CN110494124A

CN110494124A - 植物提取物

Info

Publication number: CN110494124A
Application number: CN201880023553.5A
Authority: CN
Inventors: L·维斯德尔-约翰森; M·莱奥纳尔迪; C·奥斯特伦; S·法布尔; E·斯约兰德; T·艾尔-巴德尔
Original assignee: Aurelian Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Aurelian Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-05
Publication date: 2019-11-22
Also published as: EP3606620A1; SE1730093A1; RU2019135186A; RU2019135186A3; SE542639C2; WO2018185214A1

Abstract

本发明提供了从乌拉尔甘草(G.ururalensis)植物获得的植物提取物，其中所述提取物包含甘草素(liquiritigenin)以及维采宁‑2(vicenin‑2)和/或芒柄花素(formononetin)中的一种或多种。

Description

植物提取物

技术领域

本发明涉及提取乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis，G.uralensis)植物的方法，并涉及从中获得的植物提取物。本发明还涉及一种制剂，该制剂包含从乌拉尔甘草植物的提取中获得的植物提取物，以及该制剂在防止和/或减少皮肤衰老症状中的用途。

背景技术

皮肤衰老可归因于外在的和内在的过程，其通常通过增加皱纹、下垂和松弛来表现出来。皮肤的衰老是人的遗传倾向以及对环境应力的生理反应的结果。环境应力，例如来自暴露于日光的紫外线(UV)照射、暴露于污染物以及烟，可以导致皮肤胶原组织发生明显变化。特别地，环境应力会导致胶原的分解，胶原是皮肤细胞外基质(ECM)的主要成分。已知部分由基质金属蛋白酶(MMP)介导的ECM中的这些改变是引起皮肤皱纹的原因，皮肤皱纹是皮肤过早衰老的症状。

过度的基质降解可能是由于暴露于UV引起的。特别地，UV引发的各种细胞的(例如，角质形成细胞和成纤维细胞)MMP-1分泌可能引起过度的基质降解。MMP-1的分泌对光衰老期间发生的结缔组织损伤有很大贡献。参与基质降解的主要蛋白质是胶原，它是一种三螺旋分子，其形成所有结缔组织(如皮肤)的纤维框架。胶原合成为前胶原，一种更大的前体分子。前胶原由在氨基和羧基末端均带有延伸肽的成熟的胶原组成。在胶原结合到生长中的胶原纤维之前，特异性蛋白酶将这些延伸肽或前肽从胶原分子上切割下来。这些肽向细胞培养基中的释放给出了胶原生成的化学计量学表征。在衰老过程中，发现皮肤中的胶原水平和与其他基质蛋白(如弹性蛋白)一起降低，胶原水平的降低是皱纹形成的主要原因。

传统上，植物来源的产品已用作药物来源。例如，甘草是豆科植物(豆科)中约18个公认物种的属，在亚洲、澳大利亚、欧洲和美洲具有亚世界性分布。该属最著名的是甘草，光果甘草(Glycyrrhiza glabra)，该种原产于地中海地区，可从其产生糖食甘草。

乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)，也被称为中国甘草，是一种起源于亚洲的开花植物，用于传统中药。甘草根(liquorice root)或“甘草(radix glycyrrhizae)”，是传统中药使用的50种基本草药之一，在中药中，其名称为“gancao”。

在中药中，抗炎甘草根用于多种用途已使用了多个世纪，例如用于治疗咳嗽和感冒、胃肠道疾病和女性生殖问题。它也已在中药中用作“指导药物”。甘草根已与其他草药和疗法并用，以增强其功效，并从根本上将其他草药引向最有益的方面。甘草根是化合物的复杂混合物，研究人员从glabra品种中分离出134种不同化合物，和在乌拉尔甘草中分离出170种不同化合物。发现甘草根中至少有四种主要类型的化合物：黄酮类、香豆素、三萜类和芪类化合物。

需要具有提高抗衰老活性的天然植物来源的产品。需要一种具有提高抗衰老活性的天然产品，其是从容易获得的植物来源获得的。特别地，需要具有提高胶原释放活性的植物来源的天然产品。需要具有以下一种或多种的植物来源的天然产品：提高胶原释放活性；提高抗糖基化能力；提高抗氧化能力；和/或提高抗炎作用。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种从乌拉尔甘草植物获得的植物提取物，其中所述提取物包含甘草素(liquiritigenin)以及维采宁-2(vicenin-2)和/或芒柄花素(formononetin)中的一种或多种。

本文所用的术语“植物提取物”是指从植物材料获得的液体、半固体或固体形式的制备物。

所述植物提取物优选包含甘草素、维采宁-2和芒柄花素。植物提取物优选为水提取物。本文所用的术语“水提取物”是指通过使乌拉尔甘草植物的部分与水接触而获得的提取物。然而，应当理解，提取物可以从使用任何合适的溶剂在乌拉尔甘草植物上进行的任何合适的溶剂提取中获得，并且不限制为水提取。

提取物包含甘草素作为活性剂。所述提取物优选地包含甘草素以及维采宁-2和芒柄花素中的一种或多种(优选两种)作为活性剂。

提取物可进一步包含以下一种或多种：甘草苷(liquiritin)和/或芹糖甘草苷(liquiritin apioside)。优选地，所述提取物进一步包含甘草苷和芹糖甘草苷。

根据本发明的第二方面，提供了包含本文所述的提取物的化妆品或药物制剂。化妆品制剂优选是非治疗性化妆品制剂。

提取物能以任何合适的浓度存在于制剂中。

根据本发明的另一方面，提供了一种抗衰老妆品或药物制剂，其包含本文所述的提取物。所述抗衰老妆品制剂优选为非治疗性抗衰老妆品制剂。

该抗衰老制剂优选是抗皮肤衰老的化妆品制剂。根据本发明的另一方面，提供了本文所述的提取物或制剂在防止和/或减轻和/或减少和/或最小化皮肤衰老症状或至少一个与皮肤衰老相关的皮肤损伤症状方面的用途。皮肤衰老或皮肤损伤的症状优选表现在对象的面部、身体或头皮上。术语“皮肤”在本文中涵盖在面部、身体和头皮上的皮肤。皮肤衰老或皮肤损伤状况的至少一种皮肤是由内在的生物衰老(自然衰老)或光致衰老(光化衰老)引起的，该光致衰老是由于暴露于例如UV光、污染物或应力下引起的。

皮肤衰老的症状包括但不限于以下一种或多种：皱纹、具有细纹的皮肤、皮肤干燥、皮肤弹性不足、肤色不足、皮肤变薄、皮肤松弛、皮肤遭受胶原纤维的退化、松弛的皮肤、皮肤遭受内部的降解、暗沉的皮肤、毛孔粗大和/或粗糙的皮肤质地。皮肤损伤状况包括但不限于炎症、发红、斑点、眼睛浮肿或黑眼中的一种或多种。本发明的提取物和/或制剂可用于治疗这些皮肤衰老症状和/或皮肤损伤状况的任何一种、这些皮肤衰老和/或皮肤损伤状况的任意多种组合、或同时治疗这些皮肤衰老症状和/或皮肤损伤状况的全部。

提取物可以直接施用或作为化妆品或药物(例如皮肤病学)制剂的一部分施用。

应该理解的是，提取物可以以粗植物提取物、以包含活性剂的精制或纯化植物提取物的形式单独或作为组合物或制剂的一部分施用于皮肤。

本发明的提取物和/或制剂优选为以下一种或多种：

前胶原释放增强剂；和/或

UV引发的MMP-1抑制剂；和/或

糖基化抑制剂；和/或

抗氧化剂；和/或

抗炎药；和/或

抗污染剂；或其任何组合。

本发明的提取物和/或制剂可用于防止、减轻和/或减少与以下一种或多种相关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状：胶原的释放(例如I型胶原和/或IV型胶原释放)、UV引发的MMP1分泌、污染物引发的MMP1分泌、糖基化、炎症、暴露于污染或其任何组合。优选地，本发明的提取物和/或制剂可用于防止、减轻和/或减少与以下一种或多种相关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状：胶原的释放、UV引发的MMP1分泌、污染物引发的MMP1分泌、糖基化或其任何组合。

本发明的提取物和/或制剂优选是前胶原释放增强剂。提取物和/或制剂优选增强一种或多种选自以下的胶原的表达：I型胶原和III型胶原、或其组合。提取物和/或制剂优选增强I型胶原和/或IV型胶原的释放。提取物和/或制剂优选增强I型胶原的释放。本发明的提取物和/或制剂可以用于防止、减轻和/或减少与胶原释放有关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状。

