CN110582284A - 粘液屏障性能的增强 - Google Patents

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Abstract

一种组合物或避孕组合物及其用途，该组合物或避孕组合物包含生理学上可接受的载体中的粘膜粘附聚合物，其中粘膜粘附聚合物由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元组成，该单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单。

Description

粘液屏障性能的增强
技术领域
本发明涉及包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的组合物，及其在治疗或避孕中的用途。该粘膜粘附聚合物可以交联粘液层而不使粘液聚结。
背景技术
在人体内，包括肺、胃肠道和女性生殖道内暗藏有超过400平方米的上皮表面。湿的上皮表面依赖于粘液凝胶保护其防止脱水、剪切应力和感染。除水外，粘液主要含有与蛋白质、脂质和盐混合的粘蛋白生物聚合物。粘蛋白是大型糖蛋白，其由稠密地布置有可以占分子的分子量的至多50％的低聚糖的延伸的中心蛋白核构成。粘蛋白在这种保护功能中起着核心作用，产生基于尺寸排阻和亲和力的选择性过滤，防止许多有害分子到达上皮表面。
然而，在某些情况下，粘液凝胶可能无法正确保护上皮细胞。例如，干眼症和口干症影响至少8％的人群。由于这些表面失去水合和润滑，症状可能会严重不适，而且由于感染风险增加，也会对健康造成威胁。如克罗恩病或溃疡性结肠炎的炎性肠病也与粘蛋白凝胶未能正确地保护上皮表面免受共生或致病细菌影响有关。细菌进入上皮细胞会触发难以停止的炎症循环。
粘膜粘附聚合物由于其粘附性质已经用于药物递送。例如，它们已被用于将药物递送到炎症部位。粘膜粘附聚合物通常与药物一起组装成材料或凝胶，旨在将药物浓缩于粘液层的表面上并改进药物递送。
WO 2004069230涉及含有生理活性剂，即药物和持续释放或粘膜粘附剂，例如，壳聚糖的药物组合物，其用于延长活性剂从组合物中的释放。
壳聚糖的另一个用途是女性避孕。CN 102895256涉及一种适用于女性避孕和杀真菌效果的壳聚糖凝胶发泡剂及其制备方法，并且属于发泡剂生产技术领域。根据该公开，壳聚糖分子被截留于与卡波姆结合的固体泡沫基质中，这会物理地阻止精子通过。已知粘膜粘附分子促进粘膜组织的紧密和增厚或增强屏障功能，但使用表明，粘膜粘附聚合物和粘液渗透纳米颗粒将会交联并聚结粘液。具体地，当存在高分子量的聚丙烯酸如卡波姆时，丙烯酸单体中的羧基官能团会与壳聚糖链中的碱性氨基形成离子型复合物，导致形成高度溶胀的互相贯穿的聚合物网络。因此，粘液的聚结会导致粘液内孔隙的打开，并导致粘液的屏障性能削弱。因此，需要改进粘液的交联而不发生聚结。
发明内容
因此，在该背景下，本发明的目的是提供可以交联粘液层而不聚结粘液的粘膜粘附聚合物。本发明人出乎意料地发现，由4至20个通过醚、酯或酰胺键相互连接的单体单元组成的粘膜粘附聚合物获得了增强的效果，其中单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生C6糖和脂肪酸衍生C5糖组成的列表，其中粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基基团或粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的列表。在第一方面中，本发明涉及包含上文定义的粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的组合物。在另一方面中，本发明涉及包含如上定义的粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的组合物，用于疗法，例如用于治疗粘膜损伤。在进一步的方面中，本发明涉及包含上文定义的粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的避孕组合物。在另一方面中，本发明涉及包含含有上文定义的粘膜粘附聚合物的组合物、生理学上可接受的胶凝剂和施药器的部件的试剂盒。
小尺寸的聚合物有利地允许分子在粘液内扩散。粘膜粘附聚合物到粘膜中的改进的扩散使得可以在大的厚度上交联粘液层，而不会聚结粘液。小的粘膜粘附聚合物与粘液复合，从而阻塞网络的孔隙并增强其屏障性能。此外，与较大尺寸的聚合物相比，小尺寸聚合物通常在适于递送至受试者的粘膜的条件下更可溶。因此，粘膜粘附聚合物可以更有效地递送到粘膜，这转而允许比使用更大粘膜粘附聚合物分子可获得的交联更强，而因此更有效。粘膜粘附聚合物通常可以是阳离子型的，例如至少50％的单体具有带正电荷的氨基，或疏水的，例如至少50％的单体具有疏水侧链。交联的粘液的有效持续时间由粘液的生物更新时间决定，粘液的生物更新时间可以根据身体的不同器官，例如眼睛，呼吸道，口腔或生殖道而不同。交联时间可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时，1、2、3天或甚至长达10天。
因此，粘膜粘附聚合物会提供阻止细胞和微生物如细菌、病毒和精子渗透交联的粘液并扩散到粘膜中的更可靠的屏障效果。因此，本发明的一个方面是用于预防妊娠和/或性传播感染(STI)的组合物，例如避孕组合物。
通过与生理学上可接受的胶凝剂组合，组合物和粘液之间的接触面积最大化。增加的接触面积可以帮助确保最大量的粘膜粘附聚合物可以扩散到粘液层中并改变其性质。还有助于增加扩散的是组合物的高密度。通过具有高的组合物密度，优选类似于水的密度，如半固体凝胶，施加的组合物可以改变形状并包封宫颈入口的整个表面。
此外，本发明提供了不含具有不期望的副作用的激素或化学品的避孕组合物。不期望的作用可能包括栓塞、偏头痛或轻微副作用，如影响月经周期。根据本发明的粘膜粘附聚合物的有效时间由粘液的更新时间决定，这意味着避孕效果是暂时的。避孕药在有效时间后溶解，而生育能力不受影响。充分避孕的时间受到几个因素的影响，如粘液的生物更新时间、粘膜粘附聚合物的浓度等，并持续一段时间，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时，1、2、3天或甚至长达10天，这是足以阻止精子细胞进入子宫颈的时间。通过阻止精子进入子宫颈，阴道的酸性环境将降低精子的运动性并削弱精子而使其无法使卵子受精。在自然条件下，精子细胞需要在几分钟内进入子宫颈才能存活。单次施加获得完全的避孕效果，这意味着避孕组合物的非连贯使用可以提供与连贯使用相同的保护。
