CN110507644A - 淫羊藿素促进胰岛β细胞增生与降糖的应用 - Google Patents

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王冲
吴志强
林春雨
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Abstract

淫羊藿素促进胰岛β细胞增生与降糖的应用，涉及黄酮类药物。以胰岛β‑细胞特异性表达mCherry的转基因斑马鱼Tg为模型，进行淫羊藿素促β‑细胞增生的活性筛选，并通过指示β‑细胞复制的模型Tg，以及指示β‑细胞分化的模型TgBAC进行进一步分析。打破传统意义上细胞或分子水平的筛选，以斑马鱼为模型，利用斑马鱼进行淫羊藿素的药物处理后，对其进行血糖水平的测定。整个筛选操作简单，方法便捷高效。

Description

淫羊藿素促进胰岛β细胞增生与降糖的应用
技术领域
本发明涉及黄酮类药物，尤其是涉及淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生与降糖中的应用。
背景技术
淫羊藿(Herba Epimedii)系小檗科淫羊藿属(Epimedium)植物，淫羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性，是一种具有广泛药理活性的中药材。淫羊藿素(icaritin)是淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷的苷元，既为淫羊藿苷的体内代谢产物，也均少量存在于淫羊藿药材中，属黄酮醇类化合物。
糖尿病以1型和2型为主，1型糖尿病是自体免疫性疾病，由自体免疫系统破坏产生胰岛素的β-细胞引起的；2型糖尿病主要由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起的。这两种糖尿病的最终发病都会引起胰岛β-细胞数量减少或者功能损伤，从而降低胰岛素的分泌。而寻找促进胰岛β-细胞增生的药物，以期用在糖尿病治疗上一直是科学领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生与降糖中的应用。
所述淫羊藿素的结构式为：
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中应用的方法，包括以下步骤：
1)Tg(-1.2ins:H2BmCherry，即胰岛β细胞带红色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2mL，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2mL的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
在步骤2)中，所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μL的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼自身的胰岛β细胞所带有的红色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中应用的方法，包括以下步骤：
1)Tg(ins:mAG-zGeminin 1/100，即新生的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2mL，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2mL的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
在步骤2)中，所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μL的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼新生的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中应用的方法包括以下步骤：
1)TgBAC(neurod:eGFP，即由前体细胞分化而来的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2mL，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
在步骤2)中，所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼由前体细胞分化而来的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在降糖中应用。
为了克服基于分子靶点和细胞表型分析进行的药物筛选的不足，本发明提供了以斑马鱼为模型进行淫羊藿素降糖功能的探究，所述淫羊藿素在降糖中应用的方法包括以下步骤：
1)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为：光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为27～29℃。
2)斑马鱼上清的获得
利用DGS手持式电动组织研磨器对斑马鱼进行匀浆，待离心机的温度降低至0～4℃时，将匀浆后的组织进行离心，即获得斑马鱼上清；
在步骤2)中，所述离心的速度可为10000～12000rpm/min，离心的时间可为10～15min。
3)斑马鱼血糖含量的测定
利用Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量，具体操作步骤如下：
所需试剂：
1、Amplex Red Reagent：154μg/管，加60μl DMSO溶解
2、5×reaction buffer：按照1︰4的比例稀释成1×reaction buffer使用
3、Horseradish peroxidase(HRP)：10U,加1ml 1×reaction buffer溶解
4、Glucose oxidase(葡萄糖氧化酶)：100U,加1ml 1×reaction buffer溶解
5、D-glucose(葡萄糖标准溶液)：0.1mol/L
按照每100个反应分别需要加50μl Amplex Red Reagent、100μl HRP、100μlGlucose oxidase and 4.75ml 1×reaction buffer配制反应所需mix，在干净的96孔板中依次加入40μl 1×reaction buffer，10μl测定样品，50μl mix；标准曲线按照1×reactionbuffer分别加：50、48、46、44、42、40；0.1mol/L的D-glucose分别加0、2、4、6、8、10。每个孔测定2～3个复孔，放入37℃培养箱孵育30min后，通过酶标仪(激发光：520nm；发射光：580～640nm)测量其荧光值，然后根据标准曲线将荧光值代入计算测定样品的葡萄糖浓度。
本发明以胰岛β-细胞特异性表达mCherry的转基因斑马鱼Tg(-1.2ins:H2BmCherry)为模型，进行淫羊藿素促β-细胞增生的活性筛选，并通过指示β-细胞复制的模型Tg(ins:mAG-zGeminin 1/100)，以及指示β-细胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)进行进一步分析。并打破传统意义上细胞或分子水平的筛选，以斑马鱼为模型，利用斑马鱼进行淫羊藿素的药物处理后，对其进行血糖水平的测定。整个筛选操作简单，方法便捷高效，可为淫羊藿素在糖尿病领域的进一步开发提供理论基础。
本发明以斑马鱼为模型进行淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生以及血糖水平测定方面的应用。促β-细胞增生的活性筛选的方法：(1)以胰岛β-细胞特异性表达mCherry的转基因斑马鱼Tg(-1.2ins:H2BmCherry)为模型，进行淫羊藿素的药物处理，探究淫羊藿素对β细胞增生作用的分析；(2)以指示β-细胞复制的转基因斑马鱼Tg(ins:mAG-zGeminin(1/100)为模型，进行淫羊藿素的药物处理，探究淫羊藿素对β细胞复制作用的分析；(3)以指示β-细胞分化的转基因斑马鱼TgBAC(neurod:eGFP)为模型，进行淫羊藿素的药物处理，探究淫羊藿素对β细胞分化作用的分析；血糖水平的测定方法：(1)以斑马鱼为模型进行淫羊藿素的药物处理；(2)斑马鱼上清的获取；(3)斑马鱼血糖含量的测定。反应过程简单，容易操作。