本发明的提取物和/或制剂可用于防止、减轻和/或减少与使用者皮肤内UV引发或污染物引发的MMP1分泌有关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状。

本发明的提取物和/或制剂可以用于防止、减轻和/或减少与使用者皮肤内糖基化有关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状。

根据本发明的另一方面，提供了本文所述的提取物或制剂作为抗炎剂的用途。因此，提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少和/或最小化使用者的炎症，例如肤色发红。本发明的提取物和/或制剂可以用于防止、减轻和/或减少与炎症(特别是皮肤的炎症)有关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状。

本发明的提取物和/或制剂可以用于防止、减轻和/或减少与皮肤暴露于污染物有关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状。

本发明的提取物和/或制剂可以用于防止、减轻和/或减少与皮肤暴露于自由基有关的一种或多种皮肤衰老和/或皮肤损伤的症状。

提取物能包含任何合适浓度的甘草素和以下一种或多种：维采宁-2和/或芒柄花素。

在一个实施例中，提取物和/或制剂中存在的甘草素的浓度为至少0.1％，优选至少1％，更优选至少2％，甚至更优选至少5％，例如至少10％w/w。在一个实施例中，提取物和/或制剂中存在的甘草素浓度不超过50％，优选不超过30％，更优选不超过20％，例如不超过10％w/w。在一个实施例中，提取物和/或制剂中存在的甘草素的浓度在0.1％至50％w/w的范围内，更优选在1％至30％w/w的范围内，更优选在2％至20％w/w的范围内，甚至更优选在2％至10％w/w的范围内，例如在5％至10％w/w的范围内。

在一个实施例中，提取物和或制剂中存在的芒柄花素浓度为至少0.1％w/w，更优选至少0.2％w/w，例如0.3％w/w。提取物和/或制剂中存在的芒柄花素浓度为优选不超过1％w/w，更优选不超过0.7％w/w，例如不超过0.5％w/w的。提取物和/或制剂中存在的芒柄花素的浓度为优选0.1％w/w至1％w/w，更优选0.1％w/w至0.7％w/w，例如0.1％w/w至0.5％w/w。

在一个实施例中，提取物和/或制剂中存在的维采宁-2浓度为至少0.05％w/w，更优选至少0.1％w/w，例如0.2％w/w。提取物和/或制剂中存在的维采宁-2浓度为优选不超过1％w/w，更优选不超过0.5％w/w，例如不超过0.3％w/w。提取物和/或制剂中存在的维采宁-2浓度为优选0.1％w/w至1％w/w，更优选0.1％w/w至0.5％w/w，例如0.1％w/w至0.3％w/w。

在一个实施例中，甘草素与维采宁-2和/或芒柄花素中的一种或每种的比例优选不超过30：1，更优选不超过20：1，例如不超过10：1。

在一个实施例中，甘草素与维采宁-2和芒柄花素中的一种或每种的比例优选为至少1：1，更优选至少2：1，特别优选至少3：1，例如至少4：1。

在一个实施例中，例如，甘草素与维采宁-2和芒柄花素中的一种或每种的比例优选在1：1至30：1的范围内，更优选在2：1至20：1的范围内，例如在3：1和10：1的范围内。

在一个实施例中，芒柄花素可以以大于提取物中存在的维采宁-2浓度的浓度存在于提取物和/或制剂中。例如，提取物和/或制剂中的芒柄花素与维采宁-2的浓度的比例可以不大于5：1，优选地不大于3：1，更优选地不大于2：1，例如大约1：1。

替代地，在一个实施例中，芒柄花素可以以低于提取物中存在的维采宁-2浓度的浓度存在于提取物和/或制剂中。例如，提取物中的维采宁-2与芒柄花素的浓度的比例可以不大于3：1，优选不大于2：1，更优选不大于1.5：1。

在一个实施例中，维采宁-2的浓度可以近似等于提取物和/或制剂中的芒柄花素的浓度。

在一实施例中，提取物包含：

甘草素，其浓度范围在0.1％至50％，优选为1％至30％，更优选为2％至20％，甚至更优选在2至10％，例如在5至10％w/w范围内；和

下列一项或多项：

芒柄花素，其浓度范围优选在0.1％w/w至1％w/w，更优选0.1％w/w至0.7％w/w，例如0.1％w/w至0.5％w/w，和/或

维采宁-2，其浓度范围优选在0.1％w/w至1％w/w，更优选0.1％w/w至0.5％w/w，例如0.1％w/w至0.3％w/w。

在一实施例中，提取物包含：

2.2-2.5％w/w甘草素；和

0.1-0.3％w/w维采宁-2和/或0.1-0.5％w/w芒柄花素中的一种或多种。

从乌拉尔甘草植物获得的植物提取物优选进一步包含以下一种或多种：甘草苷和/或芹糖甘草苷。例如，在一个实施例中，提取物可包含甘草素以及维采宁-2和/或芒柄花素中的一种或多种与甘草苷的组合。在一个实施例中，提取物可包含甘草素以及维采宁-2和/或芒柄花素中的一种或多种与芹糖甘草苷的组合。在一个实施例中，所述提取物可以包含甘草苷、芹糖甘草苷、甘草素以及维采宁-2和/或芒柄花素中的一种或多种的组合。

提取物可包含一种或多种其他成分。

提取物可以例如进一步包含一种或多种另外的类黄酮。所述提取物可例如包含以下中的一种或多种：异甘草素-7-4'二葡萄糖苷(isoliquiritigenin-7-4’-diglucoside)、异甘草苷(isoliquiritin)、夏佛塔苷(schaftoside)、甘草苷(liquiritin)、异芹糖甘草苷(isoliquiritin-apioside)、甘草素-7-4’-二葡萄糖苷(liquiritigenin-7-4’-diglucoside)、芹糖甘草苷(liquiritin-apioside)，异佛来心甙(isoviolanthin)、8-羟基甘草苷(8-hydroxy-liquiritin)、6”-O-乙酰基异苷草苷(6”-O-acetylisoliquiritin)、异甘草素(isoliquiritigenin)、7-异甘草苷(7-isoliquiritin)、异甘草苷-7-芹糖苷(isoliquiritin-7-apioside)、7-甘草苷(7-liquiritin)、甘草苷-7-芹糖苷(liquiritin-7-apioside)、和/或6”-O-乙酰基-甘草苷(6”-O-acetyl-liquiritin)。优选地，提取物包含异甘草素-7-4'二葡萄糖苷、异甘草苷、夏佛塔苷、甘草苷、异芹糖甘草苷、甘草素-7-4’-二葡萄糖苷、芹糖甘草苷、异佛来心甙、8-羟基甘草苷、6”-O-乙酰基异苷草苷、异甘草素、7-异甘草苷、异甘草苷-7-皂苷、7-芹糖苷、甘草苷-7-芹糖苷、和6”-O-乙酰基-甘草苷中的每种。

所述或每种另外的类黄酮能以任何合适的浓度存在于提取物中。例如，所述或每种类黄酮能以不超过0.1％w/w的浓度存在。在一个实施例中，所述或每种类黄酮以至少0.05％w/w，更优选至少0.1％w/w，例如至少0.2％w/w的浓度存在于提取物中。在一个实施例中，所述或每种类黄酮以不超过20％w/w，优选不超过10％w/w，更优选不超过5％w/w的浓度存在于提取物中。在一个实施例中，所述或每种类黄酮以0.05％至20％w/w，优选0.1％至10％w/w，例如至少0.2％至5％的浓度范围存在于提取物中。

在一个实施例中，提取物包含：

甘草素；以及

维采宁-2和/或芒柄花素中的一种或多种，以及选自以下的一种或多种类黄酮：

异甘草素-7-4'二葡萄糖苷、异甘草苷、夏佛塔苷、甘草苷、异芹糖甘草苷、甘草素-7-4’-二葡萄糖苷、芹糖甘草苷、异佛来心甙、8-羟基甘草苷，6”-O-乙酰基异苷草苷、异甘草素、7-异甘草苷、异甘草苷-7-芹糖苷、7-甘草苷、甘草苷-7-芹糖苷、和/或6”-O-乙酰基-甘草苷。