单次施加获得完全的避孕效果，这意味着宫颈粘液与避孕组合物的暂时接触提供与宫颈粘液的持续接触相同的完全保护。
粘膜粘附聚合物由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元构成。此外，多糖单体可以通过醚键、酯键和/或缩醛键连接。在本发明的一个实施方式中，粘膜粘附聚合物的至少50％的单体包含氨基。在本发明的另一个实施方式中，粘膜粘附聚合物的至少50％的单体包含疏水基团。氨基使粘膜粘附聚合物呈碱性，这有利于它们与粘膜的结合。碱性氨基特别地提供更有效的交联。此外，当粘膜粘附聚合物的至少50％单体包含疏水基团时，粘膜粘附聚合物还可以粘附并扩散到粘膜中以交联粘膜而不会聚结粘液。
在本发明的上下文中，氨基是-NH2，其中一个或两个氢原子可以被基团R取代，或氨基可以是具有3个R基团的季氨基。R可以选自C1-4烷基，可选地被一个或多个-OH、-SH或-NH2取代，并且当在相同的氮原子上存在多于一个R时，它们可以相同或不同。只要R具有4个或更少的碳原子，特别是当R的氢原子被一个或多个-OH、-SH或-NH2取代时，氨基通常是碱性的。更长的烷基链，例如，具有5个或更多个碳原子的氨基，倾向于掩盖氨基的碱性，并且在本发明的上下文中，带有5个或更多个碳原子的烷基的氨基不算作氨基。同样地，糖也可以包含酰胺基团，例如，-CONHCH3或-NHCHO，但在本发明的上下文中，这些基团不算作氨基。
粘膜粘附聚合物可以是其中C6或C5糖通过醚键彼此连接的多糖。C6和C5糖的单体可以通过任何醚键连接，例如，可以连接两个相邻C6糖的C1和C4，或可以连接两个相邻C6糖的C1和C6。具体地，当单体是C6糖例如葡萄糖时，则单体例如葡萄糖单体可以通过β(1-4)键连接。在一个实施方式中，粘膜粘附聚合物由4至20个β(1-4)连接的葡萄糖单体构成，其中至少50％的葡萄糖单体包含氨基，例如-NH2。氨基可以连接至葡萄糖单体的任何碳原子，例如C2或C3。在氨基中，一个或两个氢原子可以被基团R取代，基团R可以选自C1-4烷基，可选地被一个或多个-OH、-SH或-NH2取代。
在优选的实施方式中，粘膜粘附聚合物是壳聚糖，其中至少50％的葡萄糖单体具有-NH2基团，并且其中小于20％的葡萄糖单体具有-CONHCH3基团。壳聚糖也可以是指至少50％脱乙酰化的。粘膜粘附聚合物的其他具体实施方式包括阳离子化的二醛纤维素(DAC)、阳离子羟乙基纤维素、壳聚糖、壳聚糖-三甲基(三甲基壳聚糖，chitosan-trimethyl)，壳聚糖-巯基乙酸，壳聚糖-亚氨基四氢噻吩(iminothiolane)或壳聚糖-硫代乙脒。
对于阳离子化的二醛纤维素和阳离子羟乙基纤维素，应该理解的是，二醛或羟甲基纤维素中至少50％的葡萄糖单体被阳离子胺所胺化，因此多糖是阳离子型的。
在本发明的一个实施方式中，至少50％的单体单元是由脂肪酸衍生的糖单体。在本发明的上下文中，脂肪酸被认为是疏水基团。任何脂肪酸都适用于本发明，但脂肪酸优选是天然存在的和生物可降解的。优选的脂肪酸具有6至22个碳原子，特别是偶数个碳原子，并且脂肪酸可以包含一个或多个双键。脂肪酸优选通过酯键与糖单体连接。
在本发明的另一个实施方式中，粘膜粘附聚合物是长度为4至20个氨基酸的肽分子，其通过酰胺键连接。当粘膜粘附聚合物包含氨基酸时，可以包括任何氨基酸，只要视情况至少50％的氨基酸带有碱性基团，或只要至少50％的氨基酸带有疏水基团。粘膜粘附聚合物不限于天然存在的氨基酸，但优选的是氨基酸是无毒的并且是受试者可耐受性的。优选的是粘膜粘附聚合物不包含D-氨基酸，但粘膜粘附聚合物中包含的任何氨基酸都是L-氨基酸。通常，以下氨基酸被认为是碱性的：精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸和β-丙氨酸，并且在一个实施方式中，粘膜粘附聚合物是4至20个氨基酸的多肽，其中至少50％的氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸和β-丙氨酸组成的列表。其余的氨基酸可以选自任何氨基酸，例如由遗传密码定义的20种氨基酸中的任何氨基酸，但具体是甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。粘膜粘附聚合物的具体实施方式包括聚赖氨酸，聚鸟氨酸和聚精氨酸。使用碱性氨基酸的优点是它们在水溶液中具有良好的溶解性。
在另一个实施方式中，粘膜粘附聚合物是长度为4至20个氨基酸的肽分子，其中至少50％的氨基酸带有疏水基团，氨基酸选自以下组成的列表：丙氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸。其余的氨基酸可以选自由以下组成的列表：甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。在一个实施方式中，粘膜粘附聚合物包含氨基酸，并且至少50％的氨基酸选自由精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸和β-丙氨酸组成的组，或50％的氨基酸带有疏水基团并选自由精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸和β-丙氨酸组成的组。使用氨基酸或疏水性氨基酸是有利的，因为它们是可生物降解的，粘液蛋白和聚合物之间的蛋白-肽相互作用可以增强粘膜粘附。此外，氨基酸聚合物可以使用细菌重组产生或合成产生。
在进一步的实施方式中，如果至少50％的单体是碱性的，例如带有氨基，或至少50％的单体是疏水的，例如携带疏水基团，则粘膜粘附聚合物包含两种糖单体，例如，C6和/或C5糖单体和氨基酸。
在另一个实施方式中，聚合物由20或优选10或8个单体单元组成，这确保聚合物足够小以深入扩散到粘液凝胶中并又足够大以形成紧密的交联网络。紧密是指微生物或精子细胞不可渗透。
在进一步的实施方式中，粘膜粘附聚合物选自具有低分子量的聚合物，其应该具有提供0.5至约5kDa范围内的分子量的聚合度(DP)，这确保粘膜粘附聚合物形成与粘液的稳定复合物。在优选的实施方式中，粘膜粘附聚合物是壳聚糖，且壳聚糖的优选DP提供0.5至约3.5kDa范围内，更优选0.7至2kDa范围内，最优选约1.5kDa的分子量。