本发明从淫羊藿素对胰岛β细胞的数量影响入手，并结合其对血糖水平的影响，探究胰岛β细胞的数量变化与血糖水平之间的关系。不同于传统意义上的分子或细胞水平的药物筛选，这种方法能够更加直接、全面地反应出药物对生物体的反应。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
所述淫羊藿素的结构式为：
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中应用的方法，包括以下步骤：
1)Tg(-1.2ins:H2BmCherry，即胰岛β细胞带红色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2mL，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2mL的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μL的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼自身的胰岛β细胞所带有的红色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中应用的方法，包括以下步骤：
1)Tg(ins:mAG-zGeminin 1/100，即新生的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2mL，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2mL的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μL的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼新生的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中应用的方法包括以下步骤：
1)TgBAC(neurod:eGFP，即由前体细胞分化而来的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2mL，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼由前体细胞分化而来的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在降糖中应用。
为了克服基于分子靶点和细胞表型分析进行的药物筛选的不足，本发明提供了以斑马鱼为模型进行淫羊藿素降糖功能的探究，所述淫羊藿素在降糖中应用的方法包括以下步骤：
1)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μL；所述光照培养箱的条件可为：光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为27～29℃。
2)斑马鱼上清的获得
利用DGS手持式电动组织研磨器对斑马鱼进行匀浆，待离心机的温度降低至0～4℃时，将匀浆后的组织进行离心，即获得斑马鱼上清；所述离心的速度可为10000～12000rpm/min，离心的时间可为10～15min。
3)斑马鱼血糖含量的测定
利用Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量，具体操作步骤如下：
所需试剂：
1、Amplex Red Reagent：154μg/管，加60μl DMSO溶解
2、5×reaction buffer：按照1︰4的比例稀释成1×reaction buffer使用
3、Horseradish peroxidase(HRP)：10U,加1ml 1×reaction buffer溶解
4、Glucose oxidase(葡萄糖氧化酶)：100U,加1ml 1×reaction buffer溶解
5、D-glucose(葡萄糖标准溶液)：0.1mol/L
按照每100个反应分别需要加50μl Amplex Red Reagent、100μl HRP、100μlGlucose oxidase and 4.75ml 1×reaction buffer配制反应所需mix，在干净的96孔板中依次加入40μl 1×reaction buffer，10μl测定样品，50μl mix；标准曲线按照1×reactionbuffer分别加：50、48、46、44、42、40；0.1mol/L的D-glucose分别加0、2、4、6、8、10。每个孔测定2～3个复孔，放入37℃培养箱孵育30min后，通过酶标仪(激发光：520nm；发射光：580～640nm)测量其荧光值，然后根据标准曲线将荧光值代入计算测定样品的葡萄糖浓度。
以下给出具体实施例。
实施例1：淫羊藿素促进胰岛β细胞的增生
在洁净的24孔板中，依次加入：2mL的Tg(-1.2ins:H2BmCherry)斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μL的淫羊藿素溶液(浓度为10Mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，利用PFA固定过夜，并利用荧光显微镜进行计数。而且在实验的过程中，应设置DMSO药物处理的空白对照，以此促进胰岛β细胞增生与否的标准。
实验数据：经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其胰岛β细胞为42.50±4.365，这与对照组中的数值32.83±2.868相比，可知：淫羊藿素促进胰岛β细胞的增生。
实施例2：淫羊藿素促进胰岛β细胞的复制
在洁净的24孔板中，依次加入：2mL的Tg(ins:mAG-zGeminin(1/100)斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μL的淫羊藿素溶液(浓度为10Mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，利用PFA固定过夜，并利用荧光显微镜进行计数。而且在实验的过程中，应设置DMSO药物处理的空白对照，以此促进胰岛β细胞复制与否的标准。
实验数据：经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其胰岛β细胞为2.333±0.5578,这与对照组中的数值1.950±0.02887相比，可知：淫羊藿素促进胰岛β细胞的复制。
实施例3：淫羊藿素促进胰岛β细胞的分化
在洁净的24孔板中，依次加入：2mL的TgBAC(neurod:eGFP)斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μL的淫羊藿素溶液(浓度为10Mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，利用PFA固定过夜，并利用荧光显微镜进行计数。而且在实验的过程中，应设置DMSO药物处理的空白对照，以此作为促进胰岛β细胞分化与否的标准。
实验数据：经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其胰岛β细胞为2.333±0.3333,这与对照组中的数值3.000±0.5774相比，可知：淫羊藿素不能促进胰岛β细胞的分化。
实施例4：淫羊藿素的降糖功效
在洁净的24孔板中，依次加入：2mL的斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μL的淫羊藿素溶液(浓度为10Mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，提取斑马鱼上清溶液。最后利用Amplex Red试剂盒测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量。而且在实验的过程中，应设置DMSO药物处理的空白对照，以此作为后续血糖水平降低与否的标准。
实验数据：每条经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其血糖值为171.6±6.978pmol，这与对照组中的葡萄糖值288.1±22.58pmol相比，*P<0.05。
本发明以斑马鱼为模型，进行斑马鱼胰岛β细胞数量的测定。即利用转基因斑马鱼进行淫羊藿素的药物处理后，探究淫羊藿素对胰岛β细胞的增生、复制以及分化作用的影响，并探究其对血糖水平的影响。

