CN113893236A - 大黄素在制备治疗视网膜缺血或与视网膜缺血有关的疾病、病况或病症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物用于制备治疗或预防一有需要的个体罹患视网膜缺血或与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症的药物的用途，其中该组合物包含大黄素。

Description

大黄素在制备治疗视网膜缺血或与视网膜缺血有关的疾病、 病况或病症的药物中的应用

技术领域

本发明涉及大黄素用于制备治疗视网膜缺血的药物的用途，尤其涉及关于包含大黄素的组合物用于制备治疗及/或预防视网膜缺血和与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症的药物的用途。

背景技术

视网膜血管阻塞(视网膜中央动脉/静脉阻塞及视网膜分支动脉/静脉阻塞)，青光眼性视神经病变(glaucomatous optic neuropathy)，增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，DBR)，和新生血管性老年有关黄斑部退化(neovascular age-related macular degeneration，AMD)以及视网膜发育异常都是与视网膜缺血相关的疾病。光学相干断层扫描(OCT)证明的视网膜变薄和/或由于内部视网膜神经元死亡而导致视野改变时，可检测到视网膜缺血。视网膜神经节细胞(RGC)。临床上，当视网膜电图(electroretinogram，ERG)的b波改变，光学相干断层扫描(optical coherencetomography，OCT)所证实的视网膜变薄和/或由于因视网膜内部神经元(例如视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs))死亡而引起的视野改变时，可检测视网膜缺血。这些疾病影响了全世界数百万人口，因此视网膜缺血的治疗非常重要。因此建立了涉及诱导视网膜缺血的模型，该模型包括增加眼内压(IOP)。利用这种方法，以研究各种信息路径相关的新型治疗方法将是寻找合适的抗视网膜缺血的药物的有用方法。

研究显示，在正常氧的情况下，β-链蛋白(β-catenin)的信息路径会活化T细胞因子-4(TCF-4)并促进细胞增殖。然而，在缺氧的情况下，β-链蛋白会促进缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表现，众所周知，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)随后可提高血管内皮生长因子(VEGF)的水平。该事件继而会使细胞周期停滞以适应缺氧。此外，根据报导，抑制β-链蛋白和/或血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表现可防止缺血所引起的血管通透性增加，该血管通透性增加与随后的新血管形成，眼出血和/或囊样黄斑水肿有关。大黄素(6-甲基-1,3,8-三羟基蒽醌；6-methyl-1,3,8-trihydroxyanthraquinone)是一种可从大黄(rhubarb)、鼠李(buckthorn)和日本虎杖(Japanese knotweed)中分离出来的化合物。大黄素已显示出在各种条件下具有抑制发炎的潜力。例如，大黄素已被证明能减轻实验性疾病模型的严重性，包括关节炎、肝损伤、动脉粥状硬化、心肌缺血和癌症等。

发明内容

在本发明中，使用动物模型来研究大黄素对视网膜缺血的保护作用。此外，本发明还研究大黄素治疗视网膜缺血时，如何调控β-链蛋白的量。

本发明已经证实通过在缺血前及/或缺血后施用大黄素可以减轻因眼内压(IOP)提高而导致的视网膜缺血性损伤。上述缺血引起的改变是通过视网膜电图(ERG)、组织病理学(经甲苯酚紫染色的视网膜层的厚度)、荧光金反向免疫标记的视网膜神经节细胞(RGC)以及β-链蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表现量的测量等方法进行监测。在细胞存活率分析(MTT assay)中，氧葡萄糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation，OGD)前给予0.5μM大黄素(在大鼠玻璃体内等效注射20μM剂量的大黄素)显著减轻OGD所诱导的细胞损伤。此外，在动物实验中，在缺血前在玻璃体内注射20μM的大黄素显著降低因视网膜缺血所引起的视网膜电图(ERG)中b波振幅的降低。而缺血后的玻璃体内注射给药组也显著减轻该b波振幅的降低。当使用甲苯酚紫染色的视网膜厚度和/或逆行荧光金免疫标记的RGC密度时，也存在这种保护作用。另外，本发明已经证明视网膜缺血性损伤后的β-链蛋白/血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表现量显著性升高。通过在缺血前给予大黄素进行预处理可显著抑制这种升高的现象。上述发现意味着大黄素通过下调因缺血所导致β-链蛋白/血管内皮生长因子(VEGF)的上调而对视网膜缺血损伤的神经元(例如视网膜神经节细胞(RGC))具有保护作用。