在另一方面中，本发明是包含含有粘膜粘附聚合物和生理上可接受的胶凝剂的组合物，例如如上描述的避孕组合物，和施药器的部件的试剂盒。在一个实施方式中，施药器是类似于已知通过一方法使用的卫生棉条的递送装置，在该方法中包含如上描述的含有粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的以凝胶形式的组合物，例如避孕组合物的施药器插入阴道中。凝胶从施药器展开，并且凝胶施加于宫颈粘液，且粘液被粘膜粘附聚合物交联。在一个实施方式中，施药器是容器，其装有避孕组合物，例如作为避孕组合物，并且其可以通过排空机制排空。在另一个实施方式中，容器类似于球囊，其在第一条件下装有组合物，且在第二条件下移除以给予组合物。在又一个实施方式中，试剂盒包含用于治疗粘膜损伤的组合物中的粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂和施药器，其中施药器是容器，组合物以液体或滴剂形式从容器中释放。
附图说明
图1.壳聚糖溶液中的粘蛋白凝胶滴的示意图和壳聚糖DP8、DP52和DP100的复合物表面的冷冻SEM图像。
图2.参与与纯化的粘蛋白滴剂的复合的壳聚糖的量的量化条形图。
图3.显示荧光标记的葡聚糖在粘蛋白液滴/壳聚糖复合物中的扩散的条形图。
图4.在多孔膜上培养的HT29-MTX培养物的组织学图像。(A)年轻的，7日龄的培养物显示出多层结构。(B)在培养30天后，这些变得极化并涂有粘附粘液的层(蓝色染色)。(C)暴露于各种浓度的壳聚糖溶液后年轻的HT29-MTX细胞的代谢活性的条形图。(D)暴露于5mg/mL壳聚糖溶液后成熟的HT29-MTX的代谢活性的条形图。
图5.显示暴露于荧光标记的葡聚糖(A列)或霍乱毒素亚基B(B列)的HT29-MTX细胞的流式细胞术的输出的图表。测试的三种条件是生长30天具有粘液层的HT29-MTX(线I)、生长7天没有粘液层并用壳聚糖处理的HT29-MTX(线II)和生长30天具有粘液层并用壳聚糖处理的HT29-MTX(线III)。
图6.(A)显示参与与用粘液层覆盖的成熟HT29-MTX培养物的复合的壳聚糖量的量化的条形图。HT29-MTX细胞层和顶部的壳聚糖-FITC沉积的共焦图像以及所有三种壳聚糖(B)DP8、(B')DP52和(B”)DP100的截面视图。
图7.在粘膜粘附氨基酸聚合物和粘蛋白凝胶之间接触3min、12min、30min和50min后拍摄的光学显微镜(10×物镜)图像。
图8.与置于精子溶液中的壳聚糖复合或不复合的猪胃粘蛋白的相显微镜图像。
图9.A)滴入壳聚糖溶液中的4μL粘蛋白凝胶的宏观图像。B)使用荧光素标记的壳聚糖的复合物边界的共焦荧光图像。
图10.壳聚糖寡聚体在含有排卵的人宫颈粘液的毛细管中渗透的荧光强度测量。
图11.以每个视野的精子数和渗透距离测量的人体宫颈粘液上两次重复的精子渗透数据。
图12.通过前进能动性(％)，能动性(％)和速度(μm/s)的损失表示的壳聚糖寡聚体对精子细胞的毒性。
具体实施方式
本发明的主题涉及包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的组合物，其中粘膜粘附聚合物由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元构成，单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化C5的糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的列表，其中粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生C6糖和脂肪酸衍生C5糖组成的组。粘膜粘附剂聚合物可以用作避孕药，且在另一方面中，本发明涉及具有粘膜粘合聚合物和胶凝剂的避孕组合物。
在本发明的在另一方面中，包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的组合物用于疗法，粘膜粘附聚合物由4至20个通过醚，酯或酰胺键相互连接的单体单元构成，其单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的列表，其中粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的列表。
包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂的组合物可以是另外包括施药器的试剂盒的部分。施药器可以用于将组合物施加于例如子宫颈的表面上。
粘膜粘附聚合物可以在生理学上可接受的载体中给予，这确保了粘膜粘附聚合物在其使用的条件下是可溶的，并确保粘膜粘附聚合物均匀地分布于目标区域中。本文中均匀分布是指靶向的粘液区域经受对于技术人员可确定的至少最小量的组合物，具有足够的粘膜粘附聚合物扩散到粘液中并增强粘液屏障。
生理学上可接受的载体是指无毒的化合物，其在有效剂量下对人或动物生物体或生物过程既不是化学上也不是物理上毒性的。
在一个实施方式中，药学上可接受的载体是水、DMSO、盐水或其组合。
粘膜粘附在本文中被描述为将两种生物材料固定在一起的界面力，如生物材料和粘液或粘膜之间的吸引力。因此，对于粘膜粘附聚合物，是指对粘液或粘膜具有吸引力的聚合物。
粘液是所有上皮表面的保护性覆盖物，其保持上皮层湿润并防止微生物侵入上皮细胞。由于粘液截留微生物并促进其远端运输，因此实现了天然的保护作用。当提到由粘膜粘附聚合物实现的屏障效应时，由于聚合物的交联，其是粘液的增强。增强的屏障的作用是基于交联的粘液阻止扩散的紧密性，以及粘液被复合的粘膜粘附聚合物增强的时间长短。后者由来自粘膜的粘液细胞去除包含交联聚合物的粘液的天然更新时间。
粘膜上的粘液层的厚度是不同的，并基于不同的生物因素，例如身体的部分、动物种类、年龄或疾病爆发，并且因此由粘膜粘附聚合物影响的厚度取决于这些因素，并可能从几微米到几百微米不等。复合的粘液的厚度以及因此防止异物扩散到粘膜中所需的屏障效果取决于粘膜粘附聚合物的使用。屏障层的一个厚度对于相对较大的细胞如精子可能是不可渗透的，然而可能需要更加紧密的屏障层才能对细菌或病毒或其他微生物或感染是不可渗透的。
小的粘膜粘附聚合物由4至20个单体单元构成，其通过醚键、酯键或酰胺键相互连接。单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的列表，其中粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的列表。
本文中的小聚合物是具有低聚合度(DP)，如20个单体或更低，优选5至20个范围内，如DP为8，并且分子量低于5kDa，优选0.7至2kDa范围内，如1.5kDa的聚合物。
小尺寸聚合物确保了聚合物在使用的条件下是可溶的，并且聚合物可以通过粘液的孔隙扩散并形成厚且紧密的屏障。
