CN110499289A - 一种白膜层滤器中pbmc的提取方法 - Google Patents

一种白膜层滤器中pbmc的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，该方法主要通过多次冲洗白膜层滤器，从冲洗液中分离提取白细胞，实现了回收利用医疗废品中被丢弃的白细胞，建立了从一次性白细胞滤器中有效回收白细胞的方法，能够满足基础科研甚至临床研究的需求，为疾病治疗的免疫学相关研究提供重要的研究材料。

Description

一种白膜层滤器中PBMC的提取方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种白膜层滤器中PBMC的提取方法。
背景技术
白细胞是血液的主要成分之一，主要分类包括：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。各类白细胞在免疫系统中分别发挥着各自功能。但是，白细胞若在输血过程中进入患者体内可能会导致输血反应，因此白细胞对于临床使用的血液制品是一种废品。医疗机构采集的临床献血，以及血站采集获得的无偿献血，在进入临床回输应用前，均需要进行血液成分分离，通过分离去除血液中的白细胞。目前常用的血液成分分离方法主要有过滤法和分离机分离法。其中过滤法主要是利用一次性去白细胞滤器过滤去除白细胞。而这些被过滤的白细胞则和滤器一起成为医疗废品被丢弃，造成医疗资源的浪费。目前针对许多疾病的研究中，以白细胞作为靶向或者治疗手段的研究越来越多。例如人们已经开发了多种能够为癌症患者提供临床益处的过继性T细胞治疗方法，还有多种通过TCR、CAR等特异性修饰的T细胞改造技术、同种异体T细胞改造回输技术，这些技术正越来越多地获得药监局和卫健委的审批。所以针对白细胞资源的科研需要，在是许多医疗企业在产品研发中的迫切需求。
被丢弃的白细胞暂无有效的利用方式和途径，仅有个别文献提出以PBS缓冲液冲洗滤器的方式获取少量白细胞。
本专利旨在回收利用医疗废品中被丢弃的白细胞，建立从一次性白细胞滤器中有效回收白细胞的方法，满足基础科研甚至临床研究的需求，为疾病治疗的免疫学相关研究提供重要的研究材料。
发明内容
一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，其提取方法包括：
(1)用75％的乙醇擦拭去白细胞滤器及两侧管道外壁，反复擦拭2-3次；
(2)以无菌止血钳夹住滤器两侧管道，以无菌手术剪迅速剪断软管，在滤器的血液分离出口侧，安装50ml无菌无针注射器；
(3)将200ml-300ml冲洗液注入滤器，收集流出的冲洗液，冲洗过程中，应水平放置滤器，沿血液分离出口侧缓慢注射洗液，逆向冲洗，在血液分离方向入口处收集冲洗液；
(4)最后以50ml空气注入，排出滤器中剩余液体，合并收集的冲洗液；
(5)以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，或以溶血素溶解红细胞获取白细胞；
(6)根据目标细胞的用途，当有无菌要求时，应在百级生物安全环境中执行操作，提取的白细胞保存使用即可。
优选的，所述步骤(3)中冲洗液的成分如下：生理盐水、胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2、白介素-15和维生素E。
优选的，所述冲洗液各成分的配比(以体积计量)为：85％生理盐水、3％胰岛素、2％转铁蛋白、1.5％硒、2.5％人血白蛋白、1.5％白介素-2、2％白介素-15和2.5％维生素E。
优选的，所述步骤(5)中以溶血素溶解红细胞获取白细胞的具体步骤为：冲洗液以2000rpm(9,9)离心，弃上清液，离心后的细胞沉淀中加入沉淀物体积10％的溶血素，充分混匀后静置20min，1800rpm(9,9)离心10min收集白细胞，以无菌生理盐水重悬细胞沉淀后，再次离心，即获得目标细胞。
优选的，所述步骤(5)中以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，具体步骤为：在冲洗液加入20u/ml抗凝；在15ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，再加入冲洗液，Ficoll分离液：冲洗液体积比1:1；室温2000rpm离心20分钟；取出离心管，取上层液重悬于5倍体积的PBS中，混匀室温1500rpm离心5分钟；吸弃上清，再加4mlPBS，混匀；室温1000rpm离心5分钟；弃上清，即获得目标细胞。
