CN110585121A - 替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶、制备方法及用途 - Google Patents

替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶、制备方法及其用途。本发明将替莫唑胺固体脂质纳米粒加载到核磁共振可视化水凝胶基质中，制备成负载替莫唑胺脂质纳米粒的水凝胶。该体系结合了替莫唑胺固体脂质纳米粒、可注射水凝胶、修饰的羟丙基壳聚糖的优点，使其缓释性能显著高于替莫唑胺固体脂质纳米粒和替莫唑胺原药；本发明的水凝胶可用于脑胶质瘤术后局部治疗，增加了载药的纳米粒子在病灶部位的滞留时间，提高了局部药物浓度，相较于目前采取的口服给药剂型，本发明提供的含有替莫唑胺组合物的原位凝胶能在术后立即实施给药，在手术残腔持续缓释，并实现对病灶部位实时监控，提高了药物的生物利用度，有助于延长术后生存期。

Description

替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶、制备方法及用途
技术领域
本发明属于化学和生物医药技术领域，具体涉及一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶、制备方法及其用途。
背景技术
人脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的原发性颅脑肿瘤，据国外临床统计，脑胶质瘤的发病率约占脑肿瘤的60％。目前对于胶质瘤的治疗主要是手术切除，以及术后放疗或化疗，但是胶质瘤极易复发，很难根治，临床治疗效果并不理想。
替莫唑胺(Temozolomide，商品名Temodar，简称TMZ)是一种咪托唑胺的类似物，是第二代口服咪唑并四嗪类抗肿瘤烷化剂类化疗药物，可透过血脑屏障，对脑胶质瘤有较好疗效。在生理条件下，TMZ无需酶催化，迅速转化为活性化合物MTIC(5-(13-甲基三嗪-1-基)咪唑-酰胺)，MTIC进一步分解为AIC(5-氨基-咪唑-4-酰胺)与甲基重氮阳离子，甲基重氮阳离子对DNA进行甲基化反应，最终阻碍DNA复制启动而引起细胞凋亡。TMZ的水溶性差，TMZ在pH<5下稳定，pH>7时易分解，可口服给药。TMZ口服后迅速吸收，进入体内广泛分布于全身，而它的分解产物MTIC在心脏、肝脏、肺等部位蓄积，引发骨髓增生异常综合征、继发性恶性肿瘤等毒副作用。
固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是新一代亚微粒给药系统，以固态天然或合成的类脂为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成的固体胶粒给药系统。SLN的平均粒径小，适用于制备成多种剂型，应用于多种给药途径，如口服、静脉注射、肺部吸入、局部用药等；SLN的组成为单一或混合的固态脂质及乳化剂，亲脂性药物可以包裹在脂质内核中或者吸附在纳米粒表面，由此形成的一种基质型或骨架型脂质载药体系，该体系在溶蚀降解的过程中缓慢释放出包载的药物从而实现缓释；SLN有较好的生物相容性和较低的体内毒性，可有效防止药物水解，提高了药物的稳定性。
水凝胶是由天然或者合成的亲水性高分子材料交联而成的，具有三维网状结构的聚合物，水凝胶可以大量吸水溶胀，且溶胀后依旧可以保持其原有结构。与传统凝胶相比，可注射水凝胶具有原位成型的特点，凝胶前体在体外呈流动态，通过导管或针头等微创方式植入体内，在病灶部位原位形成水凝胶，其流动性能够使形成的凝胶形状与缺损位置的形状更好的贴合，避免材料与组织之间形成空隙或硬块鼓包。另外，可以将药物及药物载体粒子、生物活性分子和细胞等与凝胶前体充分混合，在病灶部位原位形成水凝胶，这样该凝胶就成了药物传递中的储药仓库或是组织工程中的细胞增殖分化和再生的临时支架。
在目前的临床应用中，对于植入型材料的位置、状态、降解情况以及和周围细胞和组织的相容情况的实时监控尤其重要，但长效的对体内材料进行非损伤性的监控仍然比较困难。而核磁共振正是一种临床和研究中最常用的断层成像方法，它能无损地，无辐射伤害地提供高分辨率的图像。不少研究工作集中在体内的MRI监控纳米颗粒，纳米凝胶，微胶囊和脂质体等，但涉及到凝胶尤其是注射凝胶的却非常少。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提出一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶、制备方法及其用途，该水凝胶用于脑胶质瘤术后局部治疗，可增加载药的纳米粒子在病灶部位的滞留时间，提高局部药物浓度；相较于目前采取的口服给药剂型，本发明提供的原位凝胶具有更显著的缓释性能，原位凝胶能在术后立即实施给药，在手术残腔持续缓释，并实现对病灶部位实时监控，从而提高了药物的生物利用度。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提出一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，所述水凝胶是将替莫唑胺固体脂质纳米粒加载到核磁共振可视化水凝胶基质而形成，所述替莫唑胺固体脂质纳米粒是将替莫唑胺包封在固体脂质载体中而形成；所述替莫唑胺固体脂质纳米粒与核磁共振可视化水凝胶基质的质量比为：1:1000-1:7。
进一步地，所述核磁共振可视化水凝胶基质包括组分A的络合物和组分B，所述组分A为羟丙基壳聚糖的侧链氨基经二乙烯三胺五乙酸部分取代的产物，其结构式为：
其中m、n为自然数，m/n＝5-50％；
所述组分B为聚乙二醇两端为醛基的衍生物，其结构式为：
其中聚乙二醇的分子量为1000-4000，y为自然数，且y＝22-90；
所述组分A的络合物为组分A与Gd3+的络合物；
