CN110538273A - 组合物在制备治疗发育性视网膜血管疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组合物用于制备治疗发育性视网膜血管疾病的药物的用途，其中该组合物包含有效剂量的金钗石斛(Dendrobium nobile Lindley)。

Description

组合物在制备治疗发育性视网膜血管疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种组合物用于制备治疗发育性视网膜血管疾病的药物的用途，尤其涉及一种包含金钗石斛(Dendrobium nobile Lindley,DNL)的组合物，其能有效改善视网膜血管发育异常，进而避免因视网膜血管发育异常所造成的缺血性损伤。

背景技术

诺里(Norrin)依赖性Wnt信号通路(Norrin-dependent Wnt signaling pathway)似乎会介导血管生成(vasculogenesis)(早期视网膜血管发育)的缺陷。诺里/卷曲受体-4(Frizzled-4)信号在血管生成上扮演重要的角色，如诺里疾病(Norrie disease，ND)和家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)，最终可能会进展至视网膜缺血和新血管生成(neovascularization，NV)或是血管新生(angiogenesis)。除了ND 和FEVR之外，还有其他发育性视网膜血管疾病，即柯氏症(Coatsdisease) 和永存原始玻璃体增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)，其有共同类似的眼底图片，即周边视网膜无血管形成(peripheral retinalavascularization)和视网膜下渗出(subretinal exudation)。如上所述，这些玻璃体视网膜病变(vitreoretinopathy)也可能导致视网膜缺血而对患者的视力产生类似的威胁，尽管它们并不像其他视网膜缺血性疾病(即中央视网膜动脉阻塞(central retinal arteryocclusion，CRAO)、分支视网膜动脉阻塞 (branch retinal artery occlusion，BRAO)、中央视网膜静脉阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)、分支视网膜静脉阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)、青光眼、糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR) 或新生血管型老年性黄斑部病变(neovascular age-related maculardegeneration，nvAMD))那样常见。如先前文献报导持续缺氧被推测为这些发育性视网膜血管疾病(如ND)的发展的主要动力之一。

位于内层视网膜的视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs) 和无轴突细胞(amacrine cells)是易受到缺血/再灌注(ischemia/reperfusion (I/R))的伤害。再者，在缺血后，缪氏细胞(Müller cells)中的波形蛋白 (vimentin)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) 的免疫标记会提高；而这与RGC数量减少有关。已知在缺血视网膜上，血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)和视网膜母细胞瘤结合蛋白2(retinoblastoma-bindingprotein 2， RBP2)会同时发生过度表达的现象，且进一步异常地新血管形成(NV)(后期新血管形成)可能导致因水肿和出血所引起的视觉功能障碍。而在诺里蛋白耗尽的视网膜也可以观察到HIF-1α和VEGF的上调。除VEGF外，胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)被报导出在确认的视网膜/脉络膜的血管系统疾病中会增加；因此，该因子的下调可作为视觉功能的结果和治疗的生物标志。

金钗石斛(DNL)是兰科(Orchidae)植物的家族成员之一，其属于改善视力的草药。DNL也被用作补品，并发现具有解热/抗发炎的功效以及抗血管新生(anti-angiogenic)(如抗VEGF/HIF-1α)的性质。金钗石斛(DNL) 具有多种与不同作用机制有关的活性成分，其包括生物碱(alkaloids)(透过抑制p-p38MAPK和NF-κB途径使TNFR1过量表现)、黄酮醇配醣体(flavonol glycosides)(α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)抑制剂)、SG-168、多醣(polysaccharides)(抗氧化)。此外，抗血管新生或抗氧化的石斛酚 (moscatilin)是金钗石斛的活性成分(联芐)，且可能具有与上述成分不同的已知(抗VEGF/HIF-1α、OH自由基清除剂、抗发炎和抗细胞凋亡)和未知的作用机制。

发明内容

本发明通过视网膜电图(ERG)、免疫组织化学(视网膜神经节细胞、无轴突神经细胞、缪氏细胞)、组织病理学(视网膜厚度)、细胞存活率和蛋白质测量分析(PLGF、HIF-1α、VEGF-A、PKM2、RBP2和NDP)证实在视网膜或视网膜细胞中发生的各种缺血/缺氧(OGD)所造成的改变。本发明发现HIF-1α、VEGF、PKM2和RBP2的蛋白表达量在缺血性视网膜中显著上调，但通过施予金钗石斛后会显著降低这些蛋白的上调现象。当预先施予VEGF捕获(trap)/抗PLGF的采视明(Eylea)于缺血性视网膜时，缺血所诱发的PLGF上升也显著减弱；而1.0g/Kg/天的DNL也有此功效。故其新颖性和临床意义在于DNL可能具有抗血管新生(angiogenesis)/VEGF (PLGF)的捕获效应。这与先前报导指出DNL的联芐成分石斛酚(moscatilin)是透过抑制HIF-1α和VEGF而成为抗血管生成剂的结论并不一致。

缺血可能与发育性视网膜血管疾病(如FEVR或ND)密切相关。而抗 VEGF抗体虽能有效清除眼部出血和黄斑水肿；但令人失望的是，一些患者的视觉效果不佳。而诺里(Norrin)的Wnt信号通路在视网膜血管的早期正常发育和确定的发育性视网膜血管疾病的晚期进展扮演着重要角色。而后者情况可能会进一步加重缺血/缺氧并形成新血管生成(NV)。一致的是，诺里疾病蛋白(Norrie disease protein，NDP)似乎通过调节诺里(Norrin) 依赖性Wnt信号通路来保护眼睛免于异常的血管新生和视网膜疾病。此外，过量表达的NDP会通过活化诺里(Norrin)依赖性Wnt信号通路来保护光感受器和RGC免于细胞死亡。本发明亦证实缺氧(OGD)会导致NDP表达量和细胞存活率显著降低。但金钗石斛的联芐成分石斛酚(0.1μM)能够显著缓解缺氧/类缺血(OGD)所造成的损伤。故本发明证实金钗石斛和 /或石斛酚能够活化NDP依赖性Wnt信号通路，从而提供神经保护作用，并通过抑制VEGF-A/PLGF和上调NDP来抵抗视网膜缺血的症状。

此外，在缺血性损伤和给予媒剂(Vehicle)后，视网膜内层厚度、RGC 数量、无轴突神经细胞上的ChAT免疫反应性显著和明显地下降。重要的是，本发明证实，在给予高剂量金钗石斛前及/或后(1g/kg/天)，这些缺血诱发的变化显著和明显钝化。此外，在媒剂(Vehicle)给药前/给药后的缺血性视网膜中，波形蛋白/GFAP免疫标记过量表达伴随着b波下降。但本发明的结果显示这些缺血性改变在1g/kg/天的金钗石斛给药前/给药后明显和显著地抵消，其在临床上具有重要性。

本发明的结果显示缺血/缺氧(缺血模拟OGD)显著和明显影响视网膜电生理、形态计量学、免疫组织化学和视网膜分子生物学/细胞存活率。临床上重要的是，所有这些因缺血/OGD所发生的变化可通过用金钗石斛或其联芐成分石斛酚进行预处理和/或后处理而有效减弱。故本发明认为这些保护性机制系通过抑制HIF-1α、VEGF-A、PKM2、RBP2以及最重要的是通过抑制PLGF以及上调NDP的表达量来发挥作用(如图9所示)。

总之，金钗石斛及/或石斛酚能够保护或防止确定的视网膜缺血/类缺血的改变，并且通过抑制PLGF和上调NDP来实现。金钗石斛(及/或石斛酚) 的治疗是能提供有用的方式，其允许预防及/或管理可能由于持续缺血/缺氧而发展的发育性视网膜血管疾病的患者。

