CN110511878A - 具抑菌能力和木质纤维素降解活性的新孢无柄盘菌及用途 - Google Patents

具抑菌能力和木质纤维素降解活性的新孢无柄盘菌及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冷杉内生真菌新孢无柄盘菌(Pezicula neosporulosa M51‑1)菌株及其活性。本发明公开了一种新孢无柄盘菌M51‑1，为新孢无柄盘菌(Pezicula neosporulosa)，保藏号：CGMCC No.：18137。本发明还同时公开了上述新孢无柄盘菌M51‑1的用途：用于提高植物对病原菌的抵抗能力和/或提供降解木质纤维素的工程菌。

Description

具抑菌能力和木质纤维素降解活性的新孢无柄盘菌及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冷杉内生真菌新孢无柄盘菌(Peziculaneosporulosa M51-1)菌株及其活性。
背景技术
植物内生真菌通常指能够定殖在植物的根、茎、叶、花或者种子等组织器官，但并不引起宿主明显病症的真菌类群。随着真菌与植物共生关系的重要性不断被揭示，越来越多的科学家一致认为，植物实际上是“植物-共生菌”的生命共同体。植物内生真菌作为植物根系微生物组的重要组分，其组成与功能的多样性得到广泛关注和研究。在组成方面，内生真菌主要由子囊菌、担子菌和球囊菌组成。在功能方面，内生真菌可以通过多种途径直接或者间接影响植物，例如可以促进植物的营养吸收，提高植物的抑菌能力，或者调节植物对不利环境胁迫的响应等。因其较高的物种多样性和功能多样性，内生真菌在农林业生产方面具有巨大的应用潜力。但是，目前对内生真菌资源的挖掘和利用程度还有待提高。
病原菌(例如尖孢镰刀菌)的侵害已经成为农业林生产中面临的巨大挑战之一。病原菌成功入侵健康的植物后，轻则会导致植物的生长状况变差，例如植物矮小、生物量积累能力下降；重则会导致植物的枯萎或者死亡，从而造成减产。病虫害的影响，严重制约了农业林生产的可持续发展，并造成了巨大的经济损失。寻找科学有效的手段和方式治理病虫害成为目前研究和应用的重难点。依赖杀虫剂等化学药品处理病原菌，虽然产生了一定的效果，但是也带来了严重的环境污染问题。因此，亟需环境友好型的途径和手段来解决问题，从而实现可持续发展。研究表明，一些内生真菌能够分泌抑菌的次级代谢产物起到杀菌作用，或者通过与病原菌竞争生态位等方式抑制病原菌的生长，从而有助于提高植物对病原菌的抵抗能力。但是，目前对该类资源的挖掘仍然比较初级，一定程度上阻碍了应用的推广。因此，需要更多的研究开发和利用具有抑菌能力的内生真菌资源，从而为农林业病原菌的防治提供新型的、环境友好型的解决方案。
作为地球上最重要的可再生资源，木质纤维素(主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素)广泛存在于农林产品中。以我国为例，作为全球最大的粮食生产国，我国每年产生近7亿吨农作物秸秆。由于处理能力不足，大多数秸秆被焚烧或者随意丢弃，不仅造成了资源的浪费，也带来了显著的环境问题。因此，木质纤维素的资源化综合利用成为研究与关注的热点。木质纤维素降解常用的方法有物理法、化学法和生物法，其中生物法以其高效、经济、安全等特性得到了广泛关注。真菌是降解木质纤维素的重要来源之一，降解木质纤维素的真菌主要为白腐菌、褐腐菌、子囊菌等。对自然界已有真菌资源进行深入挖掘，可以加快对真菌的综合利用，为木质纤维素的降解提供新的解决方案。作为地球上最重要的可再生资源，木质纤维素(主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素)广泛存在于农林产品中。以我国为例，作为全球最大的粮食生产国，我国每年产生近7亿吨农作物秸秆。由于处理能力不足，大多数秸秆被焚烧或者随意丢弃，不仅造成了资源的浪费，也带来了显著的环境问题。因此，木质纤维素的资源化综合利用成为研究与关注的热点。木质纤维素降解常用的方法有物理法、化学法和生物法，其中生物法以其高效、经济、安全等特性得到了广泛关注。真菌是降解木质纤维素的重要来源之一，降解木质纤维素的真菌主要为白腐菌、褐腐菌、子囊菌等。对自然界已有真菌资源进行深入挖掘，可以加快对真菌的综合利用，为木质纤维素的降解提供新的解决方案。
无柄盘菌是分离自健康植物的茎杆、叶片以及根部的一类真菌，其能与多种裸子植物形成共生互作关系。已有研究指出，从无柄盘菌一些菌株的发酵液中分离到具有抗菌活性的代谢产物。例如，徐良雄等人在专利(201710154252.3)中公布了无柄盘菌SC1337菌株，该菌株能够产生5个对12种植物常见致病真菌具有明显抑制活性以及对水果具有保鲜效果的化合物。郑瑞等人从蛇足石杉中分离到无柄盘菌JR14菌株，该菌株表现出较强的抑制乙酰胆碱酯酶的活性。王佳莹等人从金钟花茎杆中分离出ZJWCF069菌株，其发酵液所得化合物呈现出与圆弧菌醛酸相似的抑菌活性。上述研究均证明了无柄盘菌的抑菌活性。