组分A中氨基与组分B中醛基的摩尔数之比为4:1-1:1。
更进一步地，所述m/n＝10-40％，y＝22-66，聚乙二醇分子量为1000-3000。
进一步地，所述替莫唑胺固体脂质纳米粒的粒径为190nm～240nm，它包括10-25份替莫唑胺、25-65份固体脂质载体、25-50份乳化剂。
更进一步地，所述固体脂质载体选自硬脂酸、软脂酸、山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯中的一种或多种。
更进一步地，所述固体脂质载体为软脂酸。
更进一步地，所述乳化剂选自泊洛沙姆188、大豆卵磷脂中的一种或两种。
本发明的第二个目的是提出上述任一项所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制组分A溶液：取组分A，用质量百分浓度为1％-5％的醋酸溶液配成质量百分浓度为2-5％的组分A溶液；
(2)配制组分A的络合物(HPCS-DTPA/Gd3+)溶液：取GdCl3水溶液，加入组分A溶液中，使Gd3+的浓度为0.5-2.5mM；
(3)配制组分B溶液：取组分B用蒸馏水配制成浓度为10-40％的组分B溶液；
(4)取替莫唑胺固体脂质纳米粒与组分B溶液充分混合，混合均匀后加入到HPCS-DTPA/Gd3+溶液中，使其充分混合，即得到替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶。
进一步地，所述替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备方法为溶剂乳化挥发-扩散法，具体操作步骤包括：
(1)固体脂质载体在氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)替莫唑胺在二甲亚砜中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)的替莫唑胺溶液加入到步骤(1)的固体脂质载体溶液中，充分混合，形成有机相，备用；
(4)将乳化剂溶于去离子水中，形成水相，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌，形成初乳液，备用；搅拌速度为600-1200r/min；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至60～70℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分固体脂质纳米粒凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使固体脂质纳米粒完全固化析出；
(7)将步骤(6)的固体脂质纳米粒混悬液低温高速离心，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒；离心速度为8000-12000r/min。
本发明的第三个目的是提出上述任一项所述的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明将替莫唑胺固体脂质纳米粒加载到核磁共振可视化水凝胶基质中，制备成负载替莫唑胺脂质纳米粒的水凝胶。该体系结合了替莫唑胺固体脂质纳米粒、可注射水凝胶、修饰的羟丙基壳聚糖的优点，使其缓释性能显著高于替莫唑胺固体脂质纳米粒和替莫唑胺原药；本发明的水凝胶可用于脑胶质瘤术后局部治疗，增加了载药的纳米粒子在病灶部位的滞留时间，提高了局部药物浓度，相较于目前采取的口服给药剂型，本发明提供的含有替莫唑胺组合物的原位凝胶能在术后立即实施给药，在手术残腔持续缓释，并实现对病灶部位实时监控，从而提高了药物的生物利用度，降低了药物的全身副作用，有助于降低术后复发率，延长术后生存期。
(2)本发明制备水凝胶所采用的替莫唑胺固体脂质纳米粒采用固体脂质纳米粒技术包封了替莫唑胺，制得的替莫唑胺固体脂质纳米粒与TMZ原药相比，在保证药效的同时，具有显著的缓控释作用。替莫唑胺固体脂质纳米粒通过脂质载体的溶蚀逐渐释放出替莫唑胺，避免了药物的分解和泄露，提高了药物的生物利用度。该固体脂质纳米粒有良好的的药物包封率(最高可达85％-100％)和较高的载药量(10％-24％)；其粒径范围在190nm～240nm，粒径尺寸小且分布窄，具有较高的生物利用度，可应用于局部给药治疗；且活性化合物与载体之间没有化学共价键相边，没有改变活性化合物的结构。
(3)本发明使用羟丙基壳聚糖为基质给其侧链用DTPA-Gd修饰，与醛基封端的PEG制备了以亚胺键为交联元素的可注射凝胶。因为亚胺键的形成过程为可逆反应，因此该凝胶也具有自修复的特点，又因含有顺磁性金属离子Gd3+，所以在MR图像上显示高信号。以该核磁共振可视化水凝胶为基质制备本发明的产品，不需要反复注射造影剂就能持续用MRI跟踪监测病灶部位的状态，而且该凝胶可采用注射或导管导入的方式到达所需部位，创伤小或无创伤。此外，Gd3+是通过化学键较稳定的连接在聚合物上，因此，无需反复给病人注射显影剂就能够保证在较长的进间内显影，从而降低因Gd3+富集而病变的风险。随着凝胶在体内服役时间延长，壳聚糖主链会被体内的酶逐渐降解，Gd3+的浓度会慢慢减少，可指示该凝胶的降解程度，从而有效而方便地指导临床治疗，且无需二次手术取出凝胶。
附图说明
图1为本发明实施例5制备的替莫唑胺固体脂质纳米粒和替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的药物释放曲线。
图2为本发明实施例4制备的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶对U251MG细胞增殖的影响。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备
