CN110520728A - 用于酶促a1c检测和定量的系统和方法 - Google Patents

Abstract

用于测定血红蛋白A1C的浓度的系统包括第一电化学测试条，该第一电化学测试条提供了HbA1C浓度；以及第二电化学测试条，该第二电化学测试条提供了血红蛋白的总量。

Description

用于酶促A1C检测和定量的系统和方法

背景技术

对于各种血液分析物和体液中的其它可检测量度的即时护理(“POC”)和家庭测试对于患者和医生是期望的。一种此类分析物是A1C，一类糖基化血红蛋白。高水平的血糖导致遍及全身的蛋白质包括血红蛋白的过度糖基化。血红蛋白的糖基化主要发生在β链的氨基末端处以及具有游离氨基的其它位点。血红蛋白A经历由葡萄糖的缓慢糖基化，其取决于在红血细胞的120天寿命内葡萄糖的时间平均浓度。糖基化血红蛋白A的最普遍和最有特色的种类是A1C，占健康个体中的总血红蛋白的大约3％至6％。A1C与血糖水平的相关性使其成为用于监测患有糖尿病的人中的长期血糖水平的有用方法。平均(平均值)血糖水平(MBG)是A1C水平的函数，且因此可推导。

PTS制造了A1CNow，用于测量HbA1c的即时护理装置。该测试是基于免疫化学(抗原-抗体)的系统，除非患者具有血红蛋白变异(HbS和HbC是两种最常见的变体)，否则所述系统表现良好，所述血红蛋白变异产生高达30％的假高结果。期望提供不受这些血红蛋白变异影响的测定。

发明内容

在一个实施方案中，用于测定血红蛋白A1C浓度的系统包括第一电化学测试条，该第一电化学测试条提供HbA1c百分比浓度；以及第二电化学测试条，该第二电化学测试条提供血红蛋白的总量。任选地，第二电化学测试条包括具有裂解性表面活性剂例如Triton X-100的铁氰化钾溶液，使得释放的血红蛋白与铁氰化钾溶液反应以形成高铁血红蛋白。可替代地，第一电化学测试条包括具有果糖基氨基酸氧化酶(FPO-301)酶涂层的测试条，所述酶作用于作为底物的果糖基-L-缬氨酰组氨酸。在另一个替代方案中，第一电化学测试条包括具有果糖基氨基酸氧化酶涂层的测试条。可替代地，涂层进一步包括三氯化六胺合钌介质。在另一个替代方案中，涂层进一步包括三氯化六胺合钌介质衍生物。任选地，涂层包括有机金属种类的组合。可替代地，果糖基氨基氧化酶将电子直接转移到介质，因此绕过过氧化物生成步骤。在一种配置中，第一电化学测试条和第二电化学测试条各自包括第一电极和第二电极。在另一种配置中，第一电极和第二电极之一包括在第一电极和第二电极之一的表面上的试剂。任选地，将试剂涂在第一电极和第二电极之一上。可替代地，第一测试条和第二测试条位于单个把持器中。在一个替代方案中，单个把持器进一步包括第三测试条，该第三测试条测试另外的分析物。在另一个替代方案中，另外的分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐。

任选地，单个把持器进一步包括第四测试条，该第四测试条测试第四分析物，其中所述第四分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐，并且对另外的分析物非冗余。

在另一个实施方案中，用于测定血红蛋白A1C浓度的方法包括提供系统，所述系统包括第一电化学测试条，该第一电化学测试条提供HbA1c百分比浓度；以及第二电化学测试条，该第二电化学测试条提供血红蛋白的总量。该方法进一步包括将样品计量加入系统中；并且读取第一电化学测试条和第二电化学测试条，以测定HbA1C百分比浓度和血红蛋白的总量。在一种配置中，通过仪表执行读取。任选地，第二电化学测试条包括具有裂解性表面活性剂例如Triton X-100的铁氰化钾溶液，使得释放的血红蛋白与铁氰化钾溶液反应以形成高铁血红蛋白。可替代地，第一电化学测试条包括具有果糖基氨基酸氧化酶(FPO-301)涂层的测试条。