粘膜粘附聚合物应该在靶向的粘膜的环境中是稳定的，其可以处于例如胃或女性腹腔的低pH至细胞中的中性或弱碱性pH范围内。因此粘膜粘附聚合物稳定的pH范围为1-8的范围。取决于pH环境，可以使用不同类型和尺寸的聚合物。例如DP8壳聚糖在碱性pH下是可溶的，而DP52壳聚糖和DP100仅在pH<6时是可溶的。
当粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂粘附于粘液时，发生聚合物的扩散。粘膜粘附聚合物因为其低聚合度和乙酰化程度提供了良好的粘膜粘附，可以在疗法中的使用。这允许聚合物扩散到粘液中并暂时阻塞粘液的孔隙。这由于粘液的暂时交联作用而发生，其由粘液的正常更新时间和粘膜粘附聚合物的生物降解性控制。因此，有效的交联时间可以通过使粘液经受不同的粘膜粘附聚合物浓度，如例如1至100mg/mL，如5mg/mL的浓度来调节。
粘膜粘附聚合物由于其粘附性能和小尺寸，会渗透粘液并扩散到粘液表面而形成厚层。然后，小的粘膜粘附聚合物与粘液复合，由此阻塞网络的孔隙，为粘液提供增强的屏障性质。当粘液被增强时，其对颗粒是不可渗透的，并阻止，例如例如外部引入的液体、颗粒和细胞，如精子通过。粘液中形成的复合物可以靶向一定尺寸的细胞，而因此对于范围为20-30nm的病毒粒子、0.3微米范围内的支原体、0.5至5微米范围内的细菌，或3微米的范围内的精子是不可渗透的。
包含粘膜粘附聚合物和药学上可接受的胶凝剂的本发明的组合物是避孕剂，因为处理的粘液对精子是暂时不可渗透的。与本发明有关的避孕效果是指由于通过单次使用实现的非手术、无激素和非连贯阻隔效果所致的可逆且暂时的妊娠阻止，意味着避孕效果通过一次施加实现，而并不需要如同丸剂在一定时间内产生一定浓度。
包含粘膜粘附聚合物和药学上可接受的胶凝剂的本发明的组合物是避孕剂，因为处理的粘液对精子是暂时不可渗透的。与本发明有关的避孕效果是指由于在宫颈粘液与溶液接触的几分钟内实现并且几小时内使用或不使用进一步的避孕药作用都是稳定的非手术、无激素和非连贯的阻隔效果所致的可逆而暂时的妊娠防止作用。这种效果通过单次使用实现，这意味着通过一次施加实现避孕效果，而不需要在一段时间内维持一定浓度。
临时效果表明，当施加于粘液时，粘膜粘附聚合物的效果是可逆的。逆转发生的速率取决于扩散到粘液中的聚合物的量和粘液本身的生物学更新时间。
在本发明的上下文中，损伤(lesion)是指组织结构或组成的任何损害或不期望的变化。这可能发生于人体或动物体内的任何地方，包括软组织损伤，皮肤损伤，肠道损伤和粘膜组织的任何损伤，如肺或其他器官或腹内组织，如但不限于子宫颈，阴道和/或子宫。
图1是壳聚糖溶液中的粘蛋白凝胶滴剂的示意图和壳聚糖DP8、DP52和DP100复合物表面的冷冻SEM图像。
图2显示了参与与纯化的粘蛋白滴剂的复合的壳聚糖的量的量化。
图3示出了荧光标记的葡聚糖在粘蛋白滴/壳聚糖复合物中的扩散。(D)葡聚糖70KDa的扩散前沿行进速度。
图4显示了壳聚糖溶液对HT29-MTX细胞的毒性。在多孔膜上培养的HT29-MTX培养物的组织学。(A)7日龄的培养物显示多层结构。(B)在培养30天后，这些变得极化并覆盖有粘附粘液的层(蓝色染色)。(C)暴露于各种浓度的壳聚糖溶液后7日的HT29-MTX细胞的代谢活性。(D)暴露于5mg/mL壳聚糖溶液后成熟的HT29-MTX的代谢活性。
图5显示了暴露于荧光标记的葡聚糖(A列)或霍乱毒素亚基B(B列)的HT29-MTX细胞的流式细胞术分析的结果。测试的三种条件是生长30天具有粘液层的HT29-MTX(线I)、生长7天没有粘液层并用壳聚糖处理的HT29-MTX(线II)和生长30天具有粘液层并用壳聚糖处理的HT29-MTX(线III)。
图6显示了参与与粘液层覆盖的成熟HT29-MTX培养物的复合的壳聚糖的量的量化的结果。HT29-MTX细胞层和顶部的壳聚糖-FITC沉积的共焦图像以及所有三种壳聚糖(B)DP8、(B')DP52和(B”)DP100的截面视图。
图7示出了低分子量或高分子量粘膜粘附聚合物对粘蛋白凝胶的影响。将纯化的猪胃粘蛋白的4μL液滴置于聚L-精氨酸(PLA，DP11对应于1.9kDa，5mg/mL)、聚L-赖氨酸(PLL，DP11对应于1.6kDa，5mg/mL)或聚L-赖氨酸(PLL，DP 400对应于66kDa，5mg/mL)的溶液中。在显微镜下观察粘蛋白液滴(10×物镜)。在接触3分钟、12分钟、30分钟和50分钟后拍摄三张图像。小的聚氨基酸清楚地深入交联粘蛋白，而大的聚氨基酸聚合物改变粘蛋白液滴的结构并使其显著致密或聚结。
图8显示了将使用壳聚糖溶液(DP8，5mg/mL)复合的或未复合的纯化的猪胃粘蛋白的4μL液滴，置于精子溶液中。2分钟后记录图像。复合的粘蛋白没有精子细胞渗透外壳，而未复合的粘蛋白液滴则使精子细胞渗透凝胶。
图9示出了猪胃粘蛋白凝胶(10mg/mL，pH 6)在2.5mg/mL pH 5.5下与高摩尔质量壳聚糖(550kDa，脱乙酰度98％)的复合，并显示了4滴入壳聚糖溶液中的μL粘蛋白凝胶在复合1小时后(滴尺寸约800μm)的宏观图像和使用荧光素标记壳聚糖的复合物边界的共焦荧光图像。较大的壳聚糖能够结合但不能渗透粘液滴。
图10显示用荧光素荧光标记的壳聚糖寡聚体(摩尔质量1.4kDa，脱乙酰度89％)向排卵的人宫颈粘液中的渗透。
图11显示了加入溶解于pH 5.5的水中的寡壳聚糖(CO，摩尔质量1.4kDa，脱乙酰度89％)对人宫颈粘液中精子渗透的影响。
图12示出了壳聚糖寡聚物对溶解在水(H2O)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或精液缓冲液(SB)中的精子细胞(2.5mg/mL，1.4kDa的摩尔质量，89％脱乙酰度)的毒性。
实施例
材料和方法
猪胃粘蛋白纯化
遵循先前公布的方案，由猪胃的粘膜纯化粘蛋白。由于其已知的改变的生物物理性质，其对于本研究必须保持稳定，因此本研究未选择可商购的粘蛋白。简而言之，将粘液轻轻地从上皮刮下，在补充有200mM NaCl以及5mM苯甲脒HCl、1mM 2,4'-二溴苯乙酮、1mM苯甲基磺酰氟化物和5mM EDTA的水中1:5稀释。用NaOH将pH调节至pH 7.4，并加入混合物并在4℃下温和搅拌过夜。首先将溶液离心，然后超速离心以除去细胞和食物残渣，然后通过制备型尺寸排阻色谱法分级。排除的部分含有高分子量和高度糖基化的分子，这通过高碘酸希夫测试(Schiff assay)证实。汇合各个部分，然后脱盐，并通过使用100kDa分子量截止的反渗透浓缩。最后，将粘蛋白在液氮中快速冷冻并冻干，并储存于-20℃直至使用。
可商购的猪胃粘蛋白、荧光标记的葡聚糖(4kDa和70kDa)和荧光素标记的霍乱毒素B亚基购自Sigma-Aldrich。