(1)在水浴条件下，称取固体脂质硬脂酸500mg在适量氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)在水浴条件下，称取替莫唑胺100mg在适量二甲亚砜(DMSO)中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)加入到步骤(1)中，充分混合，形成有机相5mL，备用；
(4)在水浴条件下，将乳化剂泊洛沙姆188 250mg溶于去离子水中，形成水相25mL(有机相与水相体积比＝1:5)，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌(600r/min)，形成初乳液，备用；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至70℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加1M盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分SLNs凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使SLNs完全固化析出；
(7)将步骤(6)的SLNs混悬液低温高速离心(8000r/min)，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒(T-SLNs)，分装冻干(-45℃，2～3天)。
2、羟丙基壳聚糖-二乙基三胺五乙酸(HPCS-DTPA)的制备(组分A)
称取HPCS(3g，5.7mmol-NH2)溶于70mL 50mM HCl水溶液中，并加热至65℃搅拌3小时至完全溶解，冷却至室温。DTPA(0.4886g，1.2mmol)用少量二次水溶解，用N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)及1M HCl水溶液调节pH至4.7。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.1645g，1.44mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，0.2740g，1.44mmol)(均相当于DTPA的1.2当量)用50mM HCl水溶液溶解后与DTPA溶液在冰水浴中混合均匀。将DTPA/EDC/NHS混合物溶液加入到HPCS溶液中并在70℃下搅拌反应30小时，在室温下再反应12小时。装入截留分子量8k～14kDa的透析袋，对二次水透析3天，透析内液经冷冻干燥得到白色粉末HPCS-DTPA。
3、两端醛基化聚乙二醇(PEG-DF)的制备(组分B)
PEG 1000(1.00g，1.0mmol)经二氯甲烷溶解，乙醚沉淀后在50℃的真空烘箱中干燥过夜，溶于50mL干燥的四氢呋喃(THF)中，加入4-甲酰苯甲酸(0.66g，4.40mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.05g，0.4mmol)。二环己基碳二亚胺(DCC，1.10g，5.33mmol)溶于20mLTHF，在氮气保护下加入上述溶液中。在室温下磁力搅拌20小时，过滤白色沉淀物，通过旋蒸技术将滤液蒸干，加入适量异丙醇溶解结晶，过滤收集粗产品。重复三次，得到白色蜡状固体。
4、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备
取HPCS-DTPA用2％的醋酸溶液配成3％的HPCS-DTPA溶液；取PEG-DF(分子量1000)配成10％的水溶液。取0.7g的组分A溶液并加入25μL 0.1M GdCl3水溶液，得到HPCS-DTPA/Gd3+溶液。称取10mg替莫唑胺固体脂质纳米粒与100μL PEG-DF溶液混合，然后加入HPCS-DTPA/Gd3+溶液使其凝胶化。
实施例2
1、替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备
(1)在水浴条件下，称取固体脂质山嵛酸甘油酯250mg在适量氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)在水浴条件下，称取替莫唑胺250mg在适量二甲亚砜(DMSO)中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)加入到步骤(1)中，充分混合，形成有机相5mL，备用；
(4)在水浴条件下，将泊洛沙姆188 500mg溶于去离子水中，形成水相25mL(有机相与水相体积比＝1:5)，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌(1200r/min)，形成初乳液，备用；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至65℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加1M盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分SLNs凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使SLNs完全固化析出；
(7)将步骤(6)的SLNs混悬液低温高速离心(8000r/min)，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒(T-SLNs)，分装冻干(-45℃，2～3天)。
2、羟丙基壳聚糖-二乙基三胺五乙酸(HPCS-DTPA)的制备、两端醛基化聚乙二醇(PEG-DF)的制备同实施例1.