在一实施例中，提取物包含：

甘草素；

维采宁-2和/或芒柄花素中的一种或多种；

异甘草苷；

甘草苷；

芹糖异甘草苷；

芹糖甘草苷；

异甘草素；和

甘草苷-7-芹糖苷。

在一实施例中，提取物包含：

2.2-2.5％w/w甘草素；

0.1-0.3％w/w维采宁-2；

0.1-0.5％w/w芒柄花素；

1.3-1.6％w/w异甘草苷；

7.6-8.5％w/w甘草苷；

0.9-2.4％w/w芹糖异甘草苷；

7.1-8.9％w/w芹糖甘草苷；

0.9-1.2％w/w异甘草素；和

0.65-0.9％w/w甘草苷-7-芹糖苷。

提取物可以例如进一步包含一种或多种选自以下的皂苷：乌拉尔甘草皂苷C(Uralsaponin C)和/或22-β-乙酰氧基甘草甜素(22-β-Acetoxyglycyrrhizin)，和/或甘草皂苷G2(Licorice-saponin G2)和/或乌拉尔甘草皂苷N(Uralsaponin N)和/或乌拉尔甘草皂苷U(Uralsaponin U)和/或甘草甜素(Glycyrrhizin)和/或甘草甜素异构体(Glycyrrhizin isomer)和/或甘草皂苷J2(Licorice-saponin J2)和/或甘草皂苷H2(Licorice Saponin H2)，和/或甘草皂苷H2异构体(Licorice-saponin H2 isomer)。

在一实施例中，提取物还包含：乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和甘草皂苷H2异构体。

一种或多种，优选每种皂苷以至少0.05％w/w，更优选至少0.5％w/w，甚至更优选至少1％w/w，例如至少2％w/w的浓度存在于提取物中。

一种或多种，优选每种皂苷以不超过50％w/w，更优选不超过40％w/w，特别优选不超过20％w/w，更特别优选不超过10％w/w，例如不超过5％w/w的浓度存在于提取物中。

一种或多种，优选每种皂苷以0.05％w/w至50％w/w，更优选0.5％w/w至40％w/w，特别优选0.5％w/w至20％w/w，甚至更优选0.5％w/w至10％w/w，例如0.5％w/w至5％w/w的浓度范围存在于提取物中。

在一个实施例中，甘草素与每种皂苷的比例以优选不大于50：1，更优选不大于25：1，例如不大于10：1存在于提取物中。

在一个实施例中，甘草素与每种皂苷的比例以优选为至少1：2，更优选至少1：1，特别优选至少2：1，例如至少5：1存在于提取物中。

在一个实施例中，甘草素与每种皂苷的比例以优选在1：2至50：1的范围内，更优选在1：1至25：1的范围内，例如在2：2至10：1的范围内存在于提取物中。

在一实施例中，提取物包含：

2.2-2.5％w/w甘草素；

0.1-0.3％w/w维采宁-2和/或0.1-0.5％w/w芒柄花素中的一种或多种；和

一种或多种选自以下一种或多种的皂苷：乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和/或甘草皂苷H2异构体。

在一实施例中，提取物包含：

2.2-2.5％w/w甘草素；

包含以下的皂苷：乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和甘草皂苷H2异构体。

在一实施例中，提取物包含：

2.2-2.5％w/w甘草素；

一种或多种选自以下的皂苷：

0.2％w/w乌拉尔皂甘草苷C，

0.4-0.6％w/w 22-β-乙酰氧基甘草甜素，

2.9-3.2％w/w甘草皂苷G2，

3.2-3.8％w/w乌拉尔甘草皂苷N，

0.05-0.3％w/w乌拉尔甘草皂苷U，

22.1-32.0％w/w甘草甜素，

7.7-8.2％w/w甘草甜素异构体，

0.9-1.2％w/w甘草皂苷J2，

0.6-0.8％w/w甘草皂苷H2，和

0-0.1％甘草皂苷H2异构体。

优选地，提取物还包含一种或多种另外的皂苷。另外的皂苷优选选自以下一种或多种：22-羟基甘草皂苷A3(22-Hydroxy-licorice-saponin A3)、乌拉尔甘草皂苷F(Uralsaponin F)、macedonoside C、22-羟基甘草皂苷G2(22-hydroxy-licorice-saponinG2)、乌拉尔甘草皂苷X(Uralsaponin X)、甘草皂苷A3(Licorice-Saponin A3)、Yunganoside E2、22-β-乙酰基甘草醛(22-β-acetoxyglycyrrhaldehyde)、Rhaoglycyrrhizin、22-β-乙酰氧基甘草皂苷B2(22-β-acetoxy-licorice-saponin B2)、22-去羟基乌拉尔甘草皂苷C(22-Dehydroxy-uralsaponin C)、甘草皂苷J2异构体(Licorice-Saponin J2 isomer)和/或乌拉尔甘草皂苷P(Uralsaponin P)。提取物可以例如进一步包含22-羟基甘草皂苷A3、乌拉尔甘草皂苷F、macedonoside C、22-羟基甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷X、甘草皂苷A3、Yunganoside E2、22-β-乙酰基甘草醛、Rhaoglycyrrhizin、22-β-乙酰氧基甘草皂苷B2、22-去羟基乌拉尔甘草皂苷C、甘草皂苷J2异构体和乌拉尔甘草皂苷P。

优选地，所述或每种另外的皂苷以小于0.1％w/w的浓度存在。

提取物可进一步包含一种或多种异戊二烯类黄酮。一种或多种异戊二烯类黄酮可通过体现出抗炎和/或抗氧化活性而提供额外的抗衰老作用。

一种或多种异戊二烯类黄酮可以选自：甘草查尔酮D(Licochalcone D)、甘草查尔酮B(Licochalcone B)、甘草宁(Gancaonin)、光甘草酮(Glabrone)、甘草西定(Licoricidin)、光甘草酚(Glabrol)和/或粗毛甘草素A(Glyasperin A)。优选地，提取物还包含以下一种或多种：光甘草酚和/或甘草查尔酮D和/或甘草查尔酮B。优选地，提取物进一步包含光甘草酚。优选地，所述或每种光甘草酚和/或甘草查尔酮D和/或甘草查尔酮B通过体现出抗炎和/或抗氧化活性来提供额外的抗衰老活性。

所述或每种异戊二烯类黄酮可以在提取物中以任何合适的浓度存在。在一个实施例中，所述或每种类黄酮以至少0.05％w/w，优选至少0.1％w/w，优选至少0.5％w/w的浓度存在于提取物中。在一个实施例中，所述或每种类黄酮以不超过5％w/w，优选不超过2％w/w，例如不超过1.5％w/w的浓度存在于提取物中。在一个实施例中，所述或每种类黄酮以0.05％w/w至5％w/w，优选0.1％w/w至2％w/w，例如0.5％至1.5％w/w的浓度范围存在于提取物中。

在一个实施例中，提取物包含浓度在0.5％w/w至1.2％w/w的光甘草酚。另外的异戊二烯类黄酮，例如甘草查尔酮D、甘草查尔酮B、甘草宁、光甘草酮、甘草西定和粗毛甘草素A中的一种或多种，优选每种，以小于1％w/w的浓度存在于提取物中。

在一个实施例中，提取物还包含18β-甘草酸(18β-Glycyrrhizic acid)(甘草甜素，Glycyrrhizin)、蔗糖和18α-甘草酸(18α-Glycyrrhizic acid)(甘草甜素异构体，Glycyrrhizin isomer)。例如，所述提取物可以包含甘草素和以下一种或多种：维采宁-2和/或芒柄花素以及18β-甘草酸、18α-甘草酸和蔗糖。在另一个实施例中，提取物可包含甘草苷、芹糖甘草苷、甘草素以及下述中的一种或多种：维采宁-2和/或芒柄花素与18β-甘草酸、18α-甘草酸和蔗糖。

提取物的甘草苷、芹糖甘草苷、18β-甘草酸、18α-甘草酸和/或蔗糖中的一种或多种，优选每一种，各自优选以至少1％，优选至少2％，更优选5％，例如至少8％w/w的浓度存在于提取物中。提取物的甘草苷、芹糖甘草苷、18β-甘草酸、18α-甘草酸和/或蔗糖中的一种或多种，优选每一种，以小于40％w/w，优选小于30％w/w，更优选小于25％w/w，例如小于大约20％w/w的浓度存在于提取物中。提取物的甘草苷、芹糖甘草苷、18β-甘草酸、18α-甘草酸和/或蔗糖中的一种或多种，优选每一种，以在1％至40％，优选在2％至30％，更优选在5％至25％，例如在8％至20％w/w的浓度范围存在于提取物中。

