CN110551128A - 氨基酸修饰的s,r-七环醛,其合成,活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下式的S,R‑七环醛‑AA(AA表示:L‑Ala残基、L‑Phe残基、L‑Ile残基、L‑Leu残基、L‑Trp残基、L‑Cys残基、L‑Asp残基、L‑Pyr残基、Gly残基、L‑His残基、L‑Lys残基、L‑Met残基、L‑Asn残基、L‑Pro残基、L‑Gln残基、L‑Arg残基、L‑Ser残基、L‑Thr残基、L‑Val残基、L‑Tyr残基)，公开了它的制备方法,公开了它们的抗动脉血栓活性，公开了它抑制体内P‑选择素表达的活性。因而本发明公开了它在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备P‑选择素拮抗剂中的应用。。

Description

氨基酸修饰的S,R-七环醛,其合成,活性和应用

技术领域

本发明涉及(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶 [3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，涉及它的制备方法，涉及它的抗动脉血栓活性，涉及它抑制体 内P-选择素表达的活性。因而本发明涉及它们在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备凝 P-选择素拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

动脉血栓已成为当下发病率高和死亡率高的疾病。由于动脉血栓症的发病率随年龄 增长呈指数态增加，所以对我国这样的老龄化国家的人民健康的威胁尤其严重。如果把人 口基数考虑进去，对我国国计民生的绝对负面影响尤其严重。于是，动脉血栓症的预防及 治疗一直是医药领域所关注的重点。目前的抗栓药物，虽然能够用有效的抑制血栓的形成， 但由于其影响止血功能或出血风险，降低了其安全性并限制了临床疗效。β-咔啉类生物碱 的多种生物活性包括抑制血小板聚集的活性都已公开。发明人也曾经公开了一系列具有抗 动脉血栓活性的β-咔啉-3-甲酰寡肽，它们的静脉给药剂量为5μmol/kg，静脉注射使它们 进入血液循环并迅速达到高的血药浓度。但正是由于高浓度，它们迅速到达血浆和组织而 增加发生不良反应的风险。这是静脉给药本身的固有缺陷，只能通过发明可口服的化合物 才能解决。发明人假设，两个β-咔啉药效团融合，例如1个(S)-1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3, 4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸和1个(R)-1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸经分子 间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并 吲哚}-1,4-二酮(简称S,R-七环醛)，S,R-七环醛应有强的抗动脉血栓活性，发明人进一步假 设，用20种氨基酸修饰这种新型七环醛，应具有更强的抗动脉血栓活性。于是，发明人 提出本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基 -AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(AA表示:L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile 残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Cys残基、L-Asp残基、L-Pyr残基、Gly残基、L-His残基、 L-Lys残基、L-Met残基、L-Asn残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Arg残基、L-Ser残基、L-Thr 残基、L-Val残基、L-Tyr残基)。

本发明的第二个内容是提供(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基 -AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(AA表示:L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile 残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Cys残基、L-Asp残基、L-Pyr残基、Gly残基、L-His残基、L-Lys残基、L-Met残基、L-Asn残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Arg残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基)的合成方法，该方法包括：

(1)将L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler 缩合,得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)；

(2)在甲醇溶液中1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化 下,与H₂反应脱去苄酯得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；

(3)在2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATu)和N-羟基苯并三 唑(HOBt)存在下，1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在N,N-二甲基甲酰 胺(无水DMF)中进行分子间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3, 4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(3)；

(4)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶 [3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，在冰醋酸、水的条件下，将缩醛转变为醛基得到(2S,5S)-四氢吡 嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(4)；

(5)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并 吲哚}-1,4-二酮在氰基硼氢化钠为还原剂的条件下，与5种天然氨基酸苄酯进行氨化还原 反应，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA苄酯]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶 [3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(5a-e)。AA表示:L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、 L-Leu残基、L-Trp残基；

(6)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并 吲哚}-1,4-二酮在氰基硼氢化钠为还原剂的条件下，与15种天然氨基酸甲酯进行氨化还原 反应，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA甲酯]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶 [3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(5f-t)。AA表示:L-Cys残基、L-Asp残基、L-Pyr残 基、Gly残基、L-His残基、L-Lys残基、L-Met残基、L-Asn残基、L-Pro残基、L-Gln残 基、L-Arg残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基；

(7)将5a-t在浓度2N的NaOH溶液中脱除保护得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双 {(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(6a-t)。

本发明的第三个内容是评价(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮抗动血栓形成的活性。

本发明的第四个内容是评价(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮抑制体内P-选择素表达活性。

附图说明

图1.(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲 哚}-1,4-二酮的合成路线.i)CH₂Cl₂,1,1,3,3-四甲氧基丙烷,三氟乙酸,室温6小时；ii)氢 气,Pd/C,室温反应10小时；iii)DCC,HoBt,室温反应10h；iv)水,冰醋酸,浓盐酸,0℃下反应1 小时；v)NaBH₃CN,室温反应10小时，AA-OBzl(5a中的AA为L-Ala残基；5b中的AA 为L-Phe残基；5c中的AA为L-Ile残基；5d中的AA为L-Leu残基；5e中的AA为L-Trp残基)；vi)NaBH₃CN,室温反应10小时,AA-OMe(5f中的AA为L-Cys残基；5g中的AA为 L-Asp残基；5h中的AA为L-Pyr残基；5i中的AA为Gly残基；5j中的AA为L-His残 基；5k中的AA为L-Lys残基；5l中的AA为L-Met残基；5m中的AA为L-Asn残基； 5n中的AA为L-Pro残基；5o中的AA为L-Gln残基；5p中的AA为L-Arg残基；5q中 的AA为L-Ser残基；5r中的AA为L-Thr残基；5s中的AA为L-Val残基；5t中的AA 为L-Tyr残基)；vii)2N NaOH,0℃下反应1小时,6a-t的合成路线(6a中的AA为L-Ala残基； 6b中的AA为L-Phe残基；6c中的AA为L-Ile残基；6d中的AA为L-Leu残基；6e中的 AA为L-Trp残基；6f中的AA为L-Cys残基；6g中的AA为L-Asp残基；6h中的AA为L-Pyr残基；6i中的AA为Gly残基；6j中的AA为L-His残基；6k中的AA为L-Lys残 基；6l中的AA为L-Met残基；6m中的AA为L-Asn残基；6n中的AA为L-Pro残基； 6o中的AA为L-Gln残基；6p中的AA为L-Arg残基；6q中的AA为L-Ser残基；6r中 的AA为L-Thr残基；6s中的AA为L-Val残基；6t中的AA为L-Tyr残基)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们 仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

冰浴搅拌下，在5g(17.0mmol)L-Trp-OBzl中加入150mLCH₂Cl₂，5mL1,1,3,3-四 甲氧基丙烷，5mL三氟醋酸。反应14h后点TLC板监测原料点消失，有新点产生(CH₂ Cl₂:CH₃OH＝30:1)，终止反应。将反应液分别用饱和NaHCO₃萃洗3次，饱和NaCl萃洗3 次，合并CH₂Cl₂层，无水NaSO₄干燥2h，减压过滤，滤液减压浓缩后用硅胶柱层析进 行纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝100:1)，得5.87g(87％)标题化合物，为棕红色油状物。ESI-MS (m/e):393[M+H]^-。