3、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备
取HPCS-DTPA用2％的醋酸溶液配成3％的HPCS-DTPA溶液；取PEG-DF(分子量2000)配成20％的水溶液。取0.7g的组分A溶液并加入25μL 0.1M GdCl3水溶液，得到HPCS-DTPA/Gd3+溶液。称取20mg替莫唑胺固体脂质纳米粒与200μL PEG-DF溶液混合，然后加入HPCS-DTPA/Gd3+溶液使其凝胶化。
实施例3
1、替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备
(1)在水浴条件下，称取固体脂质单硬脂酸甘油酯650mg在适量氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)在水浴条件下，称取替莫唑胺100mg在适量二甲亚砜(DMSO)中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)加入到步骤(1)中，充分混合，形成有机相5mL，备用；
(4)在水浴条件下，将乳化剂泊洛沙姆188 250mg溶于去离子水中，形成水相25mL(有机相与水相体积比＝1:5)，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌(1200r/min)，形成初乳液，备用；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至65℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加1M盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分SLNs凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使SLNs完全固化析出；
(7)将步骤(6)的SLNs混悬液低温高速离心(12000r/min)，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒(T-SLNs)，分装冻干(-45℃，2～3天)。
2、羟丙基壳聚糖-二乙基三胺五乙酸(HPCS-DTPA)的制备、两端醛基化聚乙二醇(PEG-DF)的制备同实施例1.
3、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备
取HPCS-DTPA用2％的醋酸溶液配成3％的HPCS-DTPA溶液；取PEG-DF(分子量3000)配成30％的水溶液。取0.7g的组分A溶液并加入25μL 0.1M GdCl3水溶液，得到HPCS-DTPA/Gd3+溶液。称取30mg替莫唑胺固体脂质纳米粒与300μL PEG-DF溶液混合，然后加入HPCS-DTPA/Gd3+溶液使其凝胶化。
实施例4
1、替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备
(1)在水浴条件下，称取固体脂质软脂酸400mg和辅助乳化剂大豆卵磷脂100mg在适量氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)在水浴条件下，称取替莫唑胺100mg在适量二甲亚砜(DMSO)中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)加入到步骤(1)中，充分混合，形成有机相5mL，备用；
(4)在水浴条件下，将乳化剂泊洛沙姆188 400mg和甘露醇20mg溶于去离子水中，形成水相25mL(有机相与水相体积比＝1:5)，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌(900r/min)，形成初乳液，备用；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至60℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加1M盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分SLNs凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使SLNs完全固化析出；
(7)将步骤(6)的SLNs混悬液低温高速离心(12000r/min)，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒(T-SLNs)，分装冻干(-45℃，2～3天)。
2、羟丙基壳聚糖-二乙基三胺五乙酸(HPCS-DTPA)的制备、两端醛基化聚乙二醇(PEG-DF)的制备同实施例1.