在一实施例中，提取物包含：

甘草素，其浓度为至少0.1％，优选至少1％，更优选至少2％w/w；下列一项或多项：

芒柄花素，其浓度为至少0.1％w/w，更优选至少0.2％w/w，例如0.3％w/w，和/或

维采宁-2，其浓度至少为0.05％w/w，更优选至少为0.1％w/w，例如0.2％w/w；以及可选的以下中的一种或多种：

芹糖甘草苷，其浓度在2％至15％，优选在5％至10％，例如在7％至9％w/w范围内；和/或

甘草苷，其浓度在2％至15％，优选在5％至10％，例如在7％至9％w/w范围内；和/或

一种或多种选自以下的皂苷：乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和甘草皂苷H2异构体。

在一实施例中，提取物包含：

甘草素，其浓度范围为0.1％至50％，优选为1％至30％，更优选为2％至20％，甚至更优选在2至10％，例如在5至10％w/w；和以下一种或多种：

芒柄花素，其浓度范围为0.1％w/w至1％w/w，更优选0.1％w/w至0.7％w/w，例如0.1％w/w至0.5％w/w，和/或

维采宁-2，其浓度在0.1％w/w至1％w/w，更优选在0.1％w/w至0.5％w/w，例如0.1％w/w至0.3％w/w；以及可选的以下一种或多种：

芹糖甘草苷，其浓度范围在2％至15％，优选在5％至10％，例如在7％至9％w/w范；和/或

甘草苷，其浓度范围为2％至15％，优选5％至10％，例如7％至9％w/w；和/或

在一个实施例中，存在于提取物中的芹糖甘草苷和/或甘草苷的浓度高于甘草素的浓度。优选地，存在于提取物中的芹糖甘草苷和/或甘草苷的浓度分别比在提取物内的甘草素的浓度高至少50％更多，优选高至少100％更多，更优选高至少150％更多，例如高至少200％更多。

在一个实施例中，在提取物中的芹糖甘草苷：甘草苷：甘草素的浓度的比例不大于5：5：1，优选不大于4：4：1。在一个实施例中，提取物中的芹糖甘草苷：甘草苷：甘草素的浓度的比例为至少1∶1∶1，优选至少2∶2∶1，更优选至少3∶3∶1。在一个实施例中，提取物中的芹糖甘草苷∶甘草苷：脂质体皂苷的浓度的比例在1∶1∶1至5∶5∶1之间；优选在2：2：1至4：4：1之间，更优选在3：3：1至4：4：1之间。

在一个实施例中，存在于提取物中的芹糖甘草苷的浓度高于存在于提取物中的甘草苷的浓度。可选地，在一个实施例中，存在于提取物中的芹糖甘草苷的浓度小于存在于提取物中的甘草苷的浓度。

在一个实施例中，提取物中的芹糖甘草苷与甘草苷的浓度的比例为至少0.1∶1，优选至少0.5∶1，例如约0.8∶1。在一个实施例中，提取物中的芹糖甘草苷与甘草苷的浓度的比例不大于10：1，优选不大于2：1，例如约1.2：1。在一个实施例中，提取物中的芹糖甘草苷与甘草苷的比例在约0.1：1至10：1之间；优选在约0.5∶1至2∶1之间；更优选在约0.8∶1至1.2∶1之间。

在一实施例中，提取物包含：

甘草素，其浓度范围为0.1％至10％，优选为1％至10％，例如为5％至10％w/w；以及以下一种或多种：

维采宁-2，其浓度在0.1％w/w和1％w/w，更优选在0.1％w/w和0.5％w/w之间，例如在0.1％w/w和0.3％w/w之间；以及可选的以下一种或多种：

18β-甘草酸，其浓度范围在5％至50％，优选在10％至40％，例如在20％至30％w/w；和/或

蔗糖，其浓度范围在5％至30％，优选10％至20％，例如15％至18％w/w；和/或

18α-甘草酸，其浓度范围在1％至20％，优选2％至15％，例如5％至10％w/w；和/或

在一实施例中，提取物包含：

甘草素，其浓度范围在0.1％至10％，优选为1％至10％，例如为5％至10％；以及以下一种或多种：

维采宁-2，其浓度范围为0.1％w/w至1％w/w，更优选0.1％w/w至0.5％w/w，例如0.1％w/w至0.3％w/w；和

芹糖甘草苷，其浓度范围在2％至15％，优选在5％至10％，例如在7％至9％w/w；

甘草苷，其浓度范围在2％至15％，优选5％至10％，例如7％至9％w/w；

18β-甘草酸，其浓度范围在5％至50％，优选在10％至40％，例如在20％至30％w/w；

蔗糖，其浓度范围在5％至30％，优选10％至20％，例如15％至18％w/w；和

18α-甘草酸，其浓度范围为1％至20％，优选2％至15％，例如5％至10％w/w；以及可选的

一种或多种皂苷，包括：乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和甘草皂苷H2异构体。

在一实施例中，提取物包含：

8.7％芹糖甘草苷；

8％甘草苷；

1.2％甘草素；

0.1-0.3％w/w维采宁-2和/或0.1-0.5％w/w芒柄花素中的一种或多种；

26.3％18β-甘草酸；

15.3％蔗糖；和

8％18α-甘草酸。

本发明的提取物优选可溶于水溶剂。提取物优选可溶于H₂O/EtOH、100％水、H₂O/甘油、PBS/EtOH、和/或NaCl溶液中的一种或多种，优选每种。

与已知的含甘草素的提取物相比，已发现本发明的提取物在多种水溶性溶剂中具有改善的溶解度，尤其在水中。优选地，提取物在水中的溶解度约为100mg/ml。因此，本发明的提取物可以有利地用在使用水溶性溶剂来制备制剂，而无需使用额外的合成溶剂来增加提取物的溶解度。因而，本发明的提取物可用于制备具有减少的相关环境问题和风险的制剂。

提取物优选可溶于水溶性溶剂，例如水、PBS(磷酸盐缓冲盐水)/乙醇混合物；水和甘油的混合物，以及NaCl溶液。

在一个实施例中，所述制剂包含本文所述的提取物与一种或多种水溶性溶剂。水溶性溶剂优选选自：水、PBS(磷酸盐缓冲盐水)/乙醇混合物；水和甘油的混合物，以及NaCl溶液。

所述制剂优选进一步包含适合于局部施用于皮肤的赋形剂。优选地，所述制剂为霜、洗剂或精华液的形式。该制剂可以为凝胶、霜、乳、洗剂、精华液、油、磨砂膏、粉剂、面膜、爽肤水等的形式。该制剂可以是肥皂或清洁剂(例如洗面奶)、洗发剂、淋浴或沐浴露的形式。此外，所述制剂可以是彩妆产品的形式，例如粉底、化妆底料、遮瑕膏、粉饼、睫毛膏或口红。本发明的制剂可以结合到包裹物或薄膜、面膜、眼罩、布或毯子、垫、片、抹布或笔等中。所述一种或多种制剂可以是免洗型局部用产品的形式，即在施用后无需马上刻意的清洗步骤的可施用于皮肤的产品。

所述制剂可以进一步包含一种或多种其他试剂，其选自但不限于例如防晒剂、UV过滤剂、用于使受试者的肤色变浅的脱色剂、保湿剂、其他美容剂和/或额外的抗衰老成分。

本发明的制剂可以进一步包含以下一种或多种：硅氧烷、乳化剂、增稠剂、粉末、成膜剂、流变改性剂、推进剂、香料、遮光剂、防腐剂、着色剂、颜料、缓冲剂、螯合剂、感官增强剂及其组合。

本发明的制剂可以进一步包含一种或多种递送剂以增加制剂的活性物质向皮肤的递送。所述制剂可以进一步包含一种或多种皮肤病学上可接受的媒介物或载体。

所述制剂可以是乳液的形式，例如水包油乳液、油包水乳液、水包硅氧烷乳液、硅氧烷包水乳液、或诸如三重乳液(例如水/油/水乳液)的多重乳液、相转化温度(PIT)乳液、相转化浓度(PIC)乳液、水包蜡乳液、微乳液或D-相凝胶等。

制剂可以是霜、凝胶、溶液、分散液、糊剂、固体、基于醇的系统或气雾剂的形式。

所述制剂可以是含水或无水的组合物。所述制剂可以配制为包含在囊泡系统内，例如，磷脂、卵磷脂。固体或半固体壳包封材料可用于包封制剂(或提取物)。可以在非溶剂或非水溶性系统中提供制剂，并将其包装在双室分配系统的一个室中，以便在接近或在施用时与第二室中的组合物混合。该制剂能以基本上干燥的形式提供，例如作为粉末，其可以在施用时与水或第二种组合物或制剂混合或不与之混合。