在缺血(缺氧)的条件下，上调的HIF-1α蛋白与TCF-4竞争以结合细胞中β-链蛋白，一旦与HIF-1α结合，β-链蛋白将迅速从共同活化TCF-4的角色转变为刺激HIF-1α介导的转录角色。在缺血条件下，提高HIF-1α介导的转录导致下游血管内皮生长因子(VEGF)的上调，并伴随一系列可能的后遗症，包括黄斑水肿和/或眼部出血。本发明表明，大黄素对视网膜缺血性损伤具有改善作用，同时对于缺血诱导的β-链蛋白/血管内皮生长因子(VEGF)过量表现具有剂量依赖性和显著性地(在20μM时)下调。因此，大黄素的保护机制似乎涉及其对β-链蛋白/血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表现量的抑制，以及上述β-链蛋白共同活化的HIF-1α经介导转录程度的降低和接续的VEGF浓度的降低。所有这些发现和目前的蛋白质分析(图5)都强烈支持大黄素具有抗缺血和保护性效应，是通过抑制缺血诱导的β-链蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的过量表现而实现的(图5)。这是具有重大临床意义的，因其可以指出处理因视网膜缺血性疾病而在临床上证实的并发症(例如黄斑水肿)的方法。这些疾病包括视网膜血管阻塞、增生性糖尿病性视网膜病变、新生血管性老年有关黄斑部病变、和可能的视网膜发育疾病(例如家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、柯氏症(Coat’s disease)、残留型增殖性初级玻璃体症(Persistent Hyperplastic PrimaryVitreous；PHPV)、诺里氏疾病(Norrie disease)或早产儿视网膜病变(Retinopathy ofPrematurity；ROP)。

因此，本发明提供在一种治疗有需要的个体视网膜缺血或与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症的方法，包含施予该个体有效剂量的大黄素或包含大黄素的组合物。本发明施予该个体的大黄素的有效剂量可以是2至30μM。在一些实施例中，施予该个体的大黄素的有效剂量可以是4至20μM。在一些实施例中，施予该个体的大黄素的有效剂量是选自4μM、10μM或20μM。在本发明的一些实施例中，该大黄素通过玻璃体内注射给药。在本发明的另一些实施例中，该大黄素是通过口服给药。

在一些实施例中，该与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症包含视网膜血管阻塞、青光眼性视神经病变、增生性糖尿病视网膜病变、新生血管性老年有关黄斑部退化(AMD)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、柯氏症(Coat’s disease)、残留型增殖性初级玻璃体症(Persistent Hyperplastic Primary Vitreous，PHPV)、诺里氏疾病(norriedisease)或早产儿视网膜病变(Retinopathy of Prematurity，ROP)。在一些较佳实施例中，该与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症包含家族性渗出性玻璃体视网膜病变、柯氏症、残留型增殖性初级玻璃体症和诺里氏疾病和早产儿视网膜病变。

在一些实施例中，该个体是指哺乳动物，在一些更佳实施例中，该个体是指人。

在一些个实施例中，本发明的方法进一步包含向该个体施予药学上可接受的佐剂、媒剂或载体。

在一些实施例中，该组合物是通过抑制视网膜缺血引起的β-链蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的过量表现来治疗视网膜缺血或与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症。

本发明还提供一种调节β-链蛋白(β-catenin)有益于治疗或减轻疾病、病况或病症的严重性的方法，其包含向患有该些疾病、病况或病症的个体施予有效治疗剂量的大黄素或包含大黄素的组合物。在一些实施例中，本发明施予该个体的大黄素的有效剂量可以是2至30μM。在另一些实施例中，施予该个体的大黄素的有效剂量可以是4至20μM。在一些较佳实施例中，施予该个体的大黄素的有效剂量是选自4μM、10μM或20μM。在本发明的一些实施例中，该大黄素通过玻璃体内注射施予该个体。在本发明的另一些实施例中，该大黄素通过口服施予该个体。

在一些实施例中，该个体是指哺乳动物。在一些更佳实施例中，该个体是指人。

在一些实施例中，本发明的方法进一步包含向该个体施予药学上可接受的佐剂、媒剂或载体。

本发明进一步提供了一种保护有需要的个体的细胞免受视网膜缺血引起的损伤的方法，该方法包括向该个体施予有效剂量的大黄素或包含大黄素的组合物，其中该细胞选自双极细胞(bipolar Cells)、穆勒细胞(Müller Cells)和胆碱性无轴突细胞(cholinergic amacrine cells)。在一些实施例中，本发明施予该个体的大黄素的有效剂量可以是2至30μM。在另一些实施例中，施予该个体的大黄素的有效剂量可以是4至20μM。在一些较佳实施例中，施予该个体的大黄素的有效剂量选自4μM、10μM或20μM。在本发明的一些实施例中，该大黄素通过玻璃体内注射给药。在本发明的另一些实施例中，该大黄素通过口服给药。

在一些实施例中，该组合物是通过抑制视网膜缺血引起的β-链蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的过量表达来保护所述的有需要的个体的细胞免受视网膜缺血引起的损伤。

本发明提供一种组合物用于制备治疗或预防有需要的个体罹患视网膜缺血或与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症的药物的用途，其中该组合物包含大黄素。

在本发明的一些实施例中，该大黄素的有效剂量可以是2至30μM。在另一些实施例中，该大黄素的有效剂量可以是4至20μM。在一些较佳实施例中，该大黄素的有效剂量选自4μM、10μM或20μM。在本发明的一些实施例中，该大黄素通过玻璃体内注射给药。在本发明的另一些实施例中，该大黄素通过口服给药。

在一些实施例中，所述组合物被制备成药物时，每单位药物所含的大黄素的单位剂量为2至30μM。在一些实施例中，所述组合物被制备成药物时，每单位药物所含的大黄素的单位剂量较佳为4至20μM。

