CN110588005A - 一种定向形貌胶原支架的制备方法及专用装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定向形貌胶原支架的制备方法及专用装置,所述装置包括:保温盒、置物台、模具和隔热套,所述置物台置于保温盒内的底部,所述置物台内部中空且底部为开口,所述置物台与保温盒之间可任意相对移动,所述模具置于置物台表面,所述隔热套将模具未与置物台接触的外表面全部包裹。本发明采用干冰做冷源,通过本发明特定的装置对胶原溶液进行冷冻,工艺简单,安全高效,制备得到的胶原支架材料取向良好,各孔分布均匀,在取向方向上力学性能明显提高,能够更好匹配原组织的性能。
Description
技术领域
本发明涉及胶原支架的制备方法及专用装置领域,特别是涉及一种定向形貌胶原支架的制备方法及专用装置。
背景技术
当软组织如关节软骨、韧带和肌腱等严重损伤时,难以通过自我修复实现组织结构的重建和功能的恢复,最直接的治疗手段就是组织移植。然而自体组织移植来源有限,且易造成取材部位的损伤或功能障碍,异体移植应用于临床也存在安全风险,如疾病传播、免疫排斥反应等,因此二者的临床应用皆受限。随着生物学和材料学的发展,组织工程为软组织修复提供了新的想法和路径。
组织工程包含细胞、支架和调控因子三个要素,为修复、替换人体损伤或坏死的组织和器官提供了解决途径。作为组织工程要素之一,支架材料在细胞生长、诱导细胞分化和迁移过程中起到举足轻重的作用。
目前,用于组织修复支架材料包括人工生物合成材料和天然支架材料。其中,合成材料对细胞的亲和力较差,诱导细胞在材料表面粘附、生长及分化能力弱;而天然高分子材料如胶原蛋白材料因其独特的生物活性因子、良好的细胞相容性以及和正常组织类似的结构,成为目前较为理想的组织工程支架材料。
有研究表明,定向和随机排列胶原支架上都能较好的支持骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长,但定向排列胶原支架可诱导BMSCs沿着胶原纤维排列的方向铺展延伸,同时无论是力学性能或促进干细胞表达特定产物的效果皆比随机排列排列胶原支架要好。而且,这些软组织中还又存在高度有序排列的I型胶原蛋白。
关节软骨、韧带和肌腱等的修复材料在径向上要求具有较好的力学性能用于承重,而传统的胶原支架孔隙紊乱,纤维结构排列无序,力学性能不能与组织修复相匹配,不能很好满足软骨修复材料的要求。
具有定向形貌的胶原支架为各向异性的,尤其是在径向上有更好的力学性能,相比于传统的孔隙紊乱的胶原支架,在实际临床中具有更好的可操作性。定向形貌的支架能够更好适应体内软骨辐射层、肌腱和神经等也具有各向异性性质的部位,有利于细胞的迁移、分化,促进组织再生,并且新生组织的生物学、力学性能能够更好匹配原组织的性能。
现在报道的关于定向形貌胶原支架制备方法包括使用磁场、电场诱导冰晶定向生长、静电纺丝等,这些方法耗能大、模具结构复杂、装置成本高、操作规范十分严格,并且制得的支架定向效果仍不够明显,成功定向的区域很小,材料的力学性能不好。甚至有的制备方法还需要使用到危险的冷冻源如液氨等,增加了制备时的风险,因此,定向形貌胶原支架在组织工程中的应用仍然受到很大限制。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种定向形貌胶原支架的制备方法及专用装置,能够制备具有定向形貌的胶原支架,孔隙率小,力学性能好。
为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:
提供一种制备定向形貌胶原支架的装置,包括:保温盒、置物台和模具;
所述置物台置于保温盒内的底部,所述置物台内部中空且底部为开口,所述置物台与保温盒之间可任意相对移动,所述模具置于置物台表面。
进一步地,所述制备定向形貌胶原支架的装置还包括隔热套,所述隔热套将模具未与置物台接触的外表面全部包裹。
在发明的一个具体实施例中,所述模具采用空心管状结构,使用时,采用封口胶等将空心管一端密封,加入待冷冻的溶液,再将模具置于隔热套中与之外形匹配的凹槽中,再迅速倒扣在置物台上。由于溶液具有一定的表面张力,且溶液与置物台接触后接触面的胶原溶液会迅速凝固,故其中的溶液不会漏出。