任选地，果糖基氨基氧化酶将电子直接转移到介质，因此绕过过氧化物生成步骤。可替代地，第一电化学测试条包括具有果糖基氨基酸氧化酶和三氯化六胺合钌介质的涂层的测试条。

任选地，第一电化学测试条和第二电化学测试条各自包括第一电极和第二电极。可替代地，第一电极和第二电极之一包括在第一电极和第二电极之一的表面上的试剂。任选地，将试剂涂在第一电极和第二电极之一上。在另一种配置中，将试剂涂在第一电极和第二电极两者上。在一种配置中，第一测试条和第二测试条位于单个把持器中。在另一种配置中，单个把持器进一步包括第三测试条，并且该方法进一步包括用第三测试条测试另外的分析物。

任选地，另外的分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐。可替代地，单个把持器进一步包括第四测试条，该第四测试条测试第四分析物，其中所述第四分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐，并且对另外的分析物非冗余。

附图说明

图1显示了在样品消化30秒后，在左侧上具有作为对照的溶血产物且在右侧上具有Toyobo's中性蛋白酶的溶血产物的斑点印迹；

图2A显示了果糖基缬氨酰组氨酸在电化学传感器上的反应实例的结果图；

图2B显示了结果图，其中裂解的全血中的糖基化降解产物果糖基-缬氨酰组氨酸如表1中所示的与RBC裂解缓冲液中的Triton X-100或zwittergent 3-14(两性洗涤剂3-14)表面活性剂产生线性剂量应答；

图3A-3C显示了叉指金电极的实施方案，其允许由Hb和HbA1c反应产生的信号的放大；

图4显示了具有多重单一分析物测试的柔性电化学测试条的一个实施方案；

图5显示了具有多重分析物测试的柔性电化学测试条的另一个实施方案。

具体实施方案

某些术语在本文中使用仅为了方便起见，而不应视为对用于HbA1c的酶促检测和定量的系统和方法的实施方案的限制。本文所述的酶促检测和定量技术使得HbA1c的电化学检测成为可能。在附图中，在几个图自始至终，相同的附图标记用于指定相同的元件。此类检测方案提供了由于个体中的遗传差异的变异消除，提供了更大的准确度。

PTS制造了A1c Now，用于测量HbA1c的即时护理(POC)装置。该测试是基于免疫化学(抗原-抗体)的系统，除非患者具有血红蛋白变异(HbS和HbC是两种最常见的变体)，否则所述系统表现良好，所述血红蛋白变异产生高达30％的假高结果。

在一个实施方案中，通过提供酶促测量HbA1c的方法，消除了血红蛋白变异问题。随着NGSP(国家血糖标准计划(National Glycemic Standard Program))对HbA1c测量的标准日益严格，获得更佳的准确度是关于PTS Diagnostics的重大收益。

在许多实施方案中，电化学系统将允许测量HbA1c。酶的使用可以包括在电化学分析方案中。本文提供的是反应方案，并且其次，提供了测量该反应的电化学方法。这种方法的优点包括：

1.没有血红蛋白变异对测定造成的问题，能够酶促测量HbA1c使得测量更准确。这允许更容易的NGSP认证，且最重要的是，对于我们的客户更佳的准确度。

2.HbA1c测量的酶促方法的想法是相对较新的领域，但它消除了基于抗原抗体的系统的许多问题。

3.电化学HbA1c方法是新型的，允许可以测试许多不同分析物的多功能仪表。另外，HbA1c测定可以与其它测定组合，以产生多分析物安培测试条。

4.酶促测量HbA1c的优点是它将提供的准确度。在某些少数族裔人群中更可能的血红蛋白变异在当前测定中导致假高结果。通过消除来自血红蛋白变来的误差，准确性将急剧增加，允许更容易的NGSP认证和对于患者更佳的结果。