3、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备
取HPCS-DTPA用2％的醋酸溶液配成3％的HPCS-DTPA溶液；取PEG-DF(分子量4000)配成40％的水溶液。取0.7g的组分A溶液并加入25μL 0.1M GdCl3水溶液，得到HPCS-DTPA/Gd3+溶液。称取20mg替莫唑胺固体脂质纳米粒与400μL PEG-DF溶液混合，然后加入HPCS-DTPA/Gd3+溶液使其凝胶化。
实施例5
1、替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备
(1)在水浴条件下，称取固体脂质软脂酸500mg和辅助乳化剂大豆卵磷脂50mg在适量氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)在水浴条件下，称取替莫唑胺250mg在适量二甲亚砜(DMSO)中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)加入到步骤(1)中，充分混合，形成有机相5mL，备用；
(4)在水浴条件下，将乳化剂泊洛沙姆188 200mg溶于去离子水中，形成水相25mL(有机相与水相体积比＝1:5)，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌(1200r/min)，形成初乳液，备用；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至65℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加1M盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分SLNs凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使SLNs完全固化析出。
(7)将步骤(6)的SLNs混悬液低温高速离心(12000r/min)，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒(T-SLNs)，分装冻干(-45℃，2～3天)。
2、羟丙基壳聚糖-二乙基三胺五乙酸(HPCS-DTPA)的制备、端醛基聚乙二醇(PEG-DF)的制备同实施例1.
3、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备
取HPCS-DTPA用2％的醋酸溶液配成3％的HPCS-DTPA溶液；取PEG-DF(分子量2000)配成20％的水溶液。取0.7g的组分A溶液并加入25μL 0.1M GdCl3水溶液，得到HPCS-DTPA/Gd3+溶液。称取20mg替莫唑胺固体脂质纳米粒与200μL PEG-DF溶液混合，然后加入HPCS-DTPA/Gd3+溶液使其凝胶化。
实施例6
1、替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备
(1)在水浴条件下，称取固体脂质软脂酸400mg，单硬脂酸甘油脂250mg和辅助乳化剂大豆卵磷脂50mg在适量氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)在水浴条件下，称取替莫唑胺100mg在适量二甲亚砜(DMSO)中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)加入到步骤(1)中，充分混合，形成有机相5mL，备用；
(4)在水浴条件下，将乳化剂泊洛沙姆188 200mg溶于去离子水中，形成水相25mL(有机相与水相体积比＝1:5)，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌(1200r/min)，形成初乳液，备用；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至70℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加1M盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分SLNs凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使SLNs完全固化析出。
(7)将步骤(6)的SLNs混悬液低温高速离心(12000r/min)，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒(T-SLNs)，分装冻干(-45℃，2～3天)。
2、羟丙基壳聚糖-二乙基三胺五乙酸(HPCS-DTPA)的制备、端醛基聚乙二醇(PEG-DF)的制备同实施例1.
3、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备
取HPCS-DTPA用2％的醋酸溶液配成3％的HPCS-DTPA溶液；取PEG-DF(分子量2000)配成20％的水溶液。取0.7g的组分A溶液并加入25μL 0.1M GdCl3水溶液，得到HPCS-DTPA/Gd3+溶液。称取20mg替莫唑胺固体脂质纳米粒与200μL PEG-DF溶液混合，然后加入HPCS-DTPA/Gd3+溶液使其凝胶化。
对本发明的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶进行以下检测试验：
一、替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的体外释放
精确称取一定量的替莫唑胺原料药、替莫唑胺固体脂质纳米粒和替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，配成等药物浓度的的替莫唑胺水溶液(T-Sol)、替莫唑胺的T-SLNs水分散体和替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶(T-SLNs@Gel)，分别置于在30mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，在37℃的恒温水浴振荡器中，65rpm振荡，于一定间隔时间取样2mL，并补充同体积的新鲜PBS缓冲溶液，取出的释放介质用紫外分光光度仪进行检测，计算得到相应的替莫唑胺体外释放曲线。
