CN110540970A

CN110540970A - 人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获elisa试剂盒

Info

Publication number: CN110540970A
Application number: CN201811577722.8A
Authority: CN
Inventors: 胡征
Original assignee: Hubei Yunlu Bioengineering Co ltd
Current assignee: Hubei Yunlu Bioengineering Co ltd
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN110540970B

Abstract

本发明公开了一种人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒。该人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCCNO：C2017215的杂交瘤细胞株分泌产生。该人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体可用于检测人卡他莫拉菌。本发明还公开了一种基于该单克隆抗体的人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒。

Description

人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及一种人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。

背景技术

卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis，简称MC)首次发现于1896年，当时称之为卡他微球菌(Micrococcus catarrhalis)，尔后又称为卡他奈瑟菌(Neisseria catarrhalis)和卡他布兰汉菌(Branhamella catarhalis)。过去一直认为卡他莫拉菌是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌。但是，近20多年的研究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常见致病菌，仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌，而且其发病率逐年增加，尤其多见于慢性阻塞性肺病患者。卡他莫拉菌院内感染可通过呼吸道传播，有证据表明卡他莫拉菌在痰液中可生存3星期以上，所以呼吸病房尤易造成人与人间的传播。

目前检测呼吸道中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、胶体金检测方法等的基础。

抗原成分的选择是检测特异性的关键。几乎所有致病性卡他莫拉菌表面均存在表面蛋白A(Ubiquitous surface protein A，UspA)。UspA主要包括两种蛋白分子，分别为相对分子质量约88000的UspA1和60000的UspA2。UspA1和UspA2是MC近年来研究最多的外膜蛋白，是不同临床分离菌几乎均可得到的高度保守的蛋白，其在MC表面形成一个较模糊的包裹层。UspAl/A2一般具有3个明显的结构，分别为头部(N末端)、颈部及跨膜(C一末端)结构域，其跨膜结构域的序列高度保守。UspAs是一类自主转运蛋白，作为一种配体，可与宿主细胞和组织表面的受体发生特异性的受体-配体相互作用。UspAs也是多功能的外膜蛋白，能够结合细胞外基质蛋白，如上皮细胞的纤连蛋白和细胞薄膜上的层黏连蛋白，在MC黏附到宿主上皮细胞方面起重要作用。UspAs还可通过结合补体蛋白c3来阻碍固有免疫系统中补体系统的调理杀菌作用，同时在患有慢性阻塞性肺部疾病的成人中，它们可激活患者的黏膜免疫系统，产生黏膜抗体IgA。UspA1蛋白序列中一个区域可与宿主肠结膜上皮细胞、黏连蛋白以及层黏连蛋白结合而起到黏附作用，其还参与病原菌生物膜的形成。另外，UspA1蛋白还可通过结合到一种广泛存在于宿主上皮细胞的癌胚抗原相关细胞黏附分子的糖蛋白上而被调节，从而增强其黏附作用。综上，UspA以其良好的保守性与表面可及性使其成为抗原检测的良好标的物。

本研究选用具有种间特异性的表面蛋白UspA1作为抗原，制备特异性良好的单克隆抗体，并将其应用于制备卡他莫拉菌ELISA检测试剂盒。

发明内容

为了解决背景技术中存的上述技术问题，本发明提供了一种特异性良好以及与其他呼吸道常见病原体无交叉反应的人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号是保藏编号CCTCC NO：C2017215的杂交瘤细胞株Mc-4#。

一种产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)以重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1为抗原，对8周龄的BALB/c小鼠进行免疫后，采用间接ELISA方法检测抗血清效价；

2)SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养；

3)制备饲养细胞；

4)制备免疫脾细胞悬液；

5)制备SP2/0骨髓瘤细胞悬液；

6)细胞融合；

7)阳性克隆的筛选和克隆化培养，以人卡他莫拉菌菌体为包被抗原，采用间接ELISA法检测；用酶联检测仪测定OD₄₅₀，满足P/N值＞2.1为阳性；选取连续阳性的克隆孔进行2-3次亚克隆，筛选出单克隆杂交瘤细胞；对单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，获取含单克隆抗体的细胞培养液上清；以呼吸道病原菌分别包被酶标板，对所筛抗体的特异性进行ELISA检测，淘汰与这些病原体有阳性反应的单克隆抗体，筛选出合格的细胞株；所述呼吸道病原菌包括人肺炎支原体、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、鲍曼不动杆菌、副流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、人肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌以及假丝酵母菌。