实施例2制备1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

在3.96g(10.0mmol)1中，加入150mL CH₃OH溶解，加入400mg Pd/C，充入 氢气后室温搅拌反应，反应18h后点TLC板监测原料点消失，有新点产生(CH₂Cl₂:CH₃ OH＝30:1)，终止反应。减压过滤，滤液减压浓缩后得2.726g(8.9mmol)黄色固体，产率 89％。ESI-MS(m/e):303[M-H]^-。

实施例3制备(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)

在886mg(2.91mmol)2中，加入50mL无水DMF溶解，加入1.29g(3.4mmol) HATu，然后用三甲基吡啶将反应液的pH调至8-9，反应24h后点TLC板监测原料点变 浅，有新点产生(CH₂Cl₂:CH₃OH＝60:1)，终止反应；反应液减压浓缩，用乙酸乙酯溶解， 先后分别用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液，5％KHSO₄溶液，饱和NaCl溶液，5％ NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液萃洗3次，合并乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2h后， 减压过滤，滤液减压浓缩后得深黄色固体。硅胶柱层析进行异构体的分离：(石油醚:乙酸 乙酯,2.5:1)得278mg(0.48mmol)黄色固体，¹HNMR NOESY谱鉴定为SR构型；¹HN MR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝10.975(s,1H),10.950(s,1H),7.484(d,J＝7.8H z,1H),7.434(d,J＝7.8Hz,1H),7.370(d,J＝8.0Hz,1H),7.329(d,J＝7.8H z,1H),7.070(t,J＝7.8Hz,2H),6.981(m,2H),5.837(m,1H),5.206(m,1H), 4.517(t,J＝5.5Hz,1H),4.470(dd,J＝1.5Hz,J＝4.2Hz,1H),4.360(dd,J＝ 1.5Hz,J＝4.2Hz,1H),4.169(dd,J＝1.8Hz,J＝2.4Hz,1H),3.470(dd,J＝ 1.2Hz,J＝5.7Hz,1H),3.288(m,1H),3.273(s,3H),3.191(s,3H),3.124(s,3 H),3.075(s,3H),2.841(dd,J＝4.2Hz,J＝5.7Hz,1H),2.769(dd,J＝4.2Hz, J＝5.7Hz,1H),2.527(dt,J＝1.5Hz,J＝5.4Hz,1H),2.419(dt,J＝1.5Hz,J ＝5.4Hz,1H),2.172(m,2H)。

实施例4(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b] 并吲哚}-1,4-二酮(4)

在200mg(0.35mmol)3中，加入3mL冰醋酸、2mL水、1mL浓盐酸，全程冰浴下反 应1h，有黄色固体析出，TLC点板检测原料点消失，终止反应。后处理：在冰浴搅拌的 条件下，使用2M NaOH调节反应液pH值至中性，将反应液用乙酸乙酯萃取，反复3次， 收集乙酸乙酯层，使用饱和碳酸氢钠水溶液萃洗乙酸乙酯层3次，收集酯层用无水硫酸钠 干燥12h，减压过滤，将滤液减压浓缩至干，得到151mg(90.9％)标题化合物，为土黄色 固体，ESI-MS(m/e):479[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.072(s,1 H),10.933(s,1H),9.786(s,1H),9.632(s,1H),7.486(t,J＝8.4Hz,2H),7.385 (d,J＝8.4Hz,2H),7.110(t,J＝7.2Hz,2H),7.016(t,J＝6.0Hz,2H),6.095 (t,J＝6.0Hz,1H),5.484(s,1H),4.546(dd,J＝4.2Hz,11.4Hz,1H),4.406(d, J＝9Hz,1H),3.616(s,1H),3.451(dd,J＝2.1Hz,12.0Hz,1H),3.215(dd,J ＝3.0Hz,17.1Hz,2H),3.047(d,J＝5.1Hz,2H),2.887(d,J＝12.6Hz,1H), 2.840(d,J＝12.6Hz,1H)。

实施例5制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Ala-OBzl]-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5a)

在100mg(0.2mmol)4中加入3mL二氯甲烷和2mL甲醇溶液，再加入90mg(0.5mm ol)的Ala-OBzl·HCl，在冰浴下用N-甲基吗啡啉(NMM)调节反应液pH值为8-9，室温下 搅拌2h，在冰浴下加入9.3mg(0.15mmol)的氰基硼氢化钠，室温下反应1h后，再在冰浴 下加入9.3mg(0.15mmol)的氰基硼氢化钠，室温下反应1h后，再在冰浴下加入12.4mg(0. 2mmol)的氰基硼氢化钠，室温下反应12h，TLC点板检测原料点消失，终止反应，将反 应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯复溶，用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液各萃洗三次， 收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥12h，减压过滤，将滤液减压浓缩，得到黄色油状物， 经过硅胶柱层析纯化，条件为Cl₂CH₂:CH₃OH＝150:1-40:1，得16.7mg(10.7％)标题化合物， 为土黄色球状固体，TLC条件为Cl₂CH₂:CH₃OH＝30:1,Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):807[M+H] ⁺,ESI-MS(m/e):805[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝10.513(s,1H), 9.983(s,1H),7.580(d,J＝7.7Hz,1H),7.520(d,J＝7.9Hz,2H),7.375(m,11 H),7.217(d,J＝5.7Hz,2H),7.152(m,2H),6.038(dd,J＝4.8Hz,J＝10.5Hz, 1H),5.323(s,1H),5.277(d,J＝7.6Hz,2H),5.206(s,2H),4.431(dd,J＝3.9 Hz,J＝11.1Hz,1H),4.201(dd,J＝2.4Hz,J＝10.8Hz,1H),3.796(dd,J＝2. 4Hz,J＝15.0Hz,1H),3.632(d,J＝4.0Hz,1H),3.529(m,2H),3.016(d,J＝1 1.6Hz,1H),2.895(m,4H),2.750(m,1H),2.453(d,J＝14.1Hz,1H),2.204(m, 1H),1.901(m,1H),1.520(d,J＝6.8Hz,3H),1.422(d,J＝6.9Hz,3H)。

实施例6制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Phe-OBzl]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5b)

采用实例5的方法从205mg(0.5mmol)Phe-OBzl·HCl和100mg(0.2mmol)4得到18.0mg(9.3％)标题化合物，为浅黄色固体，TLC条件为酸乙酯：石油醚＝1:1,Rf＝0.3；ESI-M S(m/e):959[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):957[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm ＝10.098(s,1H),9.905(s,1H),7.612(d,J＝7.2Hz,1H),7.589(d,J＝4.8Hz, 1H),7.521(d,J＝6.3Hz,1H),7.498(d,J＝7.2Hz,1H),7.229(m,2H),7.137 (m,2H),5.950(dd,J＝4.5Hz,J＝9.0Hz,1H),5.677(dd,J＝3.6Hz,J＝9.0 Hz,1H),4.431(ddd,J＝1.2Hz,J＝4.8Hz,J＝11.4Hz,1H),4.163(m,1H),3. 867(d,J＝3.3Hz,1H),3.840(s,3H),3.810(m,4H),3.784(s,3H),3.765(m, 1H),3.746(s,3H),3.648(dd,J＝4.5Hz,J＝11.0Hz,1H),2.852(m,10H),2.4 81(m,1H),2.151(m,2H),1.982(m,2H),1.525(m,1H)。

实施例7制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Ile-OBzl]-2,3,4,9-四氢- 1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5c)