5.我们建议的酶是相对便宜并且是商购可得的。

当葡萄糖结合血红蛋白的β链的N末端缬氨酸残基时，形成血红蛋白A1c。HbA1c在总血红蛋白中的百分比描述了最近三个月平均血糖测量的过程。它是糖尿病患者已将其糖尿病控制得如何好或如何差的指示剂，并且也可以是糖尿病前期的指示剂。

经由酶测量糖基化血红蛋白(HbA1c)是相当新的领域。本文的系统和方法利用了其它人在开发用于与糖基化血红蛋白结合的新型酶方面做出的努力。据我们所知，尚未对于HbA1c发明酶促POC装置。我们的目的是介绍产生此类测定的科学和方法，我们相信所述测定将彻底改变该领域。

酶方法

在一个实施方案中，测量HbA1c的酶促途径始于通过采用蛋白酶选择性地降解血红蛋白的众所周知的方法。该蛋白酶能够将糖基化的血红蛋白选择性地降解为糖基化的血红蛋白降解产物果糖基-缬氨酰组氨酸(F-VH)或果糖基-缬氨酸(F-V)。Toyobo's中性蛋白酶(NEP-801)是用于该反应的选择蛋白酶。反应参见下文。

蛋白酶解步骤的结果在图1中证实。图1显示了在样品消化30秒后，在左侧上具有作为对照的溶血产物1且在右侧上具有Toyobo's中性蛋白酶的溶血产物2的斑点印迹。在右侧上展开的标记证实了Toyobo's中性蛋白酶的快速有效的蛋白酶解活性。所示的结果是在大约30秒的反应后。

HbA1c的这种蛋白酶解消化释放了果糖基-L-氨基酸，其由Toyobo's果糖基-氨基酸氧化酶(FPO-301)作用(参见下文的反应)。

执行的理论计算(表1)显示了在从4％到17％HbA1c的病理极限下形成的果糖基缬氨酰组氨酸与样品中各种水平的血红蛋白浓度的关系。

表1：显示了在不同的％HbA1c和血红蛋白水平下形成的果糖基-缬氨酰组氨酸的理论水平。

电化学酶促HbA1c

1.血红蛋白

在许多实施方案中，测量HbA1c需要总血红蛋白测量以及HbA1c测量，以便获得HbA1c的百分比。测量血红蛋白的标准方法之一是Drabkin′s试剂。这种经典方法基于在碱性铁氰化钾的存在下，将血红蛋白氧化为高铁血红蛋白。然后使高铁血红蛋白与氰化钾反应，以形成氰基高铁血红蛋白，用于吸光度读数的目的。氰化高铁血红蛋白浓度使用以540nm的光源读取，并且与总血红蛋白浓度成比例。Drabkin′s试剂血红蛋白测定通常用5mL试剂和20血液进行。这允许RBC(红血细胞)的裂解并稀释来自血液的红色。

根据一些实施方案，可以电化学执行测量总血红蛋白。在一个实施方案中，提供了具有铁氰化钾溶液的电化学测试条，所述铁氰化钾溶液具有裂解性表面活性剂如TritonX-100。在各种替代方案中，可以使用其它表面活性剂或裂解剂。释放的血红蛋白与铁氰化物反应，以形成高铁血红蛋白。在预定的时间间隔后，施加电势，并且使所得到的亚铁氰化物根据下式在电极处反应。

Fe²⁺珠蛋白(血红蛋白)+K³Fe³⁺(CN)6(铁氰化物) Fe³⁺珠蛋白→(高铁血红蛋白)+K⁴F²⁺(CN)₆(亚铁氰化物)

电化学测量血红蛋白具有超过使用Drabkin′s试剂或其它基于光学的测定的某些优点。首先，电化学测量血红蛋白不需要稀释步骤。稀释步骤倾向于取样误差，并且对于用户仅是多一个步骤。另外，该方法优选是因为它不具有与气泡在微型比色皿中截留相关的误差。另外，使用任何时间反射率或其它基于光的检测方案，其为血液的部分，例如可能干扰光检测方案的血细胞比容。上文给出的实例被认为是电化学测量血红蛋白的一种方法。可以使用替代技术并代替该技术。