作为优选，步骤1)中重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1的制备过程是：

1.1)人卡他莫拉菌UspA1基因的克隆表达

对人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1基因进行生物信息学分析，结合GC含量、密码子偏爱性、mRNA二级结构、RNA不稳定基序以及mRNA自由能稳定性，优化人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1基因的DNA编码序列，同时在人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1基因的5’引入酶切位点NdeI、在人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1基因的3’端引入终止信号TAA和酶切位点EcoRI后化学合成全基因序列后连于载体pUC57上，记为UspA1’；将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及EcoRI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用；同时采用NdeI及EcoRI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得的UspA1’基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-UspA1’表达载体；经酶切和序列测定证实表达载体构建无误；该载体表达重组UspA1-His融合蛋白；

1.2)人卡他莫拉菌UspA1蛋白的纯化

鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)plysS中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株后培养，纯化。

一种人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株Mc-4#分泌的单克隆抗体。

一种人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

对筛选得到的阳性单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养；常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水，收集单抗腹水并用Protein A亲和层析法对腹水进行纯化，得到人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#。

人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体在检测人卡他莫拉菌中的用途，尤其是在制备检测人卡他莫拉菌的试剂中的应用，最优是在制备检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒中的应用。

一种检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒，其特征在于：所述检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒包括酶标板以及人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#；所述酶标板是已包被人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体的固相载体。

上述人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体的制备方法是：

a)采用重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1对新西兰纯种兔进行免疫，随后进行间接ELISA法检测血清抗体水平；

b)用GE-HiTrap Protein A HP预装柱对多克隆抗体进行纯化提取，制得人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体。

本发明具有以下优点和效果：

首先，本发明采用基因优化等方式成功获得了可溶性的重组UspA1蛋白，蛋白结构天然，是作为免疫源制备抗体的良好材料。

其次，本发明所得到的单克隆抗体可特异性识别菌体UspA1蛋白的胞外区，与其他呼吸道常见病原体无交叉反应。

最后，用7株人卡他莫拉菌菌株和17株非人卡他莫拉菌标准菌株(包含绝大部分呼吸道常见病原体)进行的特异性实验，结果显示本发明的试剂盒具有良好的特异性和稳定性，其可检出所有所试的人卡他莫拉菌菌株，而与所有非人卡他莫拉菌标准菌株均无交叉反应。其次，敏感性实验结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为1×10³CFU/孔，明显高于微生物传统检测方法，并且具有快速、高效等优点。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1的制备

1)人卡他莫拉菌UspA1基因的克隆表达

对人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1(其NCBI蛋白质数据库中的accession number为U61725)基因进行生物信息学分析，结合GC含量、密码子偏爱性、mRNA二级结构、RNA不稳定基序、mRNA自由能稳定性等考虑，优化其DNA编码序列，同时在其5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点EcoRI后化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段连于载体pUC57上)，记为UspA1’。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及EcoRI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及EcoRI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得的UspA1’基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-UspA1’表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组UspA1-His融合蛋白。

2)人卡他莫拉菌UspA1蛋白的纯化

鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)plysS中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-UspA1转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mLBuffer A(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；5mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组UspA1蛋白以溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的30％以上，说明基因优化后获得了较高的表达量。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组UspA1蛋白的纯化。具体方法如下：

连接层析系统，该系统包括进样管、蠕动泵、层析柱及紫外检测器(上海沪西分析仪器厂，型号HD1)，柱体积为2ml，预热紫外检测仪30min左右至读数稳定；校对T％：调节光亮旋钮至显示100％；旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2A；以上样缓冲液平衡层析系统，至读数稳定后旋转“调零”至显示“000”；上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；用上样缓冲液洗去未结合的蛋白，此过程中记录读数，直到读数不再变化为止，收集洗脱液；用Buffer A+10mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；用Buffer A+20mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；用Buffer A+40mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；用Buffer A+100mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；用Buffer A+150mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；取各洗脱峰样品100ul进行SDS-PAGE电泳；结果发现，目标蛋白在100mM咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL，备用。至此制得重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1。

