CN110496102A

CN110496102A - 新型的ha-sp偶联物及其应用

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Publication number: CN110496102A
Application number: CN201910688376.9A
Authority: CN
Inventors: 吕慧侠; 张振海; 易拉格布
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: CN110496102B

Abstract

本发明涉及纳米递送技术领域，具体涉及一种新型的HA‑SP偶联物，其特征在于按如下方法制备获得：将HA溶于PBS中，加入EDC和NHS搅拌，将多巴胺添加到上述溶液中，将二乙胺溶解在PBS中并逐滴加入，并将pH调整为4，在氮气保护反应48h，透析，冷冻干燥得到产物HA‑DN‑EA；SP溶于MC中冰浴中搅拌。滴加TEA于溶液中，在氮气保护反应24h，室温下置于暗处，进行分离，获得闭环的SP；HA‑DN‑EA与SP混合在DMSO中，室温下在黑暗中反应48h，反应完成后，透析，冻干得到HA‑SP偶联物。本发明通过纳米效应穿透皮肤停留于真皮层，使得药物在皮肤中滞留，持续释放。

Description

新型的HA-SP偶联物及其应用

技术领域

本发明涉及纳米递送技术领域，具体来说涉及是螺吡喃(SP)与透明质酸(HA)的偶联反应形成新型材料，并以其作为纳米胶束包裹药物或化妆品。

背景技术

白癜风是一种获得性脱色障碍，表现为皮肤上的白色斑点，可引起明显的心理压力。白癜风是由皮肤中黑色素细胞受到压力触发而产生的。从晒伤到机械创伤再到化学暴露，这些触发因素最终都会引起黑色素细胞的自身免疫反应，从而导致皮肤中的黑色素逐渐丧失。目前，白癜风治疗一般使用体外治疗模式。光疗结合局部治疗是首选的也是目前临床常用的治疗方法。全身光疗治疗白癜风主要用于两种情况:广泛性疾病(占体表面积的5-10％)和快速传播性疾病。然而，在某些特殊情况下，占比面积较小，传播性较差的患者也可能需要光治疗，因为光治疗的效果更好。紫外线B(UVB)除了具有免疫抑制作用外，还能诱导黑色素细胞分化和产生黑色素。在过去的十年中，因为它优于UVA的光治疗，而且其副作用相对罕见，所以目前UVB是白癜风的一线治疗方法。

8-甲氧补骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)是一种自然发生的光反应性物质，在紫外光照射下，他可以与核酸中的嘧啶基形成共价加合物，暴露于皮肤组织后可以诱导黑色素生成。8-MOP在许多皮肤疾病中都有作用，如银屑病、湿疹、白癜风和一些皮肤淋巴瘤。8-MOP 可以和PUVA(320-400nm波长)联合应用，用于局部或系统治疗上述这些皮肤疾病。但是 8-MOP具有口服后副作用高、角质层渗透性低、皮肤滞留性差等问题。

药物递送材料可以实现特定的功能，如增强溶解性和靶向性。这些材料还可以解决药物的降解快、渗透性差、大剂量和毒副作用等问题。一些具有“应激”能力的聚合物被称为“智能材料”，可以解决个性化治疗问题。应激反应纳米载体可以通过对环境pH值的反应来改善药物性能和温度，或通过外部刺激，如超声波等，改变药物的释放。光致变色材料一直是研究的焦点。色团作为一种光响应分子，在紫外线(UV)或近红外(NIR)照射下会发生一定的结构变化，从而破坏纳米结构，在特定的位置和时间释放装载的药物。

螺吡喃(spiropyran，SP)是一类被广泛研究和应用的有机光致变色化合物。SP的首次发现是在1921年左右，该分子包括由螺旋结垂直连接在一起的吲哚啉和色素体结构，当紫外光照射时，SP杂化的C-O键通过开环反应而裂解。与其他光致变色分子相比，SP是一种可降解的光致变色化合物，在紫外(365nm)和可见光(650nm)下，它可以在疏水性、无色、闭环的SP型和水溶性、有色、开环的MC型两者之间可逆地相互转化。