本发明通过视网膜电图(缪氏细胞(müller cells)和双极细胞上的b波变化)、免疫组织化学(荧光免疫标记的视网膜神经节细胞(RGC)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫呈阳性的无轴突神经细胞、波形蛋白(vimentin) /胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)所染色的缪氏细胞)、组织病理学(视网膜厚度测量)、及/或免疫印迹法(HIF-1α、VEGF、PKM2和RBP2)以观察大鼠视网膜中各种缺血性的改变。重要的是，在缺血再灌注(I/R)前/后施予金钗石斛(DNL)可显著调节所有这些被定义的缺血性相关特征。最重要的是，在视网膜缺血/类缺血(OGD)的状况下，胎盘生长因子(PLGF) 的蛋白质浓度上调(图8)，且诺里疾病蛋白(NDP)的蛋白质浓度下调(图 2)，但以金钗石斛(DNL)/石斛酚(moscatilin)治疗处理后会抵消上述这些改变。在临床意义上，DNL可以通过下调PLGF和上调NDP来预防或保护所定义的视网膜缺血/类缺血的改变。故金钗石斛/石斛酚可透过下调胎盘生长因子的表达量及上调诺里疾病蛋白的浓度来提供另一种预防或管理患有持续缺氧/缺血相关的发育性血管疾病(如诺里疾病)的病程之于病患的替代方法。

本文中的用语“一种”系用以叙述本发明的组件及成分。此术语仅为了叙述方便及给予本发明的基本观念。此叙述应被理解为包括一种或至少一种，且除非明显地另有所指，表示单数时亦包括复数。

本文中的用语“或”其意同“及/或”。

本发明提供一种组合物在制备治疗发育性视网膜血管疾病 (developmentalretinal vascular disorder)的药物中的用途，其中该组合物包含有效剂量的金钗石斛(Dendrobium nobile Lindley，DNL)。

在一个具体实施例中，该金钗石斛的成分包含联芐(bibenzyls)、生物碱(alkaloids)、糖苷(glycosides)和多醣(polysaccharides)。在一个优选的具体实施例中，该金钗石斛包含联芐化合物(bibenzyl compound)。在一个更优选的具体实施例中，该联芐化合物包含石斛酚(moscatilin)。

在一个具体实施例中，该石斛酚(moscatilin)的结构式为：

在一个具体实施例中，其中该治疗发育性视网膜血管疾病是通过改善视网膜血管发育的缺陷所达成。视网膜血管发育分成两个部分：(1)血管生成(vasculogenesis)：起始于怀孕的第18周左右，且在怀孕的第38-40 周完成；因血管会组织成血管丛(vascularplexuses)的网络，其系藉由血管生成(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)的组合而形成；血管生成是由内皮前驱细胞(endothelial precursor cell)，其聚集成索然后形成内腔，重新(de novo)形成的血管发育过程；及(2)血管新生(angiogenesis)：血管系藉由从已存在的血管发芽而形成。一般认为血管生成形成发育中的视网膜的大部分主要视网膜血管丛，而血管新生形成中央窝(fovea)周围以及更深和周边视网膜上的剩余毛细血管层。在一个优选的具体实施例中，其中该金钗石斛或石斛酚藉由改善血管生成(vasculogenesis)的缺陷以治疗该发育性视网膜血管疾病。

如本文所使用的术语“治疗”包括减轻发育性视网膜血管疾病的严重程度，延迟发育性视网膜血管疾病的发作，使发育性视网膜血管疾病消退，缓解由发育性视网膜血管疾病引起的病状或停止由发育性视网膜血管疾病产生的症状。术语“治疗”包括但不限于预防性及/或治疗性治疗。

于另一个具体实施例中，该发育性视网膜血管疾病包含永存原始玻璃体增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)、诺里疾病(Norrie disease)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)及柯氏症(Coats disease)。在一个优选的具体实施例中，该发育性视网膜血管疾病包含诺里疾病和家族性渗出性玻璃体视网膜病变。在一个更优选的具体实施例中，该发育性视网膜血管疾病为诺里疾病。

由于该发育性视网膜血管疾病是一种视网膜血管发育异常的疾病，故会导致视网膜缺血和患者的视力受损。于另一个具体实施例中，该发育性视网膜血管疾病的症状包含视网膜血管发育异常、视网膜缺血和视力受损。

由于该发育性视网膜血管疾病会导致视网膜缺血，而视网膜缺血会造成视网膜缺血性损伤。在一个具体实施例中，该视网膜缺血性损伤包含视网膜的厚度变薄、视网膜神经节细胞(RGC)的数量减少、以及相关因子 (如缺氧诱导因子(HIF)、视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、血管内皮生长因子(VEGF))的表达量上升。于另一个具体实施例中，该金钗石斛或该石斛酚治疗该发育性视网膜血管疾病所造成的视网膜缺血性损伤。

该视网膜缺血性损伤会使视网膜的厚度变薄，故施予该金钗石斛或该石斛酚能避免视网膜厚度变薄的现象发生，即该金钗石斛或该石斛酚能修复或增加视网膜的厚度。在一个具体实施例中，该金钗石斛或该石斛酚修复该发育性视网膜血管疾病所造成的视网膜厚度变薄的情况。

该发育性视网膜血管疾病会导致视网膜缺血性损伤，进而造成视网膜神经节细胞(RGC)的数量减少，而施予该金钗石斛或石斛酚后能增加视网膜神经节细胞(RGC)的数量或保护视网膜神经节细胞免于细胞死亡，以治疗该发育性视网膜血管疾病中视网膜的缺血性损伤。在一个具体实施例中，该金钗石斛或该石斛酚增加视网膜神经节细胞(RGC)的数量。

此外，该发育性视网膜血管疾病导致视网膜缺血性损伤，进而促使视网膜中的缺氧诱导因子(HIF)、视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达量上升，而施予该金钗石斛或该石斛酚后能降低上述因子的表达量，以治疗该发育性视网膜血管疾病上的视网膜缺血性损伤。在一个具体实施例中，该金钗石斛或该石斛酚降低缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、视网膜母细胞瘤结合蛋白2 (RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达量。

该发育性视网膜血管疾病会引起血管新生(angiogenesis)。故于另一个具体实施例中，该金钗石斛或该石斛酚能捕获血管内皮生长因子(VEGF) 以抗血管新生(anti-angiogenesis)。

本文中“表达量”一词包含但不限于DNA、RNA或蛋白质的表达量。

该发育性视网膜血管疾病所造成的视网膜缺血性损伤会上调胎盘生长因子(PLGF)的表达量以及下调诺里疾病蛋白(NDP)的表达量。而施予该金钗石斛或该石斛酚后能下调胎盘生长因子(PLGF)的表达量以及上调诺里疾病蛋白(NDP)的表达量，以治疗该发育性视网膜血管疾病中因缺血/缺氧所造成的视网膜损伤。因诺里疾病蛋白(NDP)能透过调节诺里 (Norrin)依赖性Wnt信号通路来保护眼睛免于血管发育异常和其所导致的视网膜缺血性损伤。在一个具体实施例中，该金钗石斛或石斛酚下调胎盘生长因子(PLGF)的表达量以及上调诺里疾病蛋白(NDP)的表达量。在一个优选的具体实施例中，该金钗石斛或石斛酚上调诺里疾病蛋白(NDP) 的表达量以调节诺里(Norrin)依赖性Wnt信号通路来改善视网膜血管发育异常。在一个更优选的具体实施例中，该金钗石斛或石斛酚上调诺里疾病蛋白(NDP)的表达量以调节诺里(Norrin)依赖性Wnt信号通路来改善视网膜缺血。