优选的，所述步骤(6)白细胞保存方法为：将白细胞置于冻存液中放液氮罐保存。
优选的，所述冻存液配方为：DMSO(甘油)与血清按照体积比1：9配制。
有益效果：本发明提供了一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，该方法主要通过多次冲洗白膜层滤器，从冲洗液中分离提取白细胞，实现了回收利用医疗废品中被丢弃的白细胞，建立了从一次性白细胞滤器中有效回收白细胞的方法，能够满足基础科研甚至临床研究的需求，为疾病治疗的免疫学相关研究提供重要的研究材料，所述步骤(3)中冲洗液的成分如下：生理盐水、胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2、白介素-15和维生素E，所述冲洗液各成分的配比(以体积计量)为：85％生理盐水、3％胰岛素、2％转铁蛋白、1.5％硒、2.5％人血白蛋白、1.5％白介素-2、2％白介素-15和2.5％维生素E，该冲洗液能够在冲洗出需求物的同时，有效防止细胞被破坏，所述步骤(5)中以溶血素溶解红细胞获取白细胞的具体步骤为：冲洗液以2000rpm(9,9)离心，弃上清液，离心后的细胞沉淀中加入沉淀物体积10％的溶血素，充分混匀后静置20min，1800rpm(9,9)离心10min收集白细胞，以无菌生理盐水重悬细胞沉淀后，再次离心，即获得目标细胞，所述步骤(5)中以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，具体步骤为：在冲洗液加入20u/ml抗凝；在15ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，再加入冲洗液，Ficoll分离液：冲洗液体积比1:1；室温2000rpm离心20分钟；取出离心管，取上层液重悬于5倍体积的PBS中，混匀室温1500rpm离心5分钟；吸弃上清，再加4mlPBS，混匀；室温1000rpm离心5分钟；弃上清，即获得目标细胞，这两种方式均能够快速高效的分离获取白细胞，所述步骤(6)白细胞保存方法为：将白细胞置于冻存液中放液氮罐保存，所述冻存液配方为：DMSO(甘油)与血清按照体积比1：9配制，该方法能够上时间的保存包细胞。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1：
一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，其提取方法包括：
(1)用75％的乙醇擦拭去白细胞滤器及两侧管道外壁，反复擦拭2次；
(2)以无菌止血钳夹住滤器两侧管道，以无菌手术剪迅速剪断软管，在滤器的血液分离出口侧，安装50ml无菌无针注射器；
(3)将200mll冲洗液注入滤器，收集流出的冲洗液，冲洗过程中，应水平放置滤器，沿血液分离出口侧缓慢注射洗液，逆向冲洗，在血液分离方向入口处收集冲洗液；
(4)最后以50ml空气注入，排出滤器中剩余液体，合并收集的冲洗液；
(5)以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，具体步骤为：在冲洗液加入20u/ml抗凝；在15ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，再加入冲洗液，Ficoll分离液：冲洗液体积比1:1；室温2000rpm离心20分钟；取出离心管，取上层液重悬于5倍体积的PBS中，混匀室温1500rpm离心5分钟；吸弃上清，再加4mlPBS，混匀；室温1000rpm离心5分钟；弃上清，即获得目标细胞；
(6)根据目标细胞的用途，当有无菌要求时，应在百级生物安全环境中执行操作，提取的白细胞保存使用即可。
实施例2：
一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，其提取方法包括：
(1)用75％的乙醇擦拭去白细胞滤器及两侧管道外壁，反复擦拭3次；
(2)以无菌止血钳夹住滤器两侧管道，以无菌手术剪迅速剪断软管，在滤器的血液分离出口侧，安装50ml无菌无针注射器；