采用实例5的方法从128mg(0.5mmol)Ile-OBzl·HCl和100mg(0.2mmol)4得到27.8mg(15.1％)标题化合物，为无色球状固体，TLC条件为乙酸乙酯：石油醚＝1:1,Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):891[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):889[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ ppm＝10.451(s,1H),9.846(s,1H),7.546(m,3H),7.373(m,10H),7.220(d,J ＝7.3Hz,2H),6.006(d,J＝5.8Hz,1H),5.383(d,J＝6.0Hz,1H),5.266(d,J ＝13.5Hz,2H),5.202(s,2H),4.430(d,J＝7.8Hz,1H),4.186(d,J＝10.4Hz, 1H),3.777(d,J＝14.3Hz,1H),3.626(d,J＝15.2Hz,1H),3.400(d,J＝3.8H z,1H),3.328(s,1H),3.014(d,J＝12.1Hz,1H),2.921(d,J＝12.8Hz,1H), 2.854(s,1H),2.816(m,1H),2.685(m,1H),2.546(m 1H),2.206(m,1H),1.90 4(m,6H),1.601(m,3H),1.348(m,3H),1.081(d,J＝6.5Hz,3H),1.016(d,J ＝7.3Hz,3H),0.975(d,J＝8,7Hz,3H),0.963(d,J＝3.6Hz,3H)。

实施例8制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Leu-OBzl]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5d)

采用实例5的方法从128mg(0.5mmol)Leu-OBzl·HCl和100mg(0.2mmol)4得到24.1mg(13.3％)标题化合物，位微黄色固体，TLC条件为酸乙酯：石油醚＝1:1,Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):891[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):889[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/pp m＝10.407(s,1H),9.728(s,1H),7.578(d,J＝7.2Hz,1H),7.527(d,J＝6.6Hz, 1H),7.504(d,J＝7.2Hz,1H),7.360(m,11H),7.240(m,1H),7.198(m,1H), 7.152(m,1H),7.128(m,1H),6.013(dd,J＝4.8Hz,J＝9.9Hz,1H),5.376(d, J＝5.9Hz,1H),5.262(d,J＝1.6Hz,2H),5.180(s,2H),4.424(dd,J＝3.3Hz, J＝11.1Hz,1H),4.187(dd,J＝3.3Hz,J＝11.1Hz,1H),3.773(dd,J＝3.6H z,J＝15.6Hz,1H),3.609(dd,J＝4.3Hz,J＝15.6Hz,1H),3.505(dd,J＝4.8 Hz,J＝8.9Hz,1H),3.408(t,J＝7.1Hz,1H),2.979(t,J＝14.4Hz,2H),2.890 (m,2H),2.818(m,2H),2.624(m,1H),2.524(m,1H),2.200(m,1H),1.858 (m,6H),1.704(m,3H),1.617(m,2H),1.023(d,J＝6.9Hz,3H),1.005(d,J＝ 4.2Hz,3H),0.982(d,J＝3.6Hz,3H),0.962(d,J＝6.6Hz,3H)。

实施例9制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Trp-OBzl]-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5e)

采用实例5的方法从147mg(0.5mmol)Trp-OBzl·HCl和100mg(0.2mmol)4得到10mg(4.6％)标题化合物，为深黄色固体，TLC条件为石油醚：丙酮＝1:1,Rf＝0.35；ESI-MS(m/e):1037[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):1035[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm ＝8.230(s,1H),8.103(s,1H),7.604(m,2H),7.196(m,26H),5.781(s,1H),5.37 1(s,1H),5.128(s,2H),4.945(m,2H),4.037(m,2H),3.720(m,2H),3.568(m, 2H),3.414(m,2H),3.312(m,2H),3.114(m,3H),2.693(m,1H),1.845(m,4 H),1.744(m,2H),1.615(m,2H)。

实施例10制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Cys-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5f)

采用实例5的方法从120mg(0.5mmol)Cys(Bzl)-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到78.6mg(42.1％)标题化合物，为黄色油状物，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝40:1，Rf＝0.35；ESI-MS(m/e):897[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):895[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO -d₆):δ/ppm＝11.058(s,1H),10.978(s,1H),7.511(d,J＝7.6Hz,1H),7.450(d,J ＝7.6Hz,1H),7.373(m,2H),7.314(m,10H),7.097(t,J＝7.0Hz,2H),7.021 (t,J＝7.0Hz,2H),5.782(t,J＝6.6Hz,1H),5.259(m,1H),4.445(dd,J＝7.1 Hz,J＝14.2Hz,1H),4.330(d,J＝11.2Hz,1H),3.743(m,4H),3.622(m,8H), 3.526(t,J＝6.3Hz,4H),3.353(m,2H),3.225(t,J＝6.0Hz,1H),2.847(m,1 H),2.662(m,6H),2.046(m,4H)。

实施例11制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Asp(OMe)-OMe]-2,3, 4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5g)

采用实例5的方法从80mg(0.5mmol)Asp(OMe)-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得 到790.8mg(45.8％)标题化合物，为黄色固体，TLC条件为石油醚：丙酮＝1:1,Rf＝0.25；E SI-MS(m/e):743[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):741[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ ppm＝10.098(s,1H),9.905(s,1H),7.612(d,J＝7.2Hz,1H),7.589(d,J＝4.8 Hz,1H),7.521(d,J＝6.3Hz,1H),7.498(d,J＝7.2Hz,1H),7.229(m,2H), 7.137(m,2H),5.950(dd,J＝4.5Hz,J＝9.0Hz,1H),5.677(dd,J＝3.6Hz,J＝ 9.0Hz,1H),4.431(ddd,J＝1.2Hz,J＝4.8Hz,J＝11.4Hz,1H),4.163(m,1 H),3.867(d,J＝3.3Hz,1H),3.840(s,3H),3.810(m,4H),3.784(s,3H),3.765 (m,1H),3.746(s,3H),3.648(dd,J＝4.5Hz,J＝11.0Hz,1H),2.852(m,10 H),2.481(m,1H),2.151(m,2H),1.982(m,2H),1.525(m,1H)。

实施例12制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Pyr-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5h)

采用实例5的方法从90mg(0.5mmol)Glu(OMe)-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到74.7mg(48.9％)标题化合物，为黄色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝30:1，Rf＝0.2；ESI-MS(m/e):735[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):733[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/p pm＝10.239(s,1H),10.113(s,1H),7.565(d,J＝7.6Hz,1H),7.485(m,3H), 7.219(t,J＝7.6Hz,2H),7.132(m,2H),6.018(m,1H),5.287(m,1H),4.409 (m,1H),4.183(m,1H),4.104(m,1H),3.862(s,3H),3.823(s,3H),3.753(m, 1H),3.720(s,3H),3.596(m,1H),3.536(m,2H),3.382(m,1H),2.785(m,9 H),2.361(m,2H),2.174(m,6H),1.915(m,3H)。

实施例13制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Gly-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5i)