图1为本发明实施例5制备的替莫唑胺固体脂质纳米粒和替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的药物释放曲线。由图可知，替莫唑胺原料药释放很快，3h即达到完全释放；实施例5制备的替莫唑胺固体脂质纳米粒前期释放较快，后期趋于缓慢，72h后累计释放量达总量的80％，此后稳定持续释放；实施例5制备的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶在12h前快速释放，之后释放速度逐渐减小，192h后达到稳定释放。曲线表明，替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶相对于替莫唑胺固体脂质纳米粒和替莫唑胺原料药具有明显的缓释作用。
二、核磁共振可视化可注射水凝胶的体外肿瘤细胞增殖实验
体外肿瘤细胞增殖实验采用结晶紫染色测定法，以人脑胶质瘤U251MG细胞为例。U251MG细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％的CO2条件下常规培养。取对数生长期的细胞，接种于12孔板中，密度是1.5×105个/孔，3mL/孔。将样品分为两组：原料药TMZ组和T-SLNs@Gel组，每组4个平行孔，每组的药物终浓度为5、10、50μM。作用48h后用戊二醛固定使细胞停止生长，固定后的细胞用去离子水洗涤至戊二醛洗净，烘箱37℃干燥。加入0.1％的结晶紫液对细胞染色振摇30分钟，用蒸馏水将剩余的结晶紫液冲洗干净。
图2为本发明实施例4制备的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶对U251MG细胞增殖的影响。由图可知，本发明制备的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶相对于替莫唑胺原料药，其药效无明显改变。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，所述水凝胶是将替莫唑胺固体脂质纳米粒加载到核磁共振可视化水凝胶基质而形成，所述替莫唑胺固体脂质纳米粒是将替莫唑胺包封在固体脂质载体中而形成；所述替莫唑胺固体脂质纳米粒与核磁共振可视化水凝胶基质的质量比为：1:1000-1:7。
2.根据权利要求1所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，所述核磁共振可视化水凝胶基质包括组分A的络合物和组分B，所述组分A为羟丙基壳聚糖的侧链氨基经二乙烯三胺五乙酸部分取代的产物，其结构式为：
其中m、n为自然数，m/n＝5-50％；
所述组分B为聚乙二醇两端为醛基的衍生物，其结构式为：
其中聚乙二醇的分子量为1000-4000，y为自然数，且y＝22-90；
所述组分A的络合物为组分A与Gd3+的络合物；
组分A中氨基与组分B中醛基的摩尔数之比为4:1-1:1。
3.根据权利要求2所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，所述m/n＝10-40％，y＝22-66，聚乙二醇分子量为1000-3000。
4.根据权利要求1所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，所述替莫唑胺固体脂质纳米粒的粒径为190nm～240nm，它包括10-25份替莫唑胺、25-65份固体脂质载体、25-50份乳化剂。
5.根据权利要求4所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，所述固体脂质载体选自硬脂酸、软脂酸、山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，所述固体脂质载体为软脂酸。
7.根据权利要求4所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶，其特征在于，其特征在于，所述乳化剂选自泊洛沙姆188、大豆卵磷脂中的一种或两种。
8.如权利要求1-7任一项所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制组分A溶液：取组分A，用质量百分浓度为1％-5％的醋酸溶液配成质量百分浓度为2-5％的组分A溶液；
(2)配制HPCS-DTPA/Gd3+溶液：取GdCl3水溶液，加入组分A溶液中，使Gd3+的浓度为0.5-2.5mM；
(3)配制组分B溶液：取组分B用蒸馏水配制成浓度为10-40％的组分B溶液；
(4)取替莫唑胺固体脂质纳米粒与组分B溶液充分混合，混合均匀后加入到HPCS-DTPA/Gd3+溶液中，使其充分混合，即得到替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶。
9.根据权利要求8所述的一种替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述替莫唑胺固体脂质纳米粒的制备方法为溶剂乳化挥发-扩散法，具体操作步骤包括：
(1)固体脂质载体在氯仿中避光加热溶解，备用；
(2)替莫唑胺在二甲亚砜中充分溶解，备用；
(3)将步骤(2)的替莫唑胺溶液加入到步骤(1)的固体脂质载体溶液中，充分混合，形成有机相，备用；
(4)将乳化剂溶于去离子水中，形成水相，备用；
(5)将步骤(3)制得的有机相缓慢滴加到步骤(4)制得的水相中，滴加过程中快速搅拌，形成初乳液，备用；搅拌速度为600-1200r/min；
(6)将步骤(5)制得的初乳液升温至60～70℃，待体系中的氯仿完全挥发，同时，向体系中滴加盐酸溶液，调节pH值至pH<5，使得部分固体脂质纳米粒凝聚析出，在冰水浴中冷却至0～4℃，降温使固体脂质纳米粒完全固化析出；
(7)将步骤(6)的固体脂质纳米粒混悬液低温高速离心，分离上层清液，得到替莫唑胺固体脂质纳米粒；离心速度为8000-12000r/min。
10.权利要求1-7任一项所述的替莫唑胺核磁共振可视化可注射水凝胶在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的用途。
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