COS和LMW壳聚糖的生产和标记
根据先前描述的适应方案，壳寡糖(COS)和低分子量(LMW)壳聚糖通过市售壳聚糖的亚硝酸解聚而产生。简而言之，将市售壳聚糖(1g；Mn＝115kDa；N-乙酰化度(DA)<1％；由印度Mahtani Chitosan Ltd.提供，批号244/020208)通过添加浓HCl而溶解于50mL水中。加入新制备的NaNO2水溶液(对于DP8、DP52和DP100壳聚糖，GlcN/NaNO2摩尔比分别＝4、25和75)，并将反应在室温下搅拌12小时。通过加入氢氧化铵溶液直至pH～8中和溶液，超滤(MWCO 500)，在醇中沉淀并在真空下干燥之后，获得DP8壳聚糖(0.7g，70％质量产率)。通过加入氢氧化铵溶液至pH～8使溶液沉淀，用蒸馏水洗涤几次至中性pH并冷冻干燥，获得DP52(0.8g，100％质量产率)和DP100(0.9g，90％质量产率)壳聚糖。如前描述的，壳聚糖的DP和数均摩尔质量分别通过1H NMR和SEC-MALLS测定。使用前，将壳聚糖溶解于10mg/mL的超纯水中，并用36％HCl将pH调节至5，并且如果需要，在4℃下伴随涡旋或至于振荡器上使用2N HCl或2N NaOH重新调节。
遵守公开的方案的适应版本，用荧光素标记壳聚糖。简而言之，在2mL超纯水中制备4％的DP8、DP52、DP100壳聚糖溶液，并用NaOH将pH调节至pH 5.5。然后将2mL甲醇加入溶液。将溶解于DMSO中的FITC以每50个壳聚糖单体1个荧光素分子的比率加入到混合物中。将溶液在室温下振荡2小时，然后加入4体积的乙醇以沉淀壳聚糖。对于DP8壳聚糖，通过加入乙醇和NaOH的组合以达到pH 9来获得沉淀。用乙醇冲洗沉淀的壳聚糖直至除去游离的FITC，然后冻干并在-20℃下储存直至使用。
壳聚糖-粘蛋白复合物
对于与壳聚糖的复合，首先将猪胃粘蛋白以10mg/mL过夜溶解于超纯水中。然后将4μL液滴缓慢移液到300μL的由水中原液稀释的5mg/mL壳聚糖溶液中。使液滴保持复合超过1小时。然后从壳聚糖溶液中移出液滴并置于水中直至使用。对于与HT29-MTX上皮模型的复合，使用酸化的1X D-PBS(无菌)，pH 5.5将原液壳聚糖溶液进一步稀释至5mg/mL，并将其加入至细胞中1小时。
壳聚糖/PGM复合我的阻隔性能
使用荧光标记的葡聚糖(4kDa和70kDa)评价重构的粘蛋白凝胶的阻隔性能。首先，如上描述的形成复合物，然后将液滴在20mM HEPES溶液(pH 7)中洗涤5至30分钟之后引入1mg/mL的葡聚糖-FITC在20mM HEPES，pH 7中的溶液中。然后使用Zeiss LSM510荧光共聚焦显微镜和10x物镜在引入溶液中后约30秒对滴液成像，其后每分钟成像。使用ImageJ进行时间流逝的图像分析。将扩散前极限设定为粘蛋白液滴外的溶液荧光的5％。扩散前沿的距离与时间的平方根线性相关，并且显示出随机运动型扩散。
HT29-MTX细胞培养
从SFR Biosciences的CelluloNet biobank BB-0033-00072设施(UMS3444/US8)获取HT29-MTX10-6_CelluloNet N°566细胞的冷冻小瓶的。将细胞解冻并使用由DMEM/F12(1:1)(1X)-Glutamax(Sigma Aldrich)组成的补充有热灭活的10％FBS(Hyclone)、1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich)和1mM丙酮酸钠(Sigma Aldrich)的基础培养基常规继代培养。细胞的一次扩增在25cm2 T-烧瓶(Sarstedt)中在37℃下，5％CO2/95％空气气氛中完成。出于维持目的，将细胞在1X PBS洗涤并在37℃下在5％CO2/95％空气气氛中以1:10稀释度接种于75cm2 T-烧瓶(Sarstedt)后每周使用0.25％的0.53mM EDTA(Sigma Aldrich)中的胰蛋白酶进行传代。在所有培养条件下，培养基每隔一天更换一次。细胞在继代培养之前培养直至75％汇合。将具有传代循环19-35的细胞用于实验。
HT29-MTX细胞中的粘液生产
通过在具有0.4μm孔隙聚碳酸酯膜插入物(Corning Inc.USA)的12mm Transwell载体上生长HT29-MTX细胞而生成模型粘膜表面。细胞以2×104个细胞的密度在0.2mL新鲜培养基中接种于膜的顶侧，并将1mL培养基加入到基底外侧隔室中。接种后4天，培养物达到汇合，并通过在底部侧隔室中留下1mL培养基和在顶部隔室中留下50μL培养基而产生半湿的界面。为了增强粘液产生，在基底外侧和顶部加入10mM N-(3,5-二氟苯基)-乙酰基-L-丙氨酰基-2-苯基甘氨酸-1,1-二甲基乙基酯(DAPT)(Sigma-Aldrich，Sweden)6天。此后，取出顶部隔室中的培养基并保持清空，同时将1mL培养基留在基底外侧隔室中。在使用培养物进行进一步实验之前，在4周中每隔一天补充培养基。在培养的第2周后开始出现非均质的粘液层，并且在第4周时覆盖大部分表面。
代谢分析
通过测量在培养基中生长的贫粘液的7日龄培养物和在空气-水界面上生长的富粘液的30日龄培养物的代谢活性来评价壳聚糖溶液的暴露对于HT29-MTX细胞培养物的影响。去除细胞培养基，并将100μL的壳寡聚糖溶液加入到4周龄培养物的顶表面或预先以5×104个细胞/孔接种于24孔板(Nunc)中的7日龄细胞培养物，并培养7天至汇合。温育1小时后，从插入物或孔中去除壳聚糖溶液，并用无菌D-PBS洗涤三次。每个实验条件进行三次。在满足处理条件后，使细胞恢复24小时。使用基于刃天青的体外毒理学测试试剂盒(Alamarblue，Sigma)测量代谢活性的变化。在含有1％热灭活的FBS的完全培养基中制备10％Alamar蓝工作溶液，并在37℃下在5％CO2/95％空气气氛中与细胞培养物在黑暗中温育3小时。将还原的Alamar蓝等分至96孔板(NUNC)中，并使用酶标仪(BMG-CLARIOstar)采集荧光测量结果(Exc 545和Em 590nm)。
HT29-MTX组织学