在本发明中，大黄素的临床重要性在于其可用于治疗因视网膜缺血性疾病或因视网膜缺血而导致的明确相关并发症(例如黄斑水肿)，即视网膜中央/分支血管阻塞、增生性糖尿病视网膜病变、新生血管性老年有关黄斑部退化(AMD)、和视网膜发育疾病(例如家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、柯氏症(Coat’s disease)、残留型增殖性初级玻璃体症(Persistent Hyperplastic Primary Vitreous；PHPV)、诺里氏疾病(Norrie disease)或早产儿视网膜病变(Retinopathy of Prematurity；ROP))。

在一些实施例中，该个体是指哺乳动物，在一些更佳实施例中，该个体是指人。

在一些个实施例中，本发明的方法进一步包含向该个体施予药学上可接受的佐剂、媒剂或载体。

本发明进一步提供一种组合物用于制备保护有需要的个体的细胞免受视网膜缺血而导致的损伤的药物的用途，其中该组合物包含大黄素。

在本发明的一些实施例中，该细胞系选自双极细胞(bipolar Cells)、穆勒细胞(Müller Cells)和胆碱性无轴突细胞(cholinergic amacrine cells)。在本发明的一些实施例中，该大黄素的有效剂量可以是2至30μM。在另一些实施例中，该大黄素的有效剂量可以是4至20μM。在一些较佳实施例中，该大黄素的有效剂量系选自4μM、10μM或20μM。在本发明的一些实施例中，该大黄素通过玻璃体内注射给药。在本发明的另一些实施例中，该大黄素通过口服给药。

在一些实施例中，所述组合物被制备成药物时，每单位药物所含的大黄素的单位剂量为2至30μM，较佳为4至20μM。

在一些实施例中，该药物是通过抑制视网膜缺血引起的β-链蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的过量表达来治疗或预防该有需要的个体罹患视网膜缺血或与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症。

附图说明

图1为使细胞存活率分析(MTT assay)定量分析了培养的RGC-5细胞株的存活率。各组的值是培养的RGC-5细胞的存活率相对于对照组的存活率之比，其中对照组的存活率设为100％。该研究包括四个组别，即对照组(正常；RGC-5细胞在含有媒剂的培养基中培养)，OGD前媒剂组(OGD前用媒剂处理1小时)，OGD前Emo 0.25μM组(OGD前用0.25μM大黄素处理1小时)和OGD前Emo 0.5μM组(OGD前用0.5μM大黄素处理1小时)。***表示正常对照组与OGD组有显著差异(P<0.001)。

表示OGD前媒剂组与OGD前Emo 0.5μM组之间的显著差异(P＝0.04)。结果为平均值±标准误差(n＝5～6)。缩写：RGC-5：视网膜神经节细胞-5；MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)；OGD：氧葡萄糖剥夺；Emo：大黄素。

图2为视网膜电图(ERG)b波的测量结果。图2a为视网膜电流图(ERG)b波的振幅。经缺血再灌注(IR)后，相较于假手术对照组的视网膜(Sham)，在视网膜缺血前玻璃体内预先给予媒剂(Vehicle)(媒剂+IR组)的ERG b波的振幅有实质的降低；在剂量依赖性方式下，预先在玻璃体内给予大黄素(Emodin)(剂量分别为4μM、10μM及20μM，即：Emo4+IR、Emo10+IR及Emo20+IR)的组别中，改善了因缺血引起的ERG b波振幅降低，但媒剂组没改善。缺血后在玻璃体内注射20μM的大黄素的组别(IR+Emo20)也显示有抗缺血的作用。图2b为对视网膜电图(ERG)中b波比率的分析结果，显示大黄素在缺血前和缺血后给药对缺血性视网膜的功效。与假手术对照组的ERG b波比率(Sham＝0.82±0.14：标准化至1，n＝7)相比，显示媒剂+IR组的b波比率显著降低(***；P<0.001)。相较于媒剂+IR组(0.04±0.01，n＝8)，缺血前玻璃体内注射剂量效应大黄素的组别(Emo4+IR＝0.08±0.07，n＝8、Emo10+IR＝0.64±0.28，n＝4、及Emo20+IR＝0.99±0.18，n＝4)都显著减轻缺血性的损伤(

P<0.001；Emo10+IR组及Emo20+IR组)。而在缺血后在玻璃体内注射20μM大黄素(IR+Emo20＝0.24±0.09，n＝9)也具有显著的抗缺血作用(

P<0.001)。数据为括号内显示的动物数量(n)的平均值±平均值标准误差(SEM)。表3提供各组别名称的缩写。

图3是计算经甲苯酚紫(cresyl violet)染色的视网膜厚度。图3a至3f为具有相同的偏心率(eccentricity)经甲苯酚紫染色的视网膜切片。显微影像显示不同组别的整个视网膜(上排)或内层视网膜(下排)的厚度(μm)。图3a、3b、3g及3h显示，与对照组的视网膜厚度(假手术对照组：整个厚度＝186.50±1.43；内层厚度＝79.90±2.06)相比，媒剂+IR组的整个视网膜或内层视网膜的厚度实质降低(整个厚度＝71.80±1.08；内层厚度＝20.97±0.85)。图3c至3e、3g及3h显示缺血前玻璃体内注射剂量效应大黄素(4μM时作用最小，Emo4+IR组：整个厚度＝87.40±0.60、内层厚度＝38.60±1.01；其次为10μM；20μM时作用最大)，并以显著的方式减轻缺血导致的整个视网膜和内部视网膜厚度的降低(Emo10+IR组：整个厚度＝153.20±1.48、内层厚度＝70.05±0.60；Emo20+IR组：整个厚度＝170.10±0.10、内层厚度＝70.65±2.06)。图3f、3g及3h显示缺血后玻璃体内注射20μM的大黄素也显著减轻因视网膜缺血而导致的整个视网膜和内层视网膜厚度的降低(IR+Emo20：整个厚度＝125.45±1.68，内层厚度＝69.65±0.68)。图3g及3h为整个视网膜或内层视网膜厚度的定量分析。***或