(3)将300ml冲洗液注入滤器，收集流出的冲洗液，冲洗过程中，应水平放置滤器，沿血液分离出口侧缓慢注射洗液，逆向冲洗，在血液分离方向入口处收集冲洗液，冲洗液各成分的配比(以体积计量)为：85％生理盐水、3％胰岛素、2％转铁蛋白、1.5％硒、2.5％人血白蛋白、1.5％白介素-2、2％白介素-15和2.5％维生素E；
(4)最后以50ml空气注入，排出滤器中剩余液体，合并收集的冲洗液；
(5)以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，具体步骤为：在冲洗液加入20u/ml抗凝；在15ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，再加入冲洗液，Ficoll分离液：冲洗液体积比1:1；室温2000rpm离心20分钟；取出离心管，取上层液重悬于5倍体积的PBS中，混匀室温1500rpm离心5分钟；吸弃上清，再加4mlPBS，混匀；室温1000rpm离心5分钟；弃上清，即获得目标细胞；
(6)根据目标细胞的用途，当有无菌要求时，应在百级生物安全环境中执行操作，提取的白细胞保存使用即可，白细胞保存方法为：将白细胞置于冻存液中放液氮罐保存，冻存液配方为：DMSO(甘油)与血清按照体积比1：9配制。
实施例3：
一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，其提取方法包括：
(1)用75％的乙醇擦拭去白细胞滤器及两侧管道外壁，反复擦拭2次；
(2)以无菌止血钳夹住滤器两侧管道，以无菌手术剪迅速剪断软管，在滤器的血液分离出口侧，安装50ml无菌无针注射器；
(3)将250ml冲洗液注入滤器，收集流出的冲洗液，冲洗过程中，应水平放置滤器，沿血液分离出口侧缓慢注射洗液，逆向冲洗，在血液分离方向入口处收集冲洗液，冲洗液各成分的配比(以体积计量)为：85％生理盐水、3％胰岛素、2％转铁蛋白、1.5％硒、2.5％人血白蛋白、1.5％白介素-2、2％白介素-15和2.5％维生素E；
(4)最后以50ml空气注入，排出滤器中剩余液体，合并收集的冲洗液；
(5)以溶血素溶解红细胞获取白细胞，具体步骤为：冲洗液以2000rpm(9,9)离心，弃上清液，离心后的细胞沉淀中加入沉淀物体积10％的溶血素，充分混匀后静置20min，1800rpm(9,9)离心10min收集白细胞，以无菌生理盐水重悬细胞沉淀后，再次离心，即获得目标细胞；
(6)根据目标细胞的用途，当有无菌要求时，应在百级生物安全环境中执行操作，提取的白细胞保存使用即可，白细胞保存方法为：将白细胞置于冻存液中放液氮罐保存，冻存液配方为：DMSO(甘油)与血清按照体积比1：9配制。
对各实施例进行分析，并与现有技术进行对照，得出如下数据：
白细胞回收率 细胞失活率
实施例1 62％ 9.2％
实施例2 72％ 3.7％
实施例3 68％ 7.4％
现有技术指标 43％ 15.5％
根据上述表格数据可以得出，当实施实施例2参数时，本发明一种白膜层滤器中PBMC的提取方法的工艺参数为白细胞回收率为72％，细胞失活率为3.7％，而现有技术标准为白细胞回收率为43％，细胞失活率为15.5％，因此本发明一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，白细胞回收率更高，回收过程中细胞受损失活的几率更低，因此本发明具备显著的优越性。
本发明提供了一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，该方法主要通过多次冲洗白膜层滤器，从冲洗液中分离提取白细胞，实现了回收利用医疗废品中被丢弃的白细胞，建立了从一次性白细胞滤器中有效回收白细胞的方法，能够满足基础科研甚至临床研究的需求，为疾病治疗的免疫学相关研究提供重要的研究材料，所述步骤(3)中冲洗液的成分如下：生理盐水、胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2、白介素-15和维生素E，所述冲洗液各成分的配比(以体积计量)为：85％生理盐水、3％胰岛素、2％转铁蛋白、1.5％硒、2.5％人血白蛋白、1.5％白介素-2、2％白介素-15和2.5％维生素E，该冲洗液能够在冲洗出需求物的同时，有效防止细胞被破坏，所述步骤(5)中以溶血素溶解红细胞获取