螺吡喃-花青素在紫外/可见光照射下互相转化

异构化过程伴随着极性的非常大的变化，表现为亲水性-疏水性的变化，在紫外光照射下，螺旋键光裂解生成一个开放的花色素苷结构，该结构在可见光区吸收，在可见光照射下或热作用下进行逆反应。众所周知，高能量的紫外光可能导致对生物组织造成光损伤。但是 SP使用的是360nm的长波紫外线，对活细胞是安全的，这也是SP的优势之一。同时SP分子很容易共价或非共价结合到各种分子上，这使得SP分子可以很容易地进行修饰，从而可以形成许多药物传递系统。

透明质酸(HA)是一种天然的可生物降解聚合物，在医学上有多种应用，包括组织工程、皮肤填料和骨关节炎治疗的粘剂补充。HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖胺组成的重复双糖单元，由B(1-4)和B(1-3)糖带连接而成。HA在细胞外基质ECM中与细胞配体和其他生物复合物结合，大多数参与细胞信号转导。HA结构中含有丰富的羧酸COOH和羟基OH等官能团，可用于进一步的化学修饰。透明质酸在胶束制备中有着广泛的应用，但在光致敏纳米材料中，色团的分布并不广泛，故应用不多。

本发明经过对HA进行改造，合成一种新材料HA-SP，HA-SP可以对如用于白癜风治疗药物8-MOP的包载，形成的的聚合物胶束8-MOP/HA-SP，涂抹于皮肤后，由于其纳米特性，可以快速的穿透角质层屏障进入皮肤，同时由于载药胶束具有紫外光响应，停留于皮肤中进行触发释药，克服了8-MOP角质层渗透性低、皮肤滞留性差等问题。

发明内容

一种新型的HA-SP偶联物的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

(1)多巴胺与乙二胺共轭透明质酸HA-DN-EA的合成

将HA溶于PBS中，加入EDC和NHS，搅拌，将多巴胺添加到上述溶液中，将二乙胺溶解在PBS中并逐滴加入，并将pH调整为4，在氮气保护反应48h，透析，冷冻干燥得到产物 HA-DN-EA；

(2)SP激活

SP溶于MC中冰浴中搅拌。滴加TEA于溶液中，在氮气保护反应24h，室温下置于暗处，进行分离，获得闭环的SP；

(3)HA-SP结合

HA-DN-EA与SP混合在DMSO中，室温下在黑暗中反应48h，反应完成后，透析，冻干得到HA-SP。

一种新型的HA-SP偶联物的应用，其特征在于将制备获得的HA-SP偶联物包载药物制备成胶体。

所述的应用，其特征在于将药物和SP-HA溶解在四氢呋喃溶液在搅拌,然后将该溶液在黑暗中超声下将其滴入10mL蒸馏水中后，进行20分钟的超声处理，透析，以去除未结合药物，其中所述的药物为8-MOP，维生素C、维生素E、谷胱甘肽、传明酸、辅酶Q10、烟酰胺、三七总皂苷、人参皂甙、红没药醇、甘草酸二钾、胶原蛋白、花青素、虾青素。

4、所述的应用，其特征在于将10μg 8-MOP和30μg SP-HA溶解在四氢呋喃溶液在搅拌,然后将该溶液倒入一个注射器,然后在黑暗中超声下将其滴入10mL蒸馏水中，进行 20分钟的超声处理，用pH4的PBS透析两天，以去除未结合药物，所述的透析条件为MWCO 3500的透析袋。