表示与假手术对照组(Sham)或媒剂+IR组相比具有显著差异(P<0.001或P<0.001/P<0.01)。图中所使用的缩写如下：IR：缺血加再灌注；ONL：外核层(outernuclear layer)；OPL：外丛状层(outer plexiform layer)；INL：内核层(inner nuclearlayer)；IPL：内丛状层(inner plexiform layer)；GCL：神经节细胞层(ganglion celllayer)。比例尺为50μm。结果为平均值±标准偏差。表4提供各组别名称的缩写。

图4为荧光金(fluorogold)反向标记。显微影像显示各组的视网膜神经节细胞(RGC)的密度。图4a及4e显示在假手术对照组中，观察到的RGC的最高密度为5323.53±215.6/0.17mm²。图4b及4e指出媒剂+IR组的细胞密度明显降低。图4c、4d及4e显示缺血前玻璃体内注射大黄素10μM和20μM(Emo10+IR和Emo20+IR)呈现剂量依赖性并显著增加细胞密度。图4e显示视网膜神经节细胞(RGC)密度的定量分析。***或

表示与假手术对照组或媒剂+IR组具有显著差异(P<0.001或P<0.01/P<0.001)。大黄素能剂量依赖性并且显著抵消因视网膜缺血而诱导的视网膜神经节细胞(RGC)密度的降低。结果为括号内显示的动物数量的平均值±标准偏差表示。比例尺为50μm。表5提供各组别名称的缩写。

图5为Western Blot法检测分析。图5a所示为β-链蛋白(β-catenin)，血管内皮生长因子(VEGF)和β-肌动蛋白(β-actin)的Western Blot图像，泳道1来自假手术对照组的视网膜(对照组)；泳道2是以媒剂预先处理的缺血视网膜(媒剂+IR)；泳道3和4来自分别用10μM(Emo10+IR)和20μM的大黄素(Emo20+IR)预先处理并经缺血再灌柱的视网膜。图5b、图5c分别为β-链蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)对管家蛋白(house-keeping protein)β-肌动蛋白的比例柱状图。将假手术对照组的比率标准化至1，***/*表示与假手术对照组相比具有极显著的差异(P<0.001)或显著的差异(P<0.05)，

表示与媒剂+IR组相比具有显著性差异(P＝0.02/0.03)。与假手术对照组相比，在缺血性损伤和缺血前应用媒剂后，观察到β-链蛋白/血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表现量显著增加(媒剂+IR＝1.64±0.14/7.67±2.57)。相比之下，缺血前给予大黄素具有剂量依赖性地且显著地抑制因缺血导致的β-链蛋白的蛋白表现含量升高(在大黄素为20μM时，P＝0.02/0.03；Emo20+IR＝1.00±0.19/1.23±0.44)。数值为括号内所示动物数量(n)的平均值±标准偏差。缩写列出如下：IR：缺血加再灌注；Emo10+IR：缺血前给予10μM的大黄素，然后进行IR；Emo20+IR：缺血前给予20μM的大黄素，然后进行IR。表6中提供各组别名称的缩写。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

缩写

ERG：视网膜电图；OCT：光学相干断层扫描；RGC：视网膜神经节细胞；IOP：眼压/眼内压；HIOP：高眼压/高眼内压；TCF-4：T细胞因子-4(T-cell factor-4)；HIF-1α：缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α)；OGD：氧葡萄糖剥夺；MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)；IR：缺血加再灌注；Emo：大黄素；ARRIVE：动物研究：体内实验报告(Animal Research:Reporting of In Vivo Experiments)；ILM：内限膜(internal limiting membrane)；RPE：视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium)；INL：内核层；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；PVDF：聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)；P：机率；VEGF：血管内皮生长因子。

实验例1

一、材料与方法

1、细胞实验

(1)氧葡萄糖剥夺

RGC-5细胞已被报导不是转化的大鼠RGC，而是小鼠视网膜神经元前体细胞。OGD是在缺血模拟条件下，通过将RGC-5细胞孵育在37℃，不含葡萄糖的Dulbecco’s modifiedEagle的培养基(DMEM；Thermo Fisher Scientific Inc.)中建立的，即1％氧气(使用Penguin Incubator；Astec Company,Kukuoka,Japan测量)，94％的氮气和5％的二氧化碳。研究了各种实验组(表1)。这些是用以下物质处理的细胞：(i)含有媒剂的培养基(对照组)，(ii)用媒剂进行1小时的OGD前处理(OGD前媒剂组)，(iii)用0.25μM大黄素进行的OGD前处理1小时(OGD前Emo 0.25μM组)，(iv)用0.5μM大黄素进行OGD前1小时处理(OGD前Emo 0.5μM组)。在OGD 24小时后，将细胞培养物转移到新的DMEM中再放置1天，然后进行细胞存活率分析(MTT assay)以评估细胞存活率。