2.血红蛋白A1c

上文呈现了用于测量糖基化血红蛋白的酶反应的一个实施方案。下文呈现了在电化学系统中实施该反应方案的实施方案。关于将反应方案转化为电化学平台存在一些问题。在一个电化学反应方案中，首先，用众所周知的蛋白酶方法将糖基化的血红蛋白分解为果糖基氨基酸(例如，果糖基缬氨酰组氨酸或果糖基-缬氨酸)。其次，果糖基缬氨酰组氨酸或果糖基缬氨酸将受到果糖基氨基酸氧化酶的作用。通过使用三氯化六胺合钌[Ru(NH₃)Cl₃](介质)或它的其它衍生物，以及与其它有机金属种类的组合，果糖基氨基酸氧化酶将电子直接转移到介质，如下文反应中所示。我们已显示概念证明，果糖基缬氨酰组氨酸在+400mV的电势下与介质和果糖基氨基酸氧化酶反应(参见图2a)。在许多实施方案中，金叉指电极(参见图3)用于生成信号。如可以看出的，剂量响应非常线性，具有0.993的良好相关性，指示电子有效转移至介质和电极。线性剂量响应极大地帮助产生在宽范围内的可靠测定。另外，相关性很高，提示测试是准确的。反应方案显示于下文：

图2B显示了结果图，其中裂解的全血中的糖基化降解产物果糖基-缬氨酰组氨酸与RBC裂解缓冲液中的Triton x-100或zwittergent 3-14表面活性剂，且优选与zwittergent 3-14表面活性剂产生线性剂量应答。表2显示了与图2b图相关的两种基于表面活性剂的制剂(Triton X-100和Zwittergent 3-14)。向制剂中添加亚硝酸盐确保由氧合血红蛋白形成高铁血红蛋白，因此减少干扰并降低背景信号。因此，我们已显示果糖基-缬氨酰组氨酸底物能够如表1中所示的在果糖基-缬氨酰组氨酸形成的理论极限内，在复杂的基质如含有所有其天然成分的全血中检测到。

表2：

裂解缓冲液#1 Triton X-100	裂解缓冲液#2两性洗涤剂3-14
		50mM MES缓冲液	50mM MES缓冲液
20mM NaNO<sub>2</sub>	20mM NaNO<sub>2</sub>
		5mM CaCl<sub>2</sub>	5mM CaCl<sub>2</sub>
50mM NaCl	50mM NaCl
		0.75％Triton X-100	0.75两性洗涤剂3-14

图2a和2b显示了果糖基缬氨酰组氨酸在电化学传感器上反应的两个实例的结果图。在所示实例中，传感器为面积0.013平方英寸的叉指金电极。当这种数据从最小的叉指传感器获得时，可以获得甚至更多的信号(图3A)。

由于待检测的分析物的量很少，提供具有大表面积和高灵敏度的传感器因此可以获取更准确和响应更快的测量。尽管金电极由于其高灵敏度可以是良好选择，但也可以使用其它高度灵敏的电极。

图3A-3C显示了叉指金电极的实施方案，其允许由Hb和HbA1c反应产生的信号的放大。通过具有较大的面积(如连续的图A-C中所示)和更多的电极指，可以放大电化学信号。如图3A中所示，示例性测试条包括叉指金电极。一般地，叉指电极包括具有极窄叉指间隙的极窄电极。在一些情况下，电极在50-500纳米的范围内，并且叉指间隙在10-100纳米的范围内。此类布置使与样品所经历的电极的表面积接触最大化。图3A-3C中的电极6一般不是按比例绘制，而是作为此类电极的表示而显示。图3A显示了三个电极引线3A、4A、5A，其与仪表的相应触点相接，所述仪表设计为向测试条施加电压或安培数，并且由此测量Hb和HbA1c。电极引线3A包括环形部分3B，其允许由仪表使用u形电路来检测的测试条的插入。上部部分互连器3C与电极6的一半电极互连。上部部分互连器5B与电极6的另一半电极互连，使得一半电极可以充当电极且另一半充当对电极。