有益效果

常规的皮肤治疗方法一般将药物涂抹于皮肤表面，大多数药物在是在皮肤表面，只有部分药物能够进入真皮层，同时也少量药物会进入真皮层下面的微血管，参与血液循环，有时会产生副作用。因此，一种能定点释放，特别在可见光下照射就能释放，特别适合皮肤治疗，目前临床上这类药物非常少，很多光敏药物需要照射紫外线触发，这样带来潜在不良后果，如大量照射紫外线会引发皮肤癌等。因此采用可见光是最安全的一种方式，本发明采用 HA-SP采用避光涂抹皮肤后，通过纳米效应穿透皮肤进入真皮层内，在可见光照射下，HA-SP 中的SP转变为MC，产生颜色，胶束受到破坏，停留于真皮层，使得药物在皮肤中滞留，持续释放。同时HA-SP这种偶联物同时含有HA和SP，即有脂溶性和水溶性两个部分，如水溶性药物或脂溶性药物都能被偶联物包裹，如HA端可以将水溶性的药物如维生素C或花青素等，进入HA长链亲水区内。而如脂溶性如维生素E等脂溶性药物可以进入胶束脂溶性区域(SP)进入包裹。故本发明应用广泛。

如果采用8-MOP联用，可以增加治疗效果，特别是针对白癜风患者有特殊效果。本发明通过红外光谱(FTIR)和核磁共振氢谱(HNMR)表明，共轭反应是正确的，化合物的反应也就是胶束的制备是成功的。同时制备了8-MOP/HA-SP载药胶束，并对其进行表征和稳定性研究。体外释放实验表明，紫外线对其释药具有触发作用，同时胶束释药还具有明显的缓控释性能。体外细胞实验充分验证了载药胶束，在Hacat细胞中的吸收速度和程度均有明显的增加，证明上述结论的可行。

附图说明

图1:HA和HA-sp共轭的红外光谱解释官能团移位；

图2:样品1,2的核磁共振氢谱(H NMR)，显示了SP和与HA连接的NHC3桥的c-芳香；

图3：HA-SP在紫外光照射前(红色)和紫外光照射5min后的共轭色变化；

图4:紫外光照射10min前后和可见光照射30min后透射电镜下的胶束形态，其中A:透射电镜B:下紫外光照射下的胶束形态C:紫外线照射10分钟后D:可见光照射30分钟后；

图5：8-MOP/HA-SP胶束和游离药物8-MOP悬浮液累积释放72小时后对比；

图6：特定时间间隔释放药物浓度；

图7：细胞摄取游离香豆素-6和香豆素胶束4h后，取平均值±标准差(n＝5)。*p<0.05， **p<0.01；

图8：不同浓度8-MOP/HA-SP胶束和游离甲氧西林8-MOP的细胞活力(n＝5)，取平均值±标准差(n＝5)。*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

实施例所使用的材料：

透明质酸钠(HA，分子量[MW]＝12.0、9.0、5.0KDa)、螺吡喃(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-6硝基螺吡喃[2H-吲哚]、盐酸多巴胺(DN)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-盐酸卡二亚胺(EDC)购自镇江东源生物科技有限公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基卡二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)和n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自上海Aladin化工有限公司。8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)购自重庆美联药业有限公司(中国重庆)。乙二胺(EA)、氯甲酸硝基苯酯(NPC)、三乙胺、n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲基氯(MC)购自南京南京阳光生物科技有限公司。其他化学试剂均为高效液相色谱和分析级。UV、可见光灯具购自嵊州市佰赛德科技发展有限公司(河北)。

实施例1螺吡喃共轭透明质酸HA-SP的合成

1、多巴胺与乙二胺偶联透明质酸(HA-DN-EA)的合成

将0.2g HA溶于15mL PBS中，搅拌30min，制得溶液。EDC共0.15g,NHS共0.155 g溶解于PBS中，加入HA溶液，搅拌20min；PBS溶液中加入0.14g多巴胺胺，pH调整为4。在氮气气氛下反应持续48小时，48h后对pH 4(MWCO:3500,SpectraPor)进行透析，冷冻干燥得到产品。

2、SP-NPC的合成。

2、SP活化与共轭:

螺吡喃SP首先被NPC氯甲酸硝基苯酯激活；0.2g SP溶解于7mL甲基氯MC中搅拌10min, 0.23g氯甲酸硝基苯酯NPC 5mL溶解于5mL MC中加入SP溶液中搅拌20min。将0.15mL三乙胺滴加到溶液中，在氮气气氛下反应24小时，室温下置于黑暗中。然后用盐水溶液冲洗溶液，用漏斗分离有色不混溶层，用MgSO4干燥，真空过滤。