实施例2人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体的制备

1)新西兰纯种兔的免疫

将实施例1所制重组UspA1蛋白与福氏完全佐剂混合，乳化后作为免疫原免疫雄性新西兰兔2只，每只兔子皮下注射总量为2ml，抗原总量为2mg/只。后每隔两周用重组UspA1蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次，共免疫5次，抗原用量与初次免疫相同。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清。

2)多克隆抗体效价的测定

以重组UspA1蛋白为包被抗原，包被浓度为10μg/ml，每孔包被100μl，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800；ELISA板包被牛血清白蛋白作为阴性对照，用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.1为阳性。结果显示2只兔子的血清抗体效价均达到1：102400，说明免疫效果较好。

3)多克隆抗体的提取

用GE-HiTrap Protein A HP预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：

1.取5mL抗血清，加入0.5mL 1M Tris(pH8.0)调节到pH8.0，20000g离心20min除去沉淀。

2.上柱后用10倍柱体积buffer A(100mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤后，再用10倍柱体积buffer B(10mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤。

3.用大约三倍柱体积的IgG洗脱缓冲液(100mM glycine，pH3.0)洗脱IgG。(收集管内先预装0.1mL IgG-中和缓冲液(1M Tris-Cl，pH 8.0)，每管装0.9mL洗脱液)

4.用50倍体积Tris(10mM Tris-Cl，pH 8.0)进行透析。

5.超滤浓缩后，调整浓度为1mg/ml，-70℃保存备用。至此制得人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体。

实施例3人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#的制备

1)动物的免疫

以实施例1所制重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1为抗原，免疫8周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射免疫小鼠，100μg/小鼠。之后间隔三周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第二次免疫，以后间隔2周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第三次免疫。第三次免疫15天后尾静脉采血，检测抗血清效价。

2)抗血清效价检测

抗血清效价采用间接ELISA方法：用PBS(8.5g/L NaCl，1.4g/L Na₂HPO₄，0.2g/LNaH₂PO₄，pH7.4)稀释抗原浓度至3μg/mL，加入96孔板，100μL/孔，37℃孵育2h或者4℃过夜。用PBST(8.5g/L NaCl，1.4g/L Na₂HPO₄，0.2g/L NaH₂PO₄，0.5％(v/v)Tween-20，pH7.4)洗板3次之后拍板。1％的牛血清白蛋白溶于PBS溶液中，250μL/孔，37℃封闭1h或者4℃过夜。用PBST洗板3次之后拍板。4只免疫鼠血清用PBS梯度稀释加入对应孔中，100μL/孔，空白对照为PBS溶液，阴性对照为免疫前小鼠血清37℃包被1h后洗板。HRP标记的羊抗鼠IgG以1：3000倍数稀释加入，100μL/孔，37℃包被1h后洗板。每孔加新鲜配制的TMB显色底物溶液100μL，37℃作用10min后每孔加入1M盐酸100μL终止反应，用酶联检测仪测定OD₄₅₀nm值，读数并观察结果。选择效价最高(效价51200)，第三次免疫间隔一个月后加强免疫，5天后取小鼠脾细胞进行细胞融合。

3)SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养

提前对冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行复苏，将液氮冻存的骨髓瘤细胞快速取出后，置于37℃水浴中轻微晃动使其迅速融化，注意冻存管口不能碰到水，以免污染，然后将细胞转移到含2ml RPMI-1640完全培养基(含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基，胎牛血清购自山西润生大业生物材料有限公司)的24孔板中，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养半个小时，待细胞全部贴壁生长时，及时换液，以后每隔3天传代一次，并调整细胞使其处于最适生长密度，当细胞达到一定活性，计数，准备进行融合。细胞融合前2天对细胞进行1比4传代，用新鲜培养基调整每瓶细胞浓度为1×10⁵/ml。

4)饲养细胞的制备

4.1)将BALB/c小鼠眼球取血之后拉颈处死，完全浸泡于75％酒精中5min，移入超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。

4.2)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，用镊子，小剪刀小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心剥去脾脏上附带的脂肪、结缔组织等，加入RPMI-1640培养基(购自Hyclone，货号SH30809.01)5ml，用吸有5ml RPMI-1640培养基的注射器的针头穿刺脾脏，小心的洗出脾细胞，然后过筛，将脾脏细胞悬液加入10ml离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，用RPMI-1640培养基离心洗涤两次。

