血DNA样品(鼠疫耶尔森菌阴性)样本5次检测结果均为阴性；小家鼠肺脏组织DNA样品(鼠疫耶尔森菌阴性)样本5次检测结果均为阴性。
由图10-11可知，荧光法试验结果为鼠疫耶尔森菌F1基因质粒样品5次检测均呈典型S型扩增，Ct值20.83～23.10，5次试验Ct值变异系数为4.62％。人全血DNA样品(鼠疫耶尔森菌阴性)及小家鼠肺脏组织DNA样品均为阴性。
其中阳性、阴性样本均显示明显结果，如表4。
表4重复性检测结果
由表4可知，阳性样本5次检测Ct值20.83～23.10，均判为阳性，5次试验Ct值变异系数为4.62％。而两种阴性样本各5次检测均未现明显扩增曲线，判为阴性，故本试剂盒具有很好的重复性。
本发明提供了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测鼠疫耶尔森菌的特点，不仅适合国境口岸现场监测，以及大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
aagtacatgg gatcacccgc gcggctataa aacaggaac 39
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
aagtacatgg gatcacccgc cacaatctct agaatccttg ccaatc 46
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gcatctgtaa agttaacaga tgtgc 25
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
atcaaaatct ctagaatcct tgccactcag gatggaaata accacc 46
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
atcaaaatct ctagaatcct tgcccaagtt taccgccttt gg 42
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
ggcagccagg atttctttgt 20
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
accgtttacc ttaggagaga tatcacaatt cactacaaaa gtgattgg 48
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
accgtttacc ttaggagaga tatacaagtt taccgccttt gg 42
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
cgggcagcca ggatttct 18
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
ggatgacgtc gtcttggcta acaattcact acaaaagtga ttgg 44
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
ggatgacgtc gtcttggcta caagtttacc gcctttgg 38
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
cgggcagcca ggatttct 18

Claims (9)

1.一种快速检测鼠疫耶尔森菌的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：
FP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGA AC-3’；SEQ ID NO.1；
BP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCCACAATCTCTAGAATCC TTGCCAATC-3’；SEQ ID NO.2；
IF：5’-GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC-3’；SEQ ID NO.3。
2.含有权利要求1所述的特异性引物对的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括试剂一、试剂二和封闭剂；其中试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；
试剂二包含Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween-20和甜菜碱，pH8.8；
各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40-60pmol、IF20-30pmol、dNTP10-20mM、Bst DNA聚合酶8-10U/μL、Tris-HCl 20-30mM、硫酸铵10-20mM、氯化钾10-20mM、硫酸镁8-10mM、Tween-200.1％、甜菜碱0.8-1M。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；
所述试剂二包含Tris-HCl，硫酸铵，氯化钾，硫酸镁，Tween-20和甜菜碱，pH 8.8；
各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40pmol、IF 20pmol、dNTP 10mM、Bst DNA聚合酶8U/μL、Tris-HCl 20mM，硫酸铵10mM，氯化钾10mM，硫酸镁8mM，Tween-200.1％，甜菜碱0.8M。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述指示剂包括pH指示剂和/或荧光染料；所述pH指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，在最终反应体系中：甲酚红0.08mM，苯酚红0.02mM。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在最终反应体系中，所述荧光染料为1×水溶液的SYBR Green I或EveGreen。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的灵敏度为10-1000拷贝/test；核酸浓度检测限不低于100拷贝/μL。
8.根据权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用Chelex裂解液，加热提取待检测样品的核酸；
(2)以步骤(1)所述核酸为模板加入所述试剂盒的所述试剂一中，后与所述试剂二进行混合，同时并加入封闭液防止污染；并设置阳性和阴性对照；
(3)在65-67℃的条件下，恒温扩增40-60min，显色法观察判断结果和/或利用荧光实时检测法进行检测。
9.根据权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂盒的工作体系为25μL工作体系：包括所述试剂一1μL，pH为8.8的所述试剂二12.5μL和DNA模板11.5μl。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002095066A2 (de) * 2001-05-18 2002-11-28 Biotecon Diagnostics Gmbh Nachweis und differenzierung von mikroorganismen der spezies yersinia pestis/yersinia pseudotuberculosis
CN101200760A (zh) * 2007-12-13 2008-06-18 中国检验检疫科学研究院 耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
CN101824468A (zh) * 2009-12-31 2010-09-08 广州华峰生物科技有限公司 鼠疫耶尔森菌检测用引物组、快速诊断试剂盒和检测方法
US20110076672A1 (en) * 2008-05-14 2011-03-31 Schofield David A Phage-Mediated Bioluminescent Detection of Yersinia Pestis
CN108754001A (zh) * 2018-06-13 2018-11-06 华南理工大学 基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002095066A2 (de) * 2001-05-18 2002-11-28 Biotecon Diagnostics Gmbh Nachweis und differenzierung von mikroorganismen der spezies yersinia pestis/yersinia pseudotuberculosis
CN101200760A (zh) * 2007-12-13 2008-06-18 中国检验检疫科学研究院 耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
US20110076672A1 (en) * 2008-05-14 2011-03-31 Schofield David A Phage-Mediated Bioluminescent Detection of Yersinia Pestis
CN101824468A (zh) * 2009-12-31 2010-09-08 广州华峰生物科技有限公司 鼠疫耶尔森菌检测用引物组、快速诊断试剂盒和检测方法
CN108754001A (zh) * 2018-06-13 2018-11-06 华南理工大学 基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIANA DE LIRA NUNES等: "The Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Procedure for Plague Diagnostic", 《AMERICAN JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
WENLI XU等: "Establishment and Application of Polymerase Spiral Reaction Amplification for Salmonella Detection in Food", 《J MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
董德荣: "一种新型核酸恒温扩增方法的研究及其在现场检测中的应用", 《万方学位论文数据库》 *
魏东等: "鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立", 《中国卫生检验杂志》 *

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