在Transwell膜上培养的成熟和年轻细胞用1X无菌DPBS洗涤。然后对于成熟培养物，将培养插入物浸入250μL甲醇的Carnoy溶液(甲醇:氯仿:乙酸(60:30:10v/v))中过夜，且对于年轻培养物，使用4％多聚甲醛(PFA)暴露30分钟。将膜折叠以包围粘液层并将其保护。然后这些培养物用石蜡包埋。在Uppsala大学的SciLifeLab组织分析设施上完成包埋、切片、阿尔新蓝染色和载玻片扫描。从插入物上切下膜，折叠以防止对粘液层的干扰，随后将其包埋于5％SeaPlaque琼脂糖(Lonza，#50100)中并使用标准程序进行石蜡包埋处理。包埋的样品在切片机中以4μm切割并收集于SuperFrost Plus载玻片上，在55℃下烘烤过夜并保持冷冻直至使用。为了粘蛋白染色，将载玻片在二甲苯中脱石蜡并在分级的醇中再水合至蒸馏水，之后在室温下用3％乙酸处理3分钟，之后，在室温下用阿尔新蓝(1％，SigmaAldrich)处理30分钟。随后，将载玻片在流水中洗涤2分钟，并随后在蒸馏水中漂洗之后使用Autostainer XL(Leica)在Mayers苏木素(01820，Histolab)中复染色5分钟。将载玻片在分级的乙醇中脱水，并最后使用自动玻璃盖片机(CV5030，Leica)盖玻片(PERTEX，Histolab)。在自动扫描系统(Aperio XT，Aperio Technologies)中使用40x物镜将载玻片扫描至高分辨率数字图像中。
冷冻SEM观察
将壳聚糖复合的粘蛋白液滴在水中洗涤，然后沉积于铝微孔板上。之前已经描述了用于冷冻SEM观察的方法的详细说明。要注意的是在液氮(LN2)步骤中冷冻之前通过放置Tissue-TEK液滴以防止样品滑动。冷冻后，将夹持器和含有样品的板立即转移到LN2冷却的低温恒温器(ALTO2500低温制备室)中，样品制备室连接到显微镜(FEI Strata 235DB双束FIB/SEM)，并且表面通过预冷的刀片切裂而暴露。然后将样品在-60℃下升华2分钟。仍然在LN2和高真空下，样品在低温室中在高真空下在7V下用Ar气的连续流溅射涂覆40秒。然后将样品转移到扫描电子显微镜室中，并在-170℃的室中以10kV观察。图像以5000x放大率采集。
HT29-MTX粘液的屏障性能
从4周龄的HT29-MTX培养物的顶侧或年轻培养物中取出细胞培养基，并用0.1mL的壳寡糖溶液置换。1小时后，从插入物中去除壳聚糖溶液，并用1X D-PBS洗涤3次之后加入0.1mL葡聚糖-FITC或1mL FITC-霍乱毒素B。将葡聚糖-FITC(～4kDa，Sigma Aldrich)以1mg/mL溶解于无菌milliQ水中，而将FITC-霍乱毒素B(Sigma Aldrich)以50μg/mL溶解于不含血清或抗生素的培养基中。将板在37℃下在5％CO2/95％空气中温育1小时，然后用1X D-PBS洗涤。在37℃下在5％CO2/95％空气中使用0.5mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA的15min胰蛋白酶处理后收集年轻细胞。用1x D-PBS洗涤成熟培养物，并随后用碳酸氢钠-NaCl缓冲液(0.1N NaCl缓冲至pH 7.4并含有0.1M碳酸氢钠和1*10-3M DTT)洗涤，并用0.25mL的1mg/mLDTT在37℃下在5％CO2/95％空气中温育15分钟以破坏粘液屏障，并随后类似于年轻细胞进行胰蛋白酶处理。在胰蛋白酶处理后，将所有细胞在离心机(Eppendorf 5417C)上在4℃下以1700rcf离心3分钟。弃去上清液，将颗粒再悬浮于0.3mL的1％BSA-D-PBS中，并转移至样品管中用于流式细胞术分析(Galios，Beckman Coulter)。如果在实验期间使其长时间静置，则粘性凝胶会在管中组装，因此在测量之前立即使用剧烈涡旋破坏聚簇。使用DeNovoFCS Express流式细胞术软件数据。所有样品一式两份测试。
壳聚糖定量
使用荧光胺定量每种复合物中含有的壳聚糖，荧光胺与壳聚糖的伯胺结合时会发荧光。在含有100μL的5mg/mL壳聚糖的玻璃小瓶中，形成5个PGM-壳聚糖液滴。比较了复合前后壳聚糖的浓度。为此，每种样品取出2μL并在48μL的调节至pH 5.5的200mM MES缓冲液中稀释。然后加入100μL的以2mg/mL溶于DMSO中的荧光胺并使其反应之后使用酶标仪(microplate reader)(Clario Star，BMG Labtech)采用390nm激发波长和515nm发射波长测量每种溶液的荧光。由于来自细胞培养物的污染物的存在，该技术不能用于测量与HT29-MTX细胞培养物复合的壳聚糖的量。将壳聚糖-FITC溶液暴露于前述获得的粘液覆盖的HT29-MTX细胞培养物中。比较暴露于细胞之前和之后的溶液的荧光，以估计与细胞培养物结合的量。
可视化
在4周龄的成熟HT29-MTX细胞培养物中观察壳聚糖在HT29-MTX细胞培养物上的分布。首先使用溶解于无血清的培养基中的无毒膜染料(Celltracker DeepRed，Invitrogen)并将其在37℃下在5％CO2/95％空气中加入基底外侧1小时以标记细胞。然后如前描述的将细胞暴露于壳聚糖-FITC溶液1小时。除去壳聚糖后，在顶部侧加入0.5％的D-PBS中的琼脂糖液滴以保持粘液结构。然后培养物使用20x物镜使用激光扫描共焦显微镜(LSM800，Zeiss，德国)成像。
统计分析
图2、3、4和6中呈现的数据的统计学差异使用非配对t检验测试。如果发现假定正态分布的数据的发生概率低于0.05(p<0.05)，认为数据对在统计学上有差异。
壳聚糖低聚物向排卵性人宫颈粘液中的渗透
用荧光素荧光标记壳聚糖低聚物(摩尔质量1.4kDa，脱乙酰度89％)。用宫颈粘液填充0.3×0.3mm方形毛细管并暴露于pH 5.5的5mg/mL壳聚糖溶液30分钟。随后通过荧光显微镜测量荧光。从毛细管边缘可以检测到至多达0.4cm的壳聚糖荧光。
实施例1.壳聚糖与粘蛋白凝胶结合以形成不溶性物质
我们首先测试了三种壳聚糖制剂是否能与粘蛋白结合。我们首先将生物素化的粘蛋白固定于聚乙二醇化的防结垢表面上，这确保仅记录粘蛋白-壳聚糖的相互作用。使用具有耗散的石英晶体微天平(QCM-D)测量壳聚糖和粘蛋白之间的相互作用，其记录传感器表面上的重量变化，以及反映层的机械性质的声波的耗散。QCM-D频率下降表明所有壳聚糖溶液可以与实验室中纯化的猪胃粘蛋白(PGM)和可商购的牛颌下粘蛋白(BSM)结合(表1)。感兴趣的是，较大的壳聚糖链(DP52和DP100)在用缓冲液洗涤时比较小的壳聚糖(DP8)更多地从粘蛋白上解离。在所有情况下，壳聚糖的添加也导致耗散增加，这表明壳聚糖的复合导致表面上更厚且更粘弹性的膜。因此，这些实验证实了本文研究的三种壳聚糖的粘膜粘附性质。
表1.壳聚糖与附着于钝化的聚乙二醇化表面的猪胃粘蛋白(PGM)或牛颌下粘蛋白(BSM)的相互作用的QCM-D频移和消散值
实施例2.壳聚糖与粘蛋白凝胶结合并形成不溶性球形物体