4.3)用5ml HAT培养液轻轻将细胞重悬并混和均匀，计数，补加HAT培养液至细胞浓度为1×10⁵/ml。

4.4)将细胞悬液滴入96孔细胞培养板内，130μl/孔，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

5)免疫脾细胞悬液的制备

5.1)加强免疫5天后，选血清效价最高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分离血清作为抗体检测的阳性对照。

5.2)小鼠断颈处死后浸泡于75％酒精中5min，取出小鼠放在无菌超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。

5.3)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，再用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心去除脂肪和结缔组织。

5.4)用RPMI-1640洗液冲洗后，加入新的RPMI-1640洗液，用吸有5ml RPMI-1640培养基的注射器的针头穿刺脾脏小心的洗出脾细胞，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，离心洗涤两次。

5.5)用RPMI-1640培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用。

6)SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备

6.1)取2瓶T75培养瓶培养好的骨髓瘤细胞(融合前一天换液，融合时细胞应处于对数生长期)，收集于50ml离心管中。

6.2)1000rpm离心5分钟，弃上清。

6.3)沉淀中加入30ml RPMI-1640洗液，轻轻重悬，混匀，同法再离心洗涤一次。

6.4)用10ml RPMI-1640培养液轻轻将脾细胞重悬并混和均匀，计数，备用。

7)细胞融合

7.1)将含1×10⁸个脾细胞的悬液和含1×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞的悬液混合于一支50ml的离心管内，补加培养基至40ml，充分混匀。

7.2)1200rpm离心5分钟，弃去上清，尽量去上清。

7.3)用手轻轻弹离心管底，使细胞团块松散均匀呈糊状。

7.4)从4℃冰箱中拿出已配好的50％PEG(MW1450)、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用。

7.5)用1ml吸管吸取50％的PEG(MW1450)0.8ml，缓慢加入离心管边加边搅拌，时间控制在60秒。

7.6)然后再用60秒的时间逐渐加入40ml预热好的RPMI-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用。

7.7)1000rpm离心5min，弃上清。

7.8)加入400mL HAT培养液(购自Sigma，货号H0262)，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞。

7.9)将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，50μl/孔，共铺20块培养板，然后将培养板置37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

8)阳性克隆的筛选和克隆化培养

融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理。融合后第7d用HT培养液全换液(HT，50×，购自Sigma，货号H0137)。换液后第二天，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测。以人卡他莫拉菌菌体(ATCC25240，1×10⁸个菌体/孔)为包被抗原，采用间接ELISA法检测。用酶联检测仪测定OD₄₅₀，满足P/N值＞2.1为阳性。将阳性孔再次用HT培养基全换液，第二天再次ELISA检测阳性，选取连续阳性的克隆孔进行2-3次亚克隆，筛选出单克隆杂交瘤细胞。亚克隆具体步骤：①吹散并混匀阳性融合孔杂交瘤细胞，测定细胞浓度；②提前制备饲养细胞，并悬于HT培养基中，130ul/孔，铺到96孔板中，然后将培养板置37℃、5％CO₂的培养箱中备用；③取阳性融合孔杂交瘤细胞，平均分散到步骤②的96孔板中；④将培养板置37℃、5％CO₂的培养箱中培养7-8d；⑤用ELISA筛选阳性单集落孔，再次亚克隆；⑥连续亚克隆2-3次之后，可使亚克隆细胞集落孔均为阳性，且数值相近，即获得单克隆杂交瘤细胞；对单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，获取含单克隆抗体的细胞培养液上清。以人肺炎支原体(ATCC15531，1×10⁸个菌体/孔)、铜绿假单胞菌(ATCC27853，1×10⁸个菌体/孔)、嗜肺军团菌(ATCC33152，1×10⁸个菌体/孔)、鲍曼不动杆菌(ATCC19606，1×10⁸个菌体/孔)、副流感嗜血杆菌(ATCC7901，1×10⁸个菌体/孔)、流感嗜血杆菌(ATCC49247，1×10⁸个菌体/孔)、化脓性链球菌(ATCC19615，1×10⁸个菌体/孔)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923，1×10⁸个菌体/孔)、人肺炎链球菌(ATCC49619，1×10⁸个菌体/孔)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603，1×10⁸个菌体/孔)、阴沟肠杆菌(ATCC13047，1×10⁸个菌体/孔)、大肠埃希菌(ATCC25922，1×10⁸个菌体/孔)、假丝酵母菌(ATCC10231，1×10⁸个菌体/孔)等呼吸道病原菌分别包被酶标板，对所筛抗体的特异性进行ELISA检测，淘汰与这些病原体有阳性反应的单克隆抗体。此步共筛选出8株合格的细胞株。