利用隔热套包裹模具,可隔绝模具与环境的热交换,更好的保证定向冷冻方向上的温度梯度。
进一步地,所述保温盒包括盒体和盒盖,所述盒盖与盒体配合构成密封的保温盒,所述模具和隔热套均位于保温盒内部。
将保温盒设置成可密闭的结构,可进一步将整个冷冻装置与外界环境隔绝,排除外界环境对冷冻过程造成的干扰,还能减少冷源的散失,充分利用资源,节约成本。
进一步地,所述置物台采用导热材料。
置物台采用导热材料制得,才能将冷源的温度传递给模具中待冷冻的溶液,才能保证在取向方向上形成良好的温度梯度。
进一步地,所述导热材料为金属材料。
金属材料具有良好的导热性,可用于制备本发明中的置物台。
在本发明的具体实施方式中,置物台采用铝合金制得。
进一步地,所述保温盒采用保温材料。
在本发明的具体实施方式中,所述保温盒为泡沫盒。
进一步地,所述隔热套材质为隔热材料。
隔热材料,是指能阻滞热流传递的材料,又称热绝缘材料。
在本发明的具体实施方式中,所述隔热套材质为高密度聚苯乙烯泡沫。
本发明还提供了一种具有定向形貌的胶原支架的制备方法,是通过在定向冷冻步骤中使用上述的装置制得;
进一步地,包括如下内容:
(1)将制冷物质加入保温盒中,将置物台放置于保温盒内的底部,使制冷物质完全充满置物台内部中空区域;
(2)将胶原/PBS混合溶液成胶后加入到模具中,将模具放入隔热套中,再将被隔热套包裹的模具放置在置物台上,使其未被隔热套包裹的一面与置物台接触,开始定向冷冻;
(3)定向冷冻结束后,将冷冻好的样品取出进行冷冻干燥即得。
所述制冷物质,是指能为本发明制备定向胶原提供定向温度梯度的低温物质,包括但不限于液氮、干冰、冰块等,只要是能提供低温的物质均可以应用于本发明方法和本发明的装置中。
在本发明的具体实施方式中,所采用的制冷物质为干冰。
在目前制备定向胶原支架的方法中,冷冻源通常采用液氮,液氮的温度很低,很容易造成工作人员的冻伤,若不慎吸入,还会有窒息的危险。
本发明方法中冷冻源采用干冰,较液氮而言,安全性能更高,使用也更方便。
进一步地,所述胶原/PBS混合溶液先进行预聚合再加入模具中,所述预聚合是将胶原/PBS混合溶液在冰浴下保持20~40min,优选30min。
进一步地,所述胶原/PBS混合溶液浓度为1~18mg/mL,pH为6.5~8.0。
进一步地,所述成胶是将胶原/PBS溶液在35~40℃恒温放置5~40min;进一步地,是在37℃恒温放置10~30min。
本发明还提供了一种具有定向形貌的胶原支架,是由上述制备方法制得;进一步地,所述胶原支架的孔隙尺寸为30~100μm,在取向方向上弹性模量为0.0025~0.0060kPa。
本发明的有益效果是:
(1)本发明的专用装置,结构简单,原料易得,成本低廉,经济适用,能广泛应用于具有定向形貌的胶原支架的制备。
(2)通过本发明的专用装置及方法制备具有定向形貌的胶原支架,制备工艺简单,方便快捷,能够在较短的时间内制备出大量的具有大面积良好定向形貌的胶原支架,同时危险系数低,制造成本低,适于推广应用和大批量生产。
(3)本发明制备的胶原支架,具有定向形貌,胶原纤维定向排列规整,孔隙尺寸小,纵向力学性能好,可应用于人体软骨修复或关节软骨、肌腱和韧带等的再生修复。
附图说明
图1是本发明制备定向形貌胶原支架的专用装置正视剖视图;
图2是本发明制备定向形貌胶原支架的专用装置俯视剖视图;
图3是传统紊乱结构的胶原支架横向剖面扫描电镜图;
图4是传统紊乱结构的胶原支架纵向剖面扫描电镜图;
图5是本发明第一组直接冷冻制备的胶原支架横向剖面扫描电镜图;
图6是本发明第一组直接冷冻制备的胶原支架纵向剖面扫描电镜图;
图7是本发明第二组37℃下成胶10min后冷冻制备的胶原支架横向剖面扫描电镜图;
图8是本发明第二组37℃下成胶10min后冷冻制备的胶原支架纵向剖面扫描电镜图;
图9是本发明第三组37℃下成胶30min后冷冻制备的胶原支架横向剖面扫描电镜图;
图10是本发明第三组37℃下成胶30min后冷冻制备的胶原支架纵向剖面扫描电镜图;
图11是本发明定向形貌胶原支架力学性能测试结果图;