采用实例5的方法从50mg(0.5mmol)Gly-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到58.7mg(45.2％)标题化合物，为无色球状固体，TLC条件为石油醚：丙酮＝1:1,Rf＝0.35；ESI-MS(m/e):627[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):625[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/pp m＝11.082(s,1H),11.062(s,1H),7.495(d,J＝12.6Hz,1H),7.470(d,J＝12. 6Hz,1H),7.377(d,J＝1.7Hz,1H),7.350(d,J＝1.9Hz,1H),7.088(t,J＝15. 0Hz,2H),7.000(dt,J＝1.9Hz,J＝7.2Hz,2H),5.777(m,1H),5.283(m,1 H),4.446(dd,J＝4.5Hz,J＝11.4Hz,1H),4.336(dd,J＝3.0Hz,J＝11.6Hz,1 H),3.616(s,3H),3.498(s,3H),3.379(s,2H),3.228(s,2H),2.850(m,1H),2. 721(m,1H),2.633(m,2H),2.230(m,2H),2.076(m,4H)。

实施例14制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-His-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5j)

采用实例5的方法从90mg(0.5mmol)His-OMe·2HCl和100mg(0.2mmol)4得到56.5mg(34.5％)标题化合物，为黄色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝6:1，Rf＝0.2；ESI-M S(m/e):787[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):785[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm ＝11.161(s,1H),11.009(s,1H),7.518(d,J＝7.8Hz,2H),7.437(d,J＝6.9Hz, 2H),7.458(d,J＝9.7Hz,2H),7.083(t,J＝7.2Hz,2H),6.990(m,2H),6.763 (s,1H),6.668(s,1H),5.761(m,1H),5.268(m,1H),4.422(d,J＝7.7Hz,1 H),4.314(d,J＝9.8Hz,1H),3.554(s,3H),3.36(m,5H),3.172(m,2H),2.744 (m,9H),2.031(m,5H)。

实施例15制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Lys-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5k)

采用实例5的方法从150mg(0.5mmol)Lys(Z)-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到黄色油状物，经过硅胶柱层析纯化，条件为二氯甲烷：甲醇＝150:1-50:1，得到107mg(49.6％)，为无色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝30:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):1037[M +H]⁺,ESI-MS(m/e):1035[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝10.207(s,1 H),9.817(s,1H),7.553(d,J＝7.5Hz,1H),7.512(d,J＝7.5Hz,1H),7.358(d, J＝7.5Hz,1H),7.347(m,11H),7.157(m,4H),6.024(dd,J＝5.4Hz,J＝9.3 Hz,1H),5.372(dd,J＝5.4Hz,J＝9.3Hz,1H),5.090(m,4H),4.986(m,1H), 4.858(m,1H),4.429(dd,J＝6.7Hz,J＝15.4Hz,1H),4.154(m,1H),3.809(s, 3H),3.729(s,3H),3.596(dd,J＝4.5Hz,J＝15.4Hz,1H),3.467(m,1H),3.351(m,1H),3.231(m,4H),2.998(m,1H),2.836(m,4H),2.674(m,1H),2.430 (m,1H),1.956(m,2H),1.817(m,4H),1.576(m,7H),1.418(m,3H)。

实施例16制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Met-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5l)

采用实例5的方法从85mg(0.5mmol)Met-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到86.5mg(53.1％)标题化合物，为黄色球状固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝20:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):775[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):773[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ ppm＝10.250(s,1H),9.725(s,1H),7.541(d,J＝7.8Hz,1H),7.469(t,J＝7.2 Hz,2H),7.395(d,J＝7.8Hz,1H),7.172(m,2H),7.075(m,2H),5.979(dd,J ＝5.4Hz,J＝9.0Hz 1H),5.486(d,J＝7.0Hz,1H),4.386(dd,J＝3.9Hz,J＝ 11.1Hz,1H),4.057(dd,J＝1.8Hz,J＝11.3Hz,1H),3.783(s,3H),3.671(s,3 H),3.553(m,4H),3.430(m,2H),2.958(m,1H),2.857(m,1H),2.776(m,2 H),2.711(m,1H),2.409(m,2H),2.108(s,3H),2.090(s,3H),2.002(m,5H),1.840(m,4H),1.743(m,2H)。

实施例17制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Asn-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5m)

采用实例5的方法从85mg(0.5mmol)Asn-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到53.3mg(33.3％)标题化合物，为无色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝8:1，Rf＝0.2；ESI-MS(m/e):769[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):767[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝ 11.012(s,1H),10.976(s,1H),7.492(d,J＝14.2Hz,1H),7.467(d,J＝14.3H z,1H),7.369(d,J＝15.7Hz,4H),7.086(t,J＝7.2Hz,2H),7.002(m,2H),6. 844(d,J＝8.8Hz,2H),6.668(s,1H),5.762(m,1H),5.313(m,1H),4.422(d, J＝7.3Hz,1H),4.300(d,J＝9.8Hz,1H),4.075(m,3H),3.879(m,2H),3.51 9(m,2H),3.169(d,J＝5.3Hz,3H),2.971(t,J＝11.7Hz,1H),2.656(m,3H), 2.361(m,4H),2.182(m,2H),2.000(m,4H),1.132(t,J＝7.1Hz,3H),0.975(d,J＝7.0Hz,3H)。

实施例18制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Pro-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5n)

采用实例5的方法从70mg(0.5mmol)Pro-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到65.4mg(44.5％)标题化合物，为深黄色固体，TLC条件为石油醚：丙酮＝2:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):707[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):705[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝ 10.827(s,1H),8.826(s,1H),7.606(d,J＝8.0Hz,1H),7.551(d,J＝7.5Hz,1 H),7.513(d,J＝7.5Hz,1H),7.372(d,J＝7.7Hz,1H),7.200(m,2H),7.113 (m,2H),6.081(dd,J＝3.0Hz,J＝11.7Hz,1H),5.229(d,J＝7.9Hz,1H),4.4 69(dd,J＝1.4Hz,J＝14.5Hz,1H),4.222(dd,J＝6.7Hz,J＝13.2Hz,1H),3. 924(m,1H),3.874(s,3H),3.854(m,1H),3.831(s,3H),3.773(m,1H),3.630 (dd,J＝4.6Hz,J＝15.6Hz,1H),3.302(m,2H),3.100(m,2H),2.960(m,2H),2.367(m,2H),2.286(m,6H),1.991(m,3H),1.815(m,5H),1.654(m,1H),1. 415(m,1H)。

实施例19制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Gln-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5o)

采用实例5的方法从90mg(0.5mmol)Gln-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到50.2mg(30.2％)标题化合物，为黄色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝8:1，Rf＝0.2；ESI-MS(m/e):797[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):795[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝ 11.012(s,1H),10.976(s,1H),7.492(d,J＝14.2Hz,1H),7.467(d,J＝14.3H z,1H),7.369(d,J＝15.7Hz,4H),7.086(t,J＝7.2Hz,2H),7.002(m,2H),6. 844(d,J＝8.8Hz,2H),6.668(s,1H),5.762(m,1H),5.313(m,1H),4.422(d, J＝7.3Hz,1H),4.300(d,J＝9.8Hz,1H),4.075(m,3H),3.879(m,2H),3.51 9(m,2H),3.169(d,J＝5.3Hz,3H),2.971(t,J＝11.7Hz,1H),2.656(m,3H), 2.361(m,4H),2.182(m,2H),2.000(m,4H),1.132(t,J＝7.1Hz,3H),0.975(d,J＝7.0Hz,3H)。

实施例20制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Arg-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5p)