(2)细胞存活率分析(MTT assay)

线粒体烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖性氧化还原酶(Mitochondrialnicotinamide adenine dinucleotide phosphate dependent oxidoreductases)能够降低MTT生成甲

从而增加暗紫色甲

的量，这与更大的细胞存活率有关。将MTT(0.5mg/mL；Sigma-Aldrich)添加到96孔盘中每孔100μL的细胞中，在37℃下放置3小时。还原MTT后，通过添加100μL DMSO溶解甲

摇动后，使用ELISA酶标仪(Synergy H1 Multi-Mode ReaderBioTek Instruments)在562nm波长下测量溶解的甲

的光密度(OD)。与未处理的对照组(100％)相比，将OD值的变化计算为细胞存活率。

表1.利用MTT分析法对培养的RGC-5细胞系的存活率进行定量分析。

各组的值是培养的RGC-5细胞的存活率相对于对照组的存活率之比，其中对照组的存活率设为100％。这项研究包括4个组别，包括对照组(正常；RGC-5细胞，在含有媒剂的培养基中孵育)，OGD前媒剂组(在OGD病症前，在OGD前给予媒剂1小时)，OGD前Emo 0.25μM组(在OGD病症前，在OGD前施用0.25μM大黄素1小时)和OGD前Emo 0.5μM组(在OGD前施用0.5μM大黄素1小时)。***表示正常对照组和OGD组之间的极显著差异(P<0.001)。

表示OGD前媒剂组与OGD前Emo 0.5μM组之间存在显著差异(P＝0.04)。结果为平均值±标准偏差(n＝5～6)。缩写：RGC-5：视网膜神经节细胞-5；MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)；OGD：氧葡萄糖剥夺；Emo：大黄素。

2、动物实验

(1)实验动物

本发明所使用的实验动物是购自台北BioLasco公司的Wistar大鼠。抵达后，Wistar大鼠为6周大，体重175至250克重。这些大鼠被以每组少于六只的大鼠饲养在一个大的塑料鼠笼中(信德仪器有限公司)。湿度和温度分别控制在40-60％和21±2℃内。将大鼠随机分配至各个实验组。本发明中所使用的大鼠为120只(为99只+21只，99只为60只+16只+23只，如表2所示)，其中包括在以下实验过程中死亡的动物(n＝21)：这些发生在视网膜缺血诱导(n＝9)、ERG检测(n＝4)和荧光金反向标记RGC(n＝8)。进行ERG记录后，所有存活的大鼠(n＝99)均接受以下步骤，即以甲苯酚紫染色、以荧光金标记和Western Blot法。存活的动物接受假手术(Sham)程序、缺血前给予媒剂或缺血前/后给予大黄素(Emo)，分为以下几组：假手术对照组(n＝19)；媒剂+IR组(n＝20)；Emo4+IR(n＝10)；Emo10+IR(n＝20)；Emo20+IR(n＝20)和IR+Emo20(n＝10)。动物实验程序是以遵循《动物研究：体内实验报告》(ARRIVE)指南的方式进行。

表2

*本发明中所使用的大鼠数量为120只(为99只+21只，99只为60只+16只+23只)，包括在以下实验过程中死亡的动物(n＝21)：高眼压(n＝9)、ERG检测(n＝4)和荧光金标记(n＝8)。

ERG记录之后，将所有记录后的大鼠(n＝99)保留并用于以下程序：以甲苯酚紫染色，以荧光金标记和Western Blot法。

缩写：IR：缺血再灌注；Emo4：4μM大黄素；Emo10：10μM大黄素；Emo20：20μM大黄素。

(2)动物麻醉和安乐死

将Wistar大鼠使用腹腔注射氯胺酮(ketamine)(Pfizer；100mg/kg)和赛拉嗪(xylazine)(Sigma-Aldrich；5mg/kg)的组合物进行麻醉，以带来止痛和镇静作用。进行ERG记录时，执行了Wistar大鼠的颅内注射荧光金和在玻璃体内注射特定的药剂。为了最大程度地减少疼痛并以人道方式牺牲Wistar大鼠，最后给每个个体的腹腔内注射至少140mg/kg的戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)(SCI Pharmtech)。

(3)药物给予

大黄素是购自Sigma-Aldrich公司(E7881；90％；在2-8℃下储存；购自Frangulabark；St.Louis,Missouri,United States)。表3至表6描述不同的药物给予程序，即视网膜电图(ERG)、荧光金RGC标记、甲苯酚紫视网膜染色和Western Blot法。媒剂或大黄素(5μL)是通过玻璃体内注射给予，这样这些药剂便能够直接扩散至目标物。大黄素溶解在媒剂中(DMSO：蒸馏水＝1:3)。根据玻璃体体积的任意定义为200μL，给药的最终浓度为0.25μM或0.5μM，这是从储备液稀释40倍后获得的，即10μM或20μM。为了测试更大范围的剂量反应，因此在动物实验中添加了4μM大黄素。媒剂+IR组和大黄素+IR组(缺血前给予大黄素4μM、10μM或20μM)按照以下实验步骤进行；这些是初始缺血前玻璃体内注射(媒剂或大黄素)，1天后诱导视网膜缺血，并在第二天将动物牺牲以进行除了视网膜电图(ERG)以外的各种死后程序。在缺血后治疗组中，为了减少所用动物的数量，本发明仅使用了20μM的单一大黄素浓度。此外，在初始视网膜缺血诱导后1天通过玻璃体内注射给予大黄素，并在第二天牺牲动物以进行上述各种死后程序。