3、HA-SP接合:

将0.1、0.05、0.025g的HA-EA-DN和0.14g的SP-NPC分别加入30mL DMSO的烧瓶中搅拌20min，在室温下黑暗中反应48h，制备HA-SP。反应完成后，溶液经pH4透析48h (MWCO:3500,SpectraPor)，冷冻干燥得到最终产物(形成HA-SP 1，HA-SP 2，HA-SP 3)。

4、HA-SP共轭的表征:

A、红外光谱结果

透明质酸与SP通过碳二亚胺在水中的酰胺化反应发生结合，是目前应用最普遍的HA改性方法之一。红外光谱(如图1)显示了3300cm^-1左右的SP带，而HA分子内H带的OH频率为3800cm^-1。与1700cm^-1左右的HA相比，C-O-C拉伸振动约为1800cm^-1。此外，在1100cm^-1处发现了C-O螺旋拉伸频率这就是吲哚溴代吡喃化合物,HA-SP谱中所有的特征峰都表明SP与HA主链相连。结果表明，FT-IR的位移证实了SP在HA主链上的结构特征。

B、核磁共振波谱结果

HA-SP的核磁共振氢谱显示，HA亚甲基的在3.4ppm处，而SP的亚甲基在1.03-1.23ppm 处。HA的N-乙酰基出现在2.4ppm左右，SP的N-乙酰基出现在2.7ppm左右。HA的邻苯二酚含量为6ppm,SP的邻苯二酚含量为6.7-8.4ppm。1H-NMR规定，对于HA-SP 1，HA骨架共轭上有6-8个SP分子，而对于HA-SP 2，每HA骨架仅2-3个SP(如图2)。芳香族化合物具有独特的H1位移，约为7-8ppm，SP在7ppm左右的位移屏蔽了HA在6ppm左右的位移。¹H-NMR明确指出，HA-SP 1中SP与6-8个SP分子成键，HA-SP 2中SP与每个HA主链成键 2-3个SP，而HA-SP 3中SP的结合不明显。

实施例2胶束的形成与表征

A、胶束的形成

采用超声波法制备了HA-SP胶束,用于制备胶束的HA-SP共轭物；将10μg药物8-MOP和30μg SP-HA(SP-HA1，SP-HA2，SP-HA3)溶解在5mL的四氢呋喃溶液在搅拌,然后将该溶液倒了一个注射器,然后在黑暗中超声下将其滴入10mL蒸馏水中，进行20分钟的超声处理，用PBS pH4透析两天，以去除未结合药物(MWCO 3500)，获得SP-HAa，SP-HAb， SP-HAc。

表1不同SP嫁接程度聚合物所形成的胶束粒径及PDI

结果显示：

DLS检查发现，HA-SPa的纳米粒径最小且为135.5nm，但PDI为0.203，HA-SPb的粒径为173.0nm，PDI为0.194(如表1)。HA-SPb胶束直径较好，这当然反映了先共轭后胶束制备这个步骤的成功。HA-SPa包含更多的SP/HA比率(m＝每个HA约6-8SP)。从HA-SPc来看，虽然它不含有明显的SP基团，但它形成了大小为326nm的胶束，HA-SPb的粒径比HA-SPa、HA-SPb大，HA-SPc中HLB值越高，说明样品越大。

B、粒径、zeta电位和电镜检测:

采用马尔弗恩系统(Malvern ZE S.A.)测定了HA-SP胶束的粒径、多分散性指数(PDI)和 zeta电位英国伍斯特郡)。用透射电镜观察AP-M的形貌(TEM,JEM-200CX，东京，日本)；

C、紫外线光响应实验(light-responsive)实验:

在光敏实验中，HA-SP胶束在365nm紫外光照射10min后，在620nm可见光照射30min，透射电镜观察胶束形态；为了研究胶束的光响应特性，分别用365NM紫外光和620NM可见光照射制备的胶束(见图3)。TEM 365nm紫外线irradiation10分钟后表明,球形胶束聚合中断, 证明hydrophilic-hydrophobic胶束破坏平衡由于疏水性SP转换形成亲水性MC形式,620nm 可见光照射30分钟后,胶束领域改革再次回到球形结构(见图4)