本文中“有效剂量”一词为治疗剂量可在特定条件下可预防、降低、阻止或逆转个体的症状的发展，或部分、完全舒缓该个体开始接受治疗时于特别情况下已存在的症状。

在一个具体实施例中，该金钗石斛的有效剂量范围为0.01克/公斤体重至100克/公斤体重。在一个优选的具体实施例中，该金钗石斛的有效剂量范围为0.1克/公斤体重至50克/公斤体重。在一个更优选的具体实施例中，该金钗石斛的有效剂量范围为0.5克/公斤体重至10克/公斤体重。在另一个优选的具体实施例中，该金钗石斛的有效剂量范围为0.1克/公斤体重至5 克/公斤体重。

在另一个具体实施例中，该石斛酚的有效剂量范围为0.01克/公斤体重至100克/公斤体重。在一个优选的具体实施例中，该石斛酚的有效剂量范围为0.1克/公斤体重至50克/公斤体重。在一个更优选的具体实施例中，该石斛酚的有效剂量范围为0.5克/公斤体重至10克/公斤体重。在另一个优选的具体实施例中，该石斛酚的有效剂量范围为0.1克/公斤体重至5克/公斤体重。

在一个具体实施例中，该有效剂量每天以单次施予。在一个优选的具体实施例中，该有效剂量每天以两次或多次施予。

该药物可在例行时间表下施予。于本文中使用的例行时间表系指预定的所指定时期。例行时间表可涵盖一些时期，其系为相同，或其在长度上不同，只要时间表为预定即可。例如，例行时间表可涉及一天一次投药，每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周基础、每月基础或介于其间的任何设定天数或周数。或者，预定例行时间表可涉及以每日一次为基础投药，历经第一周，接着以每日为基础，历经数个月等。在其他具体实施例中，本发明系提供药物可以经口方式服用，且其时机系依赖或不依赖食物摄取而定。因此，例如药物可于每个早晨及/或每个夜晚服用，而不管病患何时已进食或将进食。

本发明的药物可进一步包含医药上可接受的载体，在本发明相关领域下习知的治疗方式中可透过许多不同途径施用于个体。在一些实施例中，该组合物(包含金钗石斛或石斛酚)及医药上可接受的载体会经由外用、静脉、肌肉、皮下、局部、口服或吸入施用。该药物将会透过消化及循环系统被传递到目标处。在一个优选的具体实施例中，该药物的给药路径为口服给予。

于另一具体实施例中，该个体为动物，优选为哺乳类，更优选为人类。

如本文所用术语“医学上可接受的载体”为透过特定组合施用及特定方法施用组合物所决定。如本文所用“载体”一词包含但不局限任何及所有溶剂、分散介质、载具、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂等渗透和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药物活性物质的这些介质和试剂在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不兼容，其用于治疗的组合就需要被考虑。补充的活性成分也可掺入组合物中。术语“医学上可接受的”系指分子实体和组合物施用于受试者时不产生过敏或类似的不良反应。以蛋白质作为活性物质的水组合物制备在本领域中是习知的。通常，此组合物被制备为液体溶液、锭剂、胶囊或悬浮液注射剂；亦可制备为可用于注射剂的可溶解或悬浮液的固体形式。

该组合物(包含金钗石斛或石斛酚)及医药上可接受的载体的配制可能经由无菌的水溶液或分散体、水悬浮液、油乳化液、油包乳化液中的水、特定点的乳化液、长停留乳化液、黏性乳化液、微乳液、纳米乳液、微脂粒、微粒、微球、纳米球、纳米颗粒、微汞及数种可持续释放的天然或合成聚合物。医药上可接受的载体及该金钗石斛(或石斛酚)也可配置成气雾剂、片剂、丸剂、胶囊、无菌粉末、栓剂、洗剂、霜剂、软膏剂、糊剂、凝胶、水凝胶，或其他可用于组合物输送的制剂。

该组合物被制备成药物时，每一单位药物所含的金钗石斛或石斛酚的单位剂量为0.5-50克(g)，优选为0.1-10克(g)，更优选为0.01-1克(g)。

本发明所提供的组合物(包含金钗石斛(DNL)或石斛酚)能治疗发育性视网膜血管疾病，其包含但不限于修复/治疗视网膜血管发育异常或血管发育的缺陷；此外，因视网膜血管发育异常，会造成视网膜缺血，故本发明的组合物能进一步改善缺血/缺氧对视网膜所造成的不良影响和损伤，即保护视网膜免于缺血/缺氧的损伤。

附图说明

图1中(a)至(e)为以光学显微镜观察石斛酚(moscatilin，Mos)对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)处理的视网膜神经节细胞-5 (retinal ganglioncell-5，RGC-5)的影响的细胞存活率研究。与正常对照组 (细胞培养于DMEM培养基中且预先施予DMSO，DMSO+DMEM)相比，在预先施予二甲亚砜(DMSO)(媒剂(Vehicle))并接着OGD(DMSO+OGD) 后，细胞数量较少且有一些会变形(如箭号所示)。通过在OGD处理前1 小时预先施予石斛酚(Pre-OGD Mos 0.1μM)会缓解OGD所诱发的改变。 (f)为使用MTT分析法定量分析Mos对OGD处理的细胞的影响。**：正常对照组(DMSO+DMEM)和DMSO+OGD组之间具有显著差异(P<0.01)。DMSO+OGD组和Pre-OGD Mos 0.1μM组之间具有显著差异(P＝0.04)。实验结果以平均值±标准误差(SEM)表示(数量为6)。比例尺为50μm。 DMSO+DMEM：含有DMSO的DMEM培养基；DMSO+OGD：OGD处理前1小时施予DMSO，再接着OGD；Pre-OGD Mos 0.1μM：OGD处理前1 小时施予0.1μM石斛酚(Mos)，再接着OGD；During OGD Mos 0.1μM： OGD期间施予0.1μM石斛酚(Mos)；及Post-OGD Mos 0.1μM：OGD处理后1小时施予0.1μM石斛酚(Mos)。N：数量。

图2为石斛酚(moscatilin，Mos)在相对于β-肌动蛋白(β-actin)的诺里疾病蛋白(NDP)的蛋白质表现的影响。上图：一系列免疫印迹的代表图；下图：柱状图。在正常对照组(DMSO+DMEM：视网膜神经节细胞-5 (RGC-5)细胞培养在DMEM培养基中，且预先施予二甲亚砜(DMSO)) 中NDP对β-actin蛋白的表达量调整为100％。**：DMSO+DMEM组和 DMSO+OGD组之间具有显著差异(P<0.01)。DMSO+OGD组和Pre-OGD Mos 0.1μM组之间具有显著差异(P＝0.048)。实验结果以平均值±标准误差 (SEM)表示(数量为3)。OGD：氧糖剥夺；RGC：视网膜神经节细胞。 DMSO+DMEM：含有DMSO的DMEM培养基；DMSO+OGD：OGD处理前1小时施予DMSO，再接着OGD；Pre-OGD Mos 0.1μM：OGD处理前1 小时施予0.1μM石斛酚(Mos)，再接着OGD；During OGD Mos 0.1μM： OGD期间施予0.1μM石斛酚(Mos)；及Post-OGD Mos 0.1μM：OGD处理后1小时施予0.1μM石斛酚(Mos)。

