CN103446099A - 淫羊藿素在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了淫羊藿素在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。本发明通过蛋白检测和免疫荧光测试在3T3-L1细胞中考察淫羊藿素对GSK-3及其下游蛋白β-catenin的影响，首次发现淫羊藿素能够通过血脑屏障，通过抑制GSK-3的活性，促进β-catenin转核，降低Tau蛋白磷酸化，保护神经元细胞的活力并抑制神经元纤维缠结，从而发挥防治阿尔茨海默病的作用。淫羊藿素作为一种来源于天然产物的新型的GSK-3抑制剂，具有良好的市场应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于中药领域，涉及中药有效成分淫羊藿素的新的药用用途，特别涉及淫羊藿素在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。
【背景技术】
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种神经系统退行性疾病，在临床上主要表现为渐进性的认知功能障碍。AD患者特征性的神经病理变化主要广泛存在于神经细胞外的老年斑（senile plaques,SPs）和细胞内的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs），同时还伴随神经元的凋亡和神经突触的退化等。SPs主要由β淀粉样蛋白（amyloid beta,Aβ）沉积而成，NFTs主要由异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau形成的双股螺旋细丝（paried helical filaments,PHFs）构成。在AD患者脑中，糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3,GSK-3）活性上调，在AD神经退行性变起重要作用：GSK-3活性升高与tau蛋白异常磷酸化修饰和Aβ异常聚集直接相关，并且在神经元中Wnt信号通路激活诱导的GSK-3对β-链蛋白（β-catenin）的磷酸化修饰和降解减弱，可保护神经元细胞免于凋亡。综上，GSK-3可能是治疗AD的新靶标，GSK-3抑制剂将成为治疗AD的候选药物。
目前，专利200680027524.3公开了脲衍生物作为“GSK-3抑制剂”在治疗和/或预防涉及GSK-3的疾病如AD中的用途；专利申请201080019654.9公开了“作为GSK-3抑制剂的7-环烷基氨基奎诺酮”在预防、改善或治疗GSK-3抑制剂介导的AD中的应用。
淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿和柔毛淫羊藿等的干燥地上部分，属于中药中补肾壮阳类药物，一般用于肾虚阳痿、遗精早泄、腰膝痿软、肢冷畏寒；祛风除湿，用于寒湿痹痛或四肢拘挛麻木。
淫羊藿素（icaritin）属于黄酮醇类化合物，少量存在于淫羊藿药材中。迄今，尚未有关于淫羊藿素防治阿尔茨海默病方面的用途的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供淫羊藿素在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
所述淫羊藿素（可市购）属于黄酮醇类化合物，如下式所示的淫羊藿素作为GSK-3抑制剂在制备用于治疗和/或预防GSK-3介导的疾病或疾病状态的药物中的用途，
所述疾病或疾病状态包括慢性神经变性疾病状态。
所述慢性神经变性疾病状态为糖尿病、阿尔茨海默病、心肌缺血、中风、双向情感障碍、肿瘤或炎症。
优选的，所述慢性神经变性疾病状态为阿尔茨海默病。
所述药物包括淫羊藿素和药物可接受的载体或赋形剂。
所述药物以口服剂、透皮吸收剂或注射剂的形式存在。
所述口服剂包括胶囊剂、片剂和囊泡剂。
本发明通过蛋白检测和免疫荧光测试在3T3-L1细胞中考察淫羊藿素对GSK-3及其下游蛋白β-catenin的影响。结果发现，淫羊藿素与LiCl的作用相当，能够促进GSK-3在Ser-9位点的磷酸化，抑制其活性；并促进β-catenin的蛋白总量；免疫荧光染色结果表明，淫羊藿素可促进β-catenin转核。
淫羊藿素的作用机理：淫羊藿素能够通过血脑屏障，通过抑制GSK-3（糖原合成酶激酶-3）的活性，促进β-catenin转核，降低Tau蛋白磷酸化，保护神经元细胞的活力并抑制神经元纤维缠结，从而发挥防治阿尔茨海默病的作用。
所述的淫羊藿素可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗阿尔茨海默病的药物组合物。
本发明相对于现有技术的优点和有益效果：本发明通过蛋白检测和免疫荧光测试在3T3-L1细胞中考察淫羊藿素对GSK-3及其下游蛋白β-catenin的影响，首次发现淫羊藿素能够通过血脑屏障，通过抑制GSK-3（糖原合成酶激酶-3）的活性，促进β-catenin转核，降低Tau蛋白磷酸化，保护神经元细胞的活力并抑制神经元纤维缠结，从而发挥防治阿尔茨海默病的作用。淫羊藿素作为一种来源于天然产物的新型的GSK-3抑制剂，具有良好的市场应用前景。
【附图说明】
图1是淫羊藿素对phospho GSK-3β（ser9）和GSK-3β蛋白表达的影响结果图；
图2是淫羊藿素对蛋白（β-catenin）表达的影响的结果图；
图3是淫羊藿素对β-catenin蛋白入核的影响的结果图；
图4是实施例4的脂质体的库尔特激光衍射粒度结果图；
图5是实施例4的淫羊藿素脂质体的扫描电子显微镜图。