D、药品含量检测:

采用离心法测定HA-SP胶束体系的药物含量。样品在7000转/分的离心力下离心10分钟，然后用离心过滤装置(Millipore Ultra-0.5，MWCO 3000，Millipore，USA)过滤，并取等份滤液进行高效液相色谱试验。样品分析3次，取浓度均值，P<0.01，包封率EE％、载药量DL％由式(1)计算:

DL％＝W_drug/W_{polymers and drug}×100％………………………………………………Equation 2

EE％＝DL_experimental/DL_Theoretical……………………………………….…………Equation 3

(W_drug表示药物的重量；W_{polymers and drug}表示聚合物共轭物的重量；DL_experimental指的是实验性药物负荷；DL_Theoretical是指理论药物负荷)

结果显示：

根据高效液相色谱数据计算了8-MOP滤液的平均实验负荷，绘制了8-MOP的标准校准曲线，结果表明，浓度5-120μg/mL之间呈线性回归，相关系数(R²)为0.9985。根据方程式1，药物效率百分比如下：

表2载药量结果

E、储存稳定性:

胶束是物理组装的结构，环境变化常常导致胶束尺寸的变化，从而影响胶束的稳定性^[13]。物理稳定性是胶束给药系统抵抗解离和过早释放的基础^[14]。在储存条件下，将胶束样品置于黑暗处，以保护其不受光破坏，经过特定的5、10和30天的时间后，胶束没有出现浑浊或分层现象(如表3)。DLS测量结果显示，在HA-SPa中，颗粒大小和PDI略有增加，颗粒大小在 10-11nm范围内增加。在HA-SPb中，第30天的胶束尺寸在2nm范围内增加(最稳定的样品)，而在HA-SP c中，在19nm的尺寸增加时表现出更大的不稳定性。

表3胶束溶液在贮存5、10、30天后的变化情况

F、药物体外释放

体外药物释放谱的研究需要良好的条件，即保持药物在释放介质中的浓度足够低，不影响药物释放的浓度梯度。

采用透析袋扩散法研究了8-MOP/HA-SP胶束的体外释放行为，首先用365nm紫外光照射5分钟，然后浸泡于水槽溶液中；简而言之，将5mL 8-MOP/HA-SP和等量的游离药物8-MOP 悬浮液作为对照组分别置于透析膜袋中(分子量为3500g/mol；中国上海Green Bird公司) 将袋子浸入含有1％(w/v)吐温80(国药控股化学试剂有限公司)的新鲜200mL PBS(pH7.4, 37℃)中；在预定的时间间隔内，取出三份等分试样，用等量的新鲜释放介质替换，以保持恒定的体积。然后用高效液相色谱法评估上清液中释放的AP的量，所有等分样品的测量值 P<0.05。

结果显示：

浓度测量时间间隔从0到72小时。模拟肠道培养基(PBS,PH 6.8)释放表明，8-MOP/HA-SP 体系和游离药物8-MOP释放差异较大。8-MOP/HA-SP胶束的释放速度比游离的8-MOP慢，例如在前12小时,8-MOP/HA-SP胶束的释放速度约为60.27％，而游离的8-MOP的释放速度约为 89.1％。8-MOP/HA-SP胶束体系缓释72h以上，释放量为82.9％，而游离的8-MOP在前12小时内释放量较大，这说明胶束体系有着了良好的缓释行为。(如图5和6)。胶束在72小时内经历了持续释放的过程，这种释放曲线可以很好地解决药物的释放行为。

实施例3香豆素6(C-6)细胞摄取实验

HaCaT人类永生的角化细胞细胞系,用10％胎牛血清和1％种抗生素(10000μg/mL链霉素和10000单位/青霉素)在37℃和5％的CO2条件下保存在DulbCo改良的EAG培养基(DMEM)中。