然后，我们测试了壳聚糖-粘蛋白相互作用对三维粘蛋白凝胶(该结构比锚定于表面上的粘蛋白更好地模仿了天然粘液)的结构和屏障性质的影响。为了改进壳聚糖复合可以对粘液凝胶诱导的影响的可视化，我们首先使用由先前表征的实验室内纯化的猪胃粘蛋白组成的重构粘液模型。我们发现，当将弱粘蛋白凝胶(10mg/mL，pH 6)滴入壳聚糖溶液(pH值用HCl，5mg/mL调节至5.5)时，粘蛋白液滴立即反应，变得视觉上不透明并在几秒钟内形成胶囊。因此，粘蛋白凝胶快速稳定，形成可以容易地移液和操作的不溶物。
在1小时后停止复合，此时液滴没有可见的额外混浊。通过使用共焦显微镜观察壳聚糖在液滴内的扩散。壳聚糖-粘蛋白液滴的截面显示出小DP8壳聚糖在整个粘蛋白液滴中分布更均匀(图1)。一部分DP52和DP100壳聚糖分子也可以在粘蛋白液滴中扩散，并优先在外周积聚(图1)。在所有样品中，我们注意到存在不含壳聚糖的暗区。这可能是由于可以含有浓缩的粘蛋白微凝胶的微区域的纯化粘蛋白凝胶的异质性所致。液滴中壳聚糖的分布取决于它们自由扩散通过粘蛋白网络的能力。与其较小的对应物相比，高分子量壳聚糖更可能被空间捕获并与粘蛋白网化学结合。除了相互作用位点的大小和数量之外，本文中测试的三种壳聚糖具有不同的物理化学性质。例如，DP8壳聚糖在所有pH下都是可溶的，而DP52和DP100仅在pH低于6.2时是可溶的。虽然这些差异可能影响它们与粘蛋白凝胶的相互作用，还不清楚其是以什么方式。
鉴于壳聚糖相互作用和在粘蛋白凝胶中扩散的明显证据，我们测试了壳聚糖复合是否影响凝胶的结构。我们使用冷冻SEM研究复合后粘蛋白凝胶的变化。必须记住的是，电子显微镜技术的样品制备不可避免地会改变水凝胶的天然结构。然而，在比较的三种条件之间观察到了复合物结构的差异(图1)。与DP8壳聚糖复合的粘蛋白导致比与DP52和DP100壳聚糖复合时更精细的形态。在后者的条件下，大的均匀结构通过分支膜的薄网络相互连接。这些差异可能源于与较大DP52和DP100壳聚糖形成的那些相比DP8壳聚糖形成的单个交联的性质或密度。虽然较大的壳聚糖会在较大尺度内与粘蛋白相互作用，但较小的壳聚糖寡聚物可以以小得多的尺度桥接粘蛋白，导致SEM观察到较小的特征结构。观察到的凝胶结构的这些变化也可以通过引用由粘蛋白滴复合的壳聚糖总量的差异解释。然而，壳聚糖量的量化表明三种分子之间没有显著差异，每μg粘蛋白约0.3μg壳聚糖。(图2)。
实施例3.壳聚糖复合作用调节重构粘液的屏障性能
鉴于壳聚糖复合作用引起的结构变化，我们假设凝胶的阻隔性能可以也受到影响。因此，我们使用粘蛋白-壳聚糖液滴研究荧光标记的葡聚糖在复合的粘蛋白凝胶中的扩散。将液液浸入葡聚糖溶液中，并随后通过共焦荧光显微镜观察扩散前沿的行进(图3)。我们选择葡聚糖是因为它们与粘蛋白的已知有限的相互作用及其作为荧光素缀合物获得。因此，我们主要探测粘蛋白凝胶的尺寸排阻效应，而不是其通过亲和相互作用过滤的能力。具有斯托克斯半径～3.6nm的70kDa的葡聚糖分子的行进在与任何壳聚糖复合的粘蛋白凝胶中比在未改变的粘蛋白凝胶中更慢(p<0.05)。在该系统中，较小的DP8壳聚糖导致葡聚糖的前沿前进速度降低最小(图3)。对于较大的DP52和DP100壳聚糖，葡聚糖分子在此处观察的短时间内(10分钟)难以在粘蛋白凝胶复合物中行进。这些结果一起表明，粘蛋白的壳聚糖复合作用减缓了葡聚糖从粘蛋白凝胶中的扩散通过，增强了其屏障特性。
实施例4.粘液产生模型—壳聚糖对分泌HT29-MTX粘液的上皮细胞模型的影响
虽然提供了有用的信息，但纯化的粘蛋白模型是天然粘膜屏障的简化。接着，我们使用在空气-水界面上培养的分泌粘液的HT29-MTX细胞更接近地模拟天然粘膜组织。因此，粘蛋白凝胶被由粘蛋白和其他成分如脂质、其他蛋白和碳水化合物组成的更复杂的粘液取代。屏障在结构上也是不同的，由松散的且更粘附性的粘液以及细胞表面上的细胞膜维系的层组成。HT29-MTX在培养7天时形成多细胞结构(图4A)。我们通过组织学证实培养30天后存在20μm厚的粘液层(图4B)，并通过质谱证实存在两种主要的分泌粘蛋白Muc5AC和Muc5B。相反，1周龄的年轻细胞培养物没有出现粘液层并且用作对照条件。
我们首先测试了将没有粘液的年轻HT29-MTX细胞暴露于用HCl酸化至pH 5.5并且浓度范围为1至5mg/mL的在PBS中稀释的壳聚糖是否是细胞相容的。图4C中显示的结果表明，壳聚糖溶液没有影响细胞的代谢活性。类似地，当在成熟和粘液覆盖的细胞上测试时，没有最高壳聚糖浓度的细胞毒性的迹象(图4D)。出乎意料地，关于壳聚糖对细胞膜完整性的影响的补充分析确实表明细胞膜对红色荧光乙锭同型二聚体-1染料的渗透性增加。对于小DP8壳聚糖，效果有限，但对于较大的DP52和DP100壳聚糖，效果更为显著。然而，壳聚糖聚合物和低聚物的记录良好的生物相容性以及壳聚糖溶液的良好细胞相容性促使我们进一步研究它们是否可以用作局部治疗而增强粘液层的天然屏障性质。
实施例5.壳聚糖复合可以增强HT29-MTX粘液的屏障性质
然后，我们测试了壳聚糖溶液增强由HT29-MTX细胞分泌的粘液凝胶的屏障性能的能力。我们首先测试了4kDa荧光标记葡聚糖分子，用于与体外重构的粘液系统直接比较。葡聚糖自发地被HT29-MTX细胞摄取，因此细胞的总荧光可以作为葡聚糖成功扩散到细胞层而穿过细胞层的指示。图5A中呈现的流式细胞术分析表明，粘液覆盖的细胞比无粘液的细胞对葡聚糖的摄取更少。中值荧光的降低证实了细胞分泌的保护性粘液层的存在。与粘液覆盖的细胞相比，DP8壳聚糖与粘液层的复合显著降低了中值荧光。然而，DP52和DP100壳聚糖未导致葡聚糖扩散和细胞摄取的显著变化。
然后，我们测试了壳聚糖复合是否影响化学上更复杂的模型分子的扩散。霍乱毒素B亚基是12kDa蛋白质，其对细胞膜的葡萄糖鞘脂GM1神经节苷脂具有强亲和力，并且充当完整毒素的细胞锚。霍乱毒素B亚基的估计的等电点为8.9，这意味着其在pH 5.5时具有净正电荷，并应该与壳聚糖分子具有有限的静电相互作用。使用荧光霍乱毒素B(F-CTB)。同样，与没有粘液的年轻细胞相比，DP8壳聚糖的复合导致F-CTB的中值荧光降低，而且也与DP8壳聚糖复合(图5B)。然而，与葡聚糖类似，当使用较高分子量的两种壳聚糖复合粘液时，蛋白质的细胞摄取没有明显变化。
实施例6
较小的DP8壳聚糖可以在重构的基于细胞的系统中增强粘液的屏障性质，但在细胞系统中效果更明显。较大的壳聚糖(即，DP100)在重构系统中非常有效，但在基于细胞的系统上测试时失去了它们的作用。这种效力差异可能源于壳聚糖在细胞和粘液上的吸附的差异，但我们发现与细胞系统复合的壳聚糖的量在三种壳聚糖尺寸之间没有差异(图6A)。还可以假设，这种差异可能源自HT29-MTX粘液的更复杂的组成和结构，其由多种其他蛋白质组成。复合的HT29-MTX培养物的荧光共焦成像表明，与较大的DP52和DP100壳聚糖相比，小DP8壳聚糖分布不同。DP8壳聚糖更接近细胞并且似乎在一定程度上扩散到细胞多层之间，而在一些区域中DP52和DP100壳聚糖形成不与细胞层混合的薄片。此外，壳聚糖与分泌的粘液的复合以及用于显微镜检查的样品制备可以去除更松散结合的粘液层。因此，可能的是图6描绘了壳聚糖与紧密结合的粘液层和糖萼的相互作用。这种DP8壳聚糖在细胞周围和细胞多层内更紧密结合的能力可以解释其在该系统中更好的阻断能力。总之，这些结果清楚地显示了用低分子量壳聚糖增强粘液层的潜力。