表3、视网膜电图(ERG)b波分析中各个组别的组名和情况

缩写：ERG：视网膜电图；IR：缺血再灌注。

表4、甲苯酚紫染色的视网膜厚度分析中各个组别的组名和情况

表5、荧光金反向标记RGC分析中各个组别的组名和情况

组名	视网膜处理的情况
		假手术对照组(n＝4)	假手术程序
媒剂+IR(n＝4)	在缺血前通过玻璃体内注射媒剂
		Emo10+IR(n＝4)	在缺血前通过玻璃体内注射10μM的大黄素
Emo20+IR(n＝4)	在缺血前通过玻璃体内注射20μM的大黄素

表6、Western Blot法分析中各个组别的组名和情况

组名	视网膜处理的情况
		假手术对照组(n＝5)	假手术程序
媒剂+IR(n＝6)	在缺血前通过玻璃体内注射媒剂
		Emo10+IR(n＝6)	在缺血前通过玻璃体内注射10μM的大黄素
Emo20+IR(n＝6)	在缺血前通过玻璃体内注射20μM的大黄素

(4)诱导视网膜缺血

所使用的IOP程序提高了IOP，旨在引起Wistar大鼠视网膜缺血并模拟缺血性视网膜疾病。首先将大鼠麻醉并以立体定位仪(stereotaxic frame)保定，将一根30G的针头连接到一个升高的盐水瓶，并将该针头刺入大鼠眼睛的前房。瓶内食盐水的注射压力控制在120毫米汞柱(mmHg)，此步骤持续进行1小时。通过观察到视网膜变白来确认成功的视网膜缺血诱导。在整个实验过程中，动物都放在加热垫上以保持动物的体温。假手术程序为在瓶内生理食盐水的压力保持在0毫米汞柱(mmHg)下执行。

(5)视网膜电图(ERG)测量记录

在进行闪烁ERG(flash ERG)测量之前，先将动物麻醉。对于假手术对照组(Sham)或缺血前治疗组(缺血前1天通过玻璃体内注射大黄素或媒剂；即为大黄素+IR组或媒剂+IR组)，闪烁ERG反应是在假手术、缺血程序或任何给药步骤前(第0天)，以及假手术后一天或缺血前玻璃体内给药的缺血程序进行测量。在缺血后治疗组中，在缺血前(第0天)和缺血后(时间点：缺血后1天；缺血后玻璃体内注射大黄素后1天)收集ERG的记录。在ERG测量前8小时，进行了暗适应并使用1％的托平卡胺(tropicamide)和2.5％的脱羟肾上腺素(phenylephrine)诱导瞳孔扩张。ERG记录设备是从Grass-Telefactor公司(AstroNova,QC,Canada)获得的，其中包括刺激器(PS22)，稳压电源(RPS107)和放大器(P511)。将作为刺激源的闪光灯(strobe light)(0.5Hz)直接置于大鼠眼前方2公分处。以每两秒钟闪烁15次进行连续测量(10kHz)，并计算振幅以获得平均值。为了进行各组之间的比较，分析一只眼(假手术或缺血性损伤并给予特定的药剂)的b波振幅与未处理的正常眼的b波振幅的比率。

(6)甲苯酚紫染色

将前述的大鼠牺牲之后，用生理食盐水对大鼠进行心内灌注，然后摘除眼球，在4℃下用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定1天，再用乙醇脱水，包埋在石蜡(Tissue-TekTEC 5；Sakura)中，并切成5μm的厚度的切片，之后将切片的样本用甲苯酚紫染色并通过光学显微镜(Leica)检视。所有切片的视网膜样本均在相同的放大倍率下拍摄(Ilford Pan-Fplus film，50ASA)。

视网膜切片的厚度是通过在相同距离(距视盘1.5mm)处撷取视网膜样本来测定。为了评估由视网膜缺血引起的损伤程度，本发明会测量整个视网膜的厚度(从内限膜(ILM)到视网膜色素上皮(RPE)层)及内层视网膜的厚度(从ILM到内核层(INL))。所有测量均由不了解样本处理的实验条件的专家进行。

(7)RGC的荧光金反向标记

本实验开始的第一天，大鼠接受麻醉后，在其头部皮肤上开了一个2公分的开口，并用钻头在颅骨上开了两个圆形的侧面开口，然后通过汉米尔顿微注射器(HamiltonMicrosyringe)在颅骨顶点以下3.8mm、4.0mm和4.2mm的深度进行颅内注射2μL的0.5％的荧光金(Sigma-Aldrich)。荧光金处理后一天，进行缺血前给予大黄素、媒剂或执行假手术程序(如药物给予段落所述)。大鼠在荧光金注射后3天进行牺牲。牺牲后，仔细地分离视网膜组织，并与4％的多聚甲醛固定剂一起孵育、切片并加工。最后，通过荧光显微镜进行样本分析。本实验中的RGC密度定义为RGC总量除以整个视网膜面积，然后计算其平均值。