9)腹水制备与细胞保藏

对最后筛选出的8株阳性单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养。常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水。(1)mAb的Western blot检测：采用常规Western blot实验方法，测定腹水在1：2000稀释度下的特异性，结果显示该8种抗体均只与人卡他莫拉菌全细胞蛋白中的UspA1蛋白结合。(2)抗体纯化及效价测定：腹水用Protein A亲和层析法进行纯化，步骤如下：

a.取5mL杂交瘤上清，加入0.5mL 1M Tris(pH8.0)调节到pH8.0，20000g离心20min除去沉淀。

b.上柱后用10倍柱体积buffer A(100mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤后，再用10倍柱体积buffer B(10mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤。

c.用大约三倍柱体积的IgG洗脱缓冲液(100mM glycine，pH3.0)洗脱IgG。(收集管内先预装0.1mL IgG-中和缓冲液(1M Tris-Cl，pH 8.0)，每管装0.9mL洗脱液)；

d.用50倍体积PBS(8.5g/L NaCl，1.4g/L Na₂HPO₄，0.2g/L NaH₂PO₄，pH 7.4)进行透析。

e.超滤浓缩后，以PBS调整浓度为1mg/ml，-70℃保存备用。

纯化后的8种抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价。抗体经SDS-PAGE分析纯度均在95％以上，ELISA效价均在1：1000000以上。纯化的抗体调整浓度为1mg/ml后，-70℃保存备用。

将此8种抗体分别作为ELISA检测的标记抗体，进行单抗-多抗配对实验，筛选出最佳组合。最终经过多次实验，确定被命名为Mc-4#的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体优选为标记抗体。将此抗体命名为单克隆抗体Mc-4#。

分泌该抗体的杂交瘤细胞株已于2018年10月15日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：杂交瘤细胞株Mc-4#，保藏编号CCTCC NO：C2017215；地址：中国武汉武汉大学。

实施例4人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒

1)人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒组成

已包被人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体的固相载体即酶标板，人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，酶的底物反应液、阳性和阴性对照，洗涤液和反应终止液共同组成人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒。

酶标板包被多抗

用PBS缓冲液将人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体(如实施例2制备所得)稀释至浓度为10μg/mL，包被96孔EIA高效结合酶标板，50μL/孔，37℃2小时。取出后用洗涤液洗板三次，甩干。用含有1％BSA的洗涤液作为封闭液，250μL/孔加入酶标板，37℃封闭1小时。取出后用洗涤液洗板3次，每次一分钟，甩干，干燥后密封保存。

其中，PBS缓冲液：磷酸氢二钠1.4g，磷酸二氢钠0.2g，氯化钠8.5g，pH7.4加去离子水至1000mL；洗涤液(PBST)：含0.01％Tween-20的PBS水溶液，pH为7.4；封闭液：含1％BSA的洗涤液水溶液，pH为7.4。

2)人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#

将如实施例3所述的浓度为1mg/mL的人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#按每支20μL的量进行分装，使用时用PBS缓冲液稀释1000倍。

3)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG

辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为普通商品，本实施例中其购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号030006-G，使用时用PBS缓冲液稀释3000倍。

4)酶的底物反应液

酶的底物反应液配置过程如下：

A液：配置量1L)

1.称柠檬酸(含1分子结晶水，分子量210.14g)3.14g，醋酸钠(含3分子结晶水，分子量136.0)11.56g溶于970mL双蒸水，制成pH5.0的醋酸钠水溶液。

2.称非那西汀0.08g加入30mL双蒸水加热至100℃，溶解完全后加入第一步的溶液中。

3.再加入0.5g过氧化脲，混匀即可。

B液：配置量1L)

往2L烧杯加入500mL甲醇，再加入1.27g 3，3，5，5-四甲基联苯胺TMB(SIGMA)，60℃加热溶解后，再加入500mL丙三醇即可。

使用前将A、B液1：1混合，配制成酶的底物反应液。

5)阳性和阴性对照

阳性对照：重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1，按照实施例1所述的方法提取，10μg/mL。