图3为视网膜电图(electroretinogram，ERG)分析。(a)和(b)：与对照组(sham)的视网膜相比，在高眼压(high intraocular pressure，HIOP) 诱发的视网膜缺血再灌注(ischemia plus reperfusion，I/R)前施予媒剂 (vehicle)(a)或后施予媒剂(b)后，ERG的b波振幅急剧下降。而这种降低可藉由预先施予金钗石斛(DNL)(DNL1.0+I/R；DNL0.5+I/R，a)或后施予金钗石斛(I/R+DNL1.0，b)会产生剂量依赖性地抵消。(c)：与对照组(sham)相比，在视网膜经缺血再灌注(I/R)后，Vehicle+I/R组中ERG 的b波比率显著地降低(**；P<0.01)。预先施予高剂量(DNL1.0+I/R)和低剂量(DNL0.5+I/R)的DNL呈现剂量反应且显著地抵消这种缺血性诱发的降低(P<0.01)。(d)：经I/R之视网膜并缺血后施予媒剂之后的第1、 3、5或7天，ERG的b波振幅显著降低(**；P<0.01)。藉由后施予DNL (I/R+DNL1.0)可显著缓解ERG的b波振幅上的降低(P<0.05/0.01)。实验结果以平均值±标准误差(SEM)表示；实验数量为10～12。Sham(对照组)：假程序手术实验(数量为12)；Vehicle+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R) 前施予媒剂(vehicle)，再接着I/R手术(数量为12)；DNL0.5+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R)前施予0.5g/kg/天的DNL，再接着I/R手术(数量为 12)；DNL1.0+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R)前施予1.0g/kg/天的DNL，再接着I/R手术(数量为12)；I/R+VehicleD7：I/R手术后施予媒剂(vehicle) 之后的第7天；I/R+DNL1.0D7：I/R手术后施予1.0g/kg/天的DNL之后的第7天；I/R+Vehicle：I/R手术后施予媒剂(vehicle)(数量为10)； I/R+DNL1.0：I/R手术后施予1.0g/kg/天的DNL(数量为10)；Pre-ischemia： I/R手术前；Post-ischemia D1：I/R手术后的第1天；Post-ischemia D3：I/R 手术后的第3天；Post-ischemiaD5：I/R手术后的第5天；Post-ischemia D7： I/R手术后的第7天。

图4为以甲苯酚紫(cresyl violet)标记的整个或内层视网膜的厚度分析。(a)、(b)和(e)分别为接受假程序(Sham)(a)、经缺血再灌注(I/R) 并预先施予媒剂(vehicle)(b)或后施予媒剂(e)的视网膜。(c)、(d)和 (f)分别为缺血加再灌注并预先施予0.5g/kg/天(c，DNL0.5+I/R)、1.0g/kg/ 天(d，DNL1.0+I/R)或后施予1.0g/kg/天(f，I/R+DNL1.0)的金钗石斛(DNL) 的视网膜切片。(g)和(h)为对相同偏心率(eccentricity)的内层及整个视网膜切片的厚度进行形态学分析。实验结果以平均值±SEM表示，实验数量为10～12。**：与假程序的视网膜有显著性差异(P<0.01)。或与 vehicle+I/R或I/R+vehicle相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。ONL：外核层(outer nuclear layer)；OPL：外丛状层(outerplexiform layer)；INL：内核层(inner nuclear layer)；IPL：内丛状层(inner plexiformlayer)；GCL：神经节细胞层(ganglion cell layer)。比例尺为50μm。

图5为荧光金(Fluorogold)标记染色。显微镜照片显示经假程序(a， Sham)、缺血前施予媒剂再缺血再灌注(I/R)(b，Vehicle+I/R)或于缺血前/后施予1.0g/kg/天的金钗石斛(DNL)加缺血再灌注(c，DNL1.0+I/R； d，I/R+DNL1.0)的视网膜神经节细胞(retinalganglion cell，RGC)的密度。 (e)为RGC密度的定量分析，其数量如每条柱状体所示，实验结果以平均值±标准误差(SEM)表示(数量为4)。**：与假程序的视网膜有显著差异(P<0.01；Sham组对Vehicle+I/R组)；或与Vehicle+I/R组有显著差异(P<0.01或P<0.05；Vehicle+I/R组对DNL1.0+I/R组或I/R+DNL1.0 组)。比例尺为50μm。

图6为胆碱乙酰转移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)的免疫组织化学实验。(a)为经假程序的视网膜(Sham)，细胞核以4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4,6-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)进行复染。无轴突神经细胞体(amacrine cell bodies)(Sham；短箭号)位于内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中，并且它们的神经突出(neuronal processes)(长箭号)在内丛状层(IPL)中显示双带状的态样。(b)和(e) 分别为经缺血再灌注(I/R)及于缺血前/后施予媒剂(Vehicle+I/R或 I/R+Vehicle)的视网膜；而且可观察到IPL内的免疫反应性伴随着无轴突神经细胞体的数量大幅减少而显著降低。(c)、(d)和(f)分别为经缺血再灌注(I/R)及预先施予0.5g/kg/天(c，DNL0.5+I/R)或1.0g/kg/天(d，DNL1.0+I/R) 的金钗石斛(DNL)、或经缺血再灌注(I/R)及后施予1.0g/kg/天(f， I/R+DNL1.0)的金钗石斛的视网膜切片。在这些组别中，当预先施予0.5 和1.0g/Kg/天的金钗石斛于缺血性视网膜时，这些缺血诱导的变化明显呈剂量依赖性形式来降低。而后施予1.0g/Kg/天的金钗石斛也明显减轻这些缺血引起的变化。比例尺为50μm。

图7为波形蛋白(vimentin)的免疫组织化学染色。(b)为在进行假程序(Sham)后，缪氏细胞(müller cells)细胞的末端在神经节细胞层(GCL) 中可观察到抗波形蛋白免疫反应性(箭头；在(c)和(f)亦可观察到)；并且缪氏细胞的突出(processes)在内丛状层(IPL)(箭号；在(c)和(f) 亦可观察到)、内核层(INL)和外核层(ONL)也被免疫染色出来。(c) 和(f)分别为与假程序的视网膜相比，在缺血前/后施予媒剂(Vehicle+I/R 或I/R+Vehicle)，视网膜上的抗波形蛋白免疫标记显著增强。(d)、(e)和 (g)分别为通过预先施予0.5g/kg/天(DNL0.5+I/R)或1g/kg/天的金钗石斛(DNL)(DNL1.0+I/R)、或后施予1g/kg/天(I/R+DNL1.0)的金钗石斛会使上述增强现象明显被减弱。(h)至(n)为胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的免疫组织化学染色。在假程序(Sham，i) 之后，缪氏细胞的末端在神经节细胞层(GCL)显示GFAP免疫反应性(箭头；在(j)和(m)亦可观察到)，并且缪氏细胞的突出(processes)在内丛状层(IPL)(箭号；在(j)和(m)亦可观察到)、内核层(INL)和外核层(ONL)亦显示GFAP免疫反应性。和经假程序的视网膜相比，在经缺血和预先/后施予媒剂(Vehicle+I/R，j；I/R+Vehicle，m)后，抗GFAP 免疫标记增强。透过预先施予0.5g/kg/天(DNL0.5+I/R，k)或1g/kg/天 (DNL1.0+I/R，l)的金钗石斛(DNL)，或后施予1g/kg/天(I/R+DNL1.0， n)的金钗石斛，会将上述增强程度减少。(a)和(h)为4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)用于在假程序的视网膜中复染细胞核。比例尺为 25μm。