能以任何合适的方式包装制剂，例如罐、瓶子、管、泵、泵分配器管、气雾剂或泡沫分配泵、滚球、棒、刷子、小袋、胶囊、安瓿或移液器。

提取物或制剂可以以下一种或多种形式提供：

用于皮肤的护理、治疗、清洁或防护产品；

抗皱或抗衰老组合物；

用于刺激皮肤的组合物；

抗日晒损伤组合物；

晒后护理组合物；和/或

抗瑕疵组合物或其任何组合。

根据本发明的另一个方面，提供了一种从乌拉尔甘草中分离水溶性提取物的方法，该方法包括：

使甘草植物的部分与溶剂接触；

过滤溶剂-植物混合物；和

收集滤液形式的提取物。

可以提取植物的任何部分，包括根、茎、叶、种子、花朵和果实。乌拉尔甘草植物的部分优选是根部分，例如根茎。根部分可以例如是甘草(Radix Glycyrrhizae)。

优选在与溶剂接触之前，将乌拉尔甘草植物的部分切碎和/或磨碎成较小的部分，以提供增加的表面积。可以使用任何常规技术例如球磨机将植物的部分切碎和/或磨碎。植物的该部分可以磨碎或切碎以提供具有用于提取的所需尺寸的植物材料颗粒。例如，切碎或磨碎的植物材料颗粒的尺寸优选在0.01mm至0.1mm的范围内。

溶剂优选为水，更优选为纯水。然而，应理解，可以使用任何合适的溶剂提取植物，并且不限于水提取。例如，可以用乙醇或任何其他合适的溶剂(包括超临界气体和液体)提取植物。在一实施例中，提取物可包括将不同提取方法获得的提取物共混在一起的多种提取物。

优选在提取过程中搅拌包含植物材料和溶剂的提取介质。可以使用任何合适的手段来搅动提取介质，例如搅拌或摇动或暴露于超声。优选地，使用超声辅助提取来提取植物材料。可以以任何合适的频率，优选地以45Hz的频率来提供超声。

在提取介质中的乌拉尔甘草植物与溶剂的比例优选为至少1:10，更优选为约1:20。然而，应当理解，植物材料和溶剂可以以任何合适的比例存在于提取介质中。

提取可以在任何合适的温度和/或压力下进行。提取温度最好在室温(即25℃)下进行。然而，应当理解，取决于提取的特定要求，可以根据需要对提取介质进行加热或冷却。提取优选在大气压下进行。

乌拉尔甘草植物可以与溶剂在任何合适的时期接触。乌拉尔甘草植物可以与溶剂接触至少30分钟，优选至少一个小时，例如2小时。该植物优选与溶剂接触不超过48小时，优选不超过24小时，更优选不超过10小时，例如不超过5小时。

该方法可以进一步包括冷冻干燥提取物。

该方法可以进一步包括纯化提取物以分离提取物中的一种或多种活性剂以提供纯化或精制提取物的步骤。

现在将在下面的示例中参考附图更详细地描述本发明的实施例的其他特征和优点。

附图说明

图1A显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物的RP-HPLC谱。

图1B显示了使用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物的MS和TCC扫描；

图2显示了用实施例1的提取方法获得的甘草提取物对处理48小时后I型胶原释放的影响；

图3显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物对处理48小时后成纤维细胞中IV型胶原释放的影响；

图4显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物对未暴露于UV的成纤维细胞中I型胶原和III型胶原基因表达的影响；

图5显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物对UV处理的成纤维细胞中I型胶原和III型胶原基因表达的影响；

图6A显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物对UV引发的MMP1产生的影响；

图6B显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物对污染物引发的MMP1产生的影响；

图7显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物的抗糖基化作用；

图8显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物逆转细胞中蛋白质糖基化过程的能力；

图9显示了用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物对污染物(DPM)引发的CYP1A1基因表达的影响；和

图10A-C显示了使用实施例1的提取方法获得的乌拉尔甘草提取物在各种溶剂中的溶解度。

具体实施方式

本发明涉及具有多种抗衰老益处的提取物和制剂。本发明提供了可以帮助防止、减少和/或减轻衰老症状的提取物和制剂。提取物的生物活性已通过一系列体外试验得到证实。体外试验探索了提取物对皮肤中关键生物标志物的影响，已知这些标志物会影响皮肤衰老。

实施例1–乌拉尔甘草植物的提取

将3g乌拉尔甘草植物的切好的根茎(5-12cm)放在电动磨机中并磨碎2分钟。为了防止由于摩擦阻力引起的温度上升，以多个20秒步骤进行磨碎过程。应当理解，植物的任何合适的部分可以用于该提取方法，并且是不限于根茎的提取。

磨碎过程的目的是增加植物材料的比表面积，以增加暴露于溶剂中的表面积。已经发现增加的植物材料的表面积增加了提取物的产量并减少了完成提取所需要的时间。磨碎后，植物材料以颗粒形式存在，粒径在0.01至0.1mm的范围内，优选在0.05至0.1mm的范围内。优选地，植物材料的平均粒径在0.01至0.1mm，优选在0.05至0.1mm的范围内。然而，应当理解，可以使用具有任何尺寸的植物材料来进行提取。已经发现通过设置植物材料为直径(例如平均直径)在0.01至0.1mm范围内(优选在0.05至0.1mm范围内)的颗粒，由于表面张力的增加，减少或防止了颗粒在溶剂中的聚集。尽管在本实施例中，在提取溶剂之前先将植物材料磨碎，但应理解，可以将植物材料切得很碎，或者在一些实施例中，在与溶剂接触之前不磨碎植物材料。

磨碎过程后，将所得植物材料粉末(粒径为0.05-0.1mm)放入容器中，并保存在冰箱中，避光直至提取的时刻。然而，应理解，在磨碎过程之后，所得粉末可立即或尽快与溶剂接触，而无需储存在冰箱中。

磨碎的粉末与纯水接触。使用超声辅助水提取来搅拌包含植物材料粉末和溶剂(即水)的提取介质。超声辅助水提取的优点是减少了提取时间，增加了提取产量，同时保留了植物的原始代谢组。应该理解的是，提取可以使用任何合适的溶剂进行，并且不限于使用纯水。

将1g磨碎的粉末放入45mL Falcon小瓶中。向小瓶中加入20mL纯水。磨碎的植物材料与溶剂的比例为1:20。然而，应理解，可以使用任何合适的植物材料：溶剂的比例，并且提取方法不限于该比例。

继续溶剂提取2小时。再次应理解，取决于提取的具体要求，提取时间可以大于或小于2小时。

提取是在室温(25℃)下进行的。然而，应当理解，提取可以在任何合适的温度下进行。例如，取决于提取的特定要求，可以温热(或冷却)包含植物材料和溶剂的提取介质。

在提取过程中，使用超声搅拌包含植物材料和溶剂的提取介质。超声以45Hz的频率传递。然而，应当理解，可以以任何合适的频率来递送超声。或者，可以在有或没有超声的情况下提供对溶剂混合物的搅拌。例如，可以通过混合或搅拌来提供溶剂混合物的搅拌。还应理解，在一些实施例中，可以在不搅拌的情况下进行提取。

提取完成后，将提取介质的悬浮液离心并过滤。通过使用0.45mm滤纸过滤介质，以提供澄清的滤液溶液。澄清的滤液溶液为浅黄色。然后使用冷冻干燥来将澄清的滤液溶液干燥。

冷冻干燥过程于7μBar的条件下进行48h，冷凝器温度为-110℃。在冷冻干燥循环之后，提取物准备用于进一步的植物化学分析和生物学测定。

冷冻干燥后，该提取方法产出19.5±2.5％w/w的粗提取物。

实施例2–提取物的表征

RP-HPLC法

样品制备

将10mg的实施例1的粗提取物溶于1mL的注射溶剂中：将水/乙腈95/5％v/v暴露于超声中以促进溶解。将溶液在1.4mL HPLC小瓶中通过0.45μm隔膜过滤器直接过滤后。样品用于初步的RP-HPLC、分析型HPLC、微分离和LC-QTOF分析。

色谱条件

所有HPLC分析均在配备有二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1260Infinity系统中进行。所用的柱为反相(RP)柱C18，250mm*4.6mm*5μm(Agilent，Zorbax)用下列溶剂洗脱：水MilliQ级(溶剂A)和乙腈(溶剂B)。表1列出了所采用的梯度。

表1

保留时间(min)	％A	％B
			0.00	95	5
15.00	95	5
			80.00	40	60
95.00	2	98
			105.00	95	5
120.00	95	5

柱温为35℃，如图1所示，检测到以下峰：280、310、340和530nm。最后，在21和18bar之间的压力下，所用流速为0.218mL/min。

为了进行微分离，将奇数级分收集在96孔板(300μL)中。从10分钟开始，每隔1分钟收集一次奇数级分。收集后，将96孔板冷冻干燥，并在分析前将板保存在-20℃下。