阴性对照：未免疫重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1的正常小鼠血清用PBS缓冲液稀释200倍。

6)洗涤液，PBST液，具体配置方法如(1)内所述。

7)反应终止液，用双蒸水配制的1M HCL溶液。

实施例5人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒的使用方法

1)待检样本的处理

按常规方法获得待检者的咽拭子，将其插入装有500μL的洗涤液(PBST)的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解。将样品进行超声破碎(宁波新芝JY96-IIN型超声波细胞粉碎机，30％功率，15min)后制成破碎液。

2)加入对照和待检样本

取待检破碎液样本100μL加入相应的酶标孔，阳性对照(100μL/孔)1孔，阴性对照(100μL/孔)4孔，37℃孵育1小时，后用250μL PBST洗涤液洗板3次，甩干。

3)加入单克隆抗体Mc-4#

加入实施例4所述人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#工作液(封闭液1：1000稀释)50μL/孔，37℃孵育1小时，后用250μL PBST洗涤液洗板3次，甩干。

4)加入酶标抗体

加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(实施例4所述)工作液(封闭液1：3000稀释)50μL/孔，37℃孵育1小时，后用250μL PBST洗涤液洗板3次，甩干。

5)加入底物显色

加入实施例4所述的新鲜配制的酶的底物反应液50μL/孔，充分显色后(15分钟)。

6)加入反应终止液

每孔加入50μL反应终止液，终止反应。

7)测OD₄₅₀nm值

酶标板置于酶标仪中测定OD₄₅₀nm值。

8)结果判定

分别读取4孔阴性质控品及1孔阳性质控品样品的OD₄₅₀nm值；4孔阴性质控品样品的OD₄₅₀nm读数的平均值与3倍标准差之和即为CUT-OFF值；若上述人咽拭子样本的检测OD₄₅₀nm值若大于CUT-OFF值即判断为此份临床咽拭子中人卡他莫拉菌抗原为阳性，反之则判断为此份人咽拭子样本中人卡他莫拉菌抗原为阴性；若阳性质控品样品的OD₄₅₀nm值小于CUT-OFF值，则表明试剂盒失效。

实施例6人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒的特异性和敏感性测定

1)特异性测定

为了验证本发明的人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒的特异性，按照实施例4及实施例5所述的试剂盒组成和方法对7株人卡他莫拉菌菌株及17株非人卡他莫拉菌标准菌株进行了检测，见表1。结果表明，本发明试剂盒对所有7株人卡他莫拉菌菌株的检测结果均为阳性，而对其他17株呼吸道常见病原微生物的检测结果均为阴性。该试剂盒显示出良好的特异性。

表1

2)敏感性测定

将人卡他莫拉菌ATCC25240菌株接种于羊血巧克力培养基，37℃培养48小时后，生理盐水10倍梯度稀释，同时平板计数，得到菌体浓度为10⁸-10³CFU/mL的菌体溶液，然后将100μL菌体溶液滴加于酶标板，按照实施例4及实施例5所述的试剂盒组成和方法将进行检测。结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为10³CFU/mL。

序列表

<110> 湖北云璐生物工程有限公司

<120> 人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1278

<212> DNA

<213> USPA1’基因序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatgcaaa acactctgat cgaacagggc gaagctcagg acgcgctgat cgctcagaac 60