图8：(a1)以免疫印迹法(western blotting)分析下显示β-肌动蛋白 (β-actin)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)的表达量。字段1或2分别为经假程序的视网膜(Sham)或预先施予媒剂的缺血性视网膜(Vehicle+I/R)。字段3显示接受缺血且在缺血前预先施予1g/kg/天的金钗石斛(DNL)(DNL1.0+I/R)的视网膜。字段4、5和6分别为接受缺血且在缺血前预先施予10μM/5μl JIB-04(RBP2抑制剂)、4μM/5μl紫草素(shikonin)(PKM2抑制剂)和125μg/5μl癌思停(avastin)(抗VEGF) 的视网膜。(a2)中每一条显示RBP2、HIF-1α、PKM2和VEGF相对β-actin的比例。**：经假程序的视网膜(Sham)与预先施予媒剂的缺血性视网膜 (Vehicle+I/R)之间有显著差异(P<0.01)。或Vehicle+I/R组与预先施予DNL1、JIB-04、紫草素或癌思停的缺血性视网膜之间有显著差异(P <0.05或P<0.01)。实验结果以平均值±标准误差(SEM)表示(数量为4 至10)。(b)为酶联免疫吸附分析法(ELISA)的分析结果。测量不同组别 (即假程序(Sham)、Vehicle+I/R、DNL1.0+I/R或Eylea+I/R)中视网膜内的胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)的浓度。**：假程序的视网膜和Vehicle+I/R组之间有显著差异(P<0.01)。或Vehicle+I/R组与 DNL1.0+I/R组或Eylea+I/R组之间有显著差异(P<0.05或P<0.01)。实验结果以平均值±标准误差(SEM)表示(数量为4)。Sham(对照组)：假程序手术实验(数量为10)；Vehicle+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R)前玻璃体内施予媒剂(vehicle)，再接着I/R手术(数量为10)；DNL1.0+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R)前玻璃体内施予1.0g/kg/天的金钗石斛，再接着I/R 手术(数量为10)；JIB-04+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R)前玻璃体内施予 JIB-04，再接着I/R手术(数量为4)；Shikonin+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R) 前玻璃体内施予紫草素(shikonin)，再接着I/R手术(数量为7)；Avastin+I/R：视网膜缺血再灌注(I/R)前玻璃体内施予癌思停(avastin)，再接着I/R手术(数量为4)；Eylea+I/R：视网膜接受缺血再灌注(I/R)加上缺血前预先施予200μg/5μl的采视明(Eylea)(数量为4)。

图9为金钗石斛(DNL)/石斛酚(moscatilin)治疗视网膜缺血的通路分析。NDP：诺里疾病蛋白；PKM2：丙酮酸激酶M2；RBP2：视网膜母细胞瘤结合蛋白2；HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；VEGF-A：血管内皮生长因子 -A；VEGF-B：血管内皮生长因子-B；PLGF：胎盘生长因子。

具体实施方式

本发明包括但不限于上述与下列说明。实施方式如下范例所示。

方法：

化学品和药物给予

金钗石斛(DNL)购自科达公司(中国台湾台北)，溶于水(ddH₂O)中。对于电生理学，免疫组织化学和分子生物学研究，药物施予会进行7天并且涉及各种实验所设计的组别，即缺血后给药(每天1g/kg/天的高剂量金钗石斛(DNL)，I/R+DNL1.0)或缺血前预先给药(每日高剂量DNL， DNL1.0+I/R；低剂量DNL 0.5g/kg/天，DNL0.5+I/R)。经过缺血的媒剂(vehicel)组中的大鼠会后施予(I/R+Vehicel)或者预先施予与DNL组类似体积的媒剂(Vehicel+I/R)。

与假程序组(sham)、媒剂加缺血组(vehicle+I/R)或DNL1.0+I/R组相比，其他组的缺血眼睛先以1％睫状肌麻痹剂(tropicamide)和2.5％脱羟肾上腺素(phenylephrine)扩张瞳孔后，使用连接25μl注射筒的30号针头进行玻璃体内注射(intravitrealinjections)。具体而言，要进行缺血手术的眼睛于缺血前1天施予各种抑制剂/抗体的玻璃体内，即10μM/5μl JIB-04 (Sigma-Aldrich)、4μM/5μl紫草素(Shikonin)(S7576；Sigma-Aldrich)、 100mg/5μl癌思停(Avastin)(Hoffmann-La Roche)或200μg/5μl采视明(eylea)(Regeneron PharmaceuticalsInc.)。在视网膜经缺血再灌注(I/R) 及施予相关化合物或在假程序(Sham)手术一天后，将动物牺牲。收集视网膜样本，并透过免疫印迹法(Western blot)分析或酶联免疫分析法(ELISA) 分析以测量缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和胎盘生长因子(PLGF)的蛋白质表达量。

石斛酚(moscatilin)购自EMMX Biotechnology(EN10271，CA，USA) 并溶解于DMSO(媒剂(vehicle))中。先前报导指出较高浓度的石斛酚(1.25 ～20μM)会以剂量和时间依赖性地降低24小时处理的IC₅₀分别具7.0和 6.7μM的两种细胞株的细胞活力；因此，目前选择0.1μM来评估其对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)的保护作用。在OGD前1小时、 OGD期间或OGD后1小时给予石斛酚(0.1μM)。藉由细胞活率分析(MTT assay)和免疫印迹法(Western blot)评估其治疗效果。

体外实验

氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)和细胞处理

视网膜神经节细胞-5(retinal ganglion cell-5，RGC-5)并不会转化成大鼠视网膜神经节细胞(RGC)，而是小鼠视网膜神经前体细胞(retinal neuronal precursorcell)。氧糖剥夺(OGD)的定义为在缺氧(类似缺血)条件(即 1％氧气(藉由分析仪进行监测；Penguin Incubator：对照范围1～89％； AstecCompany，Kukuoka，Japan)，94％氮气，5％二氧化碳)下，将细胞维持在37℃下无葡萄糖的DMEM培养基中。此实验有不同的组别，包括(i) 在DMEM培养基中的给予DMSO的细胞(对照组的细胞；DMSO+ DMEM)；(ii)于OGD前1小时先给予DMSO，再接着OGD处理的细胞 (DMSO+OGD)；(iii)于OGD前1小时先给予石斛酚(moscatilin，Mos) (于DMEM培养基中加入0.1μM)，再接着OGD处理的细胞(Pre-OGDMos 0.1μM)；(iv)在OGD期间给予石斛酚的细胞(During OGD Mos 0.1μM)；和(v)OGD后1小时给予石斛酚的细胞(DMSO+OGD)(Post-OGD Mos 0.1μM)。在1天的OGD期间结束时，细胞培养物会再回到DMEM培养基中培养24小时。接着再进行细胞活率分析(针对细胞存活率)和免疫印迹法分析(针对诺里疾病蛋白(NDP))。

MTT细胞存活率分析

粒线体烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate hydrogen，NADPH)依赖性氧化还原酶能够还原MTT以形成甲臜(blueformazan)。因此，深紫色甲臜的数量增加系对应于更高的细胞存活率。在37℃下，将MTT(0.5mg/mL；Sigma-Aldrich)加入至含有原始 100μL细胞的96孔盘中3小时。然后藉由加入100μL DMSO溶解还原的 MTT。搅动平板后，使用酶联免疫分析法(ELISA)读取器(SynergyH1 Multi-Mode Reader BioTek Instruments)在562nm下测量溶解的甲臜的光密度(OD)。细胞存活率以相对于对照组(100％)的OD值作为表示。

体内实验

动物

本发明使用6周龄的Wistar大鼠。

视网膜缺血(retinal ischemia)的建立

麻醉和安乐死

用100mg/kg的克他明(ketamine)(Pfizer)和5mg/kg甲苯噻嗪 (xylazine)(Sigma-Aldrich)进行腹腔内注射以麻醉动物。此外，腹腔给予至少140mg/kg戊巴比妥(pentobarbital)(SCI Pharmtech)以人道的方式牺牲动物。

缺血诱发

将大鼠(200-250g)以上述麻醉剂进行麻醉并置于立体定位仪 (stereotaxicframe)内。用连接0.9％生理食盐水瓶的30号的针头穿刺进大鼠的眼睛的前房，以使眼球内压(intraocular pressure，IOP)升高至120 毫米水银柱，并维持1小时。透过视网膜变白证实缺血性损伤的建立。进行上述缺血诱发过程的假程序，但并不升高连接到大鼠眼睛的盐水瓶，以作为对照。将动物置于37℃的加热垫上并在缺血和随后的3小时再灌注的期间内保持正常体温。