采用实例5的方法从120mg(0.5mmol)Arg(NO₂)-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到47.6mg(25.1％)标题化合物，为无色球状固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝10:1，Rf＝0.2；ESI-MS(m/e):915[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):913[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMS O-d₆):δ/ppm＝11.052(s,1H),10.942(s,1H),8.527(m,2H),7.888(m,4H),7.50 5(d,J＝7.8Hz,1H),7.449(d,J＝7.8Hz,1H),7.358(d,J＝7.8Hz,2H),7.08 9(t,J＝7.2Hz,2H),6.999(t,J＝7.2Hz,2H),5.795(t,J＝6.6Hz,1H),5.256 (m,1H),4.431(dd,J＝4.3Hz,J＝11.2Hz,1H),4.328(dd,J＝3.2Hz,J＝11. 6Hz,1H),3.623(s,3H),3.498(dd,J＝3.7Hz,J＝15.6Hz,1H),3.340(s,3 H),3.265(m,2H),3.144(m,5H),3.030(m,3H),2.815(dd,J＝11.7Hz,J＝15. 3Hz1H),2.637(m,4H),2.427(m,1H),2.172(m,1H),2.018(m,4H),1.855 (m,1H),1.561(m,4H),1.447(m,3H)。

实施例21制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Ser-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5q)

采用实例5的方法从60mg(0.5mmol)Ser-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到70mg(48.9％)标题化合物，为无色球状固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝20:1，Rf＝0.25；ESI -MS(m/e):687[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):685[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/pp m＝11.103(s,1H),11.021(s,1H),7.499(d,J＝7.7Hz,1H),7.457(d,J＝7.7 Hz,1H),7.087(t,J＝6.9Hz,2H),6.998(t,J＝6.6Hz,2H),5.792(m,1H),5. 270(m,1H),4.841(t,J＝5.7Hz,1H),4.807(t,J＝5.0Hz,1H),4.432(dd,J＝ 4.5Hz,J＝11.0Hz,1H),4.320(dd,J＝2.8Hz,J＝11.1Hz,1H),3.614(s,3 H),3.535(m,6H),3.442(s,3H),3.381(m,1H),3.310(m,1H),3.137(m,2H),2.731(m,5H),2.051(m,5H)。

实施例22制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Thr-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5r)

采用实例5的方法从70mg(0.5mmol)Thr-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到黄色油状物，经过硅胶柱层析纯化，条件为二氯甲烷：甲醇＝100:1-30:1，得到75mg(50.7％) 标题化合物，为黄色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝20:1，Rf＝0.2；ESI-MS(m/e):7 15[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):713[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.078(s, 1H),10.963(s,1H),7.498(d,J＝7.8Hz,1H),7.460(d,J＝7.8Hz,1H),7.36 4(d,J＝7.8Hz,2H),7.088(t,J＝6.9Hz,2H),6.998(t,J＝7.4Hz,2H),5.812 (t,J＝6.6Hz,1H),5.262(m,1H),4.756(m,1H),4.660(m,1H),4.435(dd,J ＝4.1Hz,J＝11.0Hz,1H),4.319(dd,J＝2.8Hz,J＝11.4Hz,1H),3.842(m,1 H),3.699(m,1H),3.626(s,3H),3.506(m,1H),3.426(s,3H),3.379(m,2H),3.305(m,1H),3.329(m,1H),3.141(d,J＝4.8Hz,1H),2.745(m,6H),2.081 (m,6H),1.124(d,J＝6.3Hz,3H),1.000(d,J＝6.3Hz,3H)。

实施例23制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Val-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5s)

采用实例5的方法从70mg(0.5mmol)Val-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到74.0mg(50.1％)标题化合物，为无色球状固体，TLC条件为石油醚：乙酸乙酯＝1:1,Rf＝0.2；ESI-MS(m/e):711[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):709[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ ppm＝10.419(s,1H),9.867(s,1H),7.576(d,J＝7.2Hz,1H),7.523(d,J＝4.5 Hz,1H),7.497(d,J＝4.8Hz,1H),7.367(d,J＝7.6Hz,1H),7.211(ddd,J＝ 1.4Hz,J＝2.4Hz,J＝6.6Hz,1H),7.198(m,1H),7.134(m,2H),6.001(dd,J ＝4.2Hz,J＝10.2Hz,1H),5.416(d,J＝7.3Hz,1H),4.437(dd,J＝3.0Hz,J ＝10.8Hz,1H),4.215(dd,J＝3.0Hz,J＝10.8Hz,1H),3.816(s,3H),3.770(m, 1H),3.755(s,3H),3.617(dd,J＝4.4Hz,J＝15.6Hz,1H),3.287(d,J＝5.2Hz,1H),3.121(d,J＝5.5Hz,1H),2.993(dd,J＝10.5Hz,J＝14.4Hz,1H),2. 811(m,1H),2.630(dd,J＝5.4Hz,J＝11.1Hz,2H),2.202(m,3H),1.937(m,1 H),1.836(m,1H),1.611(m,2H)。

实施例24制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Tyr-OMe]-2,3,4,9-四 氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5t)

采用实例5的方法从100mg(0.5mmol)Tyr-OMe·HCl和100mg(0.2mmol)4得到92.5mg(53.4％)标题化合物，为无色固体，TLC条件为二氯甲烷：甲醇＝30:1，Rf＝0.3；ESI- MS(m/e):839[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):837[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/pp m＝10.138(s,1H),8.420(s,1H),7.477(t,J＝7.1Hz,2H),7.362(dd,J＝2.9H z,J＝6.0Hz,1H),7.063(m,12H),6.783(m,3H),5.903(dd,J＝5.4Hz,J＝8.1 Hz,1H),5.301(dd,J＝3.6Hz,J＝9.3Hz,1H),4.226(dd,J＝3.6Hz,J＝10.5 Hz,1H),3.378(s,3H),3.758(m,1H),3.739(s,3H),3.574(m,1H),3.482(m, 1H),3.363(m,3H),3.110(dd,J＝4.5Hz,J＝14.1Hz,1H),3.030(dd,J＝3. 6Hz,J＝13.5Hz,1H),2.941(m,1H),2.878(m,1H),2.823(m,1H),2.767(m, 1H),2.722(d,J＝3.9Hz,1H),2.648(m,2H),2.564(m,1H),2.436(t,J＝7.2 Hz,1H),2.139(m,1H),1.680(m,1H),1.765(m,1H),1.434(m,1H)。

实施例25制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Ala]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6a)

在100mg(0.12mmol)化合物5a中冰浴搅拌的条件下缓慢加入4mL的氢氧化钠水溶液，冰浴下搅拌2h后，TLC点板检测原料点消失，终止反应，使用饱和硫酸氢钾水溶液 调节pH值到7，减压抽滤，收集滤饼晾干，得到70.4mg(90.6％)的标题化合物，为黄色固 体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):627[M+H]⁺, ESI-MS(m/e):625[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.845(s,1H),11. 339(s,1H),7.469(m,2H),7.379(m,2H),7.095(m,2H),6.996(m,2H),5.924 (m,1H),5.346(m,1H),3.69(m,4H),2.887(m,4H),2.45(m,1H),2.20(m,1 H),1.89(m,2H),1.332(d,J＝6.5Hz,3H),1.188(d,J＝6.5Hz,3H)。