另外，通常可以包括参考电极互连器4B。如所示的，电介质7围绕测试区域并且作用于预防在测试期间的电流或电压泄漏。通常，电介质7包括玻璃、玻璃陶瓷(sitall)或其它绝缘陶瓷。图3B和图3C显示了增加的电极6面积，其可以作用于增加灵敏度。

％HbA1c定量：计算最终HbA1c百分比的一种方法是采用Hb和HbA1c的比率，然后通过下式将该比率转换为百分比：

％HbA1c＝[(糖基化血红蛋白的摩尔数)÷(血红蛋白的摩尔数)]x 100％

3.测试条设计

可以使用通用的电化学测试条，其允许将一种或多种测定放置在测试条上。图4显示了测试条设计的一个实施方案。显示的是4个测试条10。测试条10从左到右具有4、3、2和1个样品接受端口20。每个样品接受端口可以具有电极30、对电极40和参考电极50。参考电极50可以提供填充指示，因为它仅在样品到达电极50时才通过电压。触点70、80也是可见的，其与电极互连并在插入时连接到仪表中的触点。电极60包括插入检查机构，由此U形电极的两端可以用于通过完成从U的一端到另一端的电路来验证测试条已插入。测试条大小不根据测定的次数而改变。另外，电极放置不根据测定的类型而改变。根据测试方案所需要的，可以打印关于一种、两种、三种或四种分析物的片层。本公开内容不是将实验对象组的大小限制为仅四种分析物，而是提供无论是测试一种还是十种分析物均受到保护的概念。另外，电极无需全部在测试条的一侧上。

优良技术可能能够将电极放置在测试条的两侧上，且因此允许小型化。根据需要，可以打印关于一种、两种、三种或四种分析物的片层。该测试条的一些实施方案可以包括分开的取样端口，特别是如果试剂之间可能存在“串扰”。很可能存在关于多分析物实验对象组的单一取样端口。图5显示了此类实施方案200。在许多实施方案中，存在关于多分析物实验对象组的单一取样端口210。再次，该测试条允许设计的适应性，以满足特定测定的需要。如所示的，在最左边的测试条中，单个样品端口210可以提供五组不同的触点，提供了5种不同分析物测试的测试。

在许多实施方案中，电化学HbA1c测定将利用图4中的这种通用测试条发明。一个实施方案可以包括两个分析物传感器HbA1c实验对象组，其测量血红蛋白和％HbA1c。然而，另外，在替代方案中，可以提供包括糖尿病实验对象组的多重测试，测试下述三种(或更多种)组合中的任一种：葡萄糖、HbA1c、酮、甘油三酯或乳酸盐。可替代地，可以提供不同的配置。

使用电化学平台用于开发HbA1c测定存在某些优点。我们在下文列出了其中一些：

样本量很小，通常为约<5/测试。

不需要取样器或转移吸管。

不需要特定的诊断膜。这消除了膜的资格预审步骤，并且消除了制造商停止膜生产的风险。

校准的单位是米，并且已标准化以测量nA。存在自校准的微芯片。

与基于光学的系统相比更高的能源效率，需要更少的电池能量。

一般更精确。

与通过我们先前发明的其它测定“形成实验对象组(panelize)”的能力。

尽管具体实施方案已在前述详细描述中得到详细描述并且在附图中示出，但本领域技术人员将了解，根据公开内容的总体教导及其广义的发明构思，可以开发对这些细节的各种修改和替代。因此，应理解，本公开内容的范围并不限于本文公开的特定实例和实施，而是预期覆盖如由所附权利要求及其任何和所有等价物限定的其精神和范围内的修改。

Claims (28)