闪烁视网膜电位图测量

在假程序或视网膜缺血再灌注(第0天)前，以及假程序或视网膜缺血/再灌注后及预先施予指定药物一天后，记录所有动物的闪烁视网膜电位图(Flashelectroretinogram，Flash ERG)。在后给药组中，在缺血前(第0 天)和缺血后(在缺血后施予适当的化合物以及缺血后第1、3、5或7天记录ERG)记录所有动物的ERG数据。老鼠需对黑暗适应8小时，然后麻醉以记录瞳孔扩大时的ERG。于动物的眼睛前2公分放置一闪光灯(strobe) 以诱发出0.5Hz的刺激。在10kHz时以每2秒的时间间隔内收集连续15 次的记录；并将其振幅最大化及藉由放大器P511/稳压电源RPS107/刺激器 PS22(Grass-Telefactor)计算以求平均值。为了进行不同组别之间的比较，计算一只眼(假程序或缺血)对未处理的正常眼的b波振幅之比。

甲苯酚紫(Cresyl violet)染色

在所有组别，于牺牲大鼠后，以生理食盐水进行心内灌注(intracardialperfusion)。在角膜的12点钟方向以丝线缝合来标记眼球，然后进行眼球摘除，并在4％多聚甲醛(paraformaldehyde)中于4℃下固定24小时，透过一系列梯度设计的乙醇进行脱水，再包埋于石蜡(Tissue-Tek TEC 5)中。沿着垂直子午线(vertical meridian)切出5μm厚的切片。切片用甲苯酚紫标记，并在光学显微镜(Leica)下观察。在相同放大倍数下拍摄视网膜切片，并从照片(Ilford Pan-F plus film，50ASA)测量不同层的视网膜厚度。为了量化视网膜缺血损伤程度，整个视网膜厚度(从内限界膜(inner limiting membrane，ILM)到视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE) 层)，及内层视网膜厚度(从内限界膜到内核层(inner nuclear layer，INL)) 的厚度皆被测量。

视网膜神经节细胞逆行染色(RGC retrograde staining)

在动物于麻醉状态下，在动物的头皮上制造2cm的切口，并钻出两个小孔以深入头盖骨颅。此外，透过微量滴管将10μl的5％荧光金(fluorogold) (Sigma-Aldrich)注射入头盖骨下深度3.8、4.0和4.2mm的位置。在不同组别中，在动物牺牲前3天注射荧光金。以先前方式对视网膜样本进行取出、固定、解剖和处理。视网膜神经节细胞(RGC)的密度为全部RGC的数量除以视网膜样本的总面积的比例。

免疫荧光分析

动物牺牲后，对其心脏进行生理盐水(w/v)灌注；然后，取出大鼠眼球，用4％(w/v)多聚甲醛固定45分钟，并以先前方式进行脱水并包埋在石蜡中。在假程序或诱发视网膜缺血及缺血前/后施予DNL或媒剂的一天后进行取样。将5μm视网膜切片与一级抗体(山羊抗乙酰胆碱转移酶(ChAT) 多株抗体(1:100；AB144p；Chemicon)、小鼠抗波形蛋白单株抗体(1：100； V6630；Sigma-Aldrich)、或兔抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多株抗体 (Millipore))共同孵育过夜。接着，将视网膜切片与合适的二级抗体(罗丹明(rhodamine；红色)共轭的兔抗山羊抗体(1：500；AP106R；Chemicon)、荧光异硫氰酸盐(FITC；绿色)共轭的山羊抗小鼠IgG(1：500；AP124F； Millipore)/抗兔IgG(Millipore)。同时，细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI；蓝色；Molecular Probes)进行染色标记。最后，使用荧光显微镜 (OlympusBX61，德国)观察视网膜切片。为了比较不同组别之间切片视网膜的视网膜厚度(甲酚紫染色)或免疫反应性程度，研究人员在不知切片样本是何条件下，测量视网膜厚度或评价不同组别对对照组(假程序)的免疫标记程度。

免疫印迹法分析

取出的视网膜/细胞样本进一步在裂解缓冲液(哺乳动物蛋白质提取试剂(MPER；HyCell))中进行超音波处理。在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺胶凝体电泳(SDS-PAGE；Bio-Rad)上处理等量的变性蛋白质(40μg/30μl/ 孔)。分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，且将PVDF 膜进一步在4℃下浸入各种一级抗体(兔单株抗β-肌动蛋白抗体(AC-15； 1:2000；ab6276)/抗HIF-1α抗体(1：200；H1alpha67-ChIP Grade；Abcam Inc.)，兔多株抗VEGF抗体(A-20；1：200；sc-152)/抗PKM2抗体(1： 500；ab38237)，或兔单株抗RBP2单株抗体(ab177486；1：1000；Abcam Inc.)12小时。接下来将墨点浸入相关的二级抗体，即辣根过氧化酶(HRP) 共轭的山羊抗兔IgG(1：5,000；Santa Cruz Biotechnology Inc.)或羊抗老鼠 IgG(1：5,000；sc-2005)，于37℃下1小时。以5％脱脂牛奶稀释一级/二级抗体。最后，使用增强型化学发光分析系统(HyCell)进行对膜扫描，并且曝光在X射线胶片(Fujifilm)进行。然后，透过密度扫描以评估每个蛋白质的数量。

酶联免疫吸附分析法(ELISA)

使用ELISA测定胎盘生长因子(PLGF)的表达量。在缺血一天后，将视网膜从摘除的眼杯(eye cup)中分离，并将其解离，然后透过与哺乳动物蛋白提取试剂(Sigma-Aldrich)孵育30分钟进行裂解，然后再另以13,000 rpm离心30分钟。使用二金鸡钠酸蛋白试剂盒(bicinchoninic acid protein kit) (Thermo Fisher Scientific)测定每个样本中全部蛋白。用PLGF的ELISA 试剂盒(CSB-E07400；Cusabio Life Scince)测量上清液中的PLGF表达量。先将抗PLGF抗体涂布在微孔上。用200μL洗涤缓冲液对每一个微孔洗涤两次且超过15分钟后，将样本中PLGF或PLGF标准蛋白的各种浓度(100 μL)与涂布于微孔中的抗体进行结合，于室温下并在振荡器(75rpm)上摇晃2小时。用200μL洗涤缓冲液(含有0.05％土温乳化剂(Tween 20) 的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，PBST)对每一个微孔洗涤两次后，将100μL 生物素共轭的抗PLGF抗体(以测定缓冲液稀释：PBST和0.5％牛血清蛋白(BSA))加入到每个微孔并摇晃(75rpm)1小时，以结合被涂布的抗体所捕捉的PLGF。在两次洗涤以去除未结合的生物素共轭的抗PLGF后，加入100μl亲合素(avidin)-辣根过氧化酶(HRP；以测定缓冲液稀释)并结合生物素共轭的抗VEGF-A抗体，最后于振荡器(75rpm)上摇晃。于振荡器上孵育1小时后，洗涤两次后去除未结合的亲和素-HRP。最后，将 90μL 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)(100μM)溶液(其可被HRP氧化)加入到每个微孔中20分钟。然后加入50μL终止液 (硫酸溶液，100μM)，使颜色变为黄色。用分光亮度计(Synergy H1HybridMulti-Mode Reader，Biotek ELx800)立即检测450nm处的最大吸亮度(OD)。透过使用不同量的PLGF(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和0pg/mL) 建立标准曲线来确定每个样本的PLGF浓度。用100μL样品稀释液(作为空白)将仪器归零。实验结果以相对于对照组的OD值(标准化成100％) 的OD值表示。