Claims (10)

1.淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于所述淫羊藿素的结构式为：
3.如权利要求1所述应用，其特征在于所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中应用的方法包括以下步骤：
1)Tg斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼自身的胰岛β细胞所带有的红色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于在步骤1)中，所述在24孔板中依次加入为斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为28.5℃；
在步骤2)中，所述固定的温度为4℃，固定的时间为8h；
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
5.淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中应用的方法包括以下步骤：
1)Tg斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为28.5℃；
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度为4℃，固定的时间为8h；
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼新生的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计；为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
7.淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中应用的方法包括以下步骤：
1)TgBAC斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃；
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度为4℃，固定的时间为8h；
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼由前体细胞分化而来的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计；为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
9.淫羊藿素在降糖中应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述淫羊藿素在降糖中应用的方法包括以下步骤：
1)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/L的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为：光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为27～29℃；
2)斑马鱼上清的获得
利用DGS手持式电动组织研磨器对斑马鱼进行匀浆，待离心机的温度降低至0～4℃时，将匀浆后的组织进行离心，即获得斑马鱼上清；所述离心的速度为10000～12000rpm/min，离心的时间为10～15min；
3)斑马鱼血糖含量的测定
利用Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量，具体操作步骤如下：
所需试剂：
1、Amplex Red Reagent：154μg/管，加60μl DMSO溶解；
2、5×reaction buffer：按照1︰4的比例稀释成1×reaction buffer使用；
3、Horseradish peroxidase：10U,加1ml 1×reaction buffer溶解；
4、Glucose oxidase：100U,加1ml 1×reaction buffer溶解；
5、D-glucose：0.1mol/L；
按照每100个反应分别需要加50μl Amplex Red Reagent、100μl HRP、100μl Glucoseoxidase and 4.75ml 1×reaction buffer配制反应所需mix，在干净的96孔板中依次加入40μl 1×reaction buffer，10μl测定样品，50μl mix；标准曲线按照1×reaction buffer分别加：50、48、46、44、42、40；0.1mol/L的D-glucose分别加0、2、4、6、8、10；每个孔测定2～3个复孔，放入37℃培养箱孵育30min后，通过酶标仪测量其荧光值，然后根据标准曲线将荧光值代入计算测定样品的葡萄糖浓度。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103271903A (zh) * 2013-05-21 2013-09-04 赵全成 淫羊藿素、环淫羊藿素及组合物的医药新用途
CN103446099A (zh) * 2013-08-19 2013-12-18 中国科学院深圳先进技术研究院 淫羊藿素在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103271903A (zh) * 2013-05-21 2013-09-04 赵全成 淫羊藿素、环淫羊藿素及组合物的医药新用途
CN103446099A (zh) * 2013-08-19 2013-12-18 中国科学院深圳先进技术研究院 淫羊藿素在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王冲等: "促胰岛β细胞增生的黄酮类化合物的活体筛选", 《药学研究》 *

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