1.一种用于以HbA1C确定血红蛋白的糖基化百分比的系统，所述系统包括：

第一电化学测试条，所述第一电化学测试条提供HbA1C浓度；以及

第二电化学测试条，所述第二电化学测试条提供血红蛋白的总量。

2.权利要求1的系统，其中所述第二电化学测试条包括具有裂解性表面活性剂例如Triton X-100的铁氰化钾溶液，使得释放的血红蛋白与铁氰化钾溶液反应以形成高铁血红蛋白。

3.权利要求2的系统，其中所述第一电化学测试条包括具有果糖基氨基酸氧化酶涂层的测试条。

4.权利要求3的系统，其中所述涂层进一步包括三氯化六胺合钌介质。

5.权利要求3的系统，其中所述涂层进一步包括三氯化六胺合钌介质衍生物。

6.权利要求3的系统，其中所述涂层包括有机金属种类的组合。

7.权利要求1的系统，其中所述果糖基氨基氧化酶将电子直接转移到所述介质，因此绕过过氧化物生成步骤。

8.权利要求1的系统，其中所述第一电化学测试条和第二电化学测试条各自包括第一电极和第二电极。

9.权利要求5的系统，其中所述第一电极和第二电极形成叉指电极的部分。

10.权利要求6的系统，其中所述第一电极和第二电极之一包括在所述第一电极和第二电极之一的表面上的试剂。

11.权利要求7的系统，其中将所述试剂涂在所述第一电极和第二电极之一上。

12.权利要求1的系统，其中所述第一测试条和第二测试条位于单个把持器中。

13.权利要求9的系统，其中所述单个把持器进一步包括第三测试条，所述第三测试条测试另外的分析物。

14.权利要求10的系统，其中所述另外的分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯和乳酸盐。

15.权利要求10的系统，其中所述单个把持器进一步包括第四测试条，所述第四测试条测试第四分析物，其中所述第四分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐，并且对所述另外的分析物非冗余。

16.一种用于测定血红蛋白A1C的百分比的方法，其包括：

提供系统，所述系统包括第一电化学测试条，所述第一电化学测试条提供HbA1C浓度；以及第二电化学测试条，所述第二电化学测试条提供血红蛋白的总量；

将样品计量加入所述系统中；并且

读取所述第一电化学测试条和第二电化学测试条，以测定HbA1C百分比浓度和血红蛋白的总量。

17.权利要求16的方法，其中通过仪表执行所述读取。

18.权利要求16的方法，其中所述第二电化学测试条包括具有裂解性表面活性剂例如Triton X-100的铁氰化钾溶液，使得释放的血红蛋白与铁氰化钾溶液反应以形成高铁血红蛋白。

19.权利要求16的方法，其中果糖基氨基氧化酶将电子直接转移到介质，因此绕过过氧化物生成步骤。

20.权利要求16的方法，其中所述第一电化学测试条包括具有果糖基氨基酸氧化酶和三氯化六胺合钌介质的涂层的测试条。

21.权利要求16的方法，其中所述第一电化学测试条和第二电化学测试条各自包括第一电极和第二电极。

22.权利要求21的方法，其中所述第一电极和第二电极之一包括在所述第一电极和第二电极之一的表面上的试剂。

23.权利要求18的方法，其中将所述试剂涂在所述第一电极和第二电极之一上。

24.权利要求21的方法，其中将所述试剂涂在所述第一电极和第二电极两者上。

25.权利要求16的方法，其中所述第一测试条和第二测试条位于单个把持器中。

26.权利要求25的方法，其中所述单个把持器进一步包括第三测试条；并且所述方法进一步包括用所述第三测试条测试另外的分析物。

27.权利要求26的方法，其中所述另外的分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐。

28.权利要求27的方法，其中所述单个把持器进一步包括第四测试条，所述第四测试条测试第四分析物，其中所述第四分析物选自葡萄糖、HbA1C、酮、甘油三酯或乳酸盐，并且对所述另外的分析物非冗余。