(8)Western Blot实验

本实验在牺牲大鼠后立即取出视网膜样本，然后使用裂解缓冲液(哺乳动物蛋白质提取试剂；Hycell)以获得变性的蛋白质，然后进行超音波处理并定量至每孔蛋白质样品当量为30μg/30μL。制备完成的蛋白质样本在12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis；SDS-PAGE)(Bio-Rad，Hercules，CA)上分离，并进一步转渍到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将转渍后的PVDF膜与含有5％脱脂牛奶的阻断缓冲液(Blocking Buffer；135mM NaCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.5mMKH₂PO₄，2.7mM KCl；pH 7.2)在4℃孵育16小时。接下来将该PVDF膜与各种一级抗体在25℃下孵育1小时，其中有小鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)单株抗体(ab6276；1:5000；Abcam Inc.,Cambridge，UK)，兔子抗β-链蛋白(β-catenin)单株抗体(ab32572；1:5000；Abcam Inc.,Cambridge，UK)和兔子抗VEGF多株抗体(A-20；1:200；sc-152)。随后，该PVDF膜上的条带与它们合适的二级抗体一起在25℃下孵育1小时，即辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔子IgG抗体(Horseradish Peroxidase(HRP)-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG；111-035-003；1：2000；Jackson ImmunoResearch)或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(HorseradishPeroxidase(HRP)-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG；sc-2005；1：2000；Santa CruzBiotech)。最后，使用增强型化学发光分析系统(HyCell)将该PVDF膜显影。然后，使用成像仪(Amersham Imager；LifeSciences)扫描该PVDF膜，并通过扫描光密度测定法定量每种蛋白质的量。

(9)统计学分析

本发明使用非成对学生t检定比较两个实验组之间的统计学差异。概率(P)<0.05表示具有统计学上的显著差异。所有结果均以平均值±标准偏差来表示。

二、结果

1、细胞实验

(1)通过MTT分析评估大黄素对缺血诱导的细胞存活率下降的影响

培养的细胞用于鉴定受试药剂大黄素的有效剂量。大黄素(0.25μM和0.5μM)对培养细胞的作用使用MTT细胞存活率分析和一种细胞缺血仿真模型(即OGD)评估1天。OGD的定义是在缺氧条件下(即1％O₂)在37℃在无葡萄糖的培养基中培养细胞。随后描述了各个实验组相对于对照组的结果(设置为100％；在含有载体的培养基中孵育的细胞)(图1和表1)。将细胞在培养基中进行孵育，然后在OGD前施用1小时的媒剂(细胞存活率：38.30±2.51％)、OGD前施用1小时的大黄素0.25μM(细胞存活率：43.81±3.75％)和OGD前施用1小时的大黄素0.5μM(细胞存活率：47.52±3.99％)。与媒剂治疗组相比，大黄素治疗导致OGD诱导的细胞损伤的剂量相关且显著(P＝0.04；在0.5μM时)减弱。

2、动物实验

(1)大黄素对缺血引起的ERG b波振幅降低的影响

在假手术对照组中，ERG的b波振幅测量为0.87mV/±1.00±0.00mV(如图2a所示，振幅比为0.82±0.14，并在图2b中标准化至1；表3；n＝7)。在视网膜缺血后，观察到ERG的b波振幅/比率显著下降(P<0.001)(如图2a所示媒剂+IR＝0.03mV，如图2b所示媒剂+IR＝0.04±0.02，n＝8)。缺血前在玻璃体内注射大黄素减轻了因缺血所引起的ERG的b波振幅/比率的显著下降(如图2a所示Emo4+IR＝0.07mV，如图2b所示Emo4+IR＝0.08±0.07，n＝8；如图2a所示Emo10+IR＝0.58mV，如图2b所示Emo10+IR＝0.64±0.28，P<0.001，n＝4；如图2a所示Emo20+IR＝0.63mV，如图2b所示Emo20+IR＝0.99±0.18，P<0.001，n＝4)。另外，本实验还证明了缺血后在玻璃体内给予大黄素也显著改善了上述因缺血诱导的ERG的b波振幅/比率降低的情况(P<0.001)(如图2a所示IR+Emo20＝0.12mV，如图2b所示IR+Emo20＝0.24±0.09，n＝9)。ERG的b波普遍被认为是主要用以反映双极细胞(bipolar cells)和穆勒细胞(Müller Cells)的光诱导活性。因此，以上ERG的b波结果表明，大黄素可以保护双极细胞(bipolar cells)和穆勒细胞(Müller Cells)免受视网膜缺血引起的损伤。