结果示于图1A。

LC-QTOF方法

LC-MS和LC-MS/MS：在配备有Agilent 6520Q-TOF质量检测器的Agilent 1200系列HPLC系统上，通过反相HPLC-ESI-Q-TOF分析提取物。使用反相柱(Agilent，Zorbax C-18，5μm X 4.6mm X 250mm)。HPLC条件如下：流速，0.218ml/min；烤箱温度，35℃；溶剂A，0.1％甲酸的水溶液；溶剂B，乙腈；梯度：0.00分钟，5％(B)，60.00分钟，40％(B)，70.00分钟，5％(B)，75.00分钟，5％(B)；注射体积为10μl(10mg/ml)。质谱数据在m/z 100-1000范围内采集，采集速率为1.35光谱/秒，平均10.000个瞬态。源参数调整如下：干燥气体温度，250℃；干燥流速，5mL/min；雾化器压力，45psi；碎裂器电压，150V。数据采集和处理由AgilentMass Hunter完成。

表2

保留时间(min)		％B
			0.00	95	5
15.00	95	5
			80.00	40	60
95.00	2	98
			105.00	95	5
120.00	95	5

结果如图1B所示。

如图1的RP-HPLC谱图(在280、310和340nm处的RP-HPLC色谱图)所示，提取物的分析致使DAD确定了3个主要峰。这些峰对应于甘草苷、芹糖甘草苷和甘草素。MS和TCC扫描还提供了三个峰，分别对应于甘草苷、芹糖甘草苷和甘草素。从图1A和1B可以看出，两种糖苷形式的甘草素之间的分离是良好的。

化合物检测

在通过实施例1的方法获得的提取物中检测到总共存在204种化合物。特别地，提取物中存在相对含量高于1％w/w的23种化合物。

提取物的去重复表明提取物中存在5种主要化学类别：糖、类黄酮、类黄酮糖苷、皂苷和异戊二烯类黄酮。

发现通过实施例1的方法获得的提取物包含以下主要化合物：18α-甘草酸、18β-甘草酸、甘草苷、甘草素、芹糖甘草苷、维采宁-2和芒柄花素。

发现通过实施例1的方法获得的提取物包含以下(％w/w)：

18β-甘草酸＝26.3％

蔗糖＝15.3％

芹糖甘草苷＝8.7％

甘草苷＝8.1％

18α-甘草酸＝8.0％

甘草素＝2.4％

维采宁-2＝0.2％

芒柄花素＝0.25％

发现乌拉尔甘草提取物中的甘草素的平均含量为0.00335mg/mg_提取物。

实施例3-通过实施例1的方法获得的提取物的化学分析

通过实施例1的方法获得的提取物的化学分析结果示于表3。

表3

表3显示，根据实施例1的方法获得的提取物包含甘草素、维采宁-2、芒柄花素、甘草苷、芹糖甘草苷和多种皂苷，该多种皂苷选自：乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和甘草皂苷H2异构体。

提取物的活性成分是：甘草素、维采宁-2和芒柄花素。

异戊二烯类黄酮的存在提供额外的益处，例如抗氧化和/或抗炎活性。

实施例4–前胶原释放增强剂活性(体外)

分析根据实施例1的方法获得的提取物以确定前胶原释放促进剂活性。这些实验的目的是通过ELISA技术确定处理过的和未处理过的人成纤维细胞的I型胶原(图2)和IV型胶原(图3)的表达。

材料

在无血清培养基中处理48小时以避免血清中的高背景后，使用CICPELISA(Quidel)测量从成纤维细胞释放到细胞培养基中的I型前胶原的水平。乌拉尔甘草提取物以三种不同的浓度(分别对应于5μM，1μM和100nM的甘草素)施用。

与组合实验中的媒介物相比，图2的图中显示了来自2-6个成纤维细胞供体倍数变化的结果。

从图2可以看出，用乌拉尔甘草提取物处理后，结果是，对于两种最高浓度的提取物(分别对应5μM和1μM甘草素)，I型前胶原释放水平显著增加，其中5μM剂量给出了平均值为+117±70％的增加(p＝0.0029，n＝2个供体)且1μM剂量给出了65±48％(n＝6个供体)的增加。本发明的乌拉尔甘草提取物在以可行的浓度增加从成纤维细胞释放I型前胶原方面显示了显著的改善。已发现前胶原的释放会直接影响皱纹的出现。

在无血清培养基中处理48小时后，使用来自CusaBio的Human Collagen Type IVELISA Kit(CSB-E17116h)测量IV型胶原从成纤维细胞释放到细胞培养基中的水平。乌拉尔甘草提取物以对应于50nM甘草素的浓度施用。与组合实验(n＝4)中的媒介物相比，图3中显示了来自4个成纤维细胞供体(细胞系统人原代细胞培养物)倍数变化的结果。

从图3中可以看出，用提取物(包含50nM的甘草素)进行处理可显著增加IV型胶原的水平。特别地，与未处理的媒介物相比，用提取物处理致使IV型胶原的释放增加了四倍。而且，与对照化合物TGFβ相比，用提取物处理致使IV型胶原的释放增加了两倍。

总之，本发明的提取物因此在以可行的浓度增加从成纤维细胞释放I型前胶原和IV型胶原方面显示出显著改善。已发现前胶原的释放会直接影响皱纹的出现。例如，当增强前胶原的释放时，皱纹的出现减少。已经发现该提取物显著增强了I型和IV型胶原的释放，因此有助于减少皱纹的出现。本发明的提取物可单独或在制剂中使用，以增强或增加胶原的释放，特别是一种或多种选自以下的胶原的释放：在使用者皮肤内的I型胶原和/或IV型胶原。本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止皮肤上出现皱纹。因此，本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止与在使用者皮肤内前胶原释放有关的皮肤衰老或皮肤损伤的症状。

实施例5–来自经UV处理的和未经UV处理的成纤维细胞的I型胶原和III型胶原表达的基因表达分析

这些实验的目的是通过定量聚合酶链反应(qPCR)来确定处理过的和对照处理过的细胞的基因表达，该方法测量样品中特定RNA的量。这里描述的方法包括用于来自所有样品的RNA和cDNA的制备的程序。结果如图4和5所示。

将人成纤维细胞的原代细胞培养物在48孔细胞培养板中培养至约80％融合度。

在图4中，在RNA提取和cDNA合成后再进行qPCR之前，将细胞用乌拉尔甘草提取物处理24小时或不处理24小时(媒介物)。

在图5中，将细胞用乌拉尔甘草或媒介物预处理1小时，然后用单剂量的UVB(50mJ/cm²)，然后与乌拉尔甘草提取物或媒介物一起孵育24h。处理后，进行RNA提取和cDNA合成，然后进行qPCR。

材料

Nanodrop

Biorad热循环仪CFX96^TM

乌拉尔甘草提取物有关甘草素含量为5μM

RNA提取

用乌拉尔甘草提取物进行细胞处理后，随后通过添加RTL裂解缓冲液(RNeasyMini kit，Qiagen)在细胞培养板上直接裂解细胞。然后根据制造商的方案将裂解提取物进行RNA提取处理。通过用Nanodrop读取260nm/280nm的吸光度比来测量RNA含量的最终浓度和纯度。

cDNA合成

根据制造商的方案，使用iScript Advanced(BioRad)从RNA合成cDNA。将RNA在42℃下孵育30分钟，然后在热循环仪(BioRad)中在85℃下对酶进行灭活5分钟。根据目标转录物的丰度，在每个20μl反应中使用5-15μl RNA样品。然后，通过添加80μl无RNase水将20μgcDNA样品直接在PCR板中以1：5稀释，并在qPCR分析之前储存在-80℃下。

qPCR

进行qPCR之前，用水将cDNA样品稀释为1：5，用5μl cDNA、10μl SsoAdvanced SYBRgreen+1μl特异性引物+4μl无RNase水来准备qPCR反应。GAPDH用作内参基因。PCR循环参数；95℃热启动3分钟，95℃40秒和60℃30秒的循环40次。根据相对于参考基因归一化的ΔΔCt方法分析结果。

分析通过实施例1的提取方法获得的提取物，以确定提取物是否对未用紫外线处理的成纤维细胞中的I型胶原和III型胶原表达有任何影响。结果如图4所示。图4显示，用提取物(包含5μM的甘草素)处理可显著增加I型胶原和III型胶原的水平。特别地，与未处理的媒介物相比，用提取物处理致使I型胶原和III型胶原的释放增加了两倍。