统计分析

两组之间的比较使用非成对学生t检定(unpaired Student’s t-tests)。进行单因子共变量分析(ANOVA)以比较3个或更多独立组别。在单因子共变量分析后，利用Dunnett检定比较对照组(例如媒剂处理的缺血性视网膜，Vehicle+I/R)与所有其他组(例如DNL处理的缺血性视网膜， DNL1.0+I/R)。实验结果以平均值±标准误差(standard error)表示。P<0.05 代表有显著差异。

结果

(a)MTT细胞存活率测定

首先，在光学显微镜下检查RGC-5细胞的细胞形态和数量的变化。细胞形态的改变可能暗指缺血性损伤的严重程度。培养于预先施予DMSO的 DMEM培养基中(DMSO+DMEM；图1a)的细胞表现出锥状，并展露特征性的神经元形态。与DMSO+DMEM组相比，经历氧糖剥夺(OGD)并预先施予DMSO(DMSO+OGD)的细胞会有变形的现象(如白色箭号所指；图1b)；此外，细胞数目亦显著减少。施予石斛酚(moscatilin)(0.1至100 μM)以治疗遭受氧糖剥夺的细胞；此外，本发明证实OGD前预先施予石斛酚(moscatilin)于OGD的保护作用在0.1μM(62.65％±4.35％；数量为 6)或1μM(66.36％±9.35％；数量为4)有较佳的细胞存活率；然而，在 10μM(15.43±3.09％；数量为4)和100μM(12.49％；数量为1)时却会出现细胞毒性效应(细胞存活率降低)。故后者的浓度可能超出药理保护程度。但此结果并不矛盾，因先前的研究亦指出石斛酚在时间依赖性(1～3天) 和剂量依赖性(1.25～20μM)上具有细胞毒性作用，这可能与其在浓度为 20或50μM且处理15小时后能诱导有丝分裂中G2期的阻滞的能力有关。然而，石斛酚的浓度在等于或小于1μM时被证明是无毒的，并且作为有效.OH自由基的清除剂。与DMSO+OGD组相比(图1b)，在OGD前1小时(图1c)、OGD期间(图1d)和OGD后1小时(图1e)施予0.1μM的石斛酚(moscatilin)评估细胞保护作用(cytoprotection)对抗OGD的程度。在OGD前1小时给0.1μM的石斛酚效果最大(图1c)，在OGD期间给药效果次之(图1d)，最后是OGD后1小时就无给药效果(图1e)。

与DMSO+DMEM组(正常对照组：100％；数量为6)相比，预先施予DMSO并接受OGD，在DMSO+OGD组中细胞存活率显著降低 (53.66±2.67％)(P<0.001)(图1f)。此外，与DMSO+OGD组相比，OGD 前1小时施予0.1μM石斛酚会产生显著的细胞保护作用以抵抗OGD(图 1f；62.65±4.35％；P＝0.04)。然而，OGD期间(图1f；56.03±4.08％；P＝0.31) 或OGD后1小时(图1f；52.61±4.16％；P＝0.41)施予0.1μM石斛酚并无显著的细胞保护作用以抵抗OGD。

(b)石斛酚对体外相对β-肌动蛋白的NDP表现的影响

为了研究与血管生成(vasculogenesis)相关诺里疾病蛋白(NDP)的变化，代表性的免疫印迹图像和分析条形图分别在图2的顶部和底部示出。与DMSO+DMEM组(正常对照：100％；数量为3)相比，OGD处理前给予媒剂再接着OGD(DMSO+OGD；P<0.001)显著降低NDP的量至 44.54±3.15％。当DMSO+OGD组与pre-OGD Mos 0.1μM组相比时，NDP 的数量显著增加(108.38±29.33％)(P＝0.048)。当在OGD前1小时施予石斛酚，此时的蛋白质表达量的升高是最大的；然后是在OGD后1小时施予 (54.36±3.88％)，最后是在OGD期间施予(48.99±9.89％)。

(c)金钗石斛对ERG的b波的影响

本发明接着测试视网膜电生理功能。在接受假程序的视网膜(Sham，图3)中，视网膜电位图(ERG)的b波振幅测量为0.41mV。在视网膜缺血后，b波振幅剧烈地降低，且其不受缺血前或缺血后施予媒剂(vehicel) 处理的影响(Vehicel+I/R：0.03mV，图3a；I/R+Vehicel：0.07mV，图3b)。然而，在缺血前(DNL0.5+I/R；DNL1.0+I/R，图3a)或缺血后以金钗石斛 (DNL)处理(I/R+DNL1.0D7，图3b)缓解缺血引起的b波下降，且振幅分别升高至0.18、0.22和0.15mV。此外，缺血前以DNL处理会呈剂量依赖性地减弱振幅降低的情况。

如图3c所示(数量为12)，与对照组(Sham)(1.00±0.08)相比， Vehicle+I/R组的b波比率(0.10±0.03)显著下降(P＝0.002)。重要的是，缺血前以DNL处理会呈剂量反应的显著减轻经I/R后缺血所引起的b波比率下降的情况(DNL1.0+I/R：0.57±0.06；DNL0.5+I/R：0.45±0.03(P<0.001))。

在图3d(数量为10)中，与对照组(Sham)相比，在I/R+Vehicle组 (I/R缺血手术后施予媒剂(Vehicle))中，b波比率显著降低(第1天： 0.13±0.04；第3天：0.10±0.02；第5天：0.09±0.03；第7天：0.06±0.03) (P<0.001)。重要的是，缺血后施予金钗石斛(DNL)(1.0g/kg/天， I/R+DNL1.0)显著减弱缺血所诱发的b波比率下降的情况(第1天： 0.14±0.04；第3天：0.26±0.05(P＝0.02)；第5天：0.34±0.05(P＝0.003)；第7天：0.40±0.04(P<0.001))。缺血前(第0天)b波比率分别为1.00±0.09 (I/R+Vehicle)和1.00±0.08(I/R+DNL1.0)。当对假程序(sham)的第0、 1、3、5和7天的ERG的b波比率(0.99±0.06、0.97±0.07、0.98±0.06、1.02±0.01 和0.99±0.07)进行彼此之间的相互比较后，并没有发现任何明显地不同。

(d)DNL对甲苯酚紫所标记的视网膜层厚度的影响

视网膜厚度的评估系基于对全部不同的组别在距离视盘的相同距离 (1.5mm)所切出的视网膜样本(数量为10～12，图4)。与接受假程序的视网膜相比(Sham，图4a和4g：整个视网膜(whole retina)为225.50±3.26 μm，内层视网膜(inner retina)为112.08±2.58μm)，预先施予媒剂(Vehicle) 且接受I/R的动物的视网膜厚度显著降低(Vehicle+I/R，图4b和4g：整个视网膜为110.83±1.85μm，内层视网膜为62.50±3.06μm)(P<0.001)。此外，当动物接受I/R且预先施予金钗石斛(DNL)，上述降低情况会呈剂量依赖性和显著地抵销(DNL1.0+I/R，图4c和4g：整个视网膜为190.08±4.48μm，内层视网膜为94.92±2.27μm；DNL0.5+I/R，图4d和4g：整个视网膜为 148.58±2.80μm，内层视网膜为78.25±1.53μm)(P<0.001)。

与接受假程序的视网膜(Sham，图4a)相比，接受I/R和后施予媒剂 (vehicle)的大鼠的视网膜厚度显著降低(I/R+vehicle，图4e和4h：整个视网膜为115.00±2.04μm，内层视网膜为63.92±3.30μm)(P<0.001)。此外，后施予金钗石斛会使缺血所诱发的减少显著降低(I/R+DNL1.0，图4f和4h：整个视网膜为125.25±2.66μm(P＝0.006)；内层视网膜为71.50±1.51μm(P＝ 0.048))。