(2)甲苯酚紫染色中大黄素对缺血诱导的视网膜厚度减少的影响

如图3和表4所示，在假手术对照组(n＝10)中视网膜厚度(μm)被测量为：整个视网膜厚度为186.50±1.43μm或内层视网膜厚度为79.90±2.06μm。诱导视网膜缺血后，观察到整个视网膜厚度和内层视网膜厚度有显著的损失(媒剂+IR：整个视网膜厚度＝71.80±1.08μm；内层视网膜厚度＝20.97±0.85μm；P<0.001)。然而，在缺血前在玻璃体内注射大黄素(4、10或20μΜ)是呈剂量依赖性地(n＝10，Emo4+IR：整个视网膜厚度＝87.40±0.60μm，内层视网膜厚度＝38.60±1.01μm；n＝10，Emo10+IR：整个视网膜厚度＝153.20±1.48μm，内层视网膜厚度＝70.05±0.60μm；n＝10，Emo20+IR：整个视网膜厚度＝170.10±0.10μm；内层视网膜厚度＝70.65±2.06μm)并显著缓解了因视网膜缺血和再灌注所引起的视网膜厚度减少(给予4μM的大黄素时：P<0.01；给予10或20μM的大黄素时：P<0.001)。此外，在缺血后在玻璃体内注射大黄素(n＝10；IR+Emo20：整个视网膜厚度＝125.45±1.68μm，内层视网膜厚度＝69.65±0.68μm)就缺血相关所引起的视网膜厚度损失而言也具有显著的抗缺血作用(P<0.001)。

(3)荧光金反向标记中大黄素对缺血诱导的RGC密度降低的影响

如图4a、图4e和表5所示，RGC免疫标记的评估证实，假手术后的RGC的细胞密度为5323.53±215.6/0.17mm²(假手术对照组；n＝4)。缺血前在玻璃体内给予媒剂观察到缺血性视网膜的RGC的细胞密度的极显著下降(P<0.001)(n＝4；媒剂+IR＝2069.12±212.82mm²；图4b、图4e)。此外，缺血前给予10μM或20μM的大黄素发现细胞密度呈现剂量依赖性地且显著地增加(n＝4，在10μM时P<0.01，Emo10+IR＝3345.59±206.80mm²，图4c及图4e；n＝4，在20μM时P<0.001，Emo20+IR＝4623.53±179.48mm²，图4d及图4e)。

(4)大黄素对缺血诱导的β-链蛋白(β-catenin)/血管内皮生长因子(VEGF)表现量与β-肌动蛋白(β-actin)表现量的比率变化的影响

Western Blot法分析是用于研究大黄素改善缺血性损伤的治疗机制。参照免疫印记影像显示(图5a图及表6)，与缺血前玻璃体内给予媒剂(媒剂+IR)相比，缺血前给予10μM或20μM的大黄素(Emo10+IR或Emo20+IR)对于缺血诱导的β-链蛋白(β-catenin)/血管内皮生长因子(VEGF)过量表现具有剂量依赖性地抑制作用。在定量分析中(图5b-图5c及表6)，以假手术对照组(n＝5)中β-链蛋白(β-catenin)/血管内皮生长因子(VEGF)：β-肌动蛋白(β-actin)比率标准化至1来计算大黄素对β-链蛋白(β-catenin)/血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表现量的影响。缺血性损伤后，观察到大黄素对于缺血性和缺血前玻璃体内给予媒剂(媒剂+IR＝1.64±0.14/7.67±2.57；n＝6)所引起的β-链蛋白(β-catenin)/血管内皮生长因子(VEGF)的显著上调(P<0.001)具有剂量反应性的(给予10μM的大黄素时作用较弱，Emo10+IR＝1.18±0.24/3.99±2.86，n＝6)和显著的(P＝0.02/0.03，当给予20μM的大黄素时P＝0.02，Emo20+IR＝1.00±0.19，n＝6)抑制作用。括号中显示的结果以“/”来分别表示β-链蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的结果。

本领域技术人员非常容易理解本发明所欲实现的目的，并从本发明中获得其中所提及的目的和技术优势。本发明所述的方法及其用途仅代表优选实施例，是示例性的，并不意在限制本发明的范围。任何本领域技术人员所想到的修改和其他用途均包含在本发明的精神内，并由本发明的申请专利范围所请求保护的范围所限定。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。

本发明可以在缺少本发明中未具体公开的任何一个或多个组件，一个或多个限制的情况下被适当地实践。本发明所采用的术语仅用作描述性术语，并非是限制性的，在使用这些术语时，无意排除所显示和描述的技术特征或其部分的任何等同形式，而是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过最佳或较佳实施例和可选择的技术特征具体公开了本发明，但本领域技术人员仍然可以针对本发明公开的概念进行修改和变化，并且这些修改和变化应被认为是在本发明所附申请专利范围所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种组合物在制备用于治疗或预防有需要的个体罹患视网膜缺血或与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症的药物中的用途，其特征在于，所述组合物包含大黄素。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与视网膜缺血相关的疾病、病况或病症包含视网膜血管阻塞、青光眼性神经病变、增生性糖尿病视网膜病变、新生血管性质老年性黄斑部退化、家族性渗出性玻璃体视网膜病变、柯氏症、残留型增殖性初级玻璃体症、诺里氏疾病或早产儿视网膜病变。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的个体是指哺乳类动物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的个体是指人类。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还包含药学上可接受的佐剂、媒剂、或载体。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物中所含的大黄素的单位剂量为2至30μM。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物中所含的大黄素的单位剂量为4至20μM。

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