许云峰等人从银杏中分离到一株高产纤维素酶的草酸青霉菌，证明了其具有降解木质纤维素的潜力。但是该研究仅仅关注纤维素酶，对参与木质纤维素降解的其他酶类关注较少；该研究也没有提到草酸青霉菌是否具有抑菌活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时具有用于提高植物对病原菌的抵抗能力和提供降解木质纤维素的工程菌的新孢无柄盘菌及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新孢无柄盘菌M51-1，为新孢无柄盘菌Pezicula neosporulosa，保藏号：CGMCC No.18137。
本发明还同时提供了上述新孢无柄盘菌M51-1的用途：用于提高植物对病原菌的抵抗能力和/或提供降解木质纤维素的工程菌。
病原菌包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；木质纤维素包括纤维素、木质素。
本发明的新孢无柄盘菌M51-1的保藏信息如下：保藏名称：新孢无柄盘菌Peziculaneosporulosa，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.18137，2019年06月25日。
本发明的新孢无柄盘菌M51-1同时具有抑菌活性和木质纤维素降解能力，并证明了其能够产生多种酶(纤维素酶，过氧化物酶，及漆酶)，可以用于木质纤维素的降解，将能够拓展无柄盘菌菌株资源的开发与利用。而目前现有的无柄盘菌无此性能。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是抑菌率测定结果。
图2是过氧化物酶的活力测定结果。
图3是纤维素降解酶的活性测定结果。
图4是漆酶活性的测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下文中的灭菌，均指121℃高温高压灭菌25min。
实施例1、菌株M51-1的分离培养
1、分离和培养培养基的配置
MEA(分离)培养基：麦芽糖提取物(malt extract,Oxoid)20g，适量超纯水溶解后，加入琼脂15g，超纯水定容至1L。灭菌后、常温冷却至45℃，加入终浓度为0.05g/L和0.02g/L的硫酸链霉素和盐酸四环素，以抑制细菌污染。
PDA(培养)培养基：马铃薯200g，去皮、切小块，加超纯水煮烂后用四层纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂15g，超纯水定容至1L。灭菌后、常温冷却至45℃，加入终浓度为0.05g/L和0.02g/L的硫酸链霉素和盐酸四环素，以抑制细菌污染。
2、菌株的分离培养
用自来水连续冲洗冷杉根系，洗去根系附着的土壤颗粒及其他杂质。洗净的根系用75％的酒精溶液浸泡2min后，放入1％的次氯酸钠溶液中浸泡5min，随后放入95％的酒精溶液中浸泡30s，最后用无菌水洗涤5次。消毒完成后，用无菌滤纸擦干表面残留水分，取少量根系组织置于MEA培养基中，25℃避光培养7d，若无杂菌长出，则判定为消毒彻底。
随后在超净台中将判定成消毒彻底的样品组织剪成0.5cm长的小段，用镊子夹取至MEA平板培养，每板12个。25℃避光培养7d，待组织块切口两侧长出真菌菌丝时，用接种针小心将其挑出后转接到新鲜PDA培养基上纯化培养并记录菌株编号。
所述纯化培养为：用接种针挑取菌落边缘少许菌丝转移至新鲜PDA培养基，重复上述操作3-4次；从而获得符合菌落颜色、形态均一的菌株进行下述实施例2。
实施例2、菌株M51-1的分子生物学鉴定
1、菌株DNA提取和PCR扩增
挑取纯培养真菌菌丝至1.5ml无菌离心管中，使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)试剂盒对真菌DNA进行提取。以DNA为模板，对内转录间隔区序列(ITS)进行扩增，所用引物为ITS1F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。
扩增体系共25μl：模板DNA，1μl；正反向引物，各0.5μl；Taq酶，0.2μl；dNTP，2μl；Buffer，2.5μl；无菌超纯水，18.3μl。PCR扩增程序包括：94℃预变性，4min；35个循环，包括94℃预变性40s，55℃退火50s，72℃延伸1min；终极延伸10min。
2、序列测定与物种鉴定
扩增测序后，获得ITS序列如下(长度：474bp)：
ACAGAGACTCTGCCCTTTGGGTAGACCTCCCACCCTGTGTCGTTATACCTTCGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGGGCTCCGGCCCTGCCCCTGGCTCCAGCTAGGGCGCGCCCGCCAGAGGACTCCCAAACCTGAATGTTAGTGTCGTCTGAGTACTATATAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTCTTGGGCGTCACCGGTCCCCGGTGTGCCTCAAAATCAGTGGCGGCGCCGTCTGGCTCTAAGCGTAGTACATACTCTCGCTACAGACGCCCGGCGGATGCTGGCCAGCAACCCCCAATCTATCAAGGT