实施例26制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Phe]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6b)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5b得到55.7mg(68.6％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 779[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):777[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.4 11(s,1H),11.148(s,1H),7.526(d,J＝7.5Hz,1H),7.416(d,J＝7.5Hz,1H), 7.369(d,J＝7.5Hz,2H),7.256(d,J＝16.5Hz,2H),7.233(d,J＝16.5Hz,2 H),7.052(m,10H),5.762(m,1H),5.292(m,1H),4.377(d,J＝8.4Hz,1H),4. 275(d,J＝8.4Hz,1H),3.593(m,2H),3.361(m,5H),3.03(m,3H),2.860(m, 4H),2.633(m,3H),2.244(m,3H),2.111(m,2H)。

实施例27制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Ile]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6c)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5c得到50.8mg(63.6％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 711[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):709[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.3 87(s,1H),11.177(s,1H),7.504(d,J＝7.2Hz,1H),7.428(d,J＝7.2Hz,1H), 7.369(t,J＝7.2Hz,2H),7.100(t,J＝7.2Hz,2H),7.005(dd,J＝7.2Hz,J＝ 13.2Hz,2H),5.844(m,1H),5.316(m,1H),4.431(t,J＝11.7Hz,2H),3.498 (m,2H),3.221(m,3H),2.965(m,3H),2.339(m,4H),2.192(m,1H),1.795 (m,1H),1.629(m,2H),1.497(m,2H),1.329(m,2H),1.172(m 2H),0.913(m,3H),0.867(m,3H),0.824(m,3H),0.780(m,3H)。

实施例28制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Leu]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6d)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5d得到22.0mg(27.6％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 711[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):709[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.29 4(s,1H),11.219(s,1H),7.466(m,4H),7.110(t,J＝15.0Hz,2H),7.010(dd, J＝2.7Hz,J＝7.7Hz,2H),5.788(m,1H),5.286(m,1H),4.507(dd,J＝4.4H z,J＝12.3Hz,1H),4.417(dd,J＝4.4Hz,J＝12.3Hz,1H),3.666(m,3H),3.2 69(m,3H),3.035(m,3H),2.838(m,4H),2.312(m,3H),1.773(m,2H),1.583 (m,4H)。

实施例29制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Trp]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6e)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5e得到60.6mg(73.4％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 857[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):855[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.1 49(s,1H),11.013(s,1H),10.885(s,1H),10.772(s,1H),7.569(d,J＝6.7Hz,1 H),7.475(m,1H),7.311(m,6H),7.005(m,8H),5.874(m,1H),5.371(m,1 H),4.528(m,3H),3.872(m,1H),3.561(m,4H),3.064(m,2H),2.922(m,4H), 2.035(m,2H),2.118(m,6H)。

实施例30制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Cys]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6f)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5f得到43.1mg(44.8％)的目标化合物，为黄色油状物，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 691[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):689[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.058(s, 1H),10.978(s,1H),7.511(d,J＝7.6Hz,1H),7.450(d,J＝7.6Hz,1H),7.37 3(m,2H),7.097(t,J＝7.0Hz,2H),7.021(t,J＝7.0Hz,2H),5.782(m,1H),5. 259(m,1H),4.445(m,1H),4.330(m,1H),3.622(m,8H),3.526(m,4H),3.22 5(m,1H),2.847(m,1H),2.662(m,6H),2.046(m,4H)。

实施例31制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Asp]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6g)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5g得到79.3mg(82.4％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 715[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):713[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.1 38(s,1H),11.123(s,1H),7.528(d,J＝7.9Hz,1H),7.449(d,J＝7.9Hz,1H), 7.383(d,J＝7.9Hz,2H),7.114(t,J＝7.9Hz,2H),7.023(m,2H),5.798(m,1 H),5.358(m,1H),4.388(m,2H),3.785(m,1H),3.623(m,3H),3.536(m,1 H),3.483(m,1H),3.425(m,2H),3.372(m,1H),3.326(m,2H),3.077(m,5H), 2.286(m,4H)。

实施例32制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Pyr]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6h)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5h得到81.1mg(84.3％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 707[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):705[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.1 87(s,1H),11.079(s,1H),7.470(d,J＝7.5Hz,2H),7.346(d,J＝7.5Hz,2H), 7.089(m,2H),6.994(m,2H),5.855(m,1H),5.603(m,1H),4.579(m,2H),4. 278(m,2H),3.704(m,3H),3.167(m,2H),2.972(m,3H),2.227(m,10H),1.9 34(m,2H),1.727(m,2H)。

实施例33制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Gly]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6i)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5i得到86.5mg(89.9％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 598[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):596[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.5 75(s,1H),11.345(s,1H),7.464(d,J＝6.3Hz,J＝13.2Hz,2H),7.377(t,J＝ 14.3Hz,2H),7.087(t,J＝14.3Hz,2H),6.99(d,J＝6.3Hz,J＝13.2Hz,2H), 5.864(m,1H),5.338(m,1H),4.458(m,1H),4.383(m,1H),3.379(s,2H),3.11 8(m,4H),2.969(m,4H),2.800(m,2H),2.618(m,2H),2.366(m,2H),2.169 (m,2H)。

实施例34制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-His]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6j)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5j得到56.7mg(58.8％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 759[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):757[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.1 61(s,1H),11.009(s,1H),7.518(d,J＝7.8Hz,2H),7.437(d,J＝6.9Hz,2H), 7.458(d,J＝9.7Hz,2H),7.083(t,J＝7.2Hz,2H),6.990(m,2H),6.763(s,1 H),6.668(s,1H),5.761(m,1H),5.268(m,1H),4.422(m 1H),4.314(m,1H), 3.563(m,2H),3.172(m,2H),2.744(m,9H),2.031(m,5H)。

实施例35制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Lys]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6k)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5k得到49.8mg(67.2％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 741[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):739[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.1 80(s,1H),11.136(s,1H),7.464(d,J＝7.5Hz,1H),7.386(d,J＝7.5Hz,1H), 7.266(m,3H),7.067(m,3H),5.911(m,1H),5.485(m,1H),4.559(m,2H),2. 990(m,8H),2.759(m,4H),2.242(m,5H),1.681(m,4H),1.547(m,3H),1.41 0(m,5H)。

实施例36制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Met]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6l)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5l得到82.2mg(85.3％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 747[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):745[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.3 97(s,1H),11.268(s,1H),7.495(d,J＝7.7Hz,2H),7.376(d,J＝7.7Hz,2H), 7.110(m,2H),7.015(m,2H),5.978(m,1H),5.378(m,1H),4.562(m,2H),4. 017(m,1H),3.023(m,6H),2.666(m,4H),2.355(m,3H),2.169(m,2H),2.06 0(s,3H),2.016(s,3H),1.943(m,3H)。

实施例37制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Asn]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6m)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5m得到75.2mg(81.1％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 713[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):711[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.0 12(s,1H),10.976(s,1H),7.492(d,J＝14.2Hz,1H),7.467(d,J＝14.3Hz,1 H),7.369(d,J＝15.7Hz,4H),7.086(t,J＝7.2Hz,2H),7.002(m,2H),6.844 (d,J＝8.8Hz,2H),6.668(s,1H),5.762(m,1H),5.313(m,1H),4.422(m,1 H),4.300(m,1H),3.873(m,2H),3.500(m,2H),3.169(m,3H),2.971(m,1H), 2.361(m,4H),2.182(m,2H),2.000(m,4H)。