分析通过实施例1的提取方法获得的提取物，以确定提取物是否对经紫外线处理的成纤维细胞中的I型胶原和III型胶原表达有任何影响。结果如图5所示。可以看出，与未经处理的媒介物相比，用包含浓度为5μM的甘草素以及维采宁-2和芒柄花素的提取物进行处理，可使经紫外线处理的成纤维细胞中的I型胶原和III型胶原基因表达增加三倍。

已经发现，乌拉尔甘草提取物显著增强了I型和IV型胶原的释放以及I型和III型胶原的基因表达，因此有助于减少皱纹的出现。本发明的提取物可单独或在制剂中使用，以增强或增加胶原的释放，特别是一种或多种选自以下的胶原的释放：在使用者皮肤内的I型和/或III型胶原和/或IV型胶原的释放。本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止皮肤上出现皱纹。因此，本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止在与使用者皮肤内与前胶原释放有关的皮肤衰老或皮肤损伤的症状。

实施例6-乌拉尔甘草提取物在UV引发和污染物引发的MMP1产生；MMP1抑制中的活性。

这些测定的目的是确定乌拉尔甘草提取物对抑制人皮肤成纤维细胞中的UV(图6A)或污染物(图6B)介导的炎症标志物MMP1产生的影响。

UV/污染物旁分泌刺激的成纤维细胞测定法基于以下原理：经紫外线辐射或经污染物处理的角质形成细胞可促进成纤维细胞的炎症应答。这些研究中使用的污染物由柴油颗粒物(DPM)组成。

材料

角质形成细胞条件培养基：

根据标准细胞培养程序在EpiLife/HKGS培养基中培养角质形成细胞。当达到80-90％融合度时，用UVB(50mJ/cm²)或DPM(2μg/ml)刺激细胞，再培养24小时。

然后收集细胞培养基，并用于随后的成纤维细胞刺激。

成纤维细胞刺激和活性物质处理

根据标准细胞培养程序，在DMEM/10％FBS培养基中培养成纤维细胞。实验在48孔板中进行，细胞融合度为80-90％。

在加入来自UV或污染物处理过的角质形成细胞的KC条件培养基之前，用乌拉尔甘草提取物对细胞进行1h预处理。成纤维细胞处理24小时后，根据制造商的说明，通过ELISA测定了成纤维细胞培养基中炎症标志物MMP1的水平。

皮肤衰老可归因于外在的和内在的过程，通常通过增加的皱纹、下垂和松弛来表现出来。紫外线(UV)辐射和污染物会导致皮肤胶原组织发生明显变化。暴露于UV辐射或污染物会增加皮肤中基质金属蛋白酶(MMP)的表达。MMP能够降解细胞外基质蛋白。MMP最初合成为具有前肽域的非活性酶，必须在酶具有活性之前将其除去。在正常情况下，MMP参与细胞外基质的重塑，但是当UV光、污染物或炎症刺激过量引发时，MMP活性引起降解和组织重塑，其程度导致结缔组织损伤和过早衰老。

分析通过实施例1的提取方法获得的提取物以确定提取物是否对紫外线或污染物引发的MMP-1有任何影响。结果显示在图6A和6B中。

在两个单独的实验中，总共有三个供体用来测试提取物抑制紫外线引发的MMP1的能力(见图6A)。提取物以两种不同的浓度使用：5μM和500nM的甘草素。当汇总这三个供体时，发现最高浓度的提取物(5μM的甘草素)可显著抑制约50％的紫外线引发的MMP1。

图6B示出了实施例1的提取物对污染物引发的MMP1的影响。可以看出，与未处理的媒介物相比，用包含5μM的甘草素的提取物处理显著抑制了超过80％的污染物引发的MMP1，而与对照相比，则抑制了超过85％的污染物引发的MMP1。

已经发现本发明的提取物能够减少MMP-1的分泌，从而减少细胞外基质内存在的胶原的分解。结果，本发明的提取物能够减少由于UV辐射或暴露于污染物而引起的皮肤皱纹，从而减少皮肤衰老的出现。

本发明的提取物可单独或在制剂中使用，以抑制和/或减少和/或防止使用者皮肤内MMP-1的分泌。本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止与在使用者皮肤内MMP-1的分泌有关的皮肤衰老或皮肤损伤的症状。本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止与暴露于紫外线或污染物或使用者皮肤验证相关的发红。本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止与暴露于紫外线或污染物或使用者皮肤炎症引起的MMP-1分泌相关的发红。

实施例7-乌拉尔甘草提取物在抗糖基化测定中的活性。

糖基化是蛋白质和糖之间的非酶促过程(美拉德反应)。在皮肤中，真皮中发现了糖基分子，其中，据报道，弹性蛋白和胶原纤维是糖基化的主要细胞外靶标。细胞内蛋白质如波形蛋白也已证明是糖基化的靶标。糖基化过程对皮肤结构细胞水平的影响可能导致起皱、皮肤泛黄、失去弹性、僵硬、加速衰老并损伤屏障功能。评估从实施例1的提取方法获得的提取物，以确定其是否对糖基化过程有影响。

抗糖基化测定

这项研究的目的是在无细胞测定中确定乌拉尔甘草提取物或甘草苷或甘草素抑制糖基化过程的能力。

在该测定中，在涉及蛋白质(例如胶原)和糖的非酶促反应期间形成晚期糖基化终末产物(AGE)，即美拉德或褐变反应。抗糖基化活性基于AGE的荧光，AGE的荧光由糖D-核糖对牛血清白蛋白(BSA)的糖基化作用形成。这是一种基于抗AGE荧光的测定，可测量由牛血清白蛋白(BSA)和核糖形成的AGE的荧光光谱。此测定法中使用的蛋白质和糖只能在37℃下24小时后通过AGE荧光λ_exc370nm；λ_em440nm的测量进行筛选。在AGE荧光测量之前，将BSA(10mg/mL)与D-核糖(0.5M)和1mM的活性物质在pH 7.4的缓冲磷酸钠中于37℃孵育24小时。荧光AGE通过λ_exc370nm；λ_em440nm测量用分光光度计微板读取器检测。

材料

抑制％

为了与其他主要筛选测定一致，结果以抑制％表示。

结果

参考图7的曲线图，实施例1的乌拉尔甘草提取物包含浓度为5μM的甘草素，显示出显著的抗糖基化作用，为48％。与仅由单独的甘草苷(5μM)或单独的甘草素(5μM)产生的抗糖基化作用相比，这种抗糖基化作用是显著的。因此，本发明的提取物具有显著改善的抗糖基化作用，其可用于减少和/或防止皮肤衰老例如暗沉皮肤的症状。

人皮肤成纤维细胞的体外抗糖基化活性。

这项研究的目的是通过免疫荧光观察来确定由乌拉尔甘草稳定的细胞系提取物抑制人皮肤成纤维细胞糖基化的能力。

根据标准细胞培养程序，在DMEM/10％FBS培养基中培养成纤维细胞。用0.5mM糖乙二醛处理50-70％融合度的培养后的成纤维细胞48小时，以引发糖基化。对照细胞未用乙二醛处理。暴露于乙二醛后，将培养基换成含有乌拉尔甘草稳定的细胞提取物或毛蕊花糖苷的新鲜培养基，再培养72小时。作为该测定的阳性对照，用二甲双胍(1mM)处理细胞72h。通过成纤维细胞中的免疫荧光分析了羧甲基赖氨酸(CML)的形成，羧甲基赖氨酸是由于糖基化而形成的蛋白质加合物。

材料

免疫荧光染色

细胞处理后，然后在免疫染色之前用100％甲醇将其固定5分钟。通过用PBS中的10％山羊血清封闭1h，抑制非特异性染色。羧甲基赖氨酸(CML)是糖基化作用的结果，其是在蛋白质上形成的加合物，通过与以下一起孵育进行测量：一抗；在PBS中的小鼠抗人CML(3μg/ml)和1％山羊血清中，孵育1h，然后添加在PBS中的二抗山羊抗小鼠Alex 488(1:100稀释)和1％山羊血清，孵育1h。使用10ng/ml的DAPI进行复染色以使细胞核可视化。通过使用Cytation 3软件(Biotek)中的细胞成像/图像统计工具进行图像分析，从而得出标记强度/细胞的比例。

结果

根据两个实验中的四个供体汇总的数据，测定对照二甲双胍对糖基化的抑制作用为53％，对乌拉尔甘草提取物的抑制作用为31％。

结果如图8所示。

乌拉尔甘草提取物具有抗糖基化作用，在处理70小时后，可显著降低31％的现有CML加合物。

本发明的提取物可单独使用或在制剂中使用，以抑制和/或减少和/或防止使用者皮肤内的糖基化。本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以减少、减轻和/或防止与使用者皮肤内糖基化有关的皮肤衰老或皮肤损伤的症状。因此，本发明的提取物可以单独使用或在制剂中使用，以对抗或减少或防止与糖基化有关的皮肤衰老的症状，例如暗沉的皮肤或质地粗糙的皮肤。