经与NCBI数据库内已有序列比对，确认所得菌株M51-1属于新孢无柄盘菌(Pezicula neosporulosa)。
本发明的新孢无柄盘菌M51-1的保藏信息如下：保藏名称：新孢无柄盘菌Peziculaneosporulosa，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.18137，2019年06月25日。
实施例3、菌株M51-1的抑菌能力(提高植物对病原菌的抵抗能力)
将菌株M51-1(Pezicula neosporulosa)和病原菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)分别接种在PDA平板上，25℃避光培养7d。
处理组：挑取少量且均等的两种菌株菌块(大小约为0.5×0.5cm)于PDA培养基中，分别位于平板的对角线两端且距离边缘1cm处；对照组一端接种尖孢镰刀菌，另一端为琼脂块，黑暗培养10d。利用直尺测定处理组和对照组菌株半径，计算抑菌率。如图1所示，处理组(M51-1)病原菌菌落明显小于对照组(control)，表明M51-1具有较强的抑菌能力。计算后得到，抑菌率为67％，计算公式如下：
抑菌率＝(对照组半径-处理组半径)/对照组半径*100％
实施例4、菌株M51-1的木质纤维素降解能力
过氧化物酶、纤维素酶、漆酶，均能够参与木质纤维素降解。本发明以菌株生产这些酶的能力，表征其降解木质纤维素的能力。
1、过氧化物酶的产生
挑取少量菌块(接种在PDA平板上的菌株M51-1，大小约为0.5×0.5cm)于Azure-B平板中，黑暗培养25d，培养温度为25℃。通过观察菌株M51-1对天青-B蓝色介质的清除，记录过氧化物酶的生成。如图2所示，培养结束后，处理组(M51-1)菌株分泌过氧化物酶后清除了蓝色底物，菌株周围形成较大的透明圈。
Azure-B(天青-B)固体培养基的配方，在1L超纯水中加入以下重量的成分，灭菌后、倒平板(20ml每个平板)备用：
2、纤维素酶的产生
挑取少量菌块(接种在PDA平板上的菌株M51-1，大小约为0.5×0.5cm)于CBM平板中，黑暗培养，培养温度为25℃。当菌落直径达到30mm时(黑暗培养约25d)，用2％w/v(即2g/100ml)的刚果红水淹没平板，并静待15min；倒出染色剂，用蒸馏水清洗琼脂表面；平板铺满1M的NaCl，脱色15min；倒掉脱色液，在成熟的菌落周围会形成CMC-Na降解的黄色透明区；相反地，未降解区域呈现红色。如图3所示，M51-1菌株分泌纤维素降解酶，CMC-Na降解区域呈现明显的黄色透明圈。
CBM固体培养基的配方，在1L超纯水加入以下重量的成分，灭菌后、倒平板(20ml每个平板)备用：
3、漆酶的产生
挑取少量菌块(接种在PDA平板上的菌株M51-1，大小约为0.5×0.5cm)于LBM平板中，25℃黑暗培养25d，培养温度为25℃。进行打孔测定。向孔中加入0.1％w/v丁香醛连氮(0.1g丁香醛连氮加入100ml的95％乙醇中)，30min内出现紫色，表示有漆酶产生，反之则没有。如图4所示，菌株M51-1周围呈现粉紫色，表明有漆酶产生。
LBM固体培养基的配方，在1L超纯水加入以下重量的成分，灭菌后、倒平板(20ml每个平板)备用：
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120> 具抑菌能力和木质纤维素降解活性的新孢无柄盘菌及用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagagactc tgccctttgg gtagacctcc caccctgtgt cgttatacct tcgttgcttt 60
ggcgggccgc ggggctccgg ccctgcccct ggctccagct agggcgcgcc cgccagagga 120
ctcccaaacc tgaatgttag tgtcgtctga gtactatata atagttaaaa ctttcaacaa 180
cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat 240
tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccttg gtattccggg 300
gggcatgcct gttcgagcgt cattacaacc ctcaagctct gcttggtctt gggcgtcacc 360
ggtccccggt gtgcctcaaa atcagtggcg gcgccgtctg gctctaagcg tagtacatac 420
tctcgctaca gacgcccggc ggatgctggc cagcaacccc caatctatca aggt 474

Claims (2)

1.新孢无柄盘菌M51-1，其特征是：为新孢无柄盘菌Pezicula neosporulosa，保藏号：CGMCC No.18137。
2.如权利要求1所述的新孢无柄盘菌M51-1的用途，其特征是：用于提高植物对病原菌的抵抗能力和/或提供降解木质纤维素的工程菌。
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