(e)DNL对逆行荧光金免疫标记的RGC密度的影响

图5为视网膜神经节细胞(RGC)的密度分析(数量为4)，假程序组 (Sham，图5a和5e)中RGC的密度为363.23±2.84个细胞/视野(field)。与假程序组相比，在接受视网膜缺血和预先施予媒剂(Vehicle)的动物 (Vehicle+I/R，图5b和5e)中RGC密度显著减少(192.06±23.53个细胞/ 视野)(P<0.001)。此外，当动物接受视网膜缺血和预先施予金钗石斛 (DNL)(DNL1.0+I/R，图5c和5e：295.15±7.14个细胞/视野)或缺血后施予金钗石斛(I/R+DNL1.0，图5d和5e：256.26±9.46个细胞/视野)，上述减少现象显著降低(P＝0.006或0.045)。

(f)DNL对ChAT免疫反应性的影响

在接受假程序的视网膜(Sham，图6a)的胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫反应性显示在内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中的无轴突神经细胞体(amacrine cell bodies)(短箭号)出现胆碱乙酰转移酶(ChAT)(红色) 的免疫标记；这也证实在内丛状层(IPL)中有2个明显的层(strata)(长箭号)。接受缺血和预先施予/后施予媒剂的视网膜(Vehicle+I/R，图6b； I/R+Vehicle，图6e)中，ChAT免疫标记的无轴突神经细胞体的数量显著减少；此外，无轴突神经细胞体在内丛状层(IPL)的免疫标记显著减少。而在临床上重要的是，当于缺血性视网膜预先施予金钗石斛(DNL) (DNL0.5+I/R，图6c；DNL1.0+I/R，图6d)时，这些上述变化会呈剂量依赖性形式来降低。此外，后施予金钗石斛(I/R+DNL1.0，图6f)也明显减轻因缺血所引起的变化。在所有图片中显示ChAT免疫反应标记和以4',6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)免疫标记所染的细胞核的合并图像。

(g)DNL对波形蛋白和GFAP免疫反应性的影响

进行免疫组织化学研究以研究波形蛋白和GFAP免疫反应性。

波形蛋白的免疫组织化学染色

在对照视网膜(Sham，图7b)中，缪氏细胞(müller cells)的突出 (processes)被波形蛋白免疫标记出末端(箭头，图7c和7f)在神经节细胞层(GCL)上，且突出延伸到内丛状层(IPL)、内核层(INL)和外核层 (ONL)(箭号，图7c和7f)。与对照视网膜(Sham，图7b)相比，在接受I/R的视网膜且预先施予/后施予媒剂的抗波形蛋白免疫反应增强 (Vehicle+I/R，图7c；I/R+Vehicle，图7f)。透过预先施予金钗石斛(DNL)，上述增强情况会显著且呈剂量依赖性地减弱(DNL0.5+I/R，图7d； DNL1.0+I/R，图7e)。此外，后施予金钗石斛(I/R+DNL1.0，图7g)显著地消除因缺血所诱发的变化。

GFAP的免疫组织化学染色

与对照视网膜(Sham，图7i)相比，观察到抗胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫标记在缺血性视网膜且预先/后施予媒剂有增加的现象 (Vehicle+I/R，图7j；I/R+Vehicle，图7m)。此外，当缺血性视网膜预先施予金钗石斛，上述变化会明显且呈剂量依赖性方式消除(DNL0.5+I/R，图7k；DNL1.0+I/R，图7l)。后施予金钗石斛也明显消除上述因缺血所诱发的变化(I/R+DNL1.0，图7n)。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；蓝色) (图7a和7h)染色标记假程序的视网膜的细胞核。

(h)DNL1.0对大鼠视网膜中各种蛋白质表达量的影响

测量对照视网膜(Sham，数量为4～10)中各种蛋白质的表达量，结果如图8a1和8a2所示(HIF-1α＝51.17±5.14％；VEGF＝59.72±6.94％；PKM2 ＝52.93±7.01％；RBP2＝12.81±0.55％)。相反的，当接受I/R且预先施予媒剂(Vehicle)后，观察到HIF-1α、VEGF、PKM2和RBP2的表达量(标准化成100％)显著上升(P≤0.001)。此外，当缺血性视网膜预先施予1.0g/Kg 天的金钗石斛(DNL)时，会显著抑制这种上升现象(P<0.001；HIF-1α： 56.08±6.76；VEGF：51.87±9.89；PKM2：71.99±3.05；RBP2：50.64±1.48)。另外，在预先施予各自的抑制剂/抗体：JIB-04(RBP2抑制剂)、紫草素 (shikonin)(PKM2抑制剂)和癌思停(avastin)(VEGF抗体)后，其能显著抵销缺血所诱发的HIF-1α(JIB-04：53.98±2.29；shikonin：42.65±0.76； avastin：84.61±3.96(P＝0.07))、VEGF(JIB-04：27.82±1.21；shikonin： 57.55±9.40；avastin：5.38±2.51)、PKM2(JIB-04：60.36±7.59；shikonin：44.94±10.91；avastin：84.44±4.53(P＝0.01))和RBP2(JIB-04：5.83±1.43； shikonin：3.40±0.23；avastin：78.35±3.29(P＝0.02))；P<0.001)的表达量增加(P<0.002，除癌思停(avastin)组外)。

如图8b所示(数量为4)，与对照视网膜(Sham：15.11±1.58pg/ml) 相比，接受I/R且预先施予媒剂后，胎盘生长因子(PLGF)的表达量有显著升高(Vehicle+I/R＝39.53±5.25)(P＝0.004)。此外，当预先施予金钗石斛 (DNL)(DNL1.0+I/R＝19.93±2.24)或抗PLGF抗体采视明(Eylea) (Eylea+I/R＝6.44±0.60)于缺血性视网膜时，这种升高显著变差(P＝0.01 或P<0.001)。

本发明适当的描述可以在本文未具体公开的元素或限制下实施。已被用作描述的术语并不是限制。在使用这些术语和除此之外的任何等同物的表达和描述是没有差别的，但应当认识到本发明内的权利是可能修改的。因此，虽然本发明已说明实施例和其他情况，本文中所公开的内容可以被本领域的技术人员进行修饰和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本发明的权利范围之内。

Claims (10)

1.一种包含有效剂量的金钗石斛的组合物在制备治疗发育性视网膜血管疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述发育性视网膜血管疾病包含永存原始玻璃体增生症、诺里疾病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变及柯氏症。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述金钗石斛包含石斛酚。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述金钗石斛或所述石斛酚通过改善血管生成的缺陷以治疗所述发育性视网膜血管疾病。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述发育性视网膜血管疾病的症状包含视网膜血管发育异常、视网膜缺血和视力受损。

6.如权利要求3所述的用途，其中所述金钗石斛或所述石斛酚治疗所述发育性视网膜血管疾病所造成的视网膜缺血性损伤。

7.如权利要求3所述的用途，其中所述金钗石斛或所述石斛酚修复所述发育性视网膜血管疾病所造成的视网膜厚度变薄的情况。

8.如权利要求3所述的用途，其中所述金钗石斛或所述石斛酚降低缺氧诱导因子-1α、视网膜母细胞瘤结合蛋白2、丙酮酸激酶M2和血管内皮生长因子的表达量。

9.如权利要求3所述的用途，其中所述金钗石斛或所述石斛酚下调胎盘生长因子的表达量以及上调诺里疾病蛋白的表达量以治疗所述发育性视网膜血管疾病。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述金钗石斛或所述石斛酚上调诺里疾病蛋白的表达量以调节诺里依赖性Wnt信号通路来改善视网膜血管发育异常以治疗所述发育性视网膜血管疾病。