【具体实施方式】
实施例1
通过蛋白检测和棉衣荧光测试在3T3-L1细胞中考察淫羊藿素对GSK-3及其下游蛋白β-catenin的影响。其方法如下：
蛋白检测：3T3-L1细胞购自美国菌种保藏中心（ATCC：CL-173），采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃和5%CO2条件下进行培养。细胞接种融合后，加入淫羊藿素（购自南京泽朗医药科技有限公司，CAS NO:38226-86-7）、氯化锂（LiCl）和对应的溶剂（control）培养15min后，提取蛋白，具体地，在冷的裂解液（50mM Tris、pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1%TritonX-100、0.1%SDS，再加入蛋白酶抑制剂的混合液）中进行超声裂解2分钟，之后进行蛋白检测。
免疫荧光测试：细胞接种融合后，换为成脂诱导培养基（10%胎牛血清的DMEM培养基中加入0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、2μg/ml胰岛素和200μM吲哚美辛），同时加入淫羊藿素或对应溶剂（ctl+），不做诱导的组别为ctl-。2天后，用4%福尔马林固定细胞，0.25%triton X-100/PBS进行透膜。用β-catenin（Abgent,USA）1:50抗体在4℃孵育过夜，加入二抗在室温避光孵育1小时，加入0.1ug/ml DAPI染料孵育1小时，再在莱卡激光共聚焦显微镜进行观察拍照。
淫羊藿素与LiCl的作用相当，能够促进GSK-3在Ser-9位点的磷酸化（图1），抑制其活性；并促进β-catenin的蛋白总量（图2）；免疫荧光染色结果表明，淫羊藿素可促进β-catenin转核（图3）。
可以看到，淫羊藿素在3T3-L1细胞中抑制GSK-3（糖原合成酶激酶-3）活性，促进β-catenin（β-链蛋白）转核，从而提示淫羊藿素有治疗阿尔茨海默病发的作用。
淫羊藿素的相关作用机理：淫羊藿素能够通过血脑屏障，通过抑制GSK-3的活性，促进β-catenin转核，降低Tau蛋白磷酸化，保护神经元细胞的活力并抑制神经元纤维缠结，从而发挥防治阿尔茨海默病的作用。
实施例2
分别取淫羊藿素3g、药用淀粉75g和微晶纤维素20g，将药用淀粉过60目筛，再与淫羊藿素和微晶纤维素混合均匀，过60目筛，装入1号胶囊壳，制成1000粒胶囊；每粒胶囊含3mg淫羊藿素。口服，每日3次，每次1粒。
根据中国药典空心胶囊的检测标准，检测制备得到的胶囊的外观、水分、微生物检查、崩解时间、偏重差异、含量、有关物质均符合要求。
实施例3
分别取淫羊藿素300g、羟丙甲纤维素600g、羟甲淀粉钠1kg、微晶纤维素800g、乳糖11.5kg和硬脂酸镁100g，混合均匀后，在制粒机中喷雾加入10%淀粉浆，整粒，于50-60℃干燥5小时，20目筛整粒，压片，理论片重为143mg,制成100000片，每片含3mg淫羊藿素。口服，每日3次，每次1粒。
根据中国药典片剂的检测标准，检测制备得到的片剂的外观、水分、微生物检查、溶出度、偏重差异、含量、有关物质均符合要求。
实施例4
取圆底烧瓶，将21umol淫羊藿素和360umol脂质（由DOPC、Cholesterol、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000按照摩尔比75：18：3：4组成）溶解于6ml的甲醇-氯仿混合液（1：1，V/V）中；调节温度为55℃，利用旋转真空干燥机，将圆底烧瓶中的有机溶剂挥发，得到脂质薄膜；然后将脂质薄膜置于真空干燥箱（真空度：-0.02MPa；温度40℃）内干燥过夜，把干燥完全的脂质薄膜浸于10ml PBS（10mM,pH7.4）中水化，得到脂质体悬浮液。以氮气加压，将得到的脂质体悬浮液用Lipex TM Extruder挤压，使脂质体悬浮液依次通过孔径为200nm和80nm的聚碳酸酯滤膜，连续挤压六次，得到包覆了淫羊藿素的单层囊泡，加入适量的甘露醇作为冻干保护剂，并进行冻干后灭菌包装。用于静脉注射，临用时以5%葡萄糖注射液进行稀释，每周1次，每次20mg。
以库尔特激光衍射粒度仪测定所得脂质体的粒径，得到该脂质体的平均粒径为120nm，结果如图4所示；以扫描电子显微镜测定脂质体，结果如图5所示，从图5可以看到，所得淫羊藿素脂质体为单层囊泡。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.如下式所示的淫羊藿素作为GSK-3抑制剂在制备用于治疗和/或预防GSK-3介导的疾病或疾病状态的药物中的用途，
所述疾病或疾病状态包括慢性神经变性疾病状态。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述慢性神经变性疾病状态为糖尿病、阿尔茨海默病、心肌缺血、中风、双向情感障碍、肿瘤或炎症。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述慢性神经变性疾病状态为阿尔茨海默病。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包括淫羊藿素和药物可接受的载体或赋形剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物以口服剂、透皮吸收剂或注射剂的形式存在。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述口服剂包括胶囊剂、片剂和囊泡剂。
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