实施例38制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Pro]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6n)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5n得到77.4mg(80.6％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 679[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):677[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.4 47(s,1H),11.413(s,1H),7.539(d,J＝8.0Hz,1H),7.499(d,J＝8.0Hz,1H), 7.395(d,J＝8.0Hz,2H),7.125(t,J＝7.2Hz,2H),7.027(t,J＝7.2Hz,2H), 5.928(m,1H),5.421(m,1H),4.604(m,2H),4.293(m,2H),3.588(m,7H),3.3 22(m,6H),3.077(m,3H),3.383(m,3H),2.050(m,2H),1.918(m,2H)。

实施例39制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Gln]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6o)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5o得到74.0mg(79.6％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 741[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):739[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11. 012(s,1H),10.976(s,1H),7.492(d,J＝14.2Hz,1H),7.467(d,J＝14.3Hz,1 H),7.369(d,J＝15.7Hz,4H),7.086(t,J＝7.2Hz,2H),7.002(m,2H),6.844 (d,J＝8.8Hz,2H),6.668(s,1H),5.762(m,1H),5.313(m,1H),4.422(m,1 H),4.300(m,1H),3.879(m,1H),3.519(m,2H),3.169(m,3H),2.971(m,1H), 2.656(m,3H),2.361(m,4H),2.182(m,2H),2.000(m,4H)。

实施例40制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Arg]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6p)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5p得到62.7mg(72.0％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 797[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):795[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.2 44(s,1H),11.224(s,1H),9.15(m,2H),8.614(m,2H),8.037(m,5H),7.487 (d,J＝7.5Hz,2H),7.397(d,J＝7.5Hz,2H),7.118(t,J＝7.5Hz,2H),7.022 (t,J＝7.5Hz,2H),5.904(m,1H),5.482(m,1H),4.563(m,2H),3.940(m,2 H),3.185(m,8H),3.024(m,6H),2.279(m,2H),1.875(m,4H),1.598(m,4 H)。

实施例41制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Ser]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6q)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5q得到75.9mg(79.2％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 659[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):657[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.9 12(s,1H),11.861(s,1H),7.455(d,J＝7.5Hz,1H),7.442(d,J＝7.5Hz,2H), 7.380(d,J＝7.5Hz,1H),7.056(m,2H),6.964(m,2H),5.949(m,1H),5.334 (m,1H),4.547(m,1H),4.369(m,1H),3.515(m,4H),2.844(m,6H),2.632(m, 2H),2.277(m,1H),1.997(m,6H)。

实施例42制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Thr]-2,3,4,9-四氢-1H -吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6r)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5r得到68.2mg(70.8％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 687[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):685[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.4 65(s,1H),11.332(s,1H),7.490(d,J＝8.0Hz,2H),7.384(d,J＝8.0Hz,2H), 7.097(d,J＝8.0Hz,2H),7.019(m,2H),5.885(m,1H),5.404(m,1H),4.587 (m,2H),4.109(m,2H),3.987(m,1H),3.871(m,2H),3.744(m,1H),3.572(m, 5H),3.067(m,4H),2.261(m,2H),1.296(m,3H),1.250(m,3H)。

实施例43制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Val]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6s)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5s得到89.6mg(93.3％)的标题化合物，为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e): 683[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):681[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.5 56(s,1H),11.228(s,1H),7.502(d,J＝7.7Hz,1H),7.425(d,J＝7.7Hz,1H), 7.369(t,d,J＝7.2Hz,2H),7.094(d,J＝7.2Hz,2H),6.999(dd,d,J＝7.2Hz, 2H),5.849(m,1H),5.321(m,1H),4.467(m,1H),4.389(m,1H),3.470(d,J＝ 12.0Hz,2H),3.347(dd,J＝11.2Hz,J＝19.1Hz,2H),3.208(d,J＝3.8Hz,1 H),2.988(m,4H),2.801(m,2H),2.370(m,3H),2.148(m,2H),1.939(m,1H), 1.004(d,d,J＝6.8Hz,3H),0.957(d,d,J＝6.8Hz,3H),0.856(d,d,J＝6.8 Hz,3H),0.846(d,d,J＝6.8Hz,3H)。

实施例44制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-Tyr]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6t)

采用实例25的方法从100mg(0.10mmol)化合物5t得到69.9mg(72.4)的标题化合物， 为黄色固体粉末，TLC条件为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3:1:1，Rf＝0.3；ESI-MS(m/e):811[M+H]⁺,ESI-MS(m/e):809[M+H]^-。¹HNMR(300MH_Z，DMSO-d₆):δ/ppm＝11.220(s, 1H),11.196(s,1H),7.427(m,4H),7.09(m,10H),6.698(m,5H),5.884(m,1 H),5.400(m,1H),4.194(m,2H),3.636(m,2H),3.183(m,6H),3.040(m,8 H),2.313(m,2H)。

实施例45评价6a-t的抗动脉血栓活性

1)实验材料：

乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(CAS：9041-08-1，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。

2)实验动物：

SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

3)实验方法：

实验采用动静脉旁路丝线血栓形成模型。

4)旁路插管的准备：

旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管受热拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段 由内径3.5mm的聚乙烯管构成，定长为8.0cm；将表面毛糙的丝线定长为6.0cm，选用 重4.0±0.1mg且毛糙程度相同的丝线。三段聚乙烯管内壁均用1％的硅醚溶液(1％硅油的 乙醚溶液)进行硅烷化，在完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中， 利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。

5)分组及给药剂量：

4剂量为1μmol/kg；6a-t系列化合物剂量为0.1μmol/kg；阳性对照阿司匹林剂量为167μmol/kg，阴性对照为羧甲基纤维素钠。

6)所用试剂配制：

麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液，抗凝剂为用生理盐水配制的42mg/100mL的肝素钠水溶液。

7)实验操作：

以0.3mL/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左 颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1mL/100g体重的 剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总 动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管 插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外 循环旁路。

维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循 环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的浮血后称量并记录其湿 重，代表抗动脉血栓活性。

8)实验结果及讨论：

利用动静脉旁路丝线血栓形成模型评价4和6a-t系列化合物的体内抗动脉血栓形成的 活性。口服给予的阴性对照羧甲基纤维素钠组的血栓湿重为38.1±7.6mg，而口服给予 的阳性对照167μmol/kg的阿司匹林组的血栓湿重为18.2±3.7mg，这两组数据具有显著性差距P<0.01，这表明该模型建立成功。

在1μmol/kg口服给药的剂量下，4的血栓湿重为25.2±8.5mg，与阴性对照羧甲基纤 维素钠组(血栓湿重为38.1±7.6mg)相比具有显著差异P<0.01，这表明4可以抑制体内动脉血栓的形成，表现出良好的抗动脉血栓活性。

在0.1μmol/kg口服给药剂量下，6a-t系列化合物组中，所有化合物组的血栓湿重与阴 性对照羧甲基纤维素钠组相比均具有显著性差异P<0.05。其中化合物6i、6j、6l、6t在0. 1μmol/kg口服给药的剂量下血栓湿重分别为：23.0±6.5mg、21.3±4.5mg、21.1±6.2mg、22.3±5.3mg与的阳性对照167μmol/kg的阿司匹林组(血栓湿重为18.2±3.7 mg)相比没有显著性差异P>0.05，这表明化合物6i、6j、6l、6t的抗动脉血栓活性比阿司 匹林强1670倍，具有更好的抑制动脉血栓形成的活性。并且6a-t系列化合物在0.1μmol/ kg口服给药的剂量下血栓湿重与4的血栓湿重相比没有显著性差异P>0.05，这表明在降 低了10倍的剂量下，通过氨基酸修饰后得到的目标化合物具有更好的抑制体内动脉血栓 形成的活性。本发明具有意想不到的技术效果。