cagaccgata ttaccgcaaa caaaactgct atcgagcgta acttcaaccg taccgttgta 120

aacggttttg aaatcgagaa aaacaaagct ggcatcgcaa agaaccaggc ggacattcag 180

accctggaaa acaacgtagg tgaagaactg ctgaacctga gtggccgtct gcttgaccag 240

aaagctgaca tcgacaataa cattaacaac atctacgacc tggctcagca gcaggaccag 300

cactctagcg acatcaaaac cctgaaaaaa aacgttgaag aaggtctcct ggacctgtcc 360

ggccgtctga ttgaccagaa agctgacctg actaaagata tcaaaactct ggaaaacaac 420

gttgaagaag gcctgctgga cctttcaggc cgtctgatcg accagaaggc agacatcgct 480

aaaaatcagg cagatatcgc tcagaaccag accgatatcc aggacctggc agcttataac 540

gaactgcagg atcagtacgc tcagaaacaa accgaagcaa tcgacgctct gaacaaagca 600

tcttctgcca acaccgaccg tatcgctact gctgaactgg gtattgccga aaacaagaaa 660

gacgcacaga tcgcaaaagc ccaggcaaac gagaacaaag atggtatcgc taagaaccag 720

gcagacatcc agctccatga caaaaaaatc accaacctgg gtatcctgca ctctatggtg 780

gcacgtgctg ttggcaacaa cacacagggt gttgctacca acaaggcaga tatcgctaaa 840

aaccaggctg atatcgcaaa caacatcaaa aacatctacg aactggccca gcagcaggac 900

cagcactctt ccgatatcaa gaccctggca aaagtatccg ccgcgaacac tgatcgcatc 960

gcaaagaaca aagcagaagc ggatgcatcc ttcgaaactc tgaccaaaaa ccagaacacc 1020

ctgattgagc agggcgaggc tctggtggaa cagaacaaag ctatcaacca ggaactggag 1080

ggtttcgctg cacacgctga cgttcaggac aaacagatcc tgcagaacca ggccgacatc 1140

acgaccaaca aagcggcgat cgaacagaat attaaccgta ctgtagcaaa cggtttcgaa 1200

atcgagaaaa acaaagcggg tatcgctact aacaaacagg agctgattct gcagaacgat 1260

cgtctgaacc agctcgag 1278

<210> 2

<211> 423

<212> PRT

<213> USPA1’蛋白序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly Glu Ala Gln Asp Ala Leu Ile

1 5 10 15

Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Thr Ala Asn Lys Thr Ala Ile Glu Arg

20 25 30

Asn Phe Asn Arg Thr Val Val Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys

35 40 45

Ala Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Thr Leu Glu Asn Asn

50 55 60

Val Gly Glu Glu Leu Leu Asn Leu Ser Gly Arg Leu Leu Asp Gln Lys

65 70 75 80

Ala Asp Ile Asp Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Asp Leu Ala Gln Gln

85 90 95

Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Lys Asn Val Glu

100 105 110

Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp

115 120 125

Leu Thr Lys Asp Ile Lys Thr Leu Glu Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu

130 135 140

Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys

145 150 155 160

Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala

165 170 175

Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala

180 185 190

Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala

195 200 205

Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala

210 215 220

Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala

225 230 235 240

Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His

245 250 255

Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr

260 265 270

Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile

275 280 285

Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp

290 295 300

Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala

305 310 315 320

Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn

325 330 335

Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn Lys

340 345 350

Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly Phe Ala Ala His Ala Asp Val Gln

355 360 365

Asp Lys Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ala Asp Ile Thr Thr Asn Lys Ala

370 375 380

Ala Ile Glu Gln Asn Ile Asn Arg Thr Val Ala Asn Gly Phe Glu Ile

385 390 395 400

Glu Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala Thr Asn Lys Gln Glu Leu Ile Leu

405 410 415

Gln Asn Asp Arg Leu Asn Gln

420

Claims

1.一种产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号是保藏编号CCTCC NO：C2017215的杂交瘤细胞株Mc-4#。

2.一种产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

2)SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养；

3)制备饲养细胞；

4)制备免疫脾细胞悬液；

5)制备SP2/0骨髓瘤细胞悬液；

6)细胞融合；

3.根据权利要求2所述的产生人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中重组人卡他莫拉菌表面蛋白UspA1的制备过程是：

1.1)人卡他莫拉菌UspA1基因的克隆表达

1.2)人卡他莫拉菌UspA1蛋白的纯化

4.一种人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株Mc-4#分泌的单克隆抗体。

5.一种人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

6.根据权利要求4所述的人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体在检测人卡他莫拉菌中的用途。

7.根据权利要求4所述的人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体在制备检测人卡他莫拉菌的试剂中的应用。

8.根据权利要求4所述的人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体在制备检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒中的应用。

9.一种检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒，其特征在于：所述检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒包括酶标板以及人卡他莫拉菌表面蛋白单克隆抗体Mc-4#；所述酶标板是已包被人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体的固相载体。

10.根据权利要求9所述的检测人卡他莫拉菌表面蛋白捕获ELISA试剂盒，其特征在于：所述人卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗体的制备方法是：