图1~2中:1保温盒,11盒体,12盒盖,2置物台,3模具,4隔热套。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1制备具有定向形貌的胶原支架的专用装置
一种制备定向形貌胶原支架的装置,如图1~2所示,包括:保温盒1、置物台2、模具3和隔热套4;
所述置物台2置于保温盒1内的底部,所述置物台2内部中空且底部为开口,所述置物台2与保温盒1之间可任意相对移动,所述模具3置于置物台表面。
所述隔热套4将模具3未与置物台接触的外表面全部包裹。
所述保温盒1包括盒体11和盒盖12,所述盒盖12与盒体11配合构成密封的保温盒1,所述模具3和隔热套4均位于保温盒1内部。
在本实施例中,模具为圆柱体形,隔热套的一面具有与模具外形匹配的圆柱形凹槽。
实施例2
使用实施例1的专用装置制备具有定向形貌的胶原支架,其中:
保温盒采用泡沫盒;
置物台采用铝合金材质,为一个无盖的铝合金金属盒;
模具采用PMMA空心管,为圆柱形管状;
隔热套采用高密度聚苯乙烯泡沫材质,内部设有与模具形状匹配的孔槽,使模具能完全嵌入,嵌入深度与嵌入方向上模具的长度相同;
制冷物质为干冰。
1)将胶原蛋白溶解到一定体积的PBS(磷酸盐缓冲液)中,制得胶原浓度为1~18mg/mL的胶原PBS溶液,用NaOH稀溶液(0.0013g/mL)调混合溶液的pH为6.5~8.0,在冰浴下放置半小时进行预聚合。
2)将干冰放入泡沫保温盒底部,干冰在保温盒内的高度在泡沫盒的约1/3处,干冰作为整个体系的冷源,能够使保温盒底部的温度小于顶部的温度,在竖直方向上构建温度梯度,再将置物台放入底部被干冰覆盖的保温盒内,并使置物台内部充满干冰,再将高密度聚苯乙烯泡沫隔热套放在置物台上。
3)待胶原的半小时预聚合时间过去,分别进行两组试验:第一组的胶原培养基溶液直接加入聚甲基丙烯酸酯模具(模具空心管的一端用封口胶密封)中,再放入高密度聚苯乙烯泡沫隔热套的圆柱形凹槽中,倒扣在置物台表面,使模具未封口的一端与置物台接触,开始冷冻;第二组的胶原PBS溶液在37℃下成胶10min后,加入模具(模具空心管的一端用封口胶密封)中,再放入隔热套的圆柱形凹槽中,倒扣在置物台表面,使模具未封口的一端与置物台接触,开始冷冻;第三组的胶原PBS溶液在37℃下放置30mim后,再开始用前述同样的方法冷冻。置物台将干冰释放的热量传递至胶原PBS溶液中,在温度梯度的驱使下,使溶液由靠近置物台一端向远离置物台的一端逐渐结晶从而形成定向形貌的胶原支架。
4)各组在装置中放置冷冻5小时后,整个模具内的溶液已经结晶完毕,将冷冻成圆柱状的样品从模具中取出,在冷冻干燥机中,在真空度为10Pa,温度为-50℃下,真空干燥24~48小时,即得本发明具有定向形貌的胶原支架。
通过扫描电子显微镜(SEM)观察各组制备的胶原支架的形貌,见图5~10。
由SEM图可知,本发明三组试验制备的胶原支架均具有良好的定向形貌,胶原纤维定向排列规整,随着成胶时间的增长,胶原支架的胶原纤维尺寸和孔隙率呈增加趋势:第一组0min成胶时间的胶原支架,孔隙尺寸在20μm左右,支架在横向上的孔隙率较小,电镜下未发现大片的结构坍塌;第二组10min成胶时间的胶原支架,孔隙尺寸在30~60μm左右,支架在横向上的孔隙率较小,电镜下未发现大片的结构坍塌;第三组30min成胶时间的胶原支架,孔隙尺寸在70~100μm左右,横向上的孔隙率增大,在电镜下可以看到胶原多处折叠在一起,多处结构坍塌,力学性能较差。同时,还可以看出,成胶时间越长,胶原支架水平方向上的胶原纤维越多。
从宏观上看,未进行成胶直接冷冻的胶原支架(第一组)虽然孔隙尺寸很小但是孔壁没有成胶后的材料完整,在制样时就发现其力学性能很差,于是直接舍弃未继续进行力学性能测定;第二组和第三组制得的胶原支架在纵向上的强度高,在横向上力学强度比较差,容易被压扁,通过DMA实验分别测定其弹性模量:
DMA实验步骤:
将定向支架从冷冻模具中取出,用手术刀片将支架均匀切割成长为6mm,截面直径为6mm的圆盘状支架。同时也将传统的紊乱的支架材料切割成相同的尺寸和形状。
把DMA仪器设置为压缩模式,测得其应力应变曲线,以应变为10%处的应力应变曲线的斜率为弹性模量。
DMA实验结果:
经过DMA测试,数据处理,三种支架的DMA数据见表1:
表1
组别 | 取向方向弹性模量(Pa) | 垂直取向方向弹性模量(Pa) |
成胶10min(A1) | 5.578 | 4.074 |
成胶30min(A2) | 2.932 | 2.314 |
紊乱支架(R) | 2.304 | 2.268 |
在37℃下保温时间为10min的胶原支架材料,在取向方向上弹性模量为0.00576kPa,在垂直取向方向上的弹性模量为0.00407kPa;在37℃下保温时间为30min的胶原支架材料,在取向方向上弹性模量为0.00299kPa,在垂直取向方向上的弹性模量为0.00219kPa;未使用冷冻模具制得的传统胶原支架孔隙大小不一(图3~4),在竖直方向上的弹性模量为0.0023kPa,在水平方向上的弹性模量为0.00227kPa。
可见,采用本发明定向冷冻装置制备的胶原支架,取向良好,各孔分布均匀,在取向方向上力学性能明显提高,能够更好匹配原组织的性能,且制备方法更简单,采用干冰做冷冻源,安全性更高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种制备定向形貌胶原支架的装置,其特征在于,包括:保温盒(1)、置物台(2)和模具(3);
所述置物台置于保温盒内的底部,所述置物台内部中空且底部为开口,所述置物台与保温盒之间可任意相对移动,所述模具置于置物台表面。
2.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,还包括隔热套(4),所述隔热套将模具未与置物台接触的外表面全部包裹。
3.根据权利要求2所述的装置,其特征在于,所述保温盒包括盒体(11)和盒盖(12),所述盒盖与盒体配合构成密封的保温盒,所述模具和隔热套均位于保温盒内部。
4.根据权利要求2所述的装置,其特征在于,所述置物台采用导热材料;进一步地,所述导热材料为金属材料;更进一步地,所述金属材料为铝合金。
5.根据权利要求2所述的装置,其特征在于,所述保温盒采用保温材料;进一步地,所述保温盒为泡沫盒。
6.根据权利要求2所述的装置,其特征在于,所述隔热套材质为隔热材料;进一步地,所述隔热套材质为高密度聚苯乙烯泡沫。
7.一种具有定向形貌的胶原支架的制备方法,其特征在于,在定向冷冻步骤中使用权利要求2~6任一项所述的装置;
进一步地,包括如下内容:
(1)将制冷物质加入保温盒中,将置物台放置于保温盒内的底部,使制冷物质完全充满置物台内部中空区域;
(2)将胶原/PBS混合溶液成胶后加入到模具中,将模具放入隔热套中,再将被隔热套包裹的模具放置在置物台上,使其未被隔热套包裹的一面与置物台接触,开始定向冷冻;
(3)定向冷冻结束后,将冷冻好的样品取出进行冷冻干燥即得。
更进一步地,所述制冷物质为干冰。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述胶原/PBS混合溶液先进行预聚合再加入模具中,所述预聚合是将胶原/PBS混合溶液在冰浴下保持20~40min,优选30min;进一步地,所述胶原/PBS混合溶液浓度为1~18mg/mL,pH为6.5~8.0。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述成胶是将胶原/PBS溶液在35~40℃恒温放置5~40min;进一步地,是在37℃恒温放置10~30min。
10.一种具有定向形貌的胶原支架,其特征在于,由权利要求7~9任一项所述的制备方法制得;进一步地,所述胶原支架孔隙尺寸为30~100μm,在取向方向上弹性模量为0.0025~0.0060kPa。
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CN114732949A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-07-12 | 上海工程技术大学 | 具有取向结构的肩袖补片及其制备方法 |
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