表1 6a-t的抗动脉血栓活性

a)与羧甲基纤维素钠比P<0.01；b)与羧甲基纤维钠比P<0.01,与1μmol/kg 4比P>0.05；c)与167μmol/k g阿司匹林比P>0.05；n＝12。

实施例46评价化合物6l抗动脉血栓的剂量依赖关系

1)实验材料：

乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(CAS：9041-08-1，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。

2)实验动物：

SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

3)实验方法：

实验采用动静脉旁路丝线血栓形成模型。

4)旁路插管的准备：

旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管受热拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段 由内径3.5mm的聚乙烯管构成，定长为8.0cm；将表面毛糙的丝线定长为6.0cm，选用 重4.0±0.1mg且毛糙程度相同的丝线。三段聚乙烯管内壁均用1％的硅醚溶液(1％硅油的 乙醚溶液)进行硅烷化，在完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中， 利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。

5)分组及给药剂量：

6l为三个剂量分别是0.1μmol/kg、0.01μmol/kg、0.001μmol/kg；阳性对照阿司匹林 剂量为167μmol/kg，阴性对照为生理盐水。.

6)所用试剂配制：

麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液，抗凝剂为用生理盐水配制的42mg/100mL的肝素钠水溶液。

7)实验操作：

以0.3mL/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左 颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1mL/100g体重的 剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总 动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管 插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外 循环旁路。

维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循 环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的浮血后称量并记录其湿 重，代表抗动脉血栓活性。

8)实验结果及讨论：

利用动静脉旁路丝线血栓形成模型评价6l的体内抗动脉血栓形成的活性是否存在剂 量依赖关系。口服给予的阴性对照生理盐水组的血栓湿重为33.7±3.7mg，而口服给予的 阳性对照167μmol/kg的阿司匹林组的血栓湿重为17.8±1.8mg，这两组数据具有显著性 差距P<0.01，这表明该模型建立成功。

(0.1μmol/kg)6l的栓重与生理盐水组相比P<0.01,与阿司匹林组相比P>0.05,说明在 0.1μmol/kg的剂量下6l表现出了优秀的抗动脉血栓活性。在降低10剂量之后，(0.01μmol/kg)6l组的栓重与生理盐水组相比P<0.01，且与(0.1μmol/kg)6l相比P<0.01，且与(0.001μmol/kg)6l相比P<0.01，说明在降低10倍计量后6l仍具有抗动脉血栓活性，且存 在剂量依赖关系；在降低100倍剂量后，(0.001μmol/kg)6l的栓重与(0.01μmol/kg)6l组 相比P<0.01，且与生理盐水组相比P>0.05，说明已经不具有抗动脉血栓活性。

表2三种剂量的化合物6l的抗动脉血栓活性

a)与生理盐水比P<0.01；b)与生理盐水比P<0.01,与167μmol/kg阿司匹林比P>0.05；c)与生理盐水比 P<0.01,与(0.1μmol/kg)6l比P<0.01,与(0.001μmol/kg)6l比P<0.01；d)与生理盐水比P>0.05,与 (0.01μmol/kg)6l比P<0.01；n＝12。

实施例47评价6a-t抑制体内P-选择素表达的活性

1)实验材料：

柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、NS(石家庄四药有限公司)、 蒸馏水；

2)实验样本：

大鼠抗动脉血栓实验，体循环后动脉血

3)实验方法：

采用大鼠p选择素酶联免疫试剂盒来进行检测。

4)试剂的配制：

1.从试剂盒中取出一只标准品，于6000-10000rpm离心30s，用1mL样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混合得到标准品S7，放置备 用。取7个1.5ml离心管(S0-S6)依次排列，各加入250μL样本稀释液，吸取250μL标准 品S7到第一个离心管中(S6),轻轻吹打混匀。从S6中吸取250μL到第二个EP管中(S5), 轻轻吹打混匀。依次类推进行标准品的倍比稀释。S0为样本稀释液。标准品浓度分别为： S7(600ng/mL)、S6(300ng/mL)、S5(150ng/mL)、S4(75ng/mL)、S3(37.5ng/mL)、S2(18.75 ng/mL)、S1(9.38ng/mL)、S0(0ng/mL)。

2.浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。在临用前配妥，浓洗涤液低温保存会有 盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3.生物素标记抗体液按1:100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释，在临用前10分 钟内配妥。

4.辣根过氧化物酶标记亲和素按1:100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行 稀释，在临用前10分钟内配妥。

5)样本的采集：

用3.8％的枸橼酸钠溶液为抗凝剂，采集大鼠抗动脉血栓循环后的颈动脉血，与30min 内于4℃1000rpm每分钟，离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。

6)样本检测：

将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30min，按前述方法配置试剂，备用。分别设标准品孔、待测样品孔。在每孔分别加入标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀， 覆上板贴，37℃温育2h。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加入生物素标记抗体工作液 100μL，覆上新的板贴，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min， 200μL/每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴， 37℃温育1h。弃去液体，甩干，洗板5次，200μL/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光显色15-30min，依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。在5min内用酶标 仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

7)实验结果：

从表中的数据可以看出，在0.1μmol/kg的剂量下6a-t系列化合物治疗大鼠体内P-选择 素含量显著低于羧甲基纤维素钠组治疗大鼠的P选择素含量(P＜0.05)，其中6i、6t在0.1 μmol/kg的剂量下治疗大鼠体内P-选择素含量显著低于羧甲基纤维素钠组治疗大鼠的P选 择素含量(P＜0.01)，这表明所设计的目标化合物具有降低大鼠体内P-选择素含量的活性。

表3 6a-t抑制体内P-选择素表达的活性

a)与羧甲基纤维素钠比P<0.05；b)与羧甲基纤维素钠比P<0.01；n＝3。

Claims (4)

1.下式的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮,

式中AA表示:L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Cys残基、L-Asp残基、L-Pyr残基、Gly残基、L-His残基、L-Lys残基、L-Met残基、L-Asn残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Arg残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基。

2.权利要求1的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮的制备方法，该方法包括：

(1)将L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合,得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(2)在甲醇溶液中1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下,与H₂反应脱去苄酯得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(3)在2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N-羟基苯并三唑存在下，1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水N,N-二甲基甲酰胺中进行分子间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮；

(4)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，在冰醋酸、水的条件下，将缩醛转变为醛基得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮；

(5)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在氰基硼氢化钠为还原剂的条件下，与5种天然氨基酸苄酯进行氨化还原反应，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA苄酯]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物5a-e,AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基；

(6)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在氰基硼氢化钠为还原剂的条件下，与15种天然氨基酸甲酯进行氨化还原反应，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA-甲酯]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物5f-t，AA表示：L-Cys残基、L-Asp残基、L-Pyr残基、Gly残基、L-His残基、L-Lys残基、L-Met残基、L-Asn残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Arg残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基；

(7)将5a-t在浓度2N的NaOH溶液中脱除保护得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物6a-t。

3.权利要求1的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在制备抗动脉血栓药物中的应用。

4.权利要求1的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[乙基-AA]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在制备P-选择素拮抗剂中的应用。