白细胞的具体步骤为：冲洗液以2000rpm(9,9)离心，弃上清液，离心后的细胞沉淀中加入沉淀物体积10％的溶血素，充分混匀后静置20min，1800rpm(9,9)离心10min收集白细胞，以无菌生理盐水重悬细胞沉淀后，再次离心，即获得目标细胞，所述步骤(5)中以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，具体步骤为：在冲洗液加入20u/ml抗凝；在15ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，再加入冲洗液，Ficoll分离液：冲洗液体积比1:1；室温2000rpm离心20分钟；取出离心管，取上层液重悬于5倍体积的PBS中，混匀室温1500rpm离心5分钟；吸弃上清，再加4mlPBS，混匀；室温1000rpm离心5分钟；弃上清，即获得目标细胞，这两种方式均能够快速高效的分离获取白细胞，所述步骤(6)白细胞保存方法为：将白细胞置于冻存液中放液氮罐保存，所述冻存液配方为：DMSO(甘油)与血清按照体积比1：9配制，该方法能够上时间的保存包细胞。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：
(1)用75％的乙醇擦拭去白细胞滤器及两侧管道外壁，反复擦拭2-3次；
(2)以无菌止血钳夹住滤器两侧管道，以无菌手术剪迅速剪断软管，在滤器的血液分离出口侧，安装50ml无菌无针注射器；
(3)将200ml-300ml冲洗液注入滤器，收集流出的冲洗液，冲洗过程中，应水平放置滤器，沿血液分离出口侧缓慢注射洗液，逆向冲洗，在血液分离方向入口处收集冲洗液；
(4)最后以50ml空气注入，排出滤器中剩余液体，合并收集的冲洗液；
(5)以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，或以溶血素溶解红细胞获取白细胞；
(6)根据目标细胞的用途，当有无菌要求时，应在百级生物安全环境中执行操作，提取的白细胞保存使用即可。
2.根据权利要求1所述的白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中冲洗液的成分如下：生理盐水、胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2、白介素-15和维生素E。
3.根据权利要求2所述的白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述冲洗液各成分的配比(以体积计量)为：85％生理盐水、3％胰岛素、2％转铁蛋白、1.5％硒、2.5％人血白蛋白、1.5％白介素-2、2％白介素-15和2.5％维生素E。
4.根据权利要求1所述的白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中以溶血素溶解红细胞获取白细胞的具体步骤为：冲洗液以2000rpm(9,9)离心，弃上清液，离心后的细胞沉淀中加入沉淀物体积10％的溶血素，充分混匀后静置20min，1800rpm(9,9)离心10min收集白细胞，以无菌生理盐水重悬细胞沉淀后，再次离心，即获得目标细胞。
5.根据权利要求1所述的白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中以人体淋巴细胞分离液常规分离获取白细胞，具体步骤为：在冲洗液加入20u/ml抗凝；在15ml塑料离心管中预先加入淋巴细胞分离液，再加入冲洗液，Ficoll分离液：冲洗液体积比1:1；室温2000rpm离心20分钟；取出离心管，取上层液重悬于5倍体积的PBS中，混匀室温1500rpm离心5分钟；吸弃上清，再加4mlPBS，混匀；室温1000rpm离心5分钟；弃上清，即获得目标细胞。
6.根据权利要求1所述的白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述步骤(6)白细胞保存方法为：将白细胞置于冻存液中放液氮罐保存。
7.根据权利要求6所述的白膜层滤器中PBMC的提取方法，其特征在于，所述冻存液配方为：DMSO(甘油)与血清按照体积比1：9配制。
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