实验时，将HaCaT细胞培养至100％融合，再培养一周。然后，Hacat细胞在不完全的无 FBS的DMEM中放置24小时。将装载香豆素6和游离香豆素6的胶束分别与细胞孵育1、2、4h后，用BD FACS calibur机进行细胞摄取分析。

结果显示：

高效液相色谱法测定C-6的负载效率约为64.5％(p<0.01)。C-6胶束的细胞摄取量在与hacat孵育1、2、4小时后测定。胶束内香豆素的吸收水平高于游离香豆素6的吸收水平。例如,4小时后,C-6/HA-SP胶束的荧光强度约为800，而游离C-6的荧光强度仅为290，这一迹象确实确保了我们的HA-SP共轭物能够成功地将疏水性药物8-MOP传递给细胞(如图7)

实施例4 MTT检测实验

细胞在96孔板中培养一天，然后给药，4小时后，我们给药MTT溶液。通过溶解不同量的METX-M、无METX药物和无FBS培养基，制备了不同浓度的试验溶液。Hacat细胞以 5×10⁴cells/mL的密度在96孔板中每孔接种100μl，并在5％CO2的条件中培养24小时，培养温度为37℃。然后将培养基除去，加入试验溶液，空白对照培养基中加入空白无FBS的培养基。将细胞进一步培养48小时，然后向每个孔中加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，再培养4小时，然后丢弃每个孔中的上清液，然后将MTT-formazan晶体溶解在200μl二甲基亚砜(DMSO)中。使用DG5032酶联免疫吸附测定仪在570纳米处测量每口井的吸光度。使用以下等式计算相对细胞活力：

细胞存活率(％)＝ODS/OD对照×100％....................Equation 4

ODS和OD控制是分别用试验溶液和空白FBS自由培养基处理的细胞的吸光度；

结果显示：

本实施例旨在检测胶束对HaCaT细胞的细胞毒性；用不同浓度的8-MOP共轭胶束和游离 8-MOP孵育细胞后，用MTT法测定细胞活力。胶束系统的细胞毒性与游离药物相当，特别是在高浓度25mg/mL时，胶束细胞毒性大于70％，而游离药物的细胞毒性约为60％。这更表明我们胶束可以将疏水性药物8-MOP吞没，并将其带到细胞内，且其细胞毒性与游离药物相当(如图 8)。药物8-MOP具有很高的毒性，我们的制剂细胞穿透性的增强大大提高了其生物利用度。

Claims

1.一种新型的HA-SP偶联物，其特征在于按如下方法制备获得：

(1)多巴胺与乙二胺共轭透明质酸HA-DN-EA的合成

将HA溶于PBS中，加入EDC和NHS搅拌，将多巴胺添加到上述溶液中，将二乙胺溶解在PBS中并逐滴加入，并将pH调整为4，在氮气保护反应48h，透析，冷冻干燥得到产物HA-DN-EA；

(2)SP激活

(3)HA-SP结合

HA-DN-EA与SP混合在DMSO中，室温下在黑暗中反应48h，反应完成后，透析，冻干得到HA-SP偶联物。

2.一种新型的HA-SP偶联物的应用，其特征在于将权利要求1制备获得的HA-SP偶联物包载药物制备成胶束。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的制备成胶束的步骤如下：将药物和SP-HA偶联物溶解在四氢呋喃溶液在搅拌,将该溶液在黑暗中超声将其滴入10mL蒸馏水中，进行20分钟的超声处理，透析，以去除未结合药物，其中所述的药物为8-MOP，维生素C、维生素E、谷胱甘肽、传明酸、辅酶Q10、烟酰胺、三七总皂苷、人参皂甙、红没药醇、甘草酸二钾、胶原蛋白、花青素、虾青素。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于将10μg8-MOP和30μg SP-HA偶联物溶解在四氢呋喃溶液在搅拌,在黑暗中超声下将其滴入10mL蒸馏水中，进行20分钟的超声处理，用pH4的PBS透析两天，以去除未结合药物，所述的透析条件为MWCO 3500的透析袋。