实施例7.氨基酸聚合物
低分子量或高分子量粘膜粘附聚合物对粘蛋白凝胶的影响。将4μL纯化猪胃粘蛋白滴加入聚-L-精氨酸(PLA，1.9kDa，5mg/mL)、聚-L-赖氨酸(PLL，1.6kDa，5mg/mL)或聚L-赖氨酸(PLL，66kDa，5mg/mL)的溶液中。在显微镜下观察粘蛋白滴(10x物镜)。在3分钟，12分钟30分钟和50分钟接触后拍摄三张图像。小的聚氨基酸清楚地深度交联粘蛋白，而大的聚氨基酸聚合物改变了粘蛋白滴的结构，使其显著密实。
实施例8.精子细胞的渗透测试
将使用壳聚糖(DP8，5mg/mL)溶液复合(图8A)或未复合(图8B)的4μL纯化猪胃粘蛋白液滴置于精子溶液中。2分钟后记录图像。复合的粘蛋白没有精子细胞渗透外壳，而未复合的粘蛋白滴则使精子细胞渗透凝胶。
结论
因此表明，小的壳聚糖分子(壳寡糖)可以有效结合和交联粘蛋白和粘液凝胶，从而通过壳聚糖/粘蛋白聚电解质凝胶延迟葡聚糖和霍乱毒素B蛋白的扩散。因此，小的壳聚糖聚合物通过将壳聚糖与粘蛋白复合而在上皮细胞上形成保护性塞。因此，它们可以增强炎性肠病中发现的改变的粘膜或防止诱导溃疡的螺杆菌到达上皮细胞。重要的是，壳聚糖的生物降解性和粘液的正常更新将使这种改变仅是暂时的，允许在其效果降低之前发生其他愈合机制。本发明的一个重要方面是相对低分子量的壳聚糖的使用。除了可以扩散通过粘液凝胶的优点之外，LMW壳聚糖溶液具有低粘度并且即使在中性pH下也可以具有良好的溶解性。这些为通过凝胶剂或喷雾剂创造有效的粘膜治疗策略留下了很多可能性。
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Claims (13)

1.一种组合物，包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂，其中所述聚合物由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元组成，所述单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单，其中所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述单体单元选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述粘膜粘附聚合物选自由聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、阳离子化二醛纤维素(DAC)、阳离子羟乙基纤维素、壳聚糖、壳聚糖-三甲基、壳聚糖-巯基乙酸、壳聚糖-亚氨基四氢噻吩和壳聚糖-硫代乙脒组成的组。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述粘膜粘附聚合物由式(I)描述，
其中，n是2至10的整数。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，药用载体是水、DMSO、盐水或它们的组合。
6.一种用于在治疗中使用的组合物，包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂，所述粘膜粘附聚合物由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元组成，所述单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单，其中所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单。
7.根据权利要求6所述的用于在治疗中使用的组合物，其中，所述单体单元选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的用于在治疗中使用的组合物，其中，所述粘膜粘附聚合物选自由聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、阳离子化二醛纤维素(DAC)、阳离子羟乙基纤维素、壳聚糖、壳聚糖-三甲基、壳聚糖-巯基乙酸、壳聚糖-亚氨基四氢噻吩和壳聚糖-硫代乙脒组成的组。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的用于在治疗中使用的组合物，其中，所述粘膜粘附聚合物由式(I)描述，
其中，n是2至10的整数。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的用于在治疗中使用的组合物，用于治疗粘膜损伤。
11.一种避孕组合物，包含粘膜粘附聚合物和生理学上可接受的胶凝剂，其中所述粘膜粘附聚合物由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元组成，所述单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸的衍生C5糖组成的清单，其中所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单。
12.由4至20个通过醚键、酯键或酰胺键相互连接的单体单元组成的粘膜粘附聚合物作为避孕药的用途，所述单体单元选自由氨基官能化的C6糖、C6糖、氨基官能化的C5糖、C5糖、氨基酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单，其中所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元包含氨基或所述粘膜粘附聚合物的至少50％的单体单元选自由丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脂肪酸衍生的C6糖和脂肪酸衍生的C5糖组成的清单。
13.一种部件的试剂盒，包含根据权利要求1至11中任一项所述的组合物和施药器。
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