实施例8–乌拉尔甘草提取物在DPM引发的污染物测定；抑制CYP1A1基因表达中的活性该测定的目的是确定乌拉尔甘草提取物对污染物引发的人原代角质形成细胞中CYP1A1基因表达的上调的抑制作用。

柴油颗粒物(DPM)用于引发人角质形成细胞的污染物应答和CYP1A1基因表达的上调。

材料

Nanodrop

Biorad热循环仪CFX96^TM

乌拉尔甘草提取物有关甘草素含量为5μM

根据标准细胞培养程序在EpiLife/HKGS培养基中培养角质形成细胞。实验在48孔板中进行，细胞融合度为80-90％。在添加污染物(DPM 10μg/ml)之前，用乌拉尔甘草提取物预处理细胞1h。处理角质形成细胞5小时后，进行RNA提取和cDNA合成，然后通过qPCR分析CYP1A1基因的表达。

RNA提取

用乌拉尔甘草提取物进行细胞处理后，随后通过添加RTL裂解缓冲液(RNeasyMini kit，Qiagen)将细胞直接裂解在细胞培养板上。然后根据制造商的方案将裂解提取物进行RNA提取处理。通过用Nanodrop读取260nm/280nm的吸光度比来测量RNA含量的最终浓度和纯度。

cDNA合成

根据制造商的方案，使用iScript Advanced(BioRad)从RNA合成cDNA。将RNA在42℃下孵育30分钟，然后在热循环仪(BioRad)中在85℃下对酶进行灭活5分钟。根据目标转录物的丰度，在每个20μl反应中使用5-15μl RNA样品。然后，通过添加80μl无RNase水，将20μlcDNA样品直接在PCR板中以1：5稀释，并在qPCR分析之前储存在-80℃下。

qPCR

在图9中，来自三个供体的汇总数据显示，当用DPM处理5h时，CYP1A1显著上调。通过用乌拉尔甘草提取物(5μM的甘草素)处理可明显抑制这种上调。与未经处理的媒介物相比，用乌拉尔甘草提取物(5μM的甘草素)处理使污染物引发的人原代角质形成细胞中CYP1A1基因表达上调的抑制作用增加了五倍。

实施例9

使用多种不同的溶液测定实施例1的提取物的溶解度。

该测试使用两个步骤进行：

第1步：目测评估提取物的溶解度。

第2步：每种溶液中LQ的定量。

使用多种不同的溶剂测定提取物的溶解度：

水/乙醇75:25

纯水

水/甘油95：5

丙二醇

PBS/乙醇75:25

氯化钠溶液0.9％

化妆油：克罗马多(cromadol)和芬索夫(finsolv)

在每种溶剂中以两种不同的浓度(100mg/ml和10mg/ml的甘草素)测试提取物的溶解度。

提取物如下稀释：

对于100mg/ml的样品浓度：50μl qsp 2500μl H₂O/ACN 80:20(1/50)

对于10mg/mL的样品浓度：50μl qsp 25 0μl H₂O/ACN80:20(1/5)

将提取物与每种溶剂以两种不同浓度混合。然后将样品涡旋并离心5分钟。然后目测评估提取物的溶解度。如果提取物似乎不可溶，则将提取物进行超声处理45分钟，然后离心5分钟。然后再次目测评估提取物的溶解度，以确定提取物是否可溶于溶剂。

分析：

然后使用HPLC柱分析样品：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6x250mm)，5μm(Agilent959990-902，VWR 89013-924)和保护柱：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6x 12.5mm)，5μm(Agilent 820950-936，VWR 89013-866)

HPLC方法：

表4

母液的制备：

通过称取X mg(精确量)粉末并添加(X mL*10)H₂O/ACN50:50，在4mL琥珀色小瓶中制备3种浓度为0.1mg/mL的LQ母液。将每种溶液涡旋，然后在超声处理至少15分钟下溶解。

连续稀释：

根据表5通过连续稀释母液获得不同的标准品：

表5

然后将每种溶液通过0.45μm过滤器过滤到HPLC琥珀色小瓶中，并保存在冰箱中直至分析。

结果与讨论

溶解度测试：目测评估

结果示于表6至9和图10中。

表6

表7

表8

表9

可以看出，实施例1的提取物可溶于：H₂O/EtOH75:25；100％水；H₂O/甘油95：5；PBS/乙醇75:25；和两种浓度的NaC l0.9％。

还可以看出，实施例1的提取物在任何一种浓度下都不溶于丙二醇、克罗马多和芬索夫。

已经参考优选实施例描述了本发明。但是，应当理解，在不脱离本发明范围的情况下，本领域普通技术人员可以进行变化和修改。

Claims

1.一种水提取物，其从乌拉尔甘草(G uralensis)植物获得，其中，所述提取物包含甘草素和以下一种或多种：维采宁-2和/或芒柄花素。

2.根据权利要求1所述的水提取物，其中，所述提取物包含量至少为0.1％w/w的芒柄花素。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的水提取物，其中，所述提取物包含量至少为0.1％w/w的维采宁-2。

4.根据前述权利要求中任一项所述的水提取物，其中，所述提取物包含：

甘草素，其浓度范围为0.1％至50％；和

下列一种或多种：

芒柄花素，其浓度范围为0.1％w/w至1％，和/或

维采宁-2，其浓度范围在0.1％w/w至1％w/w。

5.根据前述权利要求中任一项所述的水提取物，其中，所述提取物包含：

2.2-2.5％w/w甘草素；以及

6.根据前述权利要求中任一项所述的水提取物，其中，所述提取物还包含以下一种或多种：甘草苷和/或芹糖甘草苷。

7.根据前述权利要求中任一项所述的水提取物，其中，所述提取物还包含一种或多种选自以下的皂苷：乌拉尔甘草皂苷C、和/或22-β-乙酰氧基甘草甜素、和/或甘草皂苷G2、和/或乌拉尔甘草皂苷N和/或乌拉尔甘草皂苷U和/或甘草甜素和/或甘草甜素异构体和/或甘草皂苷J2和/或甘草皂苷H2、和/或甘草皂苷H2异构体。

8.根据权利要求7所述的水提取物，其中，所述提取物包含乌拉尔甘草皂苷C、22-β-乙酰氧基甘草甜素、甘草皂苷G2、乌拉尔甘草皂苷N、乌拉尔甘草皂苷U、甘草甜素、甘草甜素异构体、甘草皂苷J2、甘草皂苷H2和甘草皂苷H2异构体中的每种。

9.根据前述权利要求中任一项所述的水提取物，其中，所述提取物可溶于水溶性溶剂。

10.根据权利要求9所述的水提取物，其中，所述提取物可溶于以下一种或多种：H₂O/EtOH、100％水、H₂O/甘油、PBS/EtOH和/或NaCl溶液。

11.一种化妆品制剂，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的提取物。

12.一种药物制剂，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的提取物。

13.一种抗衰老化妆品制剂，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的提取物。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的制剂在治疗皮肤衰老或与皮肤衰老相关的皮肤损伤的症状的用途。

15.根据权利要求11至13中任一项所述的制剂在治疗与以下一种或多种有关的皮肤衰老或皮肤损伤的症状的用途：胶原释放、MMP1分泌、糖基化或其任何组合。

16.根据权利要求11至13中任一项所述的制剂在治疗UV和/或污染物引起的MMP1分泌的用途。

17.根据权利要求11至13中任一项所述的制剂在用作抗炎剂的用途。

18.一种方法，其用于根据权利要求1至10中任一项所述的从乌拉尔甘草中分离水溶性提取物，所述方法包括：

使乌拉尔甘草植物的部分与纯水接触；

过滤溶剂-植物混合物；和

以滤液形式收集提取物，

其中，提取物包含甘草素和以下一种或多种：维采宁-2和芒柄花素。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述乌拉尔甘草植物的所述部分是根茎。

20.根据权利要求18和19中任一项所述的方法，其中，在与溶剂接触之前，将所述乌拉尔甘草植物的所述部分磨碎。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中，在超声存在下使所述乌拉尔甘草植物与溶剂接触，以提供超声辅助提取。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中，乌拉尔甘草植物与溶剂的比例为1:20。

23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中，提取温度为25℃。

24.根据权利要求16至23中任一项所述的方法，还